JPH11507514A - 薄膜の化学的、生化学的ならびに生物学的加工方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 粒子を光学的に平坦な表面にコ−ティングした薄膜内の移動に使用した。好ましくは、薄膜コ−ティングが不均一系であり、光捕捉を用いて粒子を薄膜コーティングにある、異なる化学的、生化学的、および／あるいは生物学的操作を行う異なる領域を連続して移動させる。本発明による化学的、生化学的、および／あるいは生物学的操作の例は以下の通りである：オリゴヌクレオチド合成と配列決定、ペプチド合成と配列決定、炭酸化物合成と配列決定、コンビネーショナルライブラリ合成成とスクリ−ニング、（通常、ＳａｎｇｅｒあるいはＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）ＤＮＡ配列決定、あるいは単分子ＤＮＡ配列決定。本発明の１つの実施態様は反応産物を、粒子を薄膜コ−ティングを通過させて残すものである。この様な産物は適当な方法で特定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 薄膜の化学的、生化学的ならびに生物学的加工方法 本出願は、本出願に引用して組み込まれる米国特許出願第０８／４６２，４８ ５号、１９９５年６月５日出願の“薄膜の化学的、生化学的ならびに生物学的加 工法”を含む一部継続出願である。 発明の分野 本出願は薄膜の化学的、生化学的加工方法に関する。本出願は光学捕捉法の様 な装置と用いて微粒子を薄膜に対し移動させる方法を提供する。 発明の背景 光学捕捉法は微粒子をレ−ザ光の様な強く集光された光束の焦点付近に捕捉で きる装置である。粒子は光度勾配に比例する軸勾配力により捕捉固定され、強度 の増加方向に向かう。一般には、単光光捕捉法はおよそ１０μｍからおよそ１０ ｎｍ以下の範囲の大きさの粒子に応用できる。 本明細書に引用して組み込まれる米国特許第４，８９３，８８６号ならびに第 ５，０７９，１６９号は、液体セルあるいは膜内への微粒子の捕捉に応用した光 捕捉法について記載される。この方法では、微粒子をレ−ザ−光内に捕捉し、そ れからセルをレ−ザ−光に対して動かす（Ｃｏｌ．３、’８８６特許の３１−３ ４行）か、レ−ザ−光をセルに対して動かす（Ｃｏｌ．’８８６特許の１８−２ ０行；Ｃｏｌ．２，７１６９特許の３５−４０行）。’８８６特許は光捕捉法を 利用してウイルス、酵母、大腸菌、血液細胞、ならびに細胞の一部といった生物 粒子を扱う方法を記載している。（Ｃｏｌ．４、４５−４９行）。’１６９特許 は光捕捉法を利用して核酸断片を含む”ポリマ−繊維”を扱う方法が記載されて いる（Ｃｏｌ．１，１−１０行）。 多レ−ザ−光を利用した光捕捉が本明細書に引用として組み込まれるＢｕｉｃ ａｎら．，１９８９，ＳＰＩＥ：Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ Ｃ ｙｔｏｍｅｔｒｙ、１０６３：１９０−１９７；Ｔａｓｈｉｒｏら．，１９９３ ， Ｏｐｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３２（１１）：２８１２−２８１７ に記載されている。 この様な技術を用いた市販の光捕捉システム例としては、Ｃｅｌｌ Ｒｏｂｔ ｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏから販売さ れているＬａｓｅｒＴｗｅｅｚｅｒ_TM２０００；Ｓ＋Ｌ ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅ ｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙより販売されているＣｏｍｐａｃｔ Ｐｈｏｔｏｎ ｉｃ Ｔｗｅｅｚｅｒ；ならびにＰ．Ａ．Ｌ．Ｍ．ＢｍｂＨ、Ｗｏｌｆｒａｔｓ ｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙより販売されているＰＡＬＭメ Ｌａｓｅｒ−Ｍｉ ｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｓｙｓｔｅｍがある。 発明の要約 本発明の好適な実施態様では、光捕捉を用いて微粒子を、光学的に平坦な表面 にコ−ティングされた薄膜内を移動させる。好ましくは、コ−ティング薄膜は不 均一であり、光捕捉を用いて微粒子を、異なる化学的、生化学的ならびに／ある いは生物学的事象が生じる薄膜コ−ティングの異なる領域の連続部を移動させる 。本発明に包含される化学的、生物化学的、および／あるいは生物学的事象の例 としては以下のものがある。オリゴヌクレオチド合成と配列決定、ペプチド合成 と配列決定、炭水化物合成と配列決定、組み合わせライブラリ−合成と配列決定 、通常（例えばＳａｎｇｅｒあるいはＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）のＤＮＡ配 列決定、もしくは単分子ＤＮＡ配列決定である。本発明の実施態様では、反応産 物は粒子が薄膜コ−ティングを通過する時に残される。好都合なことに、これら の産物は適当な方法で同定することができる。 図の簡単な説明 本発明のこれら、もしくはその他の目的、特徴および利点は以下の本発明の好 適な実施態様の詳細な記載により、より明確になるだろう。 図１は、通常の光捕捉法の略図である。 図２Ａ−２Ｈは、本発明実施に使用した光捕捉法を示す概略図である。 図３Ａ−３Ｃは、本発明の実施に使用する薄膜コ−ティングと試薬の位置を示 す概略図である。 図４Ａ−４Ｅは、本発明の好適な実施態様の概略図であり、そして 図５は、本発明の実施に使用する好適な蛍光システムの概略図である。 本発明の好適な実施態様の詳細な説明 ’１６９特許よりの複写である図１は、本発明の実施に使用するタイプの通常 の光捕捉１０を示す。本捕捉には、微粒子を操作する場所である液体セルを含む チャンバ−１４を有する改良された蛍光顕微鏡１２を含む。チャンバ−は通常の 顕微鏡ステージ１６に取り付けられており、顕微鏡の軸の垂直面を直角に、また 光軸にそって動くことができる。 光捕捉は強収斂対物レンズ４８によりチャンバ−１４に焦点を結ぶレ−ザ−２ ２から発射されたレ−ザ−光によって形成される。代表的なレ−ザ−は、アルゴ ンイオンレ−ザ−、ダイオ−ドレ−ザ−、あるいはＮｄＹＡＧレ−ザ−である。 レンズ４８は開口数が０．８以上であり、好ましくは１．２以上である。好まし くは、レンズ４８は液浸タイプであり、レンズ４８とチャンバ−１４のカバ−と の間の油滴はレンズならびにカバ−の屈折率とほぼ同じであり、これによって表 面での光の損失を最小にする。 チャンバ−１４の光捕捉位置は、フラットフォ−ム２４をＸあるいはＹ方向に 動かすことにより可動できる。あるいは、ステ−ジ１６を光捕捉に対して動かす ことができる。 図１の装置は、さらに画像増感ビデオカメラ６０あるいはその他の電子光学画 像装置、アルゴンレ−ザ−もしくは水銀ランプの様な蛍光光源６２、および可視 光源６６を有する。 本光捕捉についての詳細は’１６９特許に記載されている。本捕捉に似たもの は’８６６特許の図１にも記載されている。 