JP2001147374A - ３次元イメージ取得方法及びその装置 - Google Patents
３次元イメージ取得方法及びその装置Info
- Publication number
- JP2001147374A JP2001147374A JP32803199A JP32803199A JP2001147374A JP 2001147374 A JP2001147374 A JP 2001147374A JP 32803199 A JP32803199 A JP 32803199A JP 32803199 A JP32803199 A JP 32803199A JP 2001147374 A JP2001147374 A JP 2001147374A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- light
- laser
- dimensional image
- laser beam
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Microscoopes, Condenser (AREA)
- Length Measuring Devices By Optical Means (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 直径数１０ミクロン以下の微小試料や細胞等
の生体試料を容易にかつ損傷させることなく固定でき、
これらの内部の正確な３次元イメージを取得できる方法
及びその装置を提供すること。 【解決手段】 光トラップ用光源１から発生し、対物レ
ンズ６で収束された光トラップ用レーザー光の焦点位置
を、ガルバノミラー５及び調整可能マウント７により３
次元的に走査させ、該光トラップ用レーザー光でトラッ
プされた試料１０をセル８の溶液９中で３次元的に移動
させることにより、分析用光源１１から発生し、対物レ
ンズ１６で収束された分析用レーザー光の焦点位置に対
して試料１０を３次元的に移動可能とし、これによって
試料１０から蛍光やラマン散乱光による３次元イメージ
を得る。
の生体試料を容易にかつ損傷させることなく固定でき、
これらの内部の正確な３次元イメージを取得できる方法
及びその装置を提供すること。 【解決手段】 光トラップ用光源１から発生し、対物レ
ンズ６で収束された光トラップ用レーザー光の焦点位置
を、ガルバノミラー５及び調整可能マウント７により３
次元的に走査させ、該光トラップ用レーザー光でトラッ
プされた試料１０をセル８の溶液９中で３次元的に移動
させることにより、分析用光源１１から発生し、対物レ
ンズ１６で収束された分析用レーザー光の焦点位置に対
して試料１０を３次元的に移動可能とし、これによって
試料１０から蛍光やラマン散乱光による３次元イメージ
を得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、高分子、ガラス、
液滴、細胞等の微小試料を光学的にマニュピレートして
３次元イメージを得る方法及びその装置に関するもので
ある。
液滴、細胞等の微小試料を光学的にマニュピレートして
３次元イメージを得る方法及びその装置に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】共焦点レーザー顕微鏡（共焦点走査型レ
ーザー顕微鏡ともいう。）あるいは顕微ラマン分光装置
は、高分子、ガラス、細胞等の微小（微粒子）試料の内
部における蛍光やラマン散乱光の３次元イメージを得る
ために用いられている（例えば、蛍光の３次元イメージ
については「新しい光学顕微鏡（第二巻）共焦点レーザ
ー顕微鏡の医学・生物学への応用」、ラマン散乱光の３
次元イメージについては「アナリティカルケミストリ
ー」誌、第６９巻、１９９７年、４５頁〜５０頁、また
は「モレキュラークリスタル・アンド・リキィドクリス
タル」誌、第３１４巻、１９９８年、１９１頁〜１９６
頁参照）。
ーザー顕微鏡ともいう。）あるいは顕微ラマン分光装置
は、高分子、ガラス、細胞等の微小（微粒子）試料の内
部における蛍光やラマン散乱光の３次元イメージを得る
ために用いられている（例えば、蛍光の３次元イメージ
については「新しい光学顕微鏡（第二巻）共焦点レーザ
ー顕微鏡の医学・生物学への応用」、ラマン散乱光の３
次元イメージについては「アナリティカルケミストリ
ー」誌、第６９巻、１９９７年、４５頁〜５０頁、また
は「モレキュラークリスタル・アンド・リキィドクリス
タル」誌、第３１４巻、１９９８年、１９１頁〜１９６
頁参照）。
【０００３】これらの装置では、光学系に共焦点配置を
用いている。共焦点配置とは、点光源（例えば、レーザ
ー光源）と点検出器（例えば、ピンホールを装着した光
検出器）とが共に試料内の一点に対して結像関係にあ
る。このため、焦点面以外からの画像の寄与がなく、３
次元試料中の特定の面だけの像、いわゆる断層像が得ら
れる。
用いている。共焦点配置とは、点光源（例えば、レーザ
ー光源）と点検出器（例えば、ピンホールを装着した光
検出器）とが共に試料内の一点に対して結像関係にあ
る。このため、焦点面以外からの画像の寄与がなく、３
次元試料中の特定の面だけの像、いわゆる断層像が得ら
れる。
【０００４】具体的には、試料に光束（集光されたレー
ザー光）を照射しながら、試料または光束を走査させ、
共焦点配置により焦点部からのみの反射光または散乱光
について連続的に分光測定を行う。光束を固定して試料
そのものを走査する方式をステージ走査型と呼び、試料
は固定して光束の方を走査する方式を光束走査式と呼
ぶ。
ザー光）を照射しながら、試料または光束を走査させ、
共焦点配置により焦点部からのみの反射光または散乱光
について連続的に分光測定を行う。光束を固定して試料
そのものを走査する方式をステージ走査型と呼び、試料
は固定して光束の方を走査する方式を光束走査式と呼
ぶ。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】前述したステージ走査
型の場合はステージの移動範囲によって視野が決まるた
め、視野を広くすることが可能であり、また、光束が固
定されているため、ピンホール位置に分光器の入射スリ
ットを合わせることによって蛍光やラマン散乱光のスペ
クトルを得ることができる。しかし、生体試料等の溶液
中にある試料等はステージ走査時に容易に動いてしまう
ため、試料を機械的（ガラス基板の間に挟む等）に、ま
たは接着剤（ポリリジン等）等で試料台に固定する必要
