JP5834638B2 - Objective lens unit and scanning microscope having the objective lens unit - Google Patents

Objective lens unit and scanning microscope having the objective lens unit Download PDF

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Description

本発明は、対物レンズユニット及びこの対物レンズユニットを有する走査型顕微鏡に関する。   The present invention relates to an objective lens unit and a scanning microscope having the objective lens unit.

現在、生物顕微鏡の分野では、非線形効果を用いた顕微鏡が注目を集めている。その中でも、多光子励起を使用した顕微鏡は蛍光試料内の拡散に対して強く、試料の深部まで明るく観察をすることができる。したがって、今まで観察し難かった、脳などの光の拡散が大きい試料の深部をより明るく観察することができる。そのため、ユーザーからの需要がある。この需要に対応するため、多くの多光子励起顕微鏡が提案されている。   Currently, in the field of biological microscopes, microscopes using nonlinear effects are attracting attention. Among them, a microscope using multiphoton excitation is strong against diffusion in a fluorescent sample and can observe brightly up to the deep part of the sample. Accordingly, it is possible to observe brighter deep portions of a sample such as the brain, which has been difficult to observe until now, and has a large diffusion of light. Therefore, there is a demand from users. In order to meet this demand, many multiphoton excitation microscopes have been proposed.

このような多光子励起顕微鏡は、対物レンズにより励起光がスポットを結ぶ位置のみが励起されるので、ピンホールを使用しなくともよいという特徴がある。そのため、わざわざ試料からの観察光を非走査光に変える（デスキャンする）必要がないので、走査手段と対物レンズとの間に光束分離手段を挿入配置し、その先にディテクターを配置することが可能である。このディテクターをＮＤＤ（Non Descanned Detector）と言う。ピンホールを使用する場合は、試料面のうち当該ピンホールと共役な位置から出射した観察光しか受光できないが、ＮＤＤであれば 集光位置の周りに拡散した観察光であっても受光することができるため、明るい画像を得ることができる。このＮＤＤの特徴を利用してさまざまな対物レンズが開発されている。例えば、より多くの散乱光を拾えるようにするため広視野・高開口数の対物レンズが開発されている（例えば、特許文献１参照）。   Such a multi-photon excitation microscope has a feature that it is not necessary to use a pinhole because only the position where the excitation light connects the spots is excited by the objective lens. Therefore, there is no need to bother to change the observation light from the sample to non-scanning light (descanning), so it is possible to insert a light beam separation means between the scanning means and the objective lens, and place a detector ahead of it. It is. This detector is called NDD (Non Descanned Detector). When using a pinhole, only observation light emitted from a position conjugate with the pinhole on the sample surface can be received, but if it is NDD, even observation light diffused around the condensing position is received. Therefore, a bright image can be obtained. Various objective lenses have been developed using the characteristics of this NDD. For example, an objective lens having a wide field of view and a high numerical aperture has been developed in order to pick up more scattered light (see, for example, Patent Document 1).

特開２０１０−００８９８９号公報JP 2010-008989 A

このような多光子励起顕微鏡の対物レンズにおいて、検出器をＮＤＤのみと考えた場合、良好に収差が補正されている必要があるのは励起側だけであり、蛍光は検出器に入りさえすればよい。しかし、従来の対物レンズでは、励起側と蛍光側とで開口数を変えることができないため、蛍光の取り込み側の開口数は励起側の良好に収差が補正できる範囲の開口数に限定されてしまうという課題があった。   In the objective lens of such a multi-photon excitation microscope, when the detector is considered to be only NDD, it is only the excitation side that needs to be well corrected for aberrations, and fluorescence only has to enter the detector. Good. However, since the numerical aperture cannot be changed between the excitation side and the fluorescence side in the conventional objective lens, the numerical aperture on the fluorescence capturing side is limited to a numerical aperture within a range in which aberrations can be corrected satisfactorily on the excitation side. There was a problem.

本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、良好に収差が補正されている必要がある励起側の開口数によらず蛍光側の取り込み開口数を大きくすることにより、より明るい画像を取得することが可能な対物レンズユニット及びこの対物レンズユニットを有する走査型顕微鏡を提供することを目的とする。   The present invention has been made in view of such a problem, and a brighter image can be obtained by increasing the capturing numerical aperture on the fluorescent side regardless of the numerical aperture on the excitation side, in which aberrations need to be well corrected. It is an object to provide an objective lens unit capable of acquiring a scanning microscope and a scanning microscope having the objective lens unit.

前記課題を解決するために、本発明に係る走査型顕微鏡は、光源から放射された照明光を走査する走査ユニットと、照明光を試料に照射し、試料から出射する観察光を集光する対物レンズと、走査ユニットと対物レンズとの間に配置され、照明光を対物レンズに導くとともに、観察光を検出部に導くダイクロイックミラーと、照明光を遮断し観察光を透過することにより、照明光の光束径を成形する輪帯状のフィルタと、を備え、対物レンズの射出瞳において、観察光の光束径は、成形された照明光の光束径よりも大きいことを特徴とする。 In order to solve the above problems, a scanning microscope according to the present invention includes a scanning unit that scans illumination light emitted from a light source, and an objective that irradiates the sample with illumination light and collects observation light emitted from the sample. a lens, disposed between the scanning unit and the objective lens, guides the illumination light to the objective lens, a dichroic mirror for guiding the observation light to the detection unit, by transmitting the observation light to block the illumination light, the illumination light And an annular filter for shaping the luminous flux diameter of the objective lens, wherein the luminous flux diameter of the observation light is larger than the luminous flux diameter of the shaped illumination light.

このような走査型顕微鏡において、輪帯状のフィルタは、対物レンズ内に配置されることが好ましい。   In such a scanning microscope, the annular filter is preferably disposed in the objective lens.