本発明の実施に利用できる光捕捉装置のいくつかを図２Ａ−２Ｈに示す。図２ Ａ−２Ｅの各図は対物レンズ１３０、光線１３２、基盤１３４、薄液膜１３６と 捕捉された微粒子１３２を示している。図２Ａと２Ｂでは、光線１３２が基盤１ ３４を経由して、粒子を捕捉する薄膜１３６へと対物レンズ１３０により指向さ れる。これらの図では、屈折率適合油浸オイル１４０が対物レンズと空気、なら びに空気と基盤の間の干渉により生じる光損失を最小にしている。図２Ａでは、 薄膜が基盤の下面上にコ−トされており、図２Ｂでは薄膜は基盤の上面を覆って いる。自明なことであるが、図２Ａと２Ｂでは基盤は光線に対し透過性がなくて はならない。 図２Ｃと２Ｄでは、光線は外面側から薄膜上に作用する。この場合、油浸オイ ルは使用せず、基盤が光線に対し透過性がある必要もない。しかし、’１６９と ’８８６特許の光捕捉の様な方法を用いて、観察者が薄膜を見るためには、基盤 は可視光に対し透過性でなければならない。 図２Ｅは図２Ａに似ているが、薄膜が基盤１３４と１４４に挟まれている例を 示している。 本発明はまた複数の光捕捉を用いて実施できる。この配置は図２Ｆ、２Ｇおよ び２Ｈに示されている。３種類のこの様な配置が図２Ｆ、２Ｇならびに２Ｈに描 かれている。それぞれの図には第１対物レンズ１５０、第１光線１５２，基盤１ ５４、薄液層１５６、捕捉された粒子１５８、第２対物レンズ１６０および第２ 光線１６２が描かれている。これらの要素のそれぞれは図２Ａ−２Ｅの対応する 要素に近似している。図２Ｆは薄膜が基盤の下面をコ−トしている例を示してお り、図２Ｇは薄膜が基盤の上面を覆っている例を示している。図２Ｈは薄膜が２ つの基盤１５４、１６４に挟まれている例を示している。対物レンズが薄膜の反 対側の基盤にある場合に、屈折率が一致した油浸オイルを対物レンズに利用する こともできる。 好ましくは、開口数の大きな対物レンズを使用して光捕捉ができる程度に基盤 は薄く（例えば標準的な顕微鏡カバ−ガラスの典型的な厚さの範囲である１３０ −２５０μｍ）また、光学的に平坦である。対物レンズが薄膜からみて基盤の反 対側にある場合には、基盤は極めて捕捉光の波長（例えば、１０６４ｎｍの赤外 光）に対して透過性でなければならない。蛍光を使用する場合には、基盤は捕捉 した粒子に蛍光を励起させる光の波長にも、また放出される蛍光の波長のいずれ か、もしくはその両方に対して透過性でなければならない。基盤はまた内部（内 部色）ならびに表面（例えば、蛍光色素汚染物）にバックグランド蛍光があって はいけない。好ましい材料は融合シリカあるいは水晶であり、顕微鏡カバ−グラ スあるいは薄くしたＨＯＹＡ Ｔ−４０４０水晶ウエハ−（Ｈｏｙａ Ｅｌｅｃ ｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｏｏｄｃｌｉｆｆ Ｌａｋｅ，Ｎ ｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）である。 本発明の実施において、薄膜コ−ティングは水性フィルムあるいは有機液体フ ィルムのいずれでもよく、フィルム内で行う化学的、生化学的、生物学的反応の 種類に応じて決める。酵素反応は多くの場合その酵素に適合する緩衝作用のある 水相フィルム内で行われるのに対し、オリゴヌクレオチド合成の様な有機合成反 応は多くの場合無水有機フィルム内で行われる。フィルムの厚さは多くの場合光 捕捉によ操作される粒子の直径にほぼ同じである。フィルムは裏打ちする固形基 盤の表面に沿った粒子の移動が可能な、十分な厚さを有していなければならない 。液層フィルムは２枚の基盤に挟まれるか、１個の基盤上の表面フィルムとして コ−トされ、その結果薄膜の自由インタ−フェイスを作っている。後者の場合、 基盤をコ−トする薄膜は“湿潤チャンバ−”の一側を形成し、該チャンバーは相 対湿度を調節し、あるいはフィルム形成材料の蒸気圧を調節してフィルムの不必 要な蒸発を防ぎ、フィルムの厚さを調整している。捕捉を形成する光線は、自由 表面あるいは基盤側から薄膜上に入射する。 不均一水相表面フィルムを基盤上に形成するため、それぞれ単独もしくは組み 合わせて利用できる幾つか異なる方法がある。一例は、光学的に平坦な基盤をス ピンコ−ティング、ドクタ−ブレーディング、あるいは単純な浸潤法を含む当業 者公知の方法によって薄膜でコ−トできる。マイクロピペットを、手もしくは自 動的に単細胞マイクロインジェクションに使用する様なマイクロリットル以下の 用量を扱うことができるマイクロピペットを含む方法や、当業者公知のインクジ ェットプリンティング技術に基づく様々な方法を使用し、前もって作成した薄膜 内に様々な試薬を導入することができる。あるいは、試薬は微細な針を試薬液内 に浸し、それから試薬液で湿った針の先を薄膜に接触させてフィルムに移すこと ができる。試薬は多くの場合顕微鏡レベルの大きさであるが、滴下方法や試薬特 性によっては１ｍｍ₂以上の広さをカバ−できる。試薬には、フィルム内での広 がりを最小にするために様々な成分を含ませることができる。この様な成分には グリセロ−ルあるいはポリマ−の様な粘度を増加する成分、あるいは薄膜内の試 薬の混和性と分配指数を調節するための成分がある。様々な成分を、例えば液滴 の様な形で十分な空間と一時的な分離を有する薄膜内に滴下し、必要な反応段階 を終了するのに必要な時間不必要な試薬の広がりや／あるいは混合を阻止する。 本書に於ける薄膜上の試薬含有”滴”とは、膜上に存在する滴は、一実施態様 でありこれに限定されるものでは無いが、局所化した試薬が濃縮されることは明 らかであるので”局所の試薬濃縮体”と同義であると考えられる。 本発明の１つの態様は図１の様な光捕捉を用いて不均一な薄液膜コ−ティング 域内に粒子を捕捉し、粒子を異なる化学的、生化学的また／あるいは生物学的事 象が生じている連続する薄膜コ−ティングの別の領域を通過させることである。 例えば、図３Ａに示すように、薄液膜コ−ティング１００を上から見ると、滴の 並び１１２、１１４，１１６，１１８が薄膜コ−ティング１００上にある。各滴 には異なる化学的、あるいは生化学的もしくは異なる生物学的成分が含まれてい る。光捕捉を利用して、粒子を滴１１２内に選択的に置いて、それから連続して 矢印１２０が示すように薄膜コ−ティング１００上の滴１１４、滴１１６、滴１ １８と通過させる。各滴では幾つかの化学的、生化学的あるいは生物学的事象が 起き、その結果滴１１８の中に所望の産物が生じる。 図３Ｂならびに３Ｃの側面図に示す様に試薬滴の設置と分離を行うために幾つ かの特徴を有するウエル１０２、１０４の様な構造を基盤に形成することもでき る。この様な特徴はリトグラフィ−やエッチング、印刷あるいはモルディング、 もしくはマイクロマシ−ニングの様な各種の方法で作成できる。この様な前もっ て加工された基盤を上記の様にして薄膜で覆い、それから様々な試料ウエル、微 小溝、あるいはマイクロチャンバ−を適当な試薬と一緒に薄膜コ−チング内に作 成するか、試薬チャンバ−をまず作成して、それから薄膜コ−ティングを行うこ とができる。試薬には様々な成分が含まれており、その密度を薄膜の密度より高 くし、その結果試薬が基盤の窪みに収まりフィルムと置き換わるようになる。こ の作業は電気泳動ゲルのウエルに試薬を載せるときのやり方に似ている。