があり、この場合、直径数１０ミクロン以下の小さな試
料に対してはその固定が困難である上、固定することに
よる試料の損傷が問題となっていた。
型の場合はステージの移動範囲によって視野が決まるた
め、視野を広くすることが可能であり、また、光束が固
定されているため、ピンホール位置に分光器の入射スリ
ットを合わせることによって蛍光やラマン散乱光のスペ
クトルを得ることができる。しかし、生体試料等の溶液
中にある試料等はステージ走査時に容易に動いてしまう
ため、試料を機械的（ガラス基板の間に挟む等）に、ま
たは接着剤（ポリリジン等）等で試料台に固定する必要
があり、この場合、直径数１０ミクロン以下の小さな試
料に対してはその固定が困難である上、固定することに
よる試料の損傷が問題となっていた。
【０００６】一方、光束走査型の場合は走査が速いのが
特徴であるが、光束を走査するために共焦点配置のため
のピンホール位置で光の揺らぎが生じ、このため、ピン
ホール径が１ｍｍ程度（分光器の入射スリットは１０分
の１以下）と非常に大きくなり、スペクトル分解能が悪
くなって一度に同定できる分子の種類の数が限定されて
しまうという問題があった。また、ステージ走査型の場
合程ではないにしろ、ある程度の試料固定が必要となる
ため、固定時における試料の損傷が問題となっていた。
特徴であるが、光束を走査するために共焦点配置のため
のピンホール位置で光の揺らぎが生じ、このため、ピン
ホール径が１ｍｍ程度（分光器の入射スリットは１０分
の１以下）と非常に大きくなり、スペクトル分解能が悪
くなって一度に同定できる分子の種類の数が限定されて
しまうという問題があった。また、ステージ走査型の場
合程ではないにしろ、ある程度の試料固定が必要となる
ため、固定時における試料の損傷が問題となっていた。
【０００７】本発明の目的は、直径数１０ミクロン以下
の微小試料や細胞等の生体試料を容易にかつ損傷させる
ことなく固定でき、これらの内部の正確な３次元イメー
ジを取得できる方法及びその装置を提供することにあ
る。
の微小試料や細胞等の生体試料を容易にかつ損傷させる
ことなく固定でき、これらの内部の正確な３次元イメー
ジを取得できる方法及びその装置を提供することにあ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明では、微粒子試料
の固定に光トラップ（光ピンセットとも呼ぶ。）を利用
する。この光トラップはレーザー光の光圧力によって微
粒子を非接触・非破壊で捕獲する方法である。
の固定に光トラップ（光ピンセットとも呼ぶ。）を利用
する。この光トラップはレーザー光の光圧力によって微
粒子を非接触・非破壊で捕獲する方法である。
【０００９】レーザー光を用いた光圧力による微粒子捕
獲の基本原理は、１９７０年にアシュキンによって示さ
れ（「フィジカル・レビュー・レター」誌、第２４巻、
１９７０年、１５６〜１５９頁参照）、後に、アシュキ
ンを含むグループによって高開口数の対物レンズを用い
た簡便な方法が報告された（「オプティクス・レター」
誌、第１１巻、２８８〜２９０頁参照）。これによっ
て、対物レンズにより集光されたレーザーの焦点位置近
傍に直径約２０μｍから２０ｎｍの微粒子を安定にトラ
ップすることが可能になった。
獲の基本原理は、１９７０年にアシュキンによって示さ
れ（「フィジカル・レビュー・レター」誌、第２４巻、
１９７０年、１５６〜１５９頁参照）、後に、アシュキ
ンを含むグループによって高開口数の対物レンズを用い
た簡便な方法が報告された（「オプティクス・レター」
誌、第１１巻、２８８〜２９０頁参照）。これによっ
て、対物レンズにより集光されたレーザーの焦点位置近
傍に直径約２０μｍから２０ｎｍの微粒子を安定にトラ
ップすることが可能になった。
【００１０】また、この報告の中では可視域のレーザー
光が使われていたが、代わりに近赤外域のレーザー光を
用いることによって、細胞等の生体微粒子に対して利用
できることも示されている（例えば、特公平２−９１５
４５号公報、または「ネイチャー」誌、３３０巻、１９
８７年、７６９〜７７１頁等参照）。
光が使われていたが、代わりに近赤外域のレーザー光を
用いることによって、細胞等の生体微粒子に対して利用
できることも示されている（例えば、特公平２−９１５
４５号公報、または「ネイチャー」誌、３３０巻、１９
８７年、７６９〜７７１頁等参照）。
【００１１】本発明では、蛍光やラマン散乱光の３次元
イメージを得るために、分光分析用のレーザー光ととも
に光トラップ用のレーザー光を用いる。これらのレーザ
ー光としては、試料への損傷が少ない近赤外波長（６０
０ｎｍから１８００ｎｍ）の波長域を持つＨｅ−Ｎｅレ
ーザー、半導体レーザー、Ｎｄ−ＹＡＧレーザー、Ｎｄ
−ＹＶＯ4レーザー、Ｎｄ−ＧＬＡＳＳレーザー、Ｎｄ
−ＹＬＦレーザー、クリプトンレーザー、ルビーレーザ
ー、金蒸気レーザー、アレキサンドライトレーザー、色
素レーザー、チタンサファイアレーザー等を用いるが、
分析スペクトルへの光トラップ用レーザー光による影響
を避けるため、波長差が１０ｎｍ以上（実用的には２０
０ｎｍ以上）の２つのレーザー光を用いる。
イメージを得るために、分光分析用のレーザー光ととも
に光トラップ用のレーザー光を用いる。これらのレーザ
ー光としては、試料への損傷が少ない近赤外波長（６０
０ｎｍから１８００ｎｍ）の波長域を持つＨｅ−Ｎｅレ
ーザー、半導体レーザー、Ｎｄ−ＹＡＧレーザー、Ｎｄ
−ＹＶＯ4レーザー、Ｎｄ−ＧＬＡＳＳレーザー、Ｎｄ
−ＹＬＦレーザー、クリプトンレーザー、ルビーレーザ
ー、金蒸気レーザー、アレキサンドライトレーザー、色
素レーザー、チタンサファイアレーザー等を用いるが、
分析スペクトルへの光トラップ用レーザー光による影響
を避けるため、波長差が１０ｎｍ以上（実用的には２０
０ｎｍ以上）の２つのレーザー光を用いる。
【００１２】まず、対物レンズ（または対物カセグレン
鏡）により収束された光トラップ用のレーザー光を微粒
子試料に照射することにより光圧力を発生させ、この光
圧力によって試料を固定する。光圧力はレーザー光の強
度や対物レンズの開口数等によって決まるが、走査のた
めには、試料を固定するのに必要な光圧力より大きな光
圧力でなければならない。これは光束の焦点位置を走査
（連続的に移動）させた場合、光トラップされた微粒子
試料に対し溶液抵抗がかかるため、これを相殺するため
の光圧力が必要となるからである。さらに、分析用レー
ザー光による光トラップの影響も考慮する必要がある
（これについては後で詳しく述べる。）。
