CN103926197B - 高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法与装置 - Google Patents
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Abstract
本发明属于光谱测量技术领域，涉及一种高空间分辨双轴差动共焦图谱成像方法与装置。本发明的核心思想是融合双轴差动共焦显微和光谱探测技术，采用分割焦斑差动探测实现几何位置的精密成像，简化了传统差动共焦显微系统的光路结构，继承了双轴显微技术的大视场、大工作距的优势，实现了系统高空间分辨图谱合一的探测。本发明不仅具有高空间分辨力，还具有三维层析几何成像、光谱探测和微区图谱层析成像三种模式，为微区光谱探测提供了一种新的解决途径，在生物医学、物理材料学等领域有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于光谱测量技术领域，涉及一种高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法与装置，可用于各类样品的三维形貌重构及微区光谱探测。
技术背景
自从1990年G.J.Puppels等在Nature期刊报道其发明共焦拉曼光谱显微技术并成功用于观测单细胞和染色体的形态与组成,共焦拉曼光谱显微技术迅速发展为一种极其重要的样品结构与成分分析的基本手段。该技术既继承了共焦显微术的高分辨层析成像特征，又可以对样品进行光谱分析，因而使激光共焦拉曼光谱显微技术在光谱测试领域独树一帜，并且迅速发展为一种极其重要的样品结构与成分分析的重要手段,使之广泛应用于化学﹑生物学﹑医学、物理学﹑地质学、法庭取证、刑侦学等学科的前沿基础研究中。
但是，由于受到“零视场”扫描成像方式和衍射极限的限制，传统共焦显微系统通常难以兼顾分辨能力、工作距离和视场。增大物镜的数值孔径可以改善共焦显微系统的分辨力，但数值孔径的增大反过来又制约了共焦显微系统工作距离的增大及视场范围的扩展。且大数值孔径物镜的尺寸通常在厘米量级，不利于系统的小型化。因而，1994年Stelzer等人提出了双轴共焦显微术，将照明光轴和测量光轴正交放置，对原有共焦显微光路进行了改进，实现了大工作距离、大视场和低数值孔径物镜的高轴向分辨力显微成像，及系统的小型化。
传统的激光共焦拉曼光谱仪采用单轴显微系统，导致瑞利散射光光强过大，降低了生物样品的可观测性，根据瑞利散射定则，当入射光与散射光方向垂直时，瑞利散射光强最弱，有利于系统观测高散射性的生物样品。国内外学者利用此特性，提出双轴共焦显微结构并广泛应用于生物领域，取得了一系列成果。例如，1999年，美国Wellman实验室和Schepens眼科研究中心的Webb和Rogomentich在《Confocalmicroscopewithlargefieldandworkingdistance》中提出了一种使用相对较小数值孔径物镜的双轴共焦显微系统，两个光轴的夹角小于90°，该系统实验光路的工作距离可达20mm，非常适合用于活体细胞学领域；2003年，美国斯坦福大学的ThomasWang等人在《Dual-axisconfocalmicroscopeforhigh-resolutioninvivoimaging》中将光纤和MEMS器件引入到双轴共焦显微成像系统中，研制出小型化的三维双轴共焦显微镜，用于高分辨力的医学活体成像；2008年，美国斯坦福大学研究小组研制成功两种规格的双轴共焦显微系统，封装直径分别为10mm和5mm，均可用于对非活体和活体成像。双轴结构的出现为活体样品的探测提供了解决途径，但是现有双轴技术仍不能满足现代科技对光谱探测技术的需求。
由于拉曼散射光十分微弱，为了降低拉曼光谱的能量损失，现有共焦拉曼技术中用于焦点定位的针孔尺寸通常较大，直径为150～200μm之间，而扩大针孔尺寸则会增加共焦轴向定位曲线的半高宽，降低其定位精度，不能很好的起到定焦作用。但是，现代科技的快速发展对微区光谱探测能力及空间分辨探测能力提出了更高的要求，若要提高空间分辨力及光谱探测能力，必须对系统进行精确定焦。在光学探测系统中，焦点处的测量聚焦光斑尺寸最小，激发光强最强，因此为了获得高空间分辨力和最优的光谱探测能力，必须使测量聚焦光斑位于焦点位置。