指示色 素をこれらの試薬に加えて、試薬の添加を目に見えるようにすることがよく行わ れている。この様な色素を使用する場合には試薬と適合した色素である必要があ り、試薬の中でいかなる反応も起きないことが必要である。粒子は光捕捉を利用 して垂直方向に動かして試薬溜まりに誘導することができ、それから薄膜上に連 続し隣り合って置かれている試薬位置に水平方向に移動するために粒子を垂直に 降ろす。光捕捉を図３Ｂのウエル１０２や図３Ｃの１０４のウエルの様な前加工 した基盤で行う場合（即ち、光学的に平坦でない）、この様な加工部分は捕捉光 線に干渉しないように設計された形状を有することが必要である。例えば、これ ら表面加工内に垂直の変化が突然現れる様な設計は避けるべきである。光捕捉を 薄膜側から行う場合には、この様な構造は図３Ｃに示すようにあまり重要でない 。 その他の不均一な薄液膜の効果的な作成方法および／もしくは不均一な基盤表 面化学処理方法に自己集合分子とナノケミストリ−がある（１９９２）、Ａｂｂ ｏｔら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：１５３９；（１９９１）、Ｗｈｉｔｅｓｉｄ ｅｓら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１３１２、本明細書に引用して組み込まれる 。これらの方法は使用する試薬の組み合わせの範囲を広げる。 別の実施様態では、上下に貯留ラインを有するカバ−プレ−ト（例えば薄い、 顕微鏡用の極めて平らなガラスあるいは融合シリコン薄膜より作られる）と、該 ２枚のプレ−トの間の空間を複数の反応部分に分ける構造（電気プレ−トゴ−ル ドあるいはその他の金属、もしくはスピン−コ−トフォトレジストの様なポリマ −材料よりできている）を含むカ−トリッジを使用する。これらの反応域は相互 に小さなチャネルで連結されているだけで、一つの領域から別の領域に材料物質 が拡散することを制限している。 本発明は多くの一般的な化学的、生化学的作業に有用であり、マイクロリット ルレベルの反応を、複雑で困難なこのレベルの作業の計測システムを用いること なく簡便に行うことができる方法を提供する。 例えば、オリゴヌクレオチド合成は短い、単鎖ＤＮＡ分子を合成してハイブリ ダイゼ−ションプロ−ブやＤＮＡ配列決定用プライマ−として利用するのに用い られる。現在の方法は、しばしば合成スケ−ル上の制約より生産が大過剰になる ことがある。この様な合成上のコスト問題から、現在のところダイレクトＤＮＡ 配列決定の様な作業を利用することが制限されている。本発明では、オリゴヌク レオチド合成を所望の配列の最初のヌクレオチドを結合した市販のビ−ズ一粒子 上で実施することができる。この薄膜形式のなかで通常のフォスフォルアミド試 薬を利用することでその後の反応を連続して行うことができる。 特に、一連の滴を薄膜上に置いて、１滴には所望の配列の最初の反応性ヌクレ オチドが結合されたビ−ズが含まれ、その他の滴にはそれぞれ異なるヌクレオチ ドと一緒に同一の反応性ヌクレオチド分子が多量に含まれている。結合試薬阻止 試薬、結合試薬もしくは洗浄試薬も異なる滴内に置くことができる。それから単 一粒子を光捕捉法でビ−ズを含む滴から選び出すことができる。光捕捉を薄膜に 対して動かすことにより、捕捉されたビ−ズを薄膜内を移動させて、すでにビ− ズに結合しているヌクレオチドに結合させたいヌクレオチドを含む滴に入れる。 この捕捉ビ−ズを次に結合させるヌクレオチドの滴に動かす作業を所望のヌクレ オチド配列が得られるまで何度も繰り返す。 合成が終了したら、オリゴヌクレオチドはビ−ズから切り出して、これもまた ビ−ズ表面上で実施できるＳａｎｇｅｒのＤＮＡ配列決定の固相法の薄膜フォ− マットに直接持ち込むことができる。それから最終配列決定反応産物を同一の基 盤上に作成されたキャピラリ−電気泳動システムのサンプルチャンバ−内に遊離 することができる。この様な方法はまたエンコ−ドコンビネ−ショナルライブラ リ−からのオリゴヌクレオチドタッグの配列決定にも利用できる（本明細書に引 用して組み込まれる、Ｂｒｅｎｎｅｒ＆Ｌｅｒｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５３８１−５３８３（１９９２））。 同様に、Ｅｄｍａｎｎのペプチド配列決定反応も単一ビ−ズからの直接配列決 定のための本薄膜フォ−マットに応用できる。この様な方法は特に天然蛋白の配 列決定を行うために必要な蛋白量を少なくする上で重要であり、またコンビネ− ショナルライブラリ−からのペプチドタッグの配列決定に必要な量を少なくする 上でも重要である（本明細書に引用して組み込まれる、Ｌａｍら．，Ｎａｔｕｒ ｅ３５４：８２−８４（１９９１）；Ｌａｍら．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅ ｄｉｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ３（３）：４１９−４２４ （１９９３））。 Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｆｕｒｋａら．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔ ａｉｎ Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１））、Ｐｅｐｔｏｉｄｓ（Ｓ Ｉｍｏｎら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９３６７ −９３７１（１９９２），Ｂａｒｔｌｅｔｔら．ＷＯ９１／１９７３５）、ｍａ ｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ｓｃｈｒｏｂｅｒら．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ１８（４）；６５２−６６０（１９９５））、ならびにその他のコンビネ−シ ョナルライブラリ−（例えば．，Ｅｌｌｍａｎ，米国特許第５，２８８，５１４ 号；ＢｕｎｉｎとＥｌｌｍａｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４；１０９ ９７−１０９９８（１９９２））の合成、全て本明細書に引用して組み込まれる 、も本発明の薄膜フォ−マットが適用できる。いずれの化学合成あるいは生化学 合成もしくは配列決定反応も、本発明を利用することで固相支持体上、たとえば ビ−ズ上で実施でき、単一ビ−ズのスケ−ルで実施できる。 反応産物をモニタ−あるいは、例えば、結合定数の測定などを行う場合、Ｒｉ ｇｌｅｒの蛍光関連分光法を利用して薄膜内に含まれるサブマイクロリットルレ ベルのサンプルを解析できる（本明細書に引用して組み込まれるＥｉｇｅｎとＲ ｉｇｌｅｒ，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１ ：５７４０−５７４７））。 本発明はまた多くの不要の物質の中から所望する１物質を分離する工程を含む 生物学的作業にも有用である。