鏡）により収束された光トラップ用のレーザー光を微粒
子試料に照射することにより光圧力を発生させ、この光
圧力によって試料を固定する。光圧力はレーザー光の強
度や対物レンズの開口数等によって決まるが、走査のた
めには、試料を固定するのに必要な光圧力より大きな光
圧力でなければならない。これは光束の焦点位置を走査
（連続的に移動）させた場合、光トラップされた微粒子
試料に対し溶液抵抗がかかるため、これを相殺するため
の光圧力が必要となるからである。さらに、分析用レー
ザー光による光トラップの影響も考慮する必要がある
（これについては後で詳しく述べる。）。
【００１３】光束の焦点位置を走査（移動）させる手段
は水平方向と垂直方向の２つの機構からなる。まず、水
平方向を走査させるためには、対物レンズに入射する平
行なレーザ光をガルバノミラー（光軸を平行移動させる
ための光学部品）で２次元的に移動させるか、または対
物レンズとレーザー光の双方を光軸に対し垂直な面で２
次元的に移動させることによって実現できる。そして、
垂直方向に走査させるためには、収束のための対物レン
ズを光軸方向に連続的に移動させることによって実現で
きる。但し、水平方向、垂直方向のいずれの場合におい
ても、移動速度は試料への光圧力の大きさによって制限
を受ける。
は水平方向と垂直方向の２つの機構からなる。まず、水
平方向を走査させるためには、対物レンズに入射する平
行なレーザ光をガルバノミラー（光軸を平行移動させる
ための光学部品）で２次元的に移動させるか、または対
物レンズとレーザー光の双方を光軸に対し垂直な面で２
次元的に移動させることによって実現できる。そして、
垂直方向に走査させるためには、収束のための対物レン
ズを光軸方向に連続的に移動させることによって実現で
きる。但し、水平方向、垂直方向のいずれの場合におい
ても、移動速度は試料への光圧力の大きさによって制限
を受ける。
【００１４】一方、異なる波長の分析用のレーザー光
は、光トラップを防ぐためにパルスレーザー光を用いた
り、光トラップ用のレーザー光より出力の小さなレーザ
ー光を用いる、もしくは開口数の小さい対物レンズで集
光する等を行う。試料からの反射光または散乱光に含ま
れる蛍光やラマン散乱光を再び対物レンズ（または対物
カセグレン鏡）を用いてピンホールに集光される。そし
て、これらの光を分光器でスペクトルにし、検出器でそ
の光強度を測定することにより、分子の種類を識別する
ことができる。
は、光トラップを防ぐためにパルスレーザー光を用いた
り、光トラップ用のレーザー光より出力の小さなレーザ
ー光を用いる、もしくは開口数の小さい対物レンズで集
光する等を行う。試料からの反射光または散乱光に含ま
れる蛍光やラマン散乱光を再び対物レンズ（または対物
カセグレン鏡）を用いてピンホールに集光される。そし
て、これらの光を分光器でスペクトルにし、検出器でそ
の光強度を測定することにより、分子の種類を識別する
ことができる。
【００１５】本発明によれば、微粒子試料の固定に光ト
ラップを利用することによって、直径数１０ミクロン以
下の微粒子試料の固定が容易となるとともに、溶液中等
にある細胞等の生体試料を損傷を与えることなく固定で
き、分子の種類毎の３次元イメージの取得に非常に有効
である。
ラップを利用することによって、直径数１０ミクロン以
下の微粒子試料の固定が容易となるとともに、溶液中等
にある細胞等の生体試料を損傷を与えることなく固定で
き、分子の種類毎の３次元イメージの取得に非常に有効
である。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下、本発明の内容について、発
明の実施の形態に従って具体的に説明する。なお、本発
明は以下の実施の形態の例のみに限定されるものではな
い。
明の実施の形態に従って具体的に説明する。なお、本発
明は以下の実施の形態の例のみに限定されるものではな
い。
【００１７】
【実施の形態１】図１は本発明の第１の実施の形態を示
すもので、図中、１は光トラップ用光源、２はビームエ
クスパンダ、３はレーザーラインフィルタ、４は反射ミ
ラー、５はガルバノミラー、６は対物レンズ、７は調整
可能マウント、８はセル、９は溶液、１０は微粒子試
料、１１は分析用光源、１２はレーザーラインフィル
タ、１３はビームエクスパンダ、１４，１５はビームス
プリッタ、１６は対物レンズ、１７は可視光源、１８は
集光レンズ、１９は可視透過フィルタ、２０，２１はホ
ログラフィックノッチフィルタ、２２はビームスプリッ
タ、２３はテレビカメラ、２４は反射ミラー、２５は収
束レンズ、２６はピンホール、２７は集光レンズ、２８
は反射ミラー、２９は調整可能マウント、３０は回折格
子、３１は反射ミラー、３２は収束レンズ、３３はマル
チチャネル検出器である。
すもので、図中、１は光トラップ用光源、２はビームエ
クスパンダ、３はレーザーラインフィルタ、４は反射ミ
ラー、５はガルバノミラー、６は対物レンズ、７は調整
可能マウント、８はセル、９は溶液、１０は微粒子試
料、１１は分析用光源、１２はレーザーラインフィル
タ、１３はビームエクスパンダ、１４，１５はビームス
プリッタ、１６は対物レンズ、１７は可視光源、１８は
集光レンズ、１９は可視透過フィルタ、２０，２１はホ
ログラフィックノッチフィルタ、２２はビームスプリッ
タ、２３はテレビカメラ、２４は反射ミラー、２５は収
束レンズ、２６はピンホール、２７は集光レンズ、２８
は反射ミラー、２９は調整可能マウント、３０は回折格
子、３１は反射ミラー、３２は収束レンズ、３３はマル
チチャネル検出器である。
【００１８】光トラップ用光源１には、波長１０６４ｎ
ｍ、最大出力２．５ＷのＮｄ−ＹＶＯ4レーザーを用い
た。レーザー光はビームエクスパンダ２を用いて適当な
直径に調節し、レーザーラインフィルタ３を通すことに
より他の波長成分を除いた後、反射ミラー４によりガル
バノミラー５へ導入し、収束用の対物レンズ６（開口数
０．８）を用いて集光した。
ｍ、最大出力２．５ＷのＮｄ−ＹＶＯ4レーザーを用い
た。レーザー光はビームエクスパンダ２を用いて適当な
直径に調節し、レーザーラインフィルタ３を通すことに
より他の波長成分を除いた後、反射ミラー４によりガル
バノミラー５へ導入し、収束用の対物レンズ６（開口数
０．８）を用いて集光した。
【００１９】ガルバノミラー５を用いることにより、対
物レンズ６の焦点位置を光軸に対し垂直な面内で自由に
移動できる。さらに、対物レンズ６を固定する調整可能
マウント７を光軸方向に移動することによって焦点位置
を光軸方向へも自由に移動することができるため、結果