また、本発明に係る走査型顕微鏡は、光源から放射された照明光を走査する走査ユニットと、照明光を試料に照射し、試料から出射する観察光を集光する対物レンズと、走査ユニットと対物レンズとの間に配置され、照明光を対物レンズに導くとともに、観察光を検出部に導くダイクロイックミラーと、を備え、対物レンズは、観察光が通過する第１レンズと、この第１レンズの外周に沿って配置された第２レンズと、を有し、対物レンズの射出瞳において、観察光の光束径は、成形された照明光の光束径よりも大きいことを特徴とする。 Further, a scanning microscope according to the present invention includes a scanning unit that scans illumination light emitted from a light source, an objective lens that irradiates the sample with illumination light and collects observation light emitted from the sample, and a scanning unit. And a dichroic mirror that is disposed between the objective lens and guides the illumination light to the objective lens and guides the observation light to the detection unit. The objective lens includes a first lens through which the observation light passes, and the first lens. possess a second lens disposed along the outer periphery of the, in the exit pupil of the objective lens, the beam diameter of the observation light, and greater than the beam diameter of the shaped illumination light.

このような走査型顕微鏡において、光源は、多光子励起を生じさせる赤外短パルスレーザ光源であることが好ましい。   In such a scanning microscope, the light source is preferably an infrared short pulse laser light source that causes multiphoton excitation.

また、このような走査型顕微鏡において、観察光は、ピンホールを介さずに、検出部に導かれることが好ましい。   In such a scanning microscope, it is preferable that the observation light is guided to the detection unit without passing through the pinhole.

また、本発明に係る対物レンズユニットは、走査型顕微鏡に用いられ、光源から放射された第１の波長の照明光を試料に照射し、試料から出射する第２の波長の観察光を集光する対物レンズユニットであって、対物レンズと、第１の波長の照明光を遮断し、第２の波長の観察光を透過する輪帯状のフィルタであって、対物レンズの射出瞳を通過する照明光の光束径を、対物レンズの開口数の光束の径よりも小さくするフィルタと、を有することを特徴とする。
このような本発明に係る対物レンズユニットにおいて、フィルタは、対物レンズの射出瞳と略同一位置に配置されていることが好ましい。
また、このような本発明に係る対物レンズユニットにおいて、フィルタは、射出瞳より標本側に配置される第１フィルタと、射出瞳より光源側に配置される第２フィルタと、であることが好ましい。 The objective lens unit according to the present invention is used in a scanning microscope, irradiates a sample with illumination light having a first wavelength emitted from a light source, and collects observation light having a second wavelength emitted from the sample. An objective lens unit that is an annular filter that blocks the objective lens and the illumination light of the first wavelength and transmits the observation light of the second wavelength, and passes through the exit pupil of the objective lens And a filter that makes the light beam diameter smaller than the beam diameter of the numerical aperture of the objective lens.
In such an objective lens unit according to the present invention, it is preferable that the filter is disposed at substantially the same position as the exit pupil of the objective lens.
In such an objective lens unit according to the present invention, the filters are preferably a first filter disposed on the sample side from the exit pupil and a second filter disposed on the light source side from the exit pupil. .

また、本発明に係る対物レンズユニットは、走査型顕微鏡に用いられ、光源から放射された第１の波長の照明光を試料に照射し、試料から出射する第２の波長の観察光を集光する対物レンズユニットであって、照明光が通過する第１レンズと、この第１レンズの外周に沿って配置された第２レンズと、を有する対物レンズを有し、対物レンズの射出瞳において、観察光の光束径は、成形された照明光の光束径よりも大きいことを特徴とする。 The objective lens unit according to the present invention is used in a scanning microscope, irradiates a sample with illumination light having a first wavelength emitted from a light source, and collects observation light having a second wavelength emitted from the sample. An objective lens unit having an objective lens having a first lens through which illumination light passes and a second lens arranged along an outer periphery of the first lens, and in an exit pupil of the objective lens, The light beam diameter of the observation light is larger than the light beam diameter of the shaped illumination light .

また、本発明に係る走査型顕微鏡は、光源から放射される第１の波長の照明光を走査する走査ユニットと、上述の対物レンズユニットのいずれかと、観察光を検出する検出部と、を有することを特徴とする。   In addition, a scanning microscope according to the present invention includes a scanning unit that scans illumination light having a first wavelength emitted from a light source, one of the objective lens units described above, and a detection unit that detects observation light. It is characterized by that.

本発明を以上のように構成すると、良好に収差が補正されている必要がある励起側の開口数によらず蛍光側の取り込み開口数を大きくすることにより、より明るい画像を取得することが可能な対物レンズユニット及びこの対物レンズユニットを有する走査型顕微鏡を提供することができる。   When the present invention is configured as described above, it is possible to obtain a brighter image by increasing the capturing numerical aperture on the fluorescent side, regardless of the numerical aperture on the excitation side, in which aberrations need to be well corrected. Objective lens unit and a scanning microscope having the objective lens unit can be provided.