例えば、この様な生物学的作業としては：モノク ロ−ナル抗体の産生、ファ−ジディスプレ−ペプチドライブラリ−のスクリ−ニ ング、ならびに核酸クロ−ニングがある。 モノクロ−ナル抗体の産生については、本発明は所望のモノクロ−ナル抗体を 産生している単一細胞を不要の抗体を産生する、あるいは抗体産生していない多 くの細胞の中から選別する作業に利用できる。モノクロ−ナル抗体の産生には、 所望の抗原に特異的に結合できるモノクロ−ナル抗体を作るための所望抗原の選 別が必要である。この様な抗原は蛋白、核酸、多糖類あるいはその他モノクロ− ナル抗体が望まれ、モノクロ−ナル抗体が結合する物質である。本発明の実施態 様では、抗原は光捕捉に捕捉されるのに好適な粒子に結合される。この様な粒子 には例えばラテックスビ−ズがある。 本発明のモノクロ−ナル抗体産生適用例では、第１滴１１２には１つ以上の適 当な粒子に結合された抗原が含まれている。これらの抗原結合粒子の１つを光捕 捉の光線内に捕捉し、薄膜１１０内を移動させ、第２の滴１１４に運ぶ。第２の 滴１１４は様々なモノクロ−ナル抗体産生細胞を含んでおり、その中には該抗原 に特異的なモノクロ−ナル抗体を産生している細胞がある。この様なモノクロ− ナル抗体は当業者公知の方法にて産生することができる。ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌ ｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ ら．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔ ｈｅｒａｐｙ，ｐｐ．７７−９６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．，１９ ８５）参照。 第２の滴１１４内での条件を選び、粒子に結合した抗原を、粒子に結合した抗 原に特異的であるモノクロ−ナル抗体を含むモノクロ−ナル抗体産生細胞と結合 させる。それから光捕捉を用いて抗原結合粒子を結合したモノクロ−ナル抗体産 生細胞と一緒に薄膜１１０を移動させて次の滴１１６に運び、こうして所望のモ ノクロナ−ル抗体産生細胞を不要の細胞から分離する。次に所望のモノクロ−ナ ル抗体産生細胞を滴１１６から回収して、適当な培養条件に移し細胞を増殖させ て所望のモノクロ−ナル抗体を産生する細胞株を樹立する。 同様にして、本発明を用いて所望のペプチドを表現しているファ−ジを大量の 不要なペプチドを発現しているファ−ジからスクリ−ニングすることができる。 結合するペプチドが望まれるリガンドを粒子に結合させる。１つ以上のリガンド 結合粒子を薄膜１１０に第１滴１１２の形で作用させる。光捕捉を用いてリガン ドが結合した単一粒子を光線内に捕捉し薄膜１１０内を移動させて第２の滴１１ ４に運ぶ。第２の滴１１４にはペプチド表現ファ−ジライブラリ−が含まれてい る。ライブラリ−は公知技術により作成できる。Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２ ２８：１３１５−１３１７（１９８５）；Ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚら．，Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：（４３１８−４３２２（１９８８）；Ｐａｒｍｌｅｙ とＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ７３：３０５−３１８（１９８８）；Ｐａｒｍｌｅｙと Ｓｍｉｔｈ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８（１ ９８９）；ＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０ （１９９０）参照。 ペプチド表現ファ−ジライブラリ−にリガンドに特異的に結合できるペプチド を表現するファ−ジが含まれている場合には、このファ−ジはリガンド結合粒子 と一緒に運ばれる。光捕捉を用いてリガンド結合粒子を薄膜１１０内を移動させ 次の滴１１６に運ぶ。滴１１６から所望のファ−ジを回収することができ、好適 な細菌宿主内で増殖させて所望のペプチドの分析ならびに／あるいは精製に利用 できる。 本発明はまた所望の核酸断片をゲノミックあるいはｃＤＮＡライブラリ−の様 な集合体より精製するのにも利用できる。例えば、ゲノミックライブラリ−を作 成する場合、現在の技術では生物の全ＤＮＡを分離し、ついで適当な制限酵素で これを切断することがしばしばある。その後で不要のＤＮＡ断片の中から所望の ＤＮＡ断片を同定し分離する作業を行う。本願記載の光捕捉を用いるとこれら後 者の作業を簡便化あるいは省略することができる。 従来の方法では、プロ−ブ（所望の核酸断片に特異的に結合する核酸断片）が 必要である。プロ−ブを光捕捉による捕捉に好適な粒子に結合させる。１つ以上 のプロ−ブ結合粒子を薄膜１１０上に第１滴１１２として作用させる。それから 光捕捉を利用してプロ−ブ結合粒子を薄膜内を移動させ第２の滴１１４に運ぶ。 第２の滴１１４には生物のＤＮＡを消化する制限酵素が含まれている。第２の滴 １１４の条件を選択してプロ−ブが生物のＤＮＡ断片のいずれかと特異的に結合 できる様にし、プロ−ブ結合粒子と所望のＤＮＡ断片の複合体を形成させる。こ の複合体を光捕捉により薄膜内１１０を移動させて所望の採取と操作ができる別 の滴１１６に運ぶ。 本発明の好適な適用の１つは、１回１塩基単分子ＤＮＡ配列決定である。この 応用法では、粒子はＤＮＡの一端が顕微鏡レベルのビ−ズに結合している粒子で ある。この様な単一ビ−ズと結合されたＤＮＡ分子を光捕捉によりたくさんのビ −ズと結合された鎖を含む薄膜コ−ティング内の滴から選別する。光捕捉を薄膜 コ−ティングに対して移動させ、選別されたビ−ズを薄膜内を移動させて、単一 のエクソヌクレア−ゼがＤＮＡ分子の遊離端に直接結合するエクソヌクレア−ゼ を含む滴に運ぶ。それから光捕捉によりビ−ズを移動させ、ＤＮＡ分子とエクソ ヌクレア−ゼを薄膜コ−ティングの中のエクソヌクレア−ゼ活性化部位に運ぶ。 その結果、エクソヌクレア−ゼがＤＮＡ分子から１回１ヌクレオチドづつ切断し 始める。光捕捉によりエクソヌクレア−ゼがＤＮＡ分子から１ヌクレオチドを切 り出している間にビ−ズ、分子ならびにエクソヌクレア−ゼを薄膜内を移動させ ることで、これらのものをＤＮＡ分子の動きに従って特定される移動路に置いて くる。ＤＮＡ分子は単鎖あるいは二本鎖である。 好適な検出システムで通路を探り、ＤＮＡを検出し配列内のヌクレオチドを同 定する。この様なシステムの例は繰り返し１ヌクレオチドからの蛍光を刺激する パルスレ−ザ−とヌクレオチド毎の時間差分解蛍光分光を検出する光学検出シス テムである。 本応用例は図４Ａ−４Ｅに詳細に示している。滴２１０と２１２は図示するた めに実物より大きく描かれており、また通常は博膜の厚さと同じ厚さである。 単一ヌクレオチドの同定では、単一ヌクレオチドの蛍光を励起して／あるいは 単一のヌクレオチドの放射光を基盤を通して検出し、基盤はヌクレオチドを励起 し検出するためにそれぞれ紫外光（２４０−３００ｎｍ）ならび／あるいは近紫 外光（３００−４５０ｎｍ）に対して透過性である。