的に焦点位置を３次元的に自由に設定することが可能で
ある。
物レンズ６の焦点位置を光軸に対し垂直な面内で自由に
移動できる。さらに、対物レンズ６を固定する調整可能
マウント７を光軸方向に移動することによって焦点位置
を光軸方向へも自由に移動することができるため、結果
的に焦点位置を３次元的に自由に設定することが可能で
ある。
【００２０】セル８は、光透過性を有する素材（例え
ば、ガラス、プラスチック）からなる中空の容器であ
り、その内部は光透過性を有しかつ試料に応じてこれに
影響を及ぼすことのない溶液（例えば、水）９が満たさ
れ、この溶液９中に微粒子試料１０がある。微粒子試料
１０は対物レンズ６により収束されたレーザー光によっ
て光トラップされる。光トラップされた微粒子試料１０
はレーザー光の焦点近傍に安定に固定され、レーザー光
の焦点位置を変化させることによって３次元的に移動さ
せることができる。なお、微粒子試料１０を観察するた
めの可視光学系については後述する。
ば、ガラス、プラスチック）からなる中空の容器であ
り、その内部は光透過性を有しかつ試料に応じてこれに
影響を及ぼすことのない溶液（例えば、水）９が満たさ
れ、この溶液９中に微粒子試料１０がある。微粒子試料
１０は対物レンズ６により収束されたレーザー光によっ
て光トラップされる。光トラップされた微粒子試料１０
はレーザー光の焦点近傍に安定に固定され、レーザー光
の焦点位置を変化させることによって３次元的に移動さ
せることができる。なお、微粒子試料１０を観察するた
めの可視光学系については後述する。
【００２１】一方、分析用光源１１には、波長７３０ｎ
ｍ、最大出力１Ｗのチタンサファイアレーザーを用い
た。レーザー光はビームエクスパンダ１２を用い、適当
な直径に調節し、レーザーラインフィルタ１３を通すこ
とにより他の波長成分を除いた後、ビームスプリッタ１
４で反射させ、ビームスプリッタ１５を透過させた後、
対物レンズ１６（開口数０．５５）で収束して試料１０
に照射した。
ｍ、最大出力１Ｗのチタンサファイアレーザーを用い
た。レーザー光はビームエクスパンダ１２を用い、適当
な直径に調節し、レーザーラインフィルタ１３を通すこ
とにより他の波長成分を除いた後、ビームスプリッタ１
４で反射させ、ビームスプリッタ１５を透過させた後、
対物レンズ１６（開口数０．５５）で収束して試料１０
に照射した。
【００２２】試料観察のための可視光源１７には５０Ｗ
のハロゲンランプを用いた。光源１７からの光は集光レ
ンズ１８を通してから可視透過フィルタ１９を通した
後、ビームスプリッタ１５で反射させ、対物レンズ１６
を用いて試料１０に照射した。試料１０からの反射光及
び散乱光より、光トラップ用光源１の波長の光をホログ
ラフィックノッチフィルタ２０で除去し、さらに分析用
光源１１の波長の光をホログラフィックノッチフィルタ
２１で除去した後、ビームスプリッタ２２によりテレビ
カメラ２３に導入することによって試料を観察すること
ができる。
のハロゲンランプを用いた。光源１７からの光は集光レ
ンズ１８を通してから可視透過フィルタ１９を通した
後、ビームスプリッタ１５で反射させ、対物レンズ１６
を用いて試料１０に照射した。試料１０からの反射光及
び散乱光より、光トラップ用光源１の波長の光をホログ
ラフィックノッチフィルタ２０で除去し、さらに分析用
光源１１の波長の光をホログラフィックノッチフィルタ
２１で除去した後、ビームスプリッタ２２によりテレビ
カメラ２３に導入することによって試料を観察すること
ができる。
【００２３】また、試料の分析に用いるラマン散乱光は
ビームスプリッタ２２を透過し、反射ミラー２４で収束
レンズ２５に導入される。収束レンズ２５の焦点にはピ
ンホール２６があり、試料の焦点外から発生したラマン
散乱光が排除される。そして、このラマン散乱光は集光
レンズ２７を通り、反射ミラー２８で調整マウント２９
に固定された回折格子３０に照射される。
ビームスプリッタ２２を透過し、反射ミラー２４で収束
レンズ２５に導入される。収束レンズ２５の焦点にはピ
ンホール２６があり、試料の焦点外から発生したラマン
散乱光が排除される。そして、このラマン散乱光は集光
レンズ２７を通り、反射ミラー２８で調整マウント２９
に固定された回折格子３０に照射される。
【００２４】回折格子３０でスペクトルとなった光は反
射ミラー３１で収束レンズ３２へ導入され、マルチチャ
ネル検出器３３に結像される。そして、マルチチャネル
検出器３３で光強度を測定することにより、分子の種類
を同定したり、分子の状態を知ることができる。さら
に、光トラップされている微粒子試料１０を前記方法に
より２次元または３次元に連続的に走査することによっ
て、２次元または３次元のラマン散乱光のイメージを得
ることができる。
射ミラー３１で収束レンズ３２へ導入され、マルチチャ
ネル検出器３３に結像される。そして、マルチチャネル
検出器３３で光強度を測定することにより、分子の種類
を同定したり、分子の状態を知ることができる。さら
に、光トラップされている微粒子試料１０を前記方法に
より２次元または３次元に連続的に走査することによっ
て、２次元または３次元のラマン散乱光のイメージを得
ることができる。
【００２５】測定に用いた微粒子試料１０には、メリフ
ィールド法によってポリ−Ｌ−チロシンを修飾した直径
約１０μｍのポリスチレンビーズを用いた。以下にその
作製法の詳細を述べる。
ィールド法によってポリ−Ｌ−チロシンを修飾した直径
約１０μｍのポリスチレンビーズを用いた。以下にその
作製法の詳細を述べる。
【００２６】ポリスチレンのビーズ５０ｇをクロロメチ
ルエーテル５０ｍｌに入れ、塩化スズ１．８ｍｌを滴下
する。２５℃で１時間、さらに０℃で３０分撹拌する。
反応液を除去し、ジオキサンと水の３：１の混合溶液で
洗浄後、ジオキサンと３Ｍ塩酸の３：１の混合溶液で洗
浄し、水がなくなるまでジオキサンで洗い、さらにジオ
キサンがなくなるまでメタノールで洗った後、減圧下で
乾燥させてクロロメチル化ポリスチレン樹脂を得た。
ルエーテル５０ｍｌに入れ、塩化スズ１．８ｍｌを滴下
する。２５℃で１時間、さらに０℃で３０分撹拌する。
反応液を除去し、ジオキサンと水の３：１の混合溶液で
洗浄後、ジオキサンと３Ｍ塩酸の３：１の混合溶液で洗
浄し、水がなくなるまでジオキサンで洗い、さらにジオ
キサンがなくなるまでメタノールで洗った後、減圧下で
乾燥させてクロロメチル化ポリスチレン樹脂を得た。
【００２７】次に、７．２ｍｍｏｌのｔ−ブトキシカル
ボニル（ＢＯＣ）−ニトロ−Ｌ−アルギニンと当量のト