走査型顕微鏡の構成を示す説明図である。It is explanatory drawing which shows the structure of a scanning microscope. 走査光学系の主要部の構成を示す説明図である。It is explanatory drawing which shows the structure of the principal part of scanning optical system. 第１の実施形態に係る走査型顕微鏡における対物レンズユニットの構成を示す説明図であって、（ａ）はこの対物レンズユニットを示し、（ｂ）はフィルタを示し、（ｃ）はフィルタの特性を示す。It is explanatory drawing which shows the structure of the objective lens unit in the scanning microscope which concerns on 1st Embodiment, (a) shows this objective lens unit, (b) shows a filter, (c) shows the characteristic of the filter Indicates. 第１及び第２のフィルタで励起側の開口数を制限する構成を示す説明図であって、（ａ）は励起側の光線の状態を示し、（ｂ）は蛍光側の光線の状態を示す。It is explanatory drawing which shows the structure which restrict | limits the numerical aperture on the excitation side with the 1st and 2nd filter, Comprising: (a) shows the state of the light ray of an excitation side, (b) shows the state of the light ray of a fluorescence side. . 第２の実施形態に係る走査型顕微鏡の構成を示す説明図である。It is explanatory drawing which shows the structure of the scanning microscope which concerns on 2nd Embodiment. 第３の実施形態に係る走査型顕微鏡の構成を示す説明図である。It is explanatory drawing which shows the structure of the scanning microscope which concerns on 3rd Embodiment. 対物レンズの変形例を説明するための説明図である。It is explanatory drawing for demonstrating the modification of an objective lens.

以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。まず、図１を用いて走査型顕微鏡１０の構成について説明する。この走査型顕微鏡１０は、光源２０から放射されたレーザ光（照明光）をステージ１１上に載置された標本６０に照射して走査する走査光学系３０と、標本６０からの蛍光（観察光）を検出する第１検出部４０及び第２検出部５０と、を有して構成される。なお、以降の説明において、走査光学系３０の光軸方向をｚ軸とし、このｚ軸に直交する面内で互いに直交する方向をそれぞれｘ軸及びｙ軸とする。   Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. First, the configuration of the scanning microscope 10 will be described with reference to FIG. The scanning microscope 10 includes a scanning optical system 30 that irradiates and scans a specimen 60 placed on the stage 11 with laser light (illumination light) emitted from a light source 20, and fluorescence (observation light) from the specimen 60. ) To detect the first detection unit 40 and the second detection unit 50. In the following description, the optical axis direction of the scanning optical system 30 is defined as the z axis, and the directions orthogonal to each other in a plane orthogonal to the z axis are defined as the x axis and the y axis, respectively.

この走査型顕微鏡１０において、光源２０は、波長が異なる複数のレーザ光を、同時または個別に射出することが可能に構成されている。なお、以降の説明においては、光源２０から赤外光および可視光の２種類のレーザ光が射出されるものとして説明する。また、この光源２０から射出される赤外光は、試料６０の多光子励起を誘発するための、所定の周期で射出される非常に短いパルス状の光（例えば、１００フェムト秒のパルス光であって、以下、「ＩＲパルス光」と称する）であるものとする。   In the scanning microscope 10, the light source 20 is configured to be able to emit a plurality of laser beams having different wavelengths simultaneously or individually. In the following description, it is assumed that two types of laser light, infrared light and visible light, are emitted from the light source 20. The infrared light emitted from the light source 20 is a very short pulsed light (for example, 100 femtosecond pulsed light) emitted at a predetermined period for inducing multiphoton excitation of the sample 60. And hereinafter referred to as “IR pulsed light”).

走査光学系３０は、光源２０側から順に、第１集光レンズ３１、第１ダイクロイックミラー３２、走査ユニット３３、瞳投影レンズ３４、第２集光レンズ３５、第２ダイクロックミラー３６、及び、対物レンズ３７を有する。   The scanning optical system 30 includes, in order from the light source 20 side, a first condenser lens 31, a first dichroic mirror 32, a scanning unit 33, a pupil projection lens 34, a second condenser lens 35, a second dichroic mirror 36, and An objective lens 37 is provided.

また、第１検出部４０は、上述のＮＤＤであって、第２ダイクロイックミラー３６の側方に配置され、この第２ダイクロイックミラー３６側から順に、第３集光レンズ４１、第４集光レンズ４２、及び、第１光検出器４３から構成される。ここでは、第１光検出器４３の受光面は対物レンズ３７の射出瞳位置と略共役に配置されているが、第１光検出器４３は物体面との共役になっていてもよい。   The first detection unit 40 is the above-described NDD, and is disposed on the side of the second dichroic mirror 36. The third condenser lens 41 and the fourth condenser lens are sequentially arranged from the second dichroic mirror 36 side. 42 and the first photodetector 43. Here, the light receiving surface of the first photodetector 43 is arranged substantially conjugate with the exit pupil position of the objective lens 37, but the first photodetector 43 may be conjugate with the object plane.

さらに、第２検出部５０は、第１ダイクロイックミラー３２を挟んで試料６０と対向するように配置されており、この第１ダイクロイックミラー３２側から順に、第５集光レンズ５１、対物レンズ３７の試料側の焦点面と略共役な位置に配置された遮光板５２、及び、第２光検出器５３から構成される。ここで、遮光版５２にはピンホール５２ａが設けられており、このピンホール５２ａは走査光学系３０の光軸を含むように配置されている。   Further, the second detection unit 50 is disposed so as to face the sample 60 with the first dichroic mirror 32 interposed therebetween, and in order from the first dichroic mirror 32 side, the fifth condenser lens 51 and the objective lens 37 are arranged. The light shielding plate 52 and the second photodetector 53 are arranged at a position substantially conjugate with the focal plane on the sample side. Here, the light shielding plate 52 is provided with a pinhole 52 a, and the pinhole 52 a is disposed so as to include the optical axis of the scanning optical system 30.