１つ以上の蛍光ヌクレオチ ド類似体と／あるいは色素標識ヌクレオチドを取り扱う各種の方法については、 基盤は対応する励起光と放射光の波長域に対して高い透過性を有している必要が ある。 ＤＮＡ分子を基盤表面を横切らせるために、最小の厚さの水相膜を基盤上に提 供する必要がある。ＤＮＡを結合させたビ−ズは直径が０．２−１．０μｍであ ることから、相応の厚さの膜でなければならない。液膜はエクソヌクレア−ゼに 使用可能な純粋な緩衝液といった単純なものでよく、あるいはエクソヌクレア− ゼに適合した膜粘度を上げる様々な成分を含んでいてもよい（例えばグリセロ− ル）。膜は遊離状態あるいは共有結合により基盤と結合したポリマ−あるいはプ レポリマ−を含んでいてもよい（Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｕｒ ａｐｈｙ ３４７：１９１−１９８（１９８５）本明細書に引用して組み込まれ る）。この様に膜の粘度が高くなると切り出された１ヌクレオチドの拡散が遅く なる（本明細書に引用して組み込まれる ＰｒａｔｔとＫｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｐｈ ｙｓ．Ｃｈｅｍ．９７：１０２５４−１０２５５（１９９３））。１ヌクレオチ ドが存在している間、表面膜からの蒸発を防ぐために、図２Ｅあるいは２Ｈに示 す様に適当は距離をおいた２つの基盤で膜を挟むことができる。この様な場合１ ヌクレオチドを検出するのには近視野装置が適しているが、遠視野装置も応用で きる。あるいは、薄膜は膜が接する気相の相対湿度を調節して蒸発あるいは濃縮 を防ぐことで、自由面をもつこともできる。自由面を持ったこのような膜は、本 明細書に引用して組み込まれる（ＢｅｔｚｉｇとＣｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２６２：１４２２−１４２５（１９９３））のスピンコ−ティングの 様な公知技術により基盤に作成することができる。 大きな１分子ＤＮＡは、本書参考資料もしくは当業者公知の様々な方法でビ− ズに結合される：係属出願米国出願番号第０８／３７６／７６１号；Ｐｅｒｋｉ ｎｓら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：８１９−８２２（１９９４ａ）、Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ２６４：８２２−８２５（１９９４ｂ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：８ ３−８７（１９９５）。 ＤＮＡサンプルをビ−ズに結合する最も簡単な方法は光捕捉用の対物レンズが 透明な基盤の下に位置し、薄膜が図２Ｂの様に基盤の上面にくる倒立顕微鏡を利 用するものである。図４Ａに示すように、ＤＮＡ２２０が結合したビ−ズ２２２ を含むマイクロリットルあるいはマイクロリットル以下の滴２１０を基盤２３４ 上の薄膜２３８上に配置する。単一のビ−ズ＋ＤＮＡ分子２３８は対物レンズ２ ３０から出る捕捉光２３２内に捕捉され目で見ながら選別される。図４Ｂに示す ように、それから単一ビ−ズ＋ＤＮＡ分子は基盤と対物レンズを動かした結果薄 膜を通過し、滴の外に運ばれた結果となる。選択されなかったビ−ズとＤＮＡは 滴の中に残ったままである。同様の方法をその他、図３Ａ−３Ｈの組み合わせに ついても応用できる。 図４Ｂに示すように、薄膜２３６上に適当濃度のエクソヌクレア−ゼ２２４を 含む第２のマイクロリットルあるいはマイクロリットル以下の滴２１２をビ−ズ とＤＮＡを含む滴２１０の直ぐ隣に置く。図４Ｃに示すように、単一の選択され たビ−ズ＋ＤＮＡ複合体をこの第２の滴を通過させて単一のエクソヌクレア−ゼ 分子２２４をＤＮＡの自由末端に結合させる。図４Ｄに示すように、つぎにビ− ズ＋ＤＮＡ＋エクソヌクレア−ゼ複合体を薄膜内のエクソヌクレア−ゼが作用す る箇所である表面を横断させる。図４Ｅに示すように、その結果ヌクレオチド２ ７０の配列が薄膜２３６内に残り、ビ−ズ−ＤＮＡ−エクソヌクレア−ゼ複合体 はフィルムを通過する。 単一ビ−ズ＋ＤＮＡ＋エクソヌクレア−ゼ複合体は、単一の切り出したヌクレ オチドの残りが絡まらない様なパタ−ンであれば、基盤表面上の薄膜内をどの様 な順序で移動しても良い。発明者の’７６１出願の図１３に記載した様な、例え ば円盤型の基盤表面上に放射螺旋状に移動してもよく、フォノグラフレコ−ドの 手袋型でもよく、ラスタ−スキャンの様に前進−後退パタ−ンでもよい。最も簡 単な移動は、複合体を一方向に直線上に薄膜内を通過するものである。ポリマ− を含む薄膜については、単一ＤＮＡ複合体がポリマ−マトリックスをのろのろと 移動する（すなわち、ＤＮＡ分子のエクソヌクレア−ゼ結合端はＤＮＡのビ−ズ 結合端の作用により通過に大きな制約を受ける）、前述のＰｅｒｋｉｎｓら．， １９９４ａ。 個々に切り出されたヌクレオチドが表面を２次元的に拡散することを最小にし 、切り出されたヌクレオチドが順番に絡み合うことなく近接して配置できること が望まれる（ＰｒａｔｔとＫｅｌｌｅｒ，先述）。拡散を最小にする方法は幾つ かある。最も簡単な方法の一つは、先述したように液表面膜の粘度を上げること であり、またエクソヌクレア−ゼの回転を適当に制御（例えば温度を変える）し て放出された１ヌクレオチドの間隔を調節する方法であり、そして薄膜を通る１ ＤＮＡ分子の移動速度を変える方法である。さらに、ポリマ−をフォトクロスリ ンクさせるが放出された１ヌクレオチドをフォトブリ−チしない第二の焦点レ− ザ−光で通路を追うことによって、表面の１ヌクレオチドを含むＤＮＡの跡にポ リマ−膜をクロスリンクさせることもできる。ポリマ−を正しく選択することで 、クロスリンキング時間を伸長したＤＮＡ鎖を素早く通過できるのに十分な時間 になる様調節すれば、近赤外光捕捉光線を利用してフォトリンクすることも可能 である。基質の表面化学を修飾してヌクレオチド１リン酸に強い結合力を導入す ることも可能であり、例えば負に荷電したリン酸基を静電的相互作用により修飾 することが可能である（本明細書に引用して組み込まれるＭａｔｈｅｊａとＤｅ ｇｅｎｓ，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏ ｆ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ”，Ｆｏｒｔｓｃｈｒｉｔｔｅ Ｄｅｒ Ｅｖｏｌｕｔ ｉｏｎｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，Ｂａｎｄ Ｖ、Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９７１，ｐｐ．１８０）。ヌクレオチ ド１リン酸を結合させるために使用されるアニオン交換試薬は利用できるだろう 。