リエチルアミンをアルコール２０ｍｌに溶解し、これに
１０ｇのクロロメチル化樹脂を加えて８０℃で１昼夜加
熱環流する。樹脂をろ過してエタノール、水、メタノー
ルの順で十分洗浄して乾燥し、ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アルギ
ニンが表面に結合した樹脂を得た。
ボニル（ＢＯＣ）−ニトロ−Ｌ−アルギニンと当量のト
リエチルアミンをアルコール２０ｍｌに溶解し、これに
１０ｇのクロロメチル化樹脂を加えて８０℃で１昼夜加
熱環流する。樹脂をろ過してエタノール、水、メタノー
ルの順で十分洗浄して乾燥し、ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アルギ
ニンが表面に結合した樹脂を得た。
【００２８】次に、当該樹脂に１Ｍ塩酸の氷酢酸溶液３
０ｍｌを加え、室温で３０分間ふりまぜる。溶液を除
き、氷酢酸、エタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）の順で十分に洗浄する。さらに、トリエチルアミン
３ｍｌをＤＭＦ３０ｍｌに溶解した液で２０分間洗浄
し、これを除去してさらにＤＭＦで十分に洗浄する。こ
れにより、アルギニンの先端に結合した保護基であるｔ
−ＢＯＣ基を外した。ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−チロシン１．７
６ｇを精製したＤＭＦに溶解し、これに保護基を外した
当該樹脂を入れ、１０分間ふりまぜた後、ジシクロヘキ
シルカルボジイミド（ＤＣＣ）１．３２ｇをＤＭＦ３ｍ
ｌに溶解して加え、２時間ふりまぜた。
０ｍｌを加え、室温で３０分間ふりまぜる。溶液を除
き、氷酢酸、エタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）の順で十分に洗浄する。さらに、トリエチルアミン
３ｍｌをＤＭＦ３０ｍｌに溶解した液で２０分間洗浄
し、これを除去してさらにＤＭＦで十分に洗浄する。こ
れにより、アルギニンの先端に結合した保護基であるｔ
−ＢＯＣ基を外した。ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−チロシン１．７
６ｇを精製したＤＭＦに溶解し、これに保護基を外した
当該樹脂を入れ、１０分間ふりまぜた後、ジシクロヘキ
シルカルボジイミド（ＤＣＣ）１．３２ｇをＤＭＦ３ｍ
ｌに溶解して加え、２時間ふりまぜた。
【００２９】溶液を除き、ＤＭＦ、エタノール、氷酢酸
で洗浄した後、前述と同じ方法で保護基のｔ−ＢＯＣ基
を外した。さらに同様の方法で、ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−チロ
シンを反応させて保護基のｔ−ＢＯＣ基を外すことを１
００回繰り返し、表面がポリ−Ｌ−チロシンで覆われた
ポリスチレンビーズを得た。
で洗浄した後、前述と同じ方法で保護基のｔ−ＢＯＣ基
を外した。さらに同様の方法で、ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−チロ
シンを反応させて保護基のｔ−ＢＯＣ基を外すことを１
００回繰り返し、表面がポリ−Ｌ−チロシンで覆われた
ポリスチレンビーズを得た。
【００３０】上記作製法によって得られたポリ−Ｌ−チ
ロシン修飾のポリスチレンビーズをごく少量、水中に分
散させ、そのうちのビーズ１個に対し本装置によるラマ
ンイメージ測定を行った。
ロシン修飾のポリスチレンビーズをごく少量、水中に分
散させ、そのうちのビーズ１個に対し本装置によるラマ
ンイメージ測定を行った。
【００３１】始めに、ビーズの中心付近を通る断面で２
次元イメージ取得測定を行った結果、ポリスチレンに含
まれる一置換ベンゼン基のラマンピーク（１０００ｃｍ
-1）はビーズ内部に均一に分布しているの対し、ポリ−
Ｌ−チロシンに含まれる二置換ベンゼン基のラマンピー
ク（８２６または８５０ｃｍ-1）はビーズの外周に沿っ
て円形リング状に分布していた。
次元イメージ取得測定を行った結果、ポリスチレンに含
まれる一置換ベンゼン基のラマンピーク（１０００ｃｍ
-1）はビーズ内部に均一に分布しているの対し、ポリ−
Ｌ−チロシンに含まれる二置換ベンゼン基のラマンピー
ク（８２６または８５０ｃｍ-1）はビーズの外周に沿っ
て円形リング状に分布していた。
【００３２】次に、同じ２つのラマンピークに対して３
次元イメージ取得測定を行った結果、一置換ベンゼン基
のラマンピークはビーズ内部に均一に分布しているの対
して、二置換ベンゼン基のラマンピークはビーズの外周
に沿って球状に分布していた。
次元イメージ取得測定を行った結果、一置換ベンゼン基
のラマンピークはビーズ内部に均一に分布しているの対
して、二置換ベンゼン基のラマンピークはビーズの外周
に沿って球状に分布していた。
【００３３】
【実施の形態２】図２は本発明の第２の実施の形態を示
すもので、ここでは第１の実施の形態において分光分析
用レーザー光の焦点位置を３次元的に変化させるように
なした例を示す。即ち、３４は分析用光源１１のレーザ
ー光（ここでは可視光源からの光も含めて）の位置を光
軸に対して垂直な面内で自由に移動するガルバノミラー
であり、３５は対物レンズ１６を光軸方向に移動自在に
固定する調整可能マウント３５である。
すもので、ここでは第１の実施の形態において分光分析
用レーザー光の焦点位置を３次元的に変化させるように
なした例を示す。即ち、３４は分析用光源１１のレーザ
ー光（ここでは可視光源からの光も含めて）の位置を光
軸に対して垂直な面内で自由に移動するガルバノミラー
であり、３５は対物レンズ１６を光軸方向に移動自在に
固定する調整可能マウント３５である。
【００３４】これらを用いて、第１の実施の形態におい
て光トラップ用光源１のレーザー光の焦点位置をガルバ
ノミラー５及び調整可能マウント７により３次元的に変
化させるのと同様な手法により、分析用光源１１のレー
ザー光の焦点位置を３次元的に変化させる。この場合、
光トラップされた微粒子試料１０をイメージ測定中に移
動させる必要はなく、ガルバノミラー５及び調整可能マ
ウント７はなくても良い。
て光トラップ用光源１のレーザー光の焦点位置をガルバ
ノミラー５及び調整可能マウント７により３次元的に変
化させるのと同様な手法により、分析用光源１１のレー
ザー光の焦点位置を３次元的に変化させる。この場合、
光トラップされた微粒子試料１０をイメージ測定中に移