また、この走査型顕微鏡１０には、走査ユニット３３でレーザ光を走査する位置（試料６０上の走査面内の座標）及び第１及び第２光検出器４３，５３で検出された値を処理する図示しない処理部が設けられている。なお、第１及び第２光検出器４３，５３としては、例えば、ＰＭＴ（Photo Multiplier Tube:光電子倍増管）、ＧａＡｓＰ等が用いられる。   Further, the scanning microscope 10 processes the position (coordinates in the scanning plane on the sample 60) where the scanning unit 33 scans the laser beam and the values detected by the first and second photodetectors 43 and 53. A processing unit (not shown) is provided. As the first and second photodetectors 43 and 53, for example, PMT (Photo Multiplier Tube), GaAsP or the like is used.

この走査型顕微鏡１０において、光源２０から放射されたレーザ光は、第１集光レンズ３１で略平行光束となり、第１ダイクロイックミラー３２に入射して対物レンズ３７側に反射され、走査ユニット３３に入射する。この走査ユニット３３は、光軸に直交する方向（上述のｘ軸方向及びｙ軸方向）にレーザ光を２次元的に走査するものであり、例えば、図２に示すようにレーザ光を反射することによりこのレーザ光を光軸に直交する面内で所定の方向（この方向をｘ軸方向とする）に偏向させる第１の偏向素子３３ｘ、及び、光軸に直交する面内で第１の偏向素子３３ｘの偏向方向と略直交する方向（この方向をｙ軸方向とする）に偏向させる第２の偏向素子３３ｙからなる２つの偏向素子で構成されている。そして、この走査ユニット３３を出射したレーザビーム（略平行光束）は瞳投影レンズ３４により一次像面に結像された後、第２集光レンズ３５を通過することにより再び略平行光束となり、第２ダイクロイックミラー３６を透過して対物レンズ３７によって試料６０上の対物レンズ３７の焦点面に集光される。なお、試料６０上に集光されたレーザ光は点像となっており、その点像の径は対物レンズ３７の開口数（ＮＡ）で決まる大きさである。   In the scanning microscope 10, the laser light emitted from the light source 20 becomes a substantially parallel light beam by the first condenser lens 31, enters the first dichroic mirror 32, is reflected toward the objective lens 37, and is incident on the scanning unit 33. Incident. The scanning unit 33 scans the laser light two-dimensionally in the direction orthogonal to the optical axis (the above-described x-axis direction and y-axis direction), and reflects the laser light as shown in FIG. As a result, the first deflection element 33x deflects the laser light in a predetermined direction (this direction is defined as the x-axis direction) in a plane orthogonal to the optical axis, and the first deflection element 33x in the plane orthogonal to the optical axis. It is composed of two deflection elements including a second deflection element 33y that deflects in a direction substantially perpendicular to the deflection direction of the deflection element 33x (this direction is defined as a y-axis direction). The laser beam (substantially parallel light beam) emitted from the scanning unit 33 is imaged on the primary image plane by the pupil projection lens 34 and then passes through the second condenser lens 35 to become a substantially parallel light beam again. The light passes through the two-dichroic mirror 36 and is focused on the focal plane of the objective lens 37 on the sample 60 by the objective lens 37. The laser beam condensed on the sample 60 is a point image, and the diameter of the point image is determined by the numerical aperture (NA) of the objective lens 37.

ここで、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０において、試料６０の観察時には、光源２０から放射されるレーザー光のうち、ＩＲパルス光又は可視光の何れか一方が、試料６０の画像を得るためのイメージング用の光（励起光）として用いられる。   Here, in the scanning microscope 10 according to the present embodiment, at the time of observing the sample 60, either the IR pulse light or the visible light among the laser light emitted from the light source 20 obtains an image of the sample 60. Used as imaging light (excitation light).

例えば、ＩＲパルス光を励起光（第１の波長の照明光）として用いる場合、可視光は全く使用されないか、又は、試料６０の光刺激用として使用される。この場合、ＩＲパルス光が試料６０に照射されると、試料６０からは多光子励起による蛍光が発生し、この蛍光は観察光（第２の波長の観察光）となって対物レンズ３７に入射し、この対物レンズ３７で略平行光束となり第２ダイクロイックミラー３６で反射されて第１検出部４０に入射する。そして、この観察光は第３集光レンズ４１及び第４集光レンズ４２で必要な径の略平行光束に変換されて第１光検出器４３に入射して検出される。なお、この第１検出部４０には、試料６０や対物レンズ３７等で反射され、観察光とともにこの第１検出部４０に入射するＩＲパルス光を除去するために、図示しないＩＲカットフィルタが配置されている。   For example, when IR pulse light is used as excitation light (illumination light having the first wavelength), visible light is not used at all, or is used for light stimulation of the sample 60. In this case, when the sample 60 is irradiated with IR pulse light, fluorescence from multi-photon excitation is generated from the sample 60, and this fluorescence enters the objective lens 37 as observation light (second-wavelength observation light). Then, the objective lens 37 becomes a substantially parallel light beam, is reflected by the second dichroic mirror 36, and enters the first detection unit 40. Then, the observation light is converted into a substantially parallel light beam having a required diameter by the third condenser lens 41 and the fourth condenser lens 42 and is incident on the first photodetector 43 and detected. The first detection unit 40 is provided with an IR cut filter (not shown) to remove the IR pulse light reflected by the sample 60, the objective lens 37, etc. and incident on the first detection unit 40 together with the observation light. Has been.