あるいは、異なるヌクレオチド１リン酸に特異的に結合できる、蛋白もしくは 有機および無機複合体成分（本明細書に引用して組み込まれる、Ｋｙｏｇｏｋｕ 、ＬｏｒｄとＲｉｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５７ ：２５０−２５７（１９６７）；Ｋｙｏｇｏｋｕ、ＬｏｒｄとＲｉｃｈ、Ｎａｔ ｕｒｅ ２１８；６９−７２（１９６８）；ＫｉｍとＲｉｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０：４０２−４０８（１９６８）；Ｔｅｒ ｒｏｎとＭｏｒｅｎｏ，Ｉｎｏｒｇａｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ５６： Ｌ５７−Ｌ５９（１９８１））を基質表面に結合させて放出されたモノヌクレオ チドを捕捉するために利用することができる。基質上への自己集合単層も、同様 のヌクレオチド結合能を提供する。この様な自己集合単層体が有する方向性は、 結合したヌクレオチドに方向性を持たせるのに利用できる。 切り出された単ヌクレオチドの拡散は、基盤の温度を低温域まで下げて（およ そ７７°Ｋ）硬い親水性ガラスマトリックスを薄膜に形成させて、これで放出さ れた個々のヌクレオチドを捕捉することで、さらに小さくすることができる。詳 細は本発明者係属出願の’７６１出願に示した。低温と高粘着マトリックスはさ らに光安定性とヌクレオチドの蛍光の分子収率を増して、その検出と同定を容易 にする。薄膜基盤を冷却する装置には本明細書に引用して組み込まれるＧｒｏｂ ｅｒら．，Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．６５（３）：６２６−６３１（１ ９９４）に似た設計の装置や、モデルＣＦ２１０２ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｃ ｒｙｏｓｔａｔ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，Ｍ ａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の様な市販の装置を利用できる。図４Ｅではクライ オスタット２８０を利用して基盤を低温域温度まで冷却している。 切り出されたヌクレオチドを分離できた場合、このヌクレオチドを、本発明者 係属出願の’７６１出願ならびに本明細書に引用して組み込まれる最近発表され たＴｅｌｌｉｎｇｈｕｉｓｅｎら．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６（１）：６４− ７２（１９９４）とＮｉｅら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１０１８−１０２１ （１９９４）らによって詳細記載された通常の回折装置で検出することができる 。ヌクレオチドが絡まらずに近接して連続して配置するために固定されている場 合、近接スキャニング光学顕微鏡を利用することができる。しかし、この場合ヌ クレオチドは薄膜表面上に固定しなければならないので、スキャニングプロ−ブ チップはプロ−ブ開口部の直径の３倍以内に接近することができる。そのためヌ クレオチド検出前に、基盤表面からヌクレオチドの消失がない様な方法で薄膜の 一部あるいは全てを蒸発させるか昇華させる必要がある。距離がある場合には、 遠視野光学装置を利用できる。近視野光学装置を用いた表面上の単分子蛍光顕微 鏡に最近の例にはＢｅｔｚｉｇとＣｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、前出；Ａｍｂｒｏｓｅ ら．，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．７２（１）：１６０−１６３（１９９４ａ ）；Ｔｒａｔｕｍら．，Ｎａｔｕｒｅ ３６９：４０−４２（１９９４）；Ｘｉ ｅとＤｕｎｎ，Ｓｃｉｅｃｎｅ ２６５：３６１−３６４（１９９４）；ならび にＡｍｂｒｏｓｅら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：３６４−３６７（１９９４ｂ ）、本明細書に引用して組み込まれる。 図４Ｅには、レ−ザ−システム３００、検出器３５０とコンピュ−タ４００を 含む蛍光顕微鏡システムが描かれている。本システムはさらに詳しく図５に記載 されているが、これは本発明者の’７６１出願の図９に対応する。簡単に説明す ると、本システムは時間分解シグナルフォトンカウンティングシステムで、レ− ザ−光３０５が繰り返し各ヌクレオチド２７０を蛍光励起し、検出器３５０が各 レ−ザ−パルス後のシグナル蛍光フォトンの到達時間の遅れを測定する。この様 にして、各ヌクレオチドについての時間を何度も測定することで、１蛍光フォト ンについての大量の統計サンプルを集めることができ、このデ−タよりヌクレオ チドの蛍光の半減期を決めることができる。半減期の測定はコンピュ−タ４００ を利用して前もって測定しておいた既知ヌクレオチドの半減期と比較して、最も よくあうものを探しだし、ヌクレオチドを同定する。 レ−ザ−光３０５は付属の放射光源、好ましくはモ−ド固定型レ−ザ−３１０ により作り出される。好適な実施態様では、レ−ザ−３１０はアルゴンイオンポ ンプ、出力は３重周波数でありフェムト−あるいはピコ秒のパルスを８１．５Ｍ Ｈｚの固定周波数で２４０−３００ｎｍの波長域で作り出すモ−ド固定型Ｔｉ： シャフィレレ−ザ−からなる。好適なアルゴンならびにモ−ド固定型Ｔｉ：シャ フィレレ−ザ−はＳｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ社のＭｏｅｄｌｓ ２０８０ −１５と３９６０である。モ−ド固定型Ｔｉ：シャフィレレ−ザ−から第二およ び第三同調出力を作り出す好適な装置は、Ｎｏｒｔｈｖａｌｅ、Ｎｅｗ Ｊｅｒ ｓｅｙのＩＮＲＡＤ社より販売されているＭｏｅｄｌ ５−０５０周波数トリプ ラ−である。 本発明の別の実施態様は蛍光ヌクレオチド類似体、色素標識ヌクレオチド、あ るいは天然ヌクレオチド、蛍光ヌクレオチド類似体、および／あるいは色素標識 ヌクレオチドの様々な組み合わせをＤＮＡに取り込ませて配列決定するものであ り、使用するヌクレオチドのタイプに最適の励起波長を提供するためには、前記 のレ−ザ−励起光源については改良が必要であることは、当業者にとっては明ら かである。蛍光ヌクレオチド類似体と色素標識ヌクレオチドは多くの場合、天然 ヌクレオチドと異なり近紫外光あるいは可視光で最大励起される。一般には、こ の波長の光は深紫外光よりも現行のレ−ザ−技術で簡単に作り出すことができる 。最も複雑な条件では、４種類のヌクレオチドを至適に励起するための４種類の レ−ザ−光源が必要となる。 個々のヌクレオチドの完全な時間分解放射スペクトラムは、検出器３５０内の ストリ−クカメラにより記録される。この配置により蛍光強度対時間および波長 の３−Ｄカウンタ−を測定できる。ヌクレオチド２７０がレ−ザ−光３０５に照 射された時点で、シグナル３３７が作られて、レ−ザ−パルスの発生を示す。例 えば、シグナル３３７は光線スプリッタ−３１５をレ−ザ−光３０５の光路の間 に挿入して補助レ−ザ−光３０７を遮断して発生させる。光線３０７はフォトダ イオ−ド３２０に入射され、これは出力信号を発生しディスクリミネイタ−３２ ２に伝わる。ディスクリミネイタ−３２２は、フォトダイオ−ド３２０への入射 光電子数が閾値を越えた時にだけレ−ザ−３１０からの励起パルスの発生を知ら せる出力シグナル３３７を発生するように設定されていて、誤検出を防いでいる 。 