動させる必要はなく、ガルバノミラー５及び調整可能マ
ウント７はなくても良い。
【００３５】この装置を用いて、第１の実施の形態の場
合と同様の方法で作製したポリ−Ｌ−チロシン修飾のポ
リスチレンビーズの微粒子試料１０についてラマンイメ
ージ測定を行った。その結果、第１の実施の形態の場合
と同様の結果が得られた。
合と同様の方法で作製したポリ−Ｌ−チロシン修飾のポ
リスチレンビーズの微粒子試料１０についてラマンイメ
ージ測定を行った。その結果、第１の実施の形態の場合
と同様の結果が得られた。
【００３６】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
試料の固定に非破壊・非接触の光トラップを用いること
によって、直径数１０ミクロン以下の小さな微粒子試料
の固定が容易となるとともに、細胞等の生体試料を損傷
を与えることなく固定でき、分子の種類毎の３次元イメ
ージの取得に非常に有効である。
試料の固定に非破壊・非接触の光トラップを用いること
によって、直径数１０ミクロン以下の小さな微粒子試料
の固定が容易となるとともに、細胞等の生体試料を損傷
を与えることなく固定でき、分子の種類毎の３次元イメ
ージの取得に非常に有効である。
【図１】本発明の第１の実施の形態を示す装置構成図
【図２】本発明の第２の実施の形態を示す装置構成図
１：光トラップ用光源、２，１２：ビームエクスパン
ダ、３，１３：レーザーラインフィルタ、４，２４，２
８，３１：反射ミラー、５，３４：ガルバノミラー、
６，１６：対物レンズ、７，３５：調整可能マウント、
８：セル、９：溶液、１０：微粒子試料、１１：分析用
光源、１４，１５，２２：ビームスプリッタ、１７：可
視光源、１８，２７：集光レンズ、１９：可視透過フィ
ルタ、２０，２１：ホログラフィックノッチフィルタ、
２３：テレビカメラ、２５，３２：収束レンズ、２６：
ピンホール、２９：調整可能マウント、３０：回折格
子、３３：マルチチャネル検出器。
ダ、３，１３：レーザーラインフィルタ、４，２４，２
８，３１：反射ミラー、５，３４：ガルバノミラー、
６，１６：対物レンズ、７，３５：調整可能マウント、
８：セル、９：溶液、１０：微粒子試料、１１：分析用
光源、１４，１５，２２：ビームスプリッタ、１７：可
視光源、１８，２７：集光レンズ、１９：可視透過フィ
ルタ、２０，２１：ホログラフィックノッチフィルタ、
２３：テレビカメラ、２５，３２：収束レンズ、２６：
ピンホール、２９：調整可能マウント、３０：回折格
子、３３：マルチチャネル検出器。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｇ０１Ｂ 11/24 Ａ (72)発明者 鳥光 慶一 東京都千代田区大手町２丁目３番１号 日 本電信電話株式会社内 Ｆターム(参考） 2F065 AA53 BB00 CC00 FF44 GG04 GG06 HH03 LL04 LL13 LL21 LL42 LL62 MM16 PP24 UU07 2G043 AA01 AA03 BA14 BA16 BA17 CA03 DA06 EA01 EA03 EA14 FA01 FA02 FA06 GA02 GA06 GA07 GB01 GB03 GB19 HA01 HA02 JA03 KA05 KA09 LA03 NA01 NA06 2G045 FA12 FA28 FB12 JA07 2H052 AA07 AA08 AC14 AC15 AC34 AF07
Claims (5)
- 【請求項１】 光トラップ用レーザー光で微小試料をト
ラップし、分光分析用レーザー光を走査させて該微小試
料の３次元イメージを得ることを特徴とする３次元イメ
ージ取得方法。 - 【請求項２】 分光分析用レーザー光の焦点部で、微小
試料をトラップした光トラップ用レーザー光を走査させ
て該微小試料の３次元イメージを得ることを特徴とする
３次元イメージ取得方法。 - 【請求項３】 分光分析用レーザー光と光トラップ用レ
ーザー光との波長差を１０ｎｍ以上としたことを特徴と
する請求項１または２記載の３次元イメージ取得方法。 - 【請求項４】 光トラップ用レーザー光を発生する光ト
ラップ用光源と、 分光分析用レーザー光を発生する分光分析用光源と、 微小試料を３次元方向に移動自在に保持する試料保持手
段と、 光トラップ用レーザー光もしくは分光分析用レーザー光
の焦点位置を３次元的に走査・移動する走査手段と、 微小試料からの反射光または散乱光を受光して蛍光やラ
マン散乱光による３次元イメージを得る分析手段とを備
えたことを特徴とする３次元イメージ取得装置。 - 【請求項５】 分光分析用レーザー光と光トラップ用レ
ーザー光との波長差を１０ｎｍ以上としたことを特徴と
する請求項４記載の３次元イメージ取得装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32803199A JP3568846B2 (ja) | 1999-11-18 | 1999-11-18 | ３次元イメージ取得方法及びその装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32803199A JP3568846B2 (ja) | 1999-11-18 | 1999-11-18 | ３次元イメージ取得方法及びその装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001147374A true JP2001147374A (ja) | 2001-05-29 |
| JP3568846B2 JP3568846B2 (ja) | 2004-09-22 |
Family
ID=18205751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32803199A Expired - Fee Related JP3568846B2 (ja) | 1999-11-18 | 1999-11-18 | ３次元イメージ取得方法及びその装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3568846B2 (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003050588A1 (fr) * | 2001-12-13 | 2003-06-19 | Japan Science And Technology Corporation | Systeme optique permettant de renforcer les forces de capture a pinces optiques |