一方、可視光を励起光として用いる場合、ＩＲパルス光は全く使用されないか、又は、試料６０の光刺激用として使用される。この場合、観察光が試料６０に照射されると、試料６０からは蛍光が発生し、この蛍光は観察光となって対物レンズ３７に入射し、この対物レンズ３７で略平行光束となり第２ダイクロイックミラー３６を透過する。そして、この観察光は、第２集光レンズ３５により一次像面に結像された後、さらに瞳投影レンズ３４で略平行光束にされて走査ユニット３３に入射し、この走査ユニット３３でデスキャンされて出射し、第１ダイクロイックミラー３２を透過して第２検出部５０内に入り、第５集光レンズ５１により遮光板５２のピンホール５２ａ上に集光される。この第２検出部５０において、遮光板５２のピンホール５２ａを通過した光のみが第２光検出器５３に到達し検出される。   On the other hand, when visible light is used as excitation light, IR pulse light is not used at all, or is used for light stimulation of the sample 60. In this case, when the observation light is irradiated onto the sample 60, fluorescence is generated from the sample 60, and this fluorescence becomes observation light and enters the objective lens 37. The objective lens 37 becomes a substantially parallel light beam, and the second dichroic. The light passes through the mirror 36. The observation light is imaged on the primary image plane by the second condenser lens 35, further converted into a substantially parallel light beam by the pupil projection lens 34, and incident on the scanning unit 33, and descanned by the scanning unit 33. And then passes through the first dichroic mirror 32 and enters the second detection unit 50, and is collected by the fifth condenser lens 51 onto the pinhole 52 a of the light shielding plate 52. In the second detector 50, only the light that has passed through the pinhole 52 a of the light shielding plate 52 reaches the second photodetector 53 and is detected.

上述のように、遮光板５２のピンホール５２ａは試料６０上の走査面に集光されたレーザ光の点像と共役であり、試料６０上の照射領域（対物レンズ３７の焦点面）から出た観察光（蛍光）はこのピンホール５２ａを通過することができる。一方、試料６０上の他の領域から出た光のほとんどはこのピンホール５２ａ上には集光されず、通過することができない。   As described above, the pinhole 52 a of the light shielding plate 52 is conjugate with the point image of the laser beam condensed on the scanning surface on the sample 60, and exits from the irradiation region on the sample 60 (focal plane of the objective lens 37). The observed light (fluorescence) can pass through the pinhole 52a. On the other hand, most of the light emitted from other regions on the sample 60 is not condensed on the pinhole 52a and cannot pass therethrough.

以上より、図示しない処理部が走査ユニット３３の走査に同期されて第１及び第２光検出器４３，５３で検出された光信号を処理することにより、試料６０上のレーザ光が照射された座標と光信号から求められる輝度を用いて、試料６０の走査面における二次元的な画像を得ることができる。これによりこの走査型顕微鏡１０は、高い分解能で試料６０の像を得ることができる。このように、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０は、走査型多光子顕微鏡及び走査型共焦点顕微鏡の両方として使用することができる。   As described above, the processing unit (not shown) processes the optical signals detected by the first and second photodetectors 43 and 53 in synchronization with the scanning of the scanning unit 33, so that the laser beam on the sample 60 is irradiated. A two-dimensional image on the scanning plane of the sample 60 can be obtained using the luminance obtained from the coordinates and the optical signal. As a result, the scanning microscope 10 can obtain an image of the sample 60 with high resolution. Thus, the scanning microscope 10 according to the present embodiment can be used as both a scanning multiphoton microscope and a scanning confocal microscope.

［第１の実施形態］
それでは、このような構成の走査型顕微鏡１０の第１の実施形態として、励起光が放射されるとき（励起側）の開口数（ＮＡ）よりも、蛍光を取り込むとき（蛍光側）の開口数（ＮＡ）が大きくなるようにした構成について説明する。 [First Embodiment]
Then, as a first embodiment of the scanning microscope 10 having such a configuration, the numerical aperture when capturing fluorescence (fluorescence side) is larger than the numerical aperture (NA) when excitation light is emitted (excitation side). A configuration in which (NA) is increased will be described.

図３に示すように、本第１の実施形態に係る走査型顕微鏡１０において、対物レンズ３７には、この対物レンズ３７の射出瞳の位置、若しくはその近傍に、輪帯状（リング状）のフィルタ３８が配置されて、対物レンズユニット３９を構成している。このフィルタ３８は、図３（ｃ）に示すように、光源２０から放射されたＩＲパルス光（第１の波長の照明光）を、例えば、吸収することにより遮断し、このＩＲパルス光により試料６０で励起された蛍光（第２の波長の観察光）を透過する光学部材で構成されており、その外径が、対物レンズ３７を通過する最大開口数の光束以上の大きさに形成され、また、開口部３８ａの内径は最大開口数の光束よりも小さく形成されている。そのため、図３（ａ）に示すように、ＩＲパルス光ＬＥはこのフィルタ３８の開口部３８ａのみを通過することができるので、このフィルタ３８により絞られ、対物レンズ３７から射出したときのＩＲパルス光ＬＥの開口数が対物レンズ３７の最大開口数よりも小さくなる。すなわち、ＩＲパルス光ＬＥは、対物レンズ３７の外周部は通過せず、収差が良好に補正された光軸付近を通過するため、このＩＲパルス光ＬＥを対物レンズ３７の焦点面上の一点に効率良く集光することができる。一方、このＩＲパルス光ＬＥにより励起された蛍光ＬＦはフィルタ３８を通過することができるので、対物レンズ３７の最大開口数で、散乱光も含めて効率良く取り込むことができる。   As shown in FIG. 3, in the scanning microscope 10 according to the first embodiment, the objective lens 37 includes an annular (ring-shaped) filter at or near the exit pupil of the objective lens 37. 38 is arranged to constitute an objective lens unit 39. As shown in FIG. 3C, the filter 38 blocks the IR pulse light (illumination light having the first wavelength) emitted from the light source 20, for example, by absorbing the sample, and the IR pulse light allows the sample to be blocked. The optical member is configured to transmit the fluorescence (observation light having the second wavelength) excited at 60, and the outer diameter thereof is formed to be larger than the luminous flux having the maximum numerical aperture that passes through the objective lens 37. The inner diameter of the opening 38a is smaller than the light flux having the maximum numerical aperture. Therefore, as shown in FIG. 3A, since the IR pulse light LE can pass only through the opening 38a of the filter 38, the IR pulse when being narrowed down by the filter 38 and emitted from the objective lens 37 is obtained. The numerical aperture of the light LE is smaller than the maximum numerical aperture of the objective lens 37. That is, the IR pulse light LE does not pass through the outer periphery of the objective lens 37, but passes through the vicinity of the optical axis in which the aberration is well corrected. Therefore, the IR pulse light LE is set at one point on the focal plane of the objective lens 37. It can collect light efficiently. On the other hand, since the fluorescence LF excited by the IR pulse light LE can pass through the filter 38, the maximum numerical aperture of the objective lens 37 can be efficiently captured including scattered light.