ヌクレオチドからの蛍光放射３３０は、高開口度レンズ３４５で集められて、 フィルタ−を通して回折スペクトラグラフ３７０に導かれるか、あるいは他のプ リズムあるいはモノクロメ−タの様な分散エレメントに導入され、フォトキャソ −ド３７５に集められる。プリズム３７５は入射フォトンを分散して、その波長 によってＸ軸にそってフォトンの光路を分ける。この様にしてヌクレオチドから の蛍光放射光バンド以外の波長は除外される。 シグナル３３７を用いてモ−ドが固定されたレ−ザ−の周波数をサイン型電圧 発生器３３８に同調させて、１つは図５の３８２ＡとＢに示す電極対と、これに 対して直角に配置されたをもう一対の電極対に対し瞬間、直角に横切る高圧を発 生させる。好適には、瞬圧の頻度は続いておこるレ−ザ−パルスの間に１回であ る。１蛍光フォトンがフォトンキャソ−ド３７５に当たった時放射される１シグ ナルフォトンは突出したグリッド３７７によりストリ−クチュ−ブ内部の高真空 下に加速され、レ−ザ−パルス後のシグナルフォトンの放射時間の関数である特 異電場を通過する。その結果、１フォトンエレクトロンはマイクロチャネルプレ −ト３８５をその放出時間に比例したＹ軸に沿った位置に衝突する。従って、フ ォトエレクトロンのマイクロチャネルプレ−ト３８５への入射の座標により各検 出フォトンの波長と遅延時間が分かる。この座標位置をデジタイザ３９０でデジ タル化してコンピュ−タ４００に伝える。 励起域にヌクレオチドが残っているかぎり、ヌクレオチドは繰り返し励起、放 射を行う。検出された各蛍光フォトンについて、検出時間をＹ軸にそって座標転 換し波長をＸ軸にそって座標転換する。この座標分布をデジタイザ３９０でデジ タル化してコンピュ−タ４００に提供する。その結果、放射後の適当な間隔と適 当は波長で検出されたフォトンの数を記録した検出フォトンのヒストグラムが得 られる。４つのヌクレオチド毎にこのヒストグラムを特徴を有している。 従って、検出されたヌクレオチドについて作成されたヒストグラムを前もって ４種類のヌクレオチドについて作成しておいた対照ヒストグラムと比較すること により、各ヌクレオチドを特定することができる。その為には、前もって作成し た対照ヒストグラムをコンピュ−タ４００に記録しておく；そして検出されたヌ クレオチドのヒストグラムを作成して、コンピュ−タ４００を利用して記録ヒス トグラムと比較する。 例えば、スペクトログラフ３７０はＣｈｒｏｍｅｘ ２５０ｉ−ＦＸとストリ −クカメラはＭｏｄｅｌ Ｃ１５８７で、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉ ｃｓｏｆ Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙより得られる。デ ジタイザはＣＣＤカメラであり、コンピュ−タはＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｑｕａｄ ｒａ ４８０Ａ／Ｖである。 さらなる図５の装置の詳細は、本明細書に引用して組み込まれる’７６１出願 の図９の考察に記されている。 前記より明らかなように、本発明は様々に応用できる。様々なタイプの光捕捉 を利用して、光捕捉と基盤との間の相対運動を作り出すことができ、また様々な 運動を追跡することができる。基盤が動き、捕捉体が動かなくても、捕捉体が動 き基盤が静止していても違いは無い。本発明は単一の光捕捉を例に記載されてい るが、より大きな出力を用いて複数の位置で捕捉することも可能である。 多点スキャニングレ−ザ−捕捉（Ｍｉｓａｗａら．，Ｍａｃｒｏｍｏｋｅｃｕ ｌｅｓ ２６：２８２−２８６（１９９３）、本明細書に引用して組み込まれる ）を用いて複数の単一分子複合体を同時に動かし処理能力を上げることができる 。捕捉は単一焦点レ−ザ−光を対物面に一定速度とパタ−ンでコンピュ−タ制御 スキャニングして形成する。連続するスキャンが有意に短い場合には複数の粒子 を同時に捕捉できる。各連続するスキャニングパタ−ンの違いが僅な場合には、 粒子を独立に動かすことができる。この様な複数位置光捕捉が可能な市販品があ る（たとえばＭｕｌｔｉ Ｂｅａｍ Ｐｈｏｔｏｎｉｃ ＴｗｅｅｚｅｒｓIII 、Ｓ＋ＬＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｔｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。こ の様な近接して延びるＤＮＡ分子をこの様な多点捕捉により分離して、各鎖より 切り離されたヌクレオチドが核酸により絡まることを防ぐことができる。 別の方法によっても粒子を薄膜内を移動させて１つの滴から別の滴に運ぶこと ができる。例えば、磁性粒子あるいは鉄などの様な磁石により結合するコアを持 つ粒子を利用して、光捕捉の代わりに磁場を使って粒子を薄膜内で運動させる方 法がある。 図４Ａ−４Ｅに関連する本発明の実施態様では、天然ヌクレオチドのそれぞれ について正確に検出し識別するための作業パラメ−タを提供した。理想的な条件 が得られない多くのこれに代わる実施態様がある（たとえば配列決定速度を上げ たり、装置を簡単にしたりする）ことは認められる。しかし、様々な図４Ａ−４ Ｅの実施態様を基本とした応用が可能であり、実際の配列決定も可能である。 一般には、図４Ａ−４Ｅの実施態様の実施において扱えるヌクレオチドには３ つのカテゴリ−がある。好ましいのは天然のヌクレオチドであるが、これを利用 するとゲノミックの配列を直接決定できるだけでなく、配列決定時に合成鋳型を 使用し非天然のヌクレオチドを取り扱つかった時に問題となる誤り、時間、出費 などの原因を取り除かれることができる。２番目のヌクレオチド分類は蛍光ヌク レオチドであり、３番目の分類は蛍光色素をヌクレオチドにＪｅｔｔら．，の開 発したリンカ−を用いて共有結合させたものである（米国特許番号第４，９６２ ，０３７号）。後者２つの例ではまず配列決定するＤＮＡのコピ−を適当なポリ メラゼを利用してヌクレオチドアナログあるいは色素標識したヌクレオチドを取 り込ませて合成する必要がある。さらに、エクソヌクレア−ゼで合成したヌクレ オチド類似体あるいは色素標識ヌクレオチドを含む鋳型を分解する必要がある。 さらに、天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体あるいは色素標識ヌクレオチ ドだけ使用する方法に加えて、これらヌクレオチドの組み合わせで使用する方法 としては以下の４つがある：天然ヌクレオチドとヌクレオチド類似体、天然ヌク レオチドと色素標識ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体と色素標識ヌクレオチド 、と天然ヌクレオチドとヌクレオチド類似体と色素標識ヌクレオチドの組み合わ せである。これら４つの組み合わせのそれぞれの間に、全ての組み合わせが可能 （例えば、３天然と１類似体、２天然と２類似体、１天然と３類似体等）。