| WO2004063730A1 (ja) * | 2003-01-16 | 2004-07-29 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | 蛍光測定装置 |
| WO2005114151A1 (ja) * | 2004-05-24 | 2005-12-01 | National University Corporation NARA Institute of Science and Technology | 測定システム |
| JP2006235319A (ja) * | 2005-02-25 | 2006-09-07 | Japan Science & Technology Agency | 微粒子移動制御装置 |
| JP2007538238A (ja) * | 2004-05-17 | 2007-12-27 | ショット アクチエンゲゼルシャフト | デバイス上の局所構造体を測定する方法 |
| JP2008020385A (ja) * | 2006-07-14 | 2008-01-31 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | 高分子の応力テンソルの時間変化の推算方法、高分子の３次元構造の構築方法、プログラム、情報記憶媒体、およびシステム |
| JP2009042112A (ja) * | 2007-08-09 | 2009-02-26 | Fujifilm Corp | センシング装置およびこれを用いたセンシング方法 |
| JP2013235122A (ja) * | 2012-05-09 | 2013-11-21 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 微小物の３次元操作装置 |
| JP2014081417A (ja) * | 2012-10-15 | 2014-05-08 | Astro Design Inc | レーザー走査顕微鏡装置 |
| JP2022140443A (ja) * | 2016-12-22 | 2022-09-26 | 国立大学法人 筑波大学 | 処理システム、データ処理装置、表示システム及び顕微鏡システム |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101301969B1 (ko) * | 2012-05-10 | 2013-08-30 | 한국과학기술원 | 플라즈몬 나노안테나를 이용한 광학 트랩 형성 장치 |
| CN115078319A (zh) * | 2018-06-27 | 2022-09-20 | 因纽美瑞克斯公司 | 用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置及检测方法 |
| CN117241878A (zh) | 2021-03-05 | 2023-12-15 | 伊努梅里斯公司 | 用于生成微滴和执行数字分析的系统和方法 |
| EP4351788A1 (en) | 2021-06-04 | 2024-04-17 | Enumerix, Inc. | Compositions, methods, and systems for single cell barcoding and sequencing |
| US11834714B2 (en) | 2021-12-20 | 2023-12-05 | Enumerix, Inc. | Detection and digital quantitation of multiple targets |
-
1999
- 1999-11-18 JP JP32803199A patent/JP3568846B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003050588A1 (fr) * | 2001-12-13 | 2003-06-19 | Japan Science And Technology Corporation | Systeme optique permettant de renforcer les forces de capture a pinces optiques |
| US7087894B2 (en) | 2001-12-13 | 2006-08-08 | Japan Science And Technology Agency | Optical system for reinforcing optical tweezers capturing force |
| WO2004063730A1 (ja) * | 2003-01-16 | 2004-07-29 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | 蛍光測定装置 |
| CN100451623C (zh) * | 2003-01-16 | 2009-01-14 | 松下电器产业株式会社 | 荧光计 |
| US7459697B2 (en) | 2003-01-16 | 2008-12-02 | Panasonic Corporation | Fluorescence measuring equipment |
| JP2007538238A (ja) * | 2004-05-17 | 2007-12-27 | ショット アクチエンゲゼルシャフト | デバイス上の局所構造体を測定する方法 |
| JP2005337730A (ja) * | 2004-05-24 | 2005-12-08 | Nara Institute Of Science & Technology | 測定システム |
| WO2005114151A1 (ja) * | 2004-05-24 | 2005-12-01 | National University Corporation NARA Institute of Science and Technology | 測定システム |
| JP2006235319A (ja) * | 2005-02-25 | 2006-09-07 | Japan Science & Technology Agency | 微粒子移動制御装置 |