なお、図４に示すように射出瞳が対物レンズ３７の内部にある場合は、この対物レンズ３７を構成するレンズの適宜の面で光束を制限することで、励起側の開口数を対物レンズ３７の最大開口数（蛍光側の開口数）より小さくすることができる。具体的には、軸上物点から射出される最大開口数の光線及び、軸外物点から射出される光束の中、最も光軸から離れた方向に射出される光線を、軸上物点から射出される最大開口数の光線と対物レンズ３７内の適宜のレンズ面（例えば、図４における第Ａ面）との交点で制限するように第１フィルタ３８１を配置し、最も光軸に近い方向に射出される光線を、軸上物点から射出される最大開口数の光線と対物レンズ３７内の適宜のレンズ面（例えば、図４における第Ｂ面）との交点で制限するように第２フィルタ３８２を配置する。なお、第１及び第２フィルタ３８１，３８２の各々は、図３（ｂ）に示す形状を有するとともに、入射する光の波長に対して図３（ｃ）に示す特性を有している。   When the exit pupil is inside the objective lens 37 as shown in FIG. 4, the numerical aperture on the excitation side is reduced by restricting the light flux with an appropriate surface of the lens constituting the objective lens 37. The maximum numerical aperture (the numerical aperture on the fluorescent side) can be made smaller. Specifically, the light beam having the maximum numerical aperture emitted from the on-axis object point and the light beam emitted from the off-axis object point in the direction farthest from the optical axis are converted to the on-axis object point. The first filter 381 is disposed so as to be limited by the intersection of the light beam having the maximum numerical aperture emitted from the lens and an appropriate lens surface (for example, the A surface in FIG. 4) in the objective lens 37, and is closest to the optical axis. The light beam emitted in the direction is limited to the intersection of the light beam having the maximum numerical aperture emitted from the on-axis object point and an appropriate lens surface in the objective lens 37 (for example, the B surface in FIG. 4). Two filters 382 are arranged. Each of the first and second filters 381 and 382 has the shape shown in FIG. 3B and the characteristics shown in FIG. 3C with respect to the wavelength of incident light.

このような走査型顕微鏡１０において、第１検出部４０をＮＤＤと考えた場合、対物レンズ３７の蛍光側は厳密な収差の補正は必要がないため、液浸の対物レンズであれば蛍光側の取り込み開口数を１．３３、油浸の対物レンズであれば蛍光側の取り込み開口数を１．５まで上げて、より明るい画像を取得することができる。このとき、上述のように励起側の開口数はフィルタ３８（３８１，３８２）で制限されるため、対物レンズ３７において良好に収差が補正された光軸付近を使用することができるので、ＩＲパルス光を、試料６０上の所望の位置に効率良く集光して多光子励起を起こさせることができる。また、このように対物レンズ３７にフィルタ３８を設けた対物レンズユニット３９とすることにより、従来の走査型顕微鏡の対物レンズユニットの代わりにこの対物レンズユニット３９を取り付けることで上述の効果を得ることができる。   In such a scanning microscope 10, when the first detection unit 40 is considered to be NDD, the fluorescent side of the objective lens 37 does not require strict aberration correction. If the objective numerical aperture is 1.33 and the oil immersion objective lens is used, a brighter image can be obtained by increasing the fluorescent side acquisition numerical aperture to 1.5. At this time, since the numerical aperture on the excitation side is limited by the filter 38 (381, 382) as described above, it is possible to use the vicinity of the optical axis in which the aberration is favorably corrected in the objective lens 37. Light can be efficiently collected at a desired position on the sample 60 to cause multiphoton excitation. Further, by using the objective lens unit 39 provided with the filter 38 in the objective lens 37 as described above, the above-described effects can be obtained by attaching the objective lens unit 39 in place of the objective lens unit of the conventional scanning microscope. Can do.

［第２の実施形態］
上述の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡１０では、対物レンズ３７に励起側の開口数を制限するフィルタ３８（３８１，３８２）を設けた場合について説明したが、光源２０から走査光学系３０に入射するＩＲパルス光の光束を絞ることでも、同様の効果を得ることができる。例えば、図５に示すように、光源２０と走査ユニット３３との間の略平行光束の区間（図１に示す、第１集光レンズ３１と第１ダイクロイックミラー３２との間が望ましい）に、絞り２１を配置し、ＩＲパルス光の光束を絞ることで、対物レンズ３７の射出瞳を通過するＩＲパルス光の光束径も絞られる。そのため、ＩＲパルス光は、対物レンズ３７の外周部は通過せず、収差が良好に補正された光軸付近を通過するため、このＩＲパルス光を対物レンズ３７の焦点面上の一点に効率良く集光することができる。一方、このＩＲパルス光により励起された試料６０から発生した蛍光は、対物レンズ３７の最大開口数で、散乱光も含めて効率良く取り込むことができる。 [Second Embodiment]
In the scanning microscope 10 according to the first embodiment described above, the case where the objective lens 37 is provided with the filter 38 (381, 382) for limiting the numerical aperture on the excitation side has been described. The same effect can be obtained by narrowing the luminous flux of the IR pulse light incident on the beam. For example, as shown in FIG. 5, in a section of a substantially parallel light beam between the light source 20 and the scanning unit 33 (preferably between the first condenser lens 31 and the first dichroic mirror 32 shown in FIG. 1) By arranging the diaphragm 21 and narrowing the luminous flux of the IR pulse light, the luminous flux diameter of the IR pulse light passing through the exit pupil of the objective lens 37 is also narrowed. For this reason, the IR pulse light does not pass through the outer periphery of the objective lens 37 but passes through the vicinity of the optical axis in which the aberration is well corrected. Therefore, the IR pulse light is efficiently applied to one point on the focal plane of the objective lens 37. It can be condensed. On the other hand, the fluorescence generated from the sample 60 excited by the IR pulse light can be efficiently captured including the scattered light at the maximum numerical aperture of the objective lens 37.

［第３の実施形態］
あるいは、図６に示すように、光源２０と走査ユニット３３との間の略平行光束の区間（図１に示す、第１集光レンズ３１と第１ダイクロイックミラー３２との間が望ましい）に、ビームエキスパンダ２２を配置し、ＩＲパルス光の光束を細くすることで、対物レンズ３７の射出瞳を通過するＩＲパルス光の光束径も絞ることができ、第２の実施形態と同様の効果を得ることができる。 [Third Embodiment]
Alternatively, as shown in FIG. 6, in a substantially parallel light beam section between the light source 20 and the scanning unit 33 (preferably between the first condenser lens 31 and the first dichroic mirror 32 shown in FIG. 1). By arranging the beam expander 22 and narrowing the light beam of the IR pulse light, the light beam diameter of the IR pulse light passing through the exit pupil of the objective lens 37 can be reduced, and the same effect as in the second embodiment can be obtained. Can be obtained.

なお、以上の第１〜第３の実施形態において、試料６０で発生する蛍光を取り込むために、対物レンズ３７の開口数を大きくすると、収差の補正が難しくなり、ＩＲパルス光を焦点面上の一点に集光することが難しくなる。そのため、図７に示すように、対物レンズ３７′を、走査光学系３０の光軸上に配置された第１レンズ３７ａと、その外周を囲むように配置された第２レンズ３７ｂとで構成し、光源２０から放射されたレーザ光（ＩＲパルス光）は第１レンズ３７ａで集光し、試料６０から出射した蛍光はこの第１レンズ３７ａ及び第２レンズ３７ｂで集光するように構成することができる。   In the first to third embodiments described above, if the numerical aperture of the objective lens 37 is increased in order to capture the fluorescence generated in the sample 60, it becomes difficult to correct the aberration, and the IR pulse light is reflected on the focal plane. It becomes difficult to focus on one point. Therefore, as shown in FIG. 7, the objective lens 37 ′ is composed of a first lens 37a arranged on the optical axis of the scanning optical system 30 and a second lens 37b arranged so as to surround the outer periphery thereof. The laser light (IR pulse light) emitted from the light source 20 is condensed by the first lens 37a, and the fluorescence emitted from the sample 60 is condensed by the first lens 37a and the second lens 37b. Can do.

対物レンズ３７′をこのような構成とすると、第１レンズ３７ａの開口数はＩＲパルス光を試料６０上に集光するために必要な開口数とすることができるので、収差を良好に補正することができる。一方、蛍光に対しては、上述のように第１検出部４０をＮＤＤであるとすると、対物レンズ３７′は、試料６０で発生する蛍光を集光してこの第１検出部４０に入射させれば良いので、第２レンズ３７ｂでも十分機能を発揮することができる。   When the objective lens 37 ′ has such a configuration, the numerical aperture of the first lens 37 a can be set to a numerical aperture necessary for condensing the IR pulse light on the sample 60, so that the aberration is corrected well. be able to. On the other hand, for the fluorescence, if the first detection unit 40 is NDD as described above, the objective lens 37 ′ collects the fluorescence generated in the sample 60 and makes it incident on the first detection unit 40. Therefore, the second lens 37b can sufficiently function.

なお、第２レンズ３７ｂは、中空でリング状のレンズでも良いし、複数のマイクロレンズを第１レンズ３７ａの外周に沿って輪帯状に並べた構成でも良い。また、この対物レンズ３７′を第１の実施形態の対物レンズユニット３９に適用する場合は、ＩＲパルス光が第１レンズ３７ａを通過するようにフィルタ３８を配置する。   The second lens 37b may be a hollow, ring-shaped lens, or may have a configuration in which a plurality of microlenses are arranged in a ring shape along the outer periphery of the first lens 37a. When this objective lens 37 'is applied to the objective lens unit 39 of the first embodiment, the filter 38 is disposed so that the IR pulse light passes through the first lens 37a.