ヌク レオチドを各種組み合わせることができることは、色素標識ヌクレオチドだけを 利用した場合に経験された問題点の多くを克服する（１９９２，Ｈａｒｄｉｎｇ とＫｅｌｌｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｙ １０：５５ −５７，本明細書に引用して組み込まれる）。 さらに多路スキャニングによって、同じ鎖を複数回配列決定することで配列を 得ることができる可能性がある。各路で装置の操作パラメータを変えることで、 そして／あるいは検出できるヌクレオチドの組み合わせを変えることで、複数の ヌクレオチドに関する情報を得ることができる。この最終配列は、この多路から の情報を組み合わせることにより得ることができる。この方法は相補的ＤＮＡの 配列を利用することでさらに応用範囲を拡大できる。多路配列決定に必要な正確 な組み合わせは以下の状況に依存する：（ａ）ヌクレオチドがその他の３つのヌ クレオチドと区別できるか、（ｂ）ヌクレオチドがプリンあるいはピリミジンの いずれかと認識できるか、（ｃ）ヌクレオチドがヌクレオチドとして検出できる か、（ｄ）ヌクレオチドが全く検出されないか、である。本発明により行われる 配列決定のための検出と識別にこれらの状況が多く組み合わさっていることは当 業者に明らかである。以下に代表して幾つかの一般的例を示すが、これが可能な 組み合わせについて限定するものではない。 例えば、ヌクレオチドの相補対の一方と（例えＡとＣ）、その相補体（すなわ ちＧとＴ）はヌクレオチドとして検出できるが、区別することができない場合、 以下に示すように両相補鎖を配列決定することで完全な鎖を再構築するのに十分 な情報が適用される。この場合にはヌクレオチドが天然でも、類似体でも、色素 標識体でも、その組み合わせでもかまわない。 ５’−ＡＣＧＴＴＣＡＧ−３’ ３’−ＴＧＣＡＡＧＴＣ−５’ ５’−ＡＣＸＸＸＣＡＸ−３’ ３’−ＸＸＣＡＡＸＸＣ−５’ １ヌクレオチドだけが認識でき、その他の３種類のヌクレオチドはヌクレオチ ドとして検出されるだけの場合、組み合わせにより完全な鎖を構築するには、す くなくとも３つ、好ましくは４つの別々の配列が必要である。各別々のパスで異 なったヌクレオチドは、ヌクレオチド含有マトリクッス７１の作業パラメ−タと ／あるいは検出ステ−ション９０の作業パラメ−タと／あるいは各別々のパスに ついて使用したＤＮＡ鋳型の別々のコピ−に異なる識別可能なヌクレオチドを入 れることで識別できる。 １つ以上のヌクレオチドが検出されない場合でも、作用させたエクソヌクレア −ゼの切断速度が十分に一定であれば配列を決定することができる可能性がある 。単一のヌクレオチドの均一な産生により、励起域１００での次のヌクレオチド ま での達成時間を予想することができる。従って、検出されないヌクレオチドは配 列中のギャップとして現れる。この様なギャップは、検出不可能なヌクレオチド に相補的なヌクレオチドは検出可能かつ識別可能であれば、あるいは検出不可能 なヌクレオチドが別のパスで上記方法により検出可能であり、また識別可能であ れば相補鎖を配列決定することで埋めることができる。 前記の本発明については多くの改良と変更が本発明の精神と範囲を越えること なく実施可能なことはあきらかである。特定の実施態様は実施例にのみ記載され ているが、本発明は添付の請求範囲にのみ限定される。請求項に使用した”ＤＮ Ａ”あるいは”デオキシリボキシ核酸”は天然のＤＮＡ、１つ以上の修飾ヌクレ オチド（例えば色素標識した化学的、酵素的に修飾された塩基、糖そして／ある いはリン酸を含むヌクレオチド）を含むＤＮＡ、１つ以上のヌクレオチド類似体 を含むＤＮＡ、ならびに別記なき場合には上記の組み合わせを意味する。請求項 で使用した様に、”ヌクレオチド”とは天然のヌクレオチド、ヌクレオチド類似 体、修飾ヌクレオチド（例えば色素標識した化学的、酵素的に修飾された塩基、 糖そして／あるいはリン酸を含むヌクレオチド）と別記を除く上記の組み合わせ である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ， ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．化学的、生化学的、あるいは生物学的反応を実施する方法であって、 異なる化学的、生化学的、あるいは生物学的試薬を含む少なくとも第一ならび に第二の領域薄層を提供し、 第一の領域に少なくとも１つの粒子を提供し、 第一の領域に、所望の１つの化学的、生化学的あるいは生物学的粒子を捕捉す る光捕捉を形成し、ならびに 光捕捉を利用して捕捉した粒子を液薄膜内を、該粒子が第二領域の試薬と相互 作用する第二領域まで移動させる工程。 ２．捕捉された粒子が薄膜内を通り粒子を使用する部位まで移動する請求項１ の方法。 ３．液膜が少なくとも光捕捉で捕捉された粒子と同じ厚さを有する請求項１の 方法。 ４．捕捉された粒子の大きさがおよそ１０μｍより小さい、請求項１の方法。 ５．捕捉された粒子の直径がおよそ１μｍより小さいビ−スである、請求項１ の方法。 ６．第一領域が、それぞれに第一の反応性ヌクレオチドが結合した複数のビ− ズを含み、各領域が１種類の反応性ヌクレオチド、結合試薬、脱ブロッキング試 薬、キャッピング試薬、洗浄試薬、を含む複数の別の領域が薄液膜内にあり、捕 捉された該粒子が所望の順序に別の領域から他の領域に移動して所望のヌクレオ チドを合成する、請求項１の方法。 ７．第一の領域の粒子を用いて、第二の領域の様々な分子の中から特異的性質 を有する分子を選択するスクリ−ニング法として使用する請求項１の方法。 ８．少なくとも１つの領域が滴である請求項１の方法。 ９．化学的、生化学的、あるいは生物学的反応を表面上で行う方法であって、 少なくとも第一と第二の連続する領域を結ぶ薄液膜を提供し、 少なくとも該第一領域に第一粒子を供給し、ならびに 第一粒子を液膜内を移動させて第一粒子が第二領域の試薬と相互作用する第二 領域に運ぶ、工程からなる方法。 １０．第一粒子が第二領域から第一粒子を利用する薄液膜領域に移動させる、 請求項９の方法。 １１．液膜が少なくとも第一粒子と同じ厚さである、請求項９の方法。 １２．第一領域が、それぞれに第一の反応性ヌクレオチドが結合した複数のビ −ズを含み、各領域が１種類の反応性ヌクレオチド、結合試薬、脱ブロッキング 試薬、キャッピング試薬、洗浄試薬、を含む複数の別の領域が薄液膜内にあり、 捕捉された該粒子が所望の順序に別の領域から他の領域に移動して所望のオリゴ ヌクレオチドを合成する、オリゴヌクレオチド合成に使用される請求項９の方法 。 １３．第一の領域の粒子を用いて、第二の領域の様々な分子の中から特異的性 質を有する分子を選択するスクリ−ニング法として使用する請求項９の方法。 １４．少なくとも１つの領域が滴である請求項９の方法。 １５．単ＤＮＡ分子が一端に結合した単粒子を、固相表面の薄液膜内を移動さ せ、その間にエクソヌクレア−ゼをＤＮＡ分子に結合させ、続いて該ＤＮＡ分子 より１ヌクレオチドを切り出させる路で、該路の固相表面が単ヌクレトチドと結 合し、単ヌクレオチドあるいはその断片が該表面に形成される路を形成する方法 。 １６．ビ−ズが光捕捉法で動く請求項１５の方法。 １７．薄液膜が少なくともビ−ズと同じ厚さの請求項１５の方法。 １８．ビ−ズの大きさが．１０μｍより小さい請求項１５の方法。 １９．ビ−ズの直径がおよそ１μｍより小さいビ−スである請求項１５の方法 。