| JP2008020385A (ja) * | 2006-07-14 | 2008-01-31 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | 高分子の応力テンソルの時間変化の推算方法、高分子の３次元構造の構築方法、プログラム、情報記憶媒体、およびシステム |
| JP2009042112A (ja) * | 2007-08-09 | 2009-02-26 | Fujifilm Corp | センシング装置およびこれを用いたセンシング方法 |
| JP2013235122A (ja) * | 2012-05-09 | 2013-11-21 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 微小物の３次元操作装置 |
| JP2014081417A (ja) * | 2012-10-15 | 2014-05-08 | Astro Design Inc | レーザー走査顕微鏡装置 |
| JP2022140443A (ja) * | 2016-12-22 | 2022-09-26 | 国立大学法人 筑波大学 | 処理システム、データ処理装置、表示システム及び顕微鏡システム |
| JP7336654B2 (ja) | 2016-12-22 | 2023-09-01 | 国立大学法人 筑波大学 | 処理システム、データ処理装置、表示システム及び顕微鏡システム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3568846B2 (ja) | 2004-09-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3568846B2 (ja) | ３次元イメージ取得方法及びその装置 | |
| US7218446B2 (en) | Imaging system having a fine focus | |
| EP0807814B1 (en) | Two-photon molecular excitation in a laser scanning microscopy | |
| CN108971747A (zh) | 一种具备在线监测功能的超快激光微纳加工装置 | |
| CN107192702B (zh) | 分光瞳激光共焦cars显微光谱测试方法及装置 | |
| JP7249339B2 (ja) | 微小球レンズ組立体 | |
| JP7203464B2 (ja) | コヒーレント反ストークスラマン散乱顕微鏡結像装置 | |
| JP2012237647A (ja) | 多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡 | |
| CN108267445A (zh) | 三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置及方法 | |
| US20200278525A1 (en) | Microscope for imaging a sample and sample holder for such a microscope | |
| CN112414992A (zh) | 拉曼光谱激发增强模块 | |
| CN110960198A (zh) | 基于多维调节架的近红外二区共聚焦显微成像系统 | |
| CN114324183A (zh) | 大焦深的紫外光声显微成像系统及成像方法 | |
| US20110057121A1 (en) | Single nanoparticle tracking spectroscopic microscope | |
| JP2003344777A (ja) | 光ファイバ顕微鏡および内視鏡 | |
| JP2004361087A (ja) | 生体分子解析装置 | |
| JP2004144839A (ja) | 光走査装置 | |
| JP2000227556A (ja) | 顕微鏡 | |
| CN113568294A (zh) | 一种全息光镊融合结构光照明显微系统和方法 | |
| CN113710996A (zh) | 流动性试样的三维拉曼图像映射检测装置 | |
| JP2000356611A (ja) | 熱レンズ顕微鏡超微量分析方法とその装置 | |
| JP2001174708A (ja) | 赤外顕微鏡 | |
| KR20130121224A (ko) | 고속 영상 촬영 장치 및 그 방법 | |
| CN116678853B (zh) | 一种基于光热效应的干涉散射显微镜及成像方法 | |
| JP2836859B2 (ja) | ３次元空間分解・時間分解吸収スペクトル測定装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20040123 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040217 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040414 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040615 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040616 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090625 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090625 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100625 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100625 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110625 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120625 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130625 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140625 Year of fee payment: 10 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |