CN113607700A - 手性荧光共聚焦成像系统及成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及光学技术领域，具体公开了一种手性荧光共聚焦成像系统及成像方法，包括：激光器、激发光路、显微镜、样品台、探测光路、光电探测器以及控制装置，其中，所述激光器发射的激光经激发光路调制产生偏振光，所述偏振光通过显微镜照射到样品台的待测样品上，并激发待测样品产生荧光信号，所述荧光信号被所述探测光路调制并传送至所述光电探测器，所述光电探测器将荧光信号转化成电信号并成像，所述控制装置与所述光电探测器以及样品台连接。本发明的手性荧光共聚焦成像系统能够提高传统光学显微镜成像分辨率，实现激光共聚焦成像。

Description

手性荧光共聚焦成像系统及成像方法

技术领域

本发明涉及光学技术领域，具体公开了一种手性荧光共聚焦成像系统及成像方法。

背景技术

激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope)是20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术，它是激光、电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段渗透，并与传统的光学显微镜结合产生的先进的细胞分子生物学分析仪器，在生物及医学等领域的应用越来越广泛，已经成为生物医学实验研究的必备工具。

传统荧光显微镜使用荧光物质标志细胞中的特定结构，不仅图像与背景的对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辨率(δ＝0.61·λ/NA，其中δ为显微镜的分辨率；λ为照明光线的波长；NA为物镜的数值孔径)。但当所观察的荧光标本稍厚时，传统荧光显微镜一个难以克服的缺点就显现出来：焦平面以外的荧光结构模糊、发虚。原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构(如耳蜗基底膜。其实是外毛细胞、多种支持细胞、神经纤维等组成的空间结构)，在普通光学显微镜下聚焦平面的变化，会表现出不同的形态。假若荧光标记的结构在不同层次上都有分布，且重叠在一起，反射荧光显微镜(epifluorescent microscope)不仅从焦平面上收集光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜所接收，荧光显微镜的光学分辨率就要大大降低。

在传统光学显微镜基础上，激光扫描共聚焦显微镜用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出。其特点是可以对样品进行断层扫描和成像，进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构。同时，利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针，该技术不仅可观察固定的细胞、组织切片,还可以对活细胞的结构、分子、离子及生命活动进行实时动态观察和检测，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+，pH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具，极大地丰富了人们对细胞生命现象的认识。

手性是指化学分子的实物与其镜像不能重叠的现象，它是自然界普遍存在的一种现象，如结构蛋白中的氨基酸均为L-型氨基酸，天然存在的糖类则为D-型，核酸在人体中的稳定构型为右旋等。一对对映异构体有着相似的物理和化学性质，但是它们在手性环境下具有不同的光学或者药理学活性。手性发光材料能够分别发出左、右手圆偏振光(CPL)，在圆偏振电致发光器件(CP-OLED)和3D显示有潜在的应用价值。基于手性发光材料的显示器，其发出的圆偏振光可以直接通过过滤器，而没有能量损失。目前，手性荧光材料在手性识别及拆分、药物化学、材料科学、食品检测及生命科学等领域具有十分重要的意义。但是，在显微镜成像领域，缺乏对手性荧光进行研究的成像仪器。圆二色性是指手性材料可以选择性地吸收或者发射左旋圆偏振光和右旋圆偏振光，这也是手性材料独有的性质。因此，发明手性荧光共聚焦显微镜，利用手性荧光进行成像，具有重要的创新意义，同时也扩展了手性荧光材料的应用前景。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种手性荧光共聚焦成像系统及成像方法，旨在解决上述至少一个技术问题。

为实现上述目的，本发明提出了一种手性荧光共聚焦成像系统，包括：激光器、激发光路、显微镜、样品台、探测光路、光电探测器以及控制装置，其中，所述激光器发射的激光经激发光路调制产生偏振光，所述偏振光通过显微镜照射到样品台的待测样品上，并激发待测样品产生荧光信号，所述荧光信号被所述探测光路调制并传送至所述光电探测器，所述光电探测器将荧光信号转化成电信号并成像，所述控制装置与所述光电探测器以及样品台连接。

另外，本发明提出了一种手性荧光共聚焦成像系统的成像方法，包括以下步骤：

控制激光器输出所需波长的激光；

所述激光经过激发光路的调制产生偏振光；

所述偏振光通过显微镜照射到样品台的待测样品上，并激发待测样品产生荧光信号；

所述荧光信号经所述探测光路的调制，并将所述荧光信号传送至所述光电探测器，所述光电探测器将荧光信号转化成电信号并成像。

另外，本发明的上述手性荧光共聚焦成像系统还可以具有如下附加的技术特征。

根据本发明的一个实施例，所述激发光路中设有第一线性偏振片、第一反射镜、第二反射镜、第一四分之一波片以及二向色性滤光片，所述激光器发射的激光依次经过线性偏振片、第一反射镜、第二反射镜、四分之一波片以及二向色性滤光片后在显微镜汇聚。

根据本发明的一个实施例，所述探测光路中设有第二荧光滤波片、第三反射镜、第四反射镜、第五反射镜、第二四分之一波片、第二线性偏振片、第三荧光滤波片以及荧光收集透镜，所述荧光信号经所述二向色性滤光片的分离后，再依次经过第二荧光滤波片、第三反射镜、第四反射镜、第五反射镜、第二四分之一波片、第二线性偏振片、第三荧光滤波片以及荧光收集透镜后进入所述光电探测器。

根据本发明的一个实施例，所述激发光路中还设有准直透镜，所述激光器发射的激光通过所述准直透镜进行准直后，再通过第一线性偏振片。

根据本发明的一个实施例，所述控制装置控制所述样品台与光电探测器的同步运动。

根据本发明的一个实施例，所述激光器发射的激光波长为手性荧光分子所需激发波长。

根据本发明的一个实施例，所述光电探测器选自雪崩光电探测器。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的手性荧光共聚焦成像系统能够提高传统光学显微镜成像分辨率，实现激光共聚焦成像；

2、本发明的手性荧光共聚焦成像系统采用一路激发光，激发光经过四分之一波片调制，经过二向色性片照射到成像区域，操作简单可行。

3、本发明的手性荧光共聚焦成像系统采用手性荧光分子作为待测样品，通过该共聚焦成像系统和成像方法，可用来研究手性荧光分子与偏振光的相互作用，探索荧光分子在偏振光作用下，荧光信号的强弱和手性特征；

4、本发明提出的手性荧光共聚焦成像系统和成像方法，简单易行，成像光路系统较简单，同时节约经济成本；

5、本发明提出的手性荧光共聚焦成像系统和成像方法，有助于进一步了解手性荧光分子的光学特性，挖掘手性荧光材料在光学研究方面的应用潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明实施例中一种手性荧光共聚焦成像系统的结构示意图。

1激光器；2第一线性偏振片；3第一反射镜；4第二反射镜；5第一四分之一波片；6二向色性滤光片；7显微镜；8样品台；9第一荧光滤波片；10第三反射镜；11第四反射镜；12第五反射镜；13第二四分之一波片；14第二线性偏振片；15第二荧光滤波片；16荧光收集透镜；17光电探测器。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。

另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“连接”、“固定”等应做广义理解，例如，“固定”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

本发明的实施例提供了一种手性荧光共聚焦成像系统，该手性荧光共聚焦成像系统首先实现对激光进行调制，调制成圆偏振光照射在成像区域，再将待测样品发出的荧光调制成线偏振光，从而实现手性共聚焦成像。

如图1所示，该手性荧光共聚焦成像系统包括激光器1、激发光路、显微镜7、探测光路、光电探测器17以及控制装置，其中，所述激光器1发射的激光经激发光路调制产生偏振光，所述偏振光通过显微镜7照射到样品台8的待测样品上，并激发待测样品产生荧光信号，所述荧光信号经所述探测光路的调制，所述探测光路将所述荧光信号传送至所述光电探测器17，所述光电探测器17将荧光信号转化成电信号并成像，所述控制装置与所述光电探测器17以及样品台8连接。需要说明的是，本实施例中的待测样品可以是手性荧光分子。

其中，所述激发光路中设有准直透镜、第一线性偏振片2、第一反射镜3、第二反射镜4、第一四分之一波片5以及二向色性滤光片6，所述激光器1发射的激光依次经过准直透镜、第一线性偏振片2、第一反射镜3、第二反射镜4、第一四分之一波片5以及二向色性滤光片6后在显微镜7汇聚，然后照射在样品台8上的待测样品上。

值得一提的是，激光器1所输出的激光要经过第一反射镜3、第二反射镜4之后才汇聚至显微镜。具体地，激光要经过两个反射镜后才进入显微镜以便于光路的对准。

进一步地，所述探测光路中设有第二荧光滤波片9、第三反射镜10、第四反射镜11、第五反射镜12、第二四分之一波片13、第二线性偏振片14、第三荧光滤波片15以及荧光收集透镜16，所述荧光信号经所述二向色性滤光片9的分离后，再依次经过第二荧光滤波片9、第三反射镜10、第四反射镜11、第五反射镜12、第二四分之一波片13、第二线性偏振片14、第三荧光滤波片15以及荧光收集透镜16后进入所述光电探测器17。

需要说明的是，所述待测样品的荧光信号在入射光电探测器17之前要经过第四反射镜11、第五反射镜12，以便于光路对准。所述待测样品的荧光信号在入射至光电探测器17之前要经过第三荧光滤波片1可以滤除激发光。所述待测样品的荧光信号在入射至光电探测器17之前都要经过荧光收集透镜16以收集荧光。

在本实施例中，所述待测样品的荧光信号在入射至光电探测器17之前要经过第二四分之一波片13和第二线性偏振片14，以将圆偏振光调制成线偏振光，并校准。

此外，控制控制装置分别与光电探测器17和样品台8上的位移控制器相连接，用于控制光电探测器17的工作、收集光学信号以及样品台8的移动，进而获得手性荧光显微图像。

具体地，本实施例中的手性荧光共聚焦成像系统的成像方法可以包括以下步骤：

激光器输出的激光经准直透镜、偏振片和两个反射镜后，再依次经过四分之一波片、二向色性滤光片后汇聚至显微镜照射到样品台，用于激发待测样品，得到的待测样品的荧光信号经同一显微镜汇聚后经过反射镜、二向色性滤光片，再经过荧光滤波片、四分之一波片、偏振片、荧光滤波片和收集透镜后进入光电探测器，光电探测器输出的光电信号输入至光学信号采集器，进而获得手性荧光显微图像。

以上对本公开的实施例进行了描述。但是，这些实施例仅仅是为了说明的目的，而并非为了限制本公开的范围。本公开的范围由所附权利要求及其等价物限定。不脱离本公开的范围，本领域技术人员可以做出多种替代和修改，这些替代和修改都应落在本公开的范围之内。

Claims (9)

1.一种手性荧光共聚焦成像系统，其特征在于，包括：激光器、激发光路、显微镜、样品台、探测光路、光电探测器以及控制装置，其中，所述激光器发射的激光经激发光路调制产生偏振光，所述偏振光通过显微镜照射到样品台的待测样品上，并激发待测样品产生荧光信号，所述荧光信号被所述探测光路调制并传送至所述光电探测器，所述光电探测器将荧光信号转化成电信号并成像，所述控制装置与所述光电探测器以及样品台连接。

2.根据权利要求1所述的手性荧光共聚焦成像系统，其特征在于，所述激发光路中设有第一线性偏振片、第一反射镜、第二反射镜、第一四分之一波片以及二向色性滤光片，所述激光器发射的激光依次经过线性偏振片、第一反射镜、第二反射镜、第一四分之一波片以及二向色性滤光片后在显微镜汇聚。

3.根据权利要求2所述的手性荧光共聚焦成像系统，其特征在于，所述探测光路中设有第二荧光滤波片、第三反射镜、第四反射镜、第五反射镜、第二四分之一波片、第二线性偏振片、第三荧光滤波片以及荧光收集透镜，所述荧光信号经所述二向色性滤光片的分离后，再依次经过第二荧光滤波片、第三反射镜、第四反射镜、第五反射镜、第二四分之一波片、第二线性偏振片、第三荧光滤波片以及荧光收集透镜后进入所述光电探测器。

4.根据权利要求2所述的手性荧光共聚焦成像系统，其特征在于，所述激发光路中还设有准直透镜，所述激光器发射的激光通过所述准直透镜进行准直后，再通过第一线性偏振片。

5.根据权利要求1所述的手性荧光共聚焦成像系统，其特征在于，所述控制装置控制所述样品台与光电探测器的同步运动。

6.根据权利要求1所述的手性荧光共聚焦成像系统，其特征在于，所述激光器发射的激光波长为手性荧光分子所需激发波长。

7.根据权利要求1所述的手性荧光共聚焦成像系统，其特征在于，所述光电探测器选自雪崩光电探测器。

8.根据权利要求1-7任一项所述的手性荧光共聚焦成像系统，其特征在于，所述待测样品为手性荧光分子。

9.权利要求1-8任一项所述的手性荧光共聚焦成像系统的成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

控制激光器输出所需波长的激光；

所述激光经过激发光路的调制产生偏振光；

所述偏振光通过显微镜照射到样品台的待测样品上，并激发待测样品产生荧光信号；

所述荧光信号经所述探测光路的调制，并将所述荧光信号传送至所述光电探测器，所述光电探测器将荧光信号转化成电信号并成像。

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