１０ 走査型顕微鏡 ２０ 光源 ２１ 絞り
２２ ビームエキスパンダ ３３ 走査ユニット
３７，３７′ 対物レンズ ３７ａ 第１レンズ ３７ｂ 第２レンズ
３８ フィルタ ３８１ 第１フィルタ ３８２ 第２フィルタ
３９ 対物レンズユニット ６０ 試料 DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Scanning microscope 20 Light source 21 Aperture 22 Beam expander 33 Scanning unit 37, 37 'Objective lens 37a First lens 37b Second lens 38 Filter 381 First filter 382 Second filter 39 Objective lens unit 60 Sample

Claims (10)

光源から放射された照明光を走査する走査ユニットと、
前記照明光を試料に照射し、前記試料から出射する観察光を集光する対物レンズと、
前記走査ユニットと前記対物レンズとの間に配置され、前記照明光を対物レンズに導くとともに、前記観察光を検出部に導くダイクロイックミラーと、
前記照明光を遮断し前記観察光を透過することにより、前記照明光の光束径を成形する輪帯状のフィルタと、を備え、
前記対物レンズの射出瞳において、前記観察光の光束径は、成形された前記照明光の光束径よりも大きいことを特徴とする走査型顕微鏡。 A scanning unit for scanning illumination light emitted from a light source;
An objective lens that irradiates the sample with the illumination light and collects the observation light emitted from the sample;
A dichroic mirror that is disposed between the scanning unit and the objective lens, guides the illumination light to the objective lens, and guides the observation light to a detection unit;
A ring-shaped filter that blocks the illumination light and transmits the observation light to shape the luminous flux diameter of the illumination light , and
A scanning microscope characterized in that a diameter of a beam of the observation light is larger than a diameter of a beam of the formed illumination light at an exit pupil of the objective lens. 前記輪帯状のフィルタは、前記対物レンズ内に配置されることを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。 The scanning microscope according to claim 1, wherein the ring-shaped filter is disposed in the objective lens. 光源から放射された照明光を走査する走査ユニットと、
前記照明光を試料に照射し、前記試料から出射する観察光を集光する対物レンズと、
前記走査ユニットと前記対物レンズとの間に配置され、前記照明光を対物レンズに導くとともに、前記観察光を検出部に導くダイクロイックミラーと、を備え、
前記対物レンズは、
前記観察光が通過する第１レンズと、
前記第１レンズの外周に沿って配置された第２レンズと、を有し、
前記対物レンズの射出瞳において、前記観察光の光束径は、成形された前記照明光の光束径よりも大きいことを特徴とする走査型顕微鏡。 A scanning unit for scanning illumination light emitted from a light source;
An objective lens that irradiates the sample with the illumination light and collects the observation light emitted from the sample;
A dichroic mirror that is disposed between the scanning unit and the objective lens and guides the illumination light to the objective lens and guides the observation light to a detection unit;
The objective lens is
A first lens through which the observation light passes;
A second lens disposed along the outer periphery of the first lens,
A scanning microscope characterized in that a diameter of a beam of the observation light is larger than a diameter of a beam of the formed illumination light at an exit pupil of the objective lens. 前記光源は、多光子励起を生じさせる赤外短パルスレーザ光源であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。 The scanning light source according to any one of claims 1 to 3, wherein the light source is an infrared short pulse laser light source that generates multiphoton excitation. 前記観察光は、ピンホールを介さずに、前記検出部に導かれることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。 The observation light, without passing through the pinhole, scanning microscope according to any one of claims 1 to 4, characterized in that guided in the detection unit. 走査型顕微鏡に用いられ、光源から放射された第１の波長の照明光を試料に照射し、前記試料から出射する第２の波長の観察光を集光する対物レンズユニットであって、
対物レンズと、
前記第１の波長の照明光を遮断し、前記第２の波長の観察光を透過する輪帯状のフィルタであって、前記対物レンズの射出瞳を通過する前記照明光の光束径を、前記対物レンズの開口数の光束の径よりも小さくするフィルタと、を有することを特徴とする対物レンズユニット。 An objective lens unit that is used in a scanning microscope, irradiates a sample with illumination light of a first wavelength emitted from a light source, and collects observation light of a second wavelength emitted from the sample,
An objective lens;
An annular filter that blocks the illumination light of the first wavelength and transmits the observation light of the second wavelength, wherein a beam diameter of the illumination light that passes through an exit pupil of the objective lens An objective lens unit comprising: a filter that makes the numerical aperture of the lens smaller than the diameter of the light beam. 前記フィルタは、前記対物レンズの射出瞳と略同一位置に配置されていることを特徴とする請求項６に記載の対物レンズユニット。 The objective lens unit according to claim 6 , wherein the filter is disposed at substantially the same position as an exit pupil of the objective lens. 前記フィルタは、前記射出瞳より標本側に配置される第１フィルタと、
前記射出瞳より前記光源側に配置される第２フィルタと、であることを特徴とする請求項６に記載の対物レンズユニット。 The filter is a first filter disposed on the sample side from the exit pupil;
The objective lens unit according to claim 6 , wherein the objective lens unit is a second filter disposed closer to the light source than the exit pupil. 走査型顕微鏡に用いられ、光源から放射された第１の波長の照明光を試料に照射し、前記試料から出射する第２の波長の観察光を集光する対物レンズユニットであって、
前記照明光が通過する第１レンズと、
前記第１レンズの外周に沿って配置された第２レンズと、を有する対物レンズを有し、
前記対物レンズの射出瞳において、前記観察光の光束径は、成形された前記照明光の光束径よりも大きいことを特徴とする対物レンズユニット。 An objective lens unit that is used in a scanning microscope, irradiates a sample with illumination light of a first wavelength emitted from a light source, and collects observation light of a second wavelength emitted from the sample,
A first lens through which the illumination light passes;
An objective lens having a second lens disposed along an outer periphery of the first lens,
In the exit pupil of the objective lens, the light beam diameter of the observation light is larger than the light beam diameter of the shaped illumination light . 前記光源から放射される第１の波長の照明光を走査する走査ユニットと、
請求項６〜９のいずれか一項に記載の対物レンズユニットと、
前記観察光を検出する検出部と、を有することを特徴とする走査型顕微鏡。 A scanning unit for scanning the illumination light of the first wavelength emitted from said light source,
The objective lens unit according to any one of claims 6 to 9 ,
And a detection unit that detects the observation light.
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