在差动共焦光路中，要求针孔、探测器中心与测量系统光轴重合，从而保证被测样品反射回的光束可以恰好进入探测器，但是，由于针孔尺寸较小，通常在10μm左右，使得针孔调节会有一定困难。另外，差动共焦光路中，两针孔的最优化轴向离焦量与物镜数值孔径N.A.相关，对于光路装调好的针孔位置只适用于特定的物镜N.A.，因而，无法根据样品更换物镜，从而导致差动共焦光路在实际应用中存在较大的局限性。
此外，拉曼散射光极其微弱，只有瑞利光束强度的10-3～10-6倍，而现有共焦拉曼光谱探测仪器只利用了微弱的拉曼散射光进行光谱探测而遗弃强于拉曼散射光103～106倍的瑞利光束，因而，在共焦拉曼光谱探测中如何改善光路结构从而提高拉曼散射光收集效率及利用现有光谱探测系统中遗弃的瑞利光束进行辅助探测是改善共焦拉曼光谱探测技术空间分辨力的新途径。
基于上述情况，本发明提出双轴差动共焦图谱显微系统，采用双轴方式降低瑞利散射光强度，提高系统空间分辨力；利用现有共焦拉曼光谱探测系统样品散射光中遗弃的瑞利光束构建双轴差动共焦显微成像系统实现样品三维几何位置的高空间分辨成像，利用差动共焦曲线过零点与焦点精确对应这一特性来控制光谱探测器精确捕获焦点处拉曼光谱信息，使其与光谱探测系统有机融合，从而，进行空间位置信息和光谱信息的同时探测，以期实现高空间分辨“图谱合一”成像与探测。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有共焦拉曼探测仪器中收集效率低、空间分辨力不足，以及不利于对环境背景光、光源强度波动等因素的抑制等缺陷，提出一种具有高空间分辨双轴差动共焦图谱探测方法与装置。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
本发明提出的高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法，采用双轴差动共焦的方式对被测样品进行图谱成像，其实现步骤为：
1)照明物镜与采集物镜对称分布在测量面法线两侧，并且照明光轴与测量面法线的夹角为θ1，采集光轴与测量面法线的夹角为θ2，以测量面法线方向为测量轴线，建立系统坐标系(x,y,z)，其中θ1＝θ2；
2)激发光经由照明物镜聚焦到被测样品上，激发出瑞利光和载有被测样品光谱特性的拉曼散射光，轴向即z向移动被测样品使瑞利光及对应被测样品不同区域的拉曼散射光被反射进入采集物镜，并被采集物镜会聚到二向色分光系统，光束经二向色分光系统分光后，拉曼散射光和瑞利光相互分离，瑞利光被二向色分光系统反射进入差动探测系统，拉曼散射光透射过二向色分光系统进入光谱探测系统获得光谱信号I(λ)，λ为波长；
3)对进入差动探测系统的瑞利光进行差动处理，其中，差动探测系统中两个相同的探测系统对称放置于测量光轴两侧，利用针孔横向偏移可使双轴共焦显微系统的轴向响应特性曲线产生相移的特性拟合出相应的差动共焦曲线，并获得差动信号I(x,y,z,vxM)，其中vxM是针孔横向偏移量，利用差动共焦曲线过零点与焦点位置精确对应的特性，通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点O位置，实现被测样品的高空间分辨的焦点定位；
4)将被测样品移动至焦点O处，重新获取焦点O处的光谱信号I(λ)；
5)利用数据处理系统将获得的差动信号I(x,y,z,vxM)和光谱信号I(λ)进行数据融合处理，以获得样品的位置信息和光谱信息的四维测量信息I(x,y,z,λ)；
6)完成上述步骤后，对被测样品进行横向扫描，即x、y方向，将被测样品移动到下一个点重复步骤2)、3)、4)、5)；
7)单独处理瑞利光的信号时，获得高空间分辨的三维尺度层析图像；单独处理拉曼散射光的信号时，获得光谱图像；同时处理瑞利光和拉曼散射光的信号时，获得高空间分辨的微区图谱层析成像，即被测样品几何位置信息和光谱信息的“图谱合一”。
本发明所示的测量方法中，差动探测系统中的两个相同的探测系统还可以是单一的探测系统即第一探测器，数据处理系统从第一探测器上获取焦斑图案后，计算出此时焦斑图案的中心，以此中心作为坐标原点，建立探测器像面上的坐标系(xd′,yd′)，在xd′轴上对称设置两个具有相同半径的圆形针孔对焦斑图案进行分割探测，分别为第一虚拟针孔和第二虚拟针孔，其位置分别对应上述两个探测系统，当对被测样品进行扫描时，数据处理系统分别计算出第一虚拟针孔和第二虚拟针孔范围内像素灰度总和，得到强度响应。
本发明所示的测量方法中，所述激发光是偏振光束：线偏光、圆偏光、径向偏振光；或是由光瞳滤波技术生成的结构光束。
本发明所示的测量方法中，光谱探测系统还可以探测荧光、布里渊散射光和康普顿散射光。
本发明还提供了高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像装置，包括光源，照明物镜，采集物镜和三维扫描工作台，还包括准直扩束镜，二向色分光系统，差动探测系统和光谱探测系统；其中，照明物镜和采集物镜对称地布局在测量面法线两侧，照明光轴与测量面法线的夹角为θ1，采集光轴与测量面法线的夹角为θ2，其中θ1＝θ2，准直扩束镜和照明物镜依次放在光源的出射光线方向，采集物镜和二向色分光系统依次放在被测样品的反射光线方向，差动探测系统放置在二向色分光系统的反射方向，光谱探测系统放在二向色分光装置透射方向。
本发明所示的测量装置中，还包括在准直扩束镜和照明物镜之间加入照明端光瞳滤波器，或者在采集物镜和差动探测系统之间加入采集端光瞳滤波器，或者在准直扩束镜和照明物镜之间加入照明端光瞳滤波器同时在采集物镜和差动探测系统之间加入采集端光瞳滤波器。
本发明所示的测量装置中，还包括在准直扩束镜和照明物镜之间加入偏振调制装置，或者在照明物镜和照明端光瞳滤波器之间加入偏振调制装置。
本发明所示的测量装置中，差动探测系统的探测装置是CCD探测器，或者是两个参数相同的点探测器。
本发明所示的测量装置中，还包括最后进行数据融合处理的数据处理系统。
本发明所示的测量装置中，光谱探测系统可以是共焦光谱探测装置，包括第一聚光镜、位于第一聚光镜焦点处的针孔、第二聚光镜、位于第二聚光镜焦点处的光谱仪及光谱仪后的第二探测器；还可以是普通光谱探测装置，包括第二聚光镜、位于第二聚光镜焦点处的光谱仪及光谱仪后的第二探测器。
有益效果
本发明对比已有技术有以下显著创新点：
1、将双轴差动共焦显微技术与光谱探测技术有机结合，利用双轴差动共焦显微系统轴向响应曲线的过零点与焦点位置精确对应的特性，通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点位置的光谱信息，并且进行对焦点位置的实时跟踪测量，实现高空间分辨的光谱探测；
2利用双轴结构，降低瑞利散射光强度；利用二向色分光装置对瑞利光和拉曼散射光进行分光，瑞利光进入差动探测系统进行几何位置探测，拉曼散射光进入拉曼光谱探测系统进行光谱探测，提高系统光谱探测灵敏度，二向色分光装置可以根据需要调整角度，有利于低波数拉曼光谱的探测；
3、将双轴差动共焦显微系统与拉曼光谱成像系统在结构和功能上相融合，既可实现样品微区几何参数的层析成像，又可实现样品微区的光谱探测，即同时实现微尺度层析成像、图谱层析成像和光谱测试三种成像模式，并显著改善成像测试系统的抗干扰能力、线性和离焦特性；
4、该系统可选用单一CCD探测器结合计算机软件实现虚拟针孔差动或共焦探测，探测方式灵活，有利于实际应用中不同行N.A.物镜的转换，更有利于实现仪器的通用性。
本发明对比已有技术具有以下显著优点：
1、与单轴拉曼光谱系统相比，降低了瑞利散射光强度；
2、采用分割焦斑的横向差动共焦方式，便于系统根据需求更换物镜，调节方便；
3、二向色分光装置可以根据需求进行调整，以提高系统低波数探测能力；
4、双轴差动共焦光路的采用提高了系统的信噪比，并使测量系统具有绝对零点和双极性跟踪的特性，提高了层析精度的同时还可实现绝对测量。
附图说明
图1为高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法示意图；
图2为高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法示意图；
图3信号探测过程示意图；
图4为高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像装置示意图；
图5为带偏振调制的高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像装置示意图；
图6为高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法与装置实施例1示意图；
图7为高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法与装置实施例2示意图；
其中，1-光源，2-照明物镜，3-被测样品，4-照明光轴，5-测量面法线，6-θ1，7-采集物镜，8-二向色分光系统，9-测量透镜，10-显微物镜，11-第一探测系统，12-第二探测系统，13-测量光轴，14-针孔横向偏移量，15-差动探测系统，16-焦斑图案，17-第二探测系统光斑，18-第一探测系统光斑，19-光谱探测系统，20-采集光轴，21-数据处理系统，22-第一探测器，23-第二虚拟针孔，24-第一虚拟针孔，25-准直扩束系统，26-三维扫描工作台，27-差动共焦曲线，28-照明端光瞳滤波器，29-偏振调制装置，30-采集端光瞳滤波器，31-第一聚光镜，32-针孔，33-第二聚光镜，34-光谱仪，35-第二探测器，36-共焦拉曼曲线，37-θ2。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例中，光源1为激光器，偏振调制装置29为径向偏振光产生器，二向色分光系统8为Notchfilter，数据处理系统21为计算机，第一探测器22为第一CCD探测器，第二探测器35为第二CCD探测器。
如图2、图3和图6所示，照明物镜2与采集物镜7对称分布在测量面法线5两侧，并且照明光轴4与测量面法线5的夹角为θ16，采集光轴20与测量面法线5的夹角为θ237，其中θ1＝θ2，以测量面法线5方向为测量轴线，建立系统坐标系(x,y,z)，高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法，其测量步骤是：
首先，激光器1发出的光束经准直扩束系统25后，进行扩束出射后成为与照明物镜2入瞳直径相等的平行光，经过径向偏振光产生器29后成为径向偏振光，径向偏振光经照明端光瞳滤波器28后光束被调制，经由照明物镜2形成压缩光斑聚焦到放置在三维扫描工作台26上的被测样品3表面，并激发出瑞利光和载有被测样品3光谱特性的拉曼散射光，被测样品3可通过增强拉曼光谱纳米粒子等拉曼增强技术进行处理，以提高拉曼散射光的强度。
轴向(即图中的Z方向)移动三维扫描工作台26来轴向扫描被测样品3，移动时使瑞利光及对应被测样品3不同区域的拉曼散射光被反射进入采集物镜7，经过采集物镜7收集的光束被Notchfilter8进行分光。
被Notchfilter8反射的瑞利光，经过采集端光瞳滤波器30调制后，通过测量透镜9进行汇聚到差动探测系统15，汇聚光斑经过显微物镜10放大并成像在第一CCD探测器22上；透射过Notchfilter8的拉曼散射光进入光谱探测系统19，光谱探测系统19为共焦拉曼光谱探测系统，拉曼散射光被第一聚光镜31会聚到针孔32，经过第二聚光镜33会聚进入光谱仪34，最后入射到第二CCD探测器35，获得被测样品3的拉曼光谱I(λ)，λ为波长，如共焦拉曼曲线36所示。
测量过程中，计算机21从第一CCD探测器22上获取焦斑图像16，计算出此时焦斑图像16的中心，以此中心作为坐标原点，建立CCD像面上的坐标系(xd′,yd′)，在xd′轴上对称设置两个具有相同半径的圆形虚拟针孔对焦斑图像16进行分割探测，分别为第一虚拟针孔24和第二虚拟针孔23，其对应的针孔横向偏移量14为M；当对被测样品3进行扫描时，计算机21分别计算出第一虚拟针孔24和第二虚拟针孔23范围内像素灰度总和，分别对应为焦斑图像16中的第一探测系统光斑18和第二探测系统光斑17，得到强度响应I1(x,y,z,-vxM)和I2(x,y,z,+vxM)，其中vxM是针孔横向偏移量。
计算机21对I1(x,y,z,-vxM)和I2(x,y,z,+vxM)进行差动相减处理，得到带有被测样品3凸凹变化的强度响应I(x,y,z,vxM)，
I(x,y,z,vxM)＝I1(x,y,z,-vxM)-I2(x,y,z,+vxM)(1)
根据公式(1)的结果拟合出相应差动共焦曲线27，利用差动共焦曲线27过零点与焦点位置精确对应的特性，获系统焦点O的位置，并通过三维扫描工作台26将被测样品3移动至焦点O位置。那么此时可重新捕获被测样品3在焦点O处的拉曼光谱I(λ)。
将I(λ)、I(x,y,z,vxM)传送到计算机21进行数据处理，从而获得包含被测样品3位置信息I(x,y,z,vxM)和光谱信息I(λ)的四维测量信息I(x,y,z,λ)。
完成上述步骤后，利用三维扫描工作台26对被测样品3进行横向扫描(即图中的x、y方向)，移动到下一个点后，利用三维扫描工作台26对被测样品3进行轴向扫描(即图中的z方向)，获取系统焦点O的位置后，将被测样品3移动到焦点O处，并获取光谱信息。
通过上述过程，即可获得精确的光谱信息，实现焦点位置的光谱探测和三维几何位置探测，其中，通过对测量信息{I(λ)，I(x,y,z)}的融合处理，可实现式(2)所示的三种测量模式，即：微区图谱层析成像测试、三维尺度层析成像和光谱测试。
当θ＝45°时，照明光轴4和采集光轴20相互垂直，此时被测样品3的瑞利光光强最弱，有利于系统观测高散射性生物样品。
如图6所示，高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像装置包括沿光路依次放置的激光器1、准直扩束系统25、径向偏振光产生器29、照明端光瞳滤波器28、照明物镜2、被测样品3、三维扫描工作台26，及光路反射方向的采集物镜7、Notchfilter8、位于Notchfilter8透射方向的拉曼光谱探测系统19、位于Notchfilter8反射方向的采集端光瞳滤波器30、测量透镜9及差动探测系统15、及连接差动探测系统15与拉曼光谱探测系统19的计算机21；其中，拉曼光谱探测系统19包括沿光路依次放置的第一聚光镜31、位于第一聚光镜31焦点位置的针孔32、位于针孔32后的第二聚光镜33、位于第二聚光镜33焦点位置的光谱仪34及位于光谱仪后的第二CCD探测器35；差动探测系统15包括位于测量透镜9焦点处的显微物镜10，及位于显微物镜10焦点处的第一CCD探测器22。
实施例2
本实施例中，偏振调制系统29为径向偏振光产生器，二向色分光系统8为Notchfilter，第一探测系统11第一点探测器，第二探测系统12第二点探测器，数据处理系统21为计算机，第一探测器22为第一CCD探测器，第二探测器35为第二CCD探测器。
如图1、图4、图5和图7所示，将实施例1图6中的第一CCD探测器替换为图7的两个参数相同的点探测器，分别是第一点探测器11和第二点探测器12，即可构成实施例2。第一点探测器11和第二点探测器12所在的位置分别与实施例1的第一虚拟针孔24和第二虚拟针孔23所在的位置对应。第一虚拟针孔24和第二虚拟针孔23所在的位置可根据系统参数事先计算得出。
在对样品进行轴向扫描时，设被测样品3位于系统焦平面上时为系统初始位置，此时探测面上的焦斑16中心与(xd,yd)坐标系原点重合，如图3(1)所示，此时第一点探测器11和第二点探测器12探测到的信号大小相同，差动相减后的信号大小为零，即该特性曲线的零点位置对应系统焦点位置。当被测样品3沿着z轴向靠近透镜方向移动时，此时探测面上的焦斑位置如图3(2)和(3)所示，焦斑中心趋近于第二点探测器12，第二点探测器12接收到的光强比如图3(1)所示初始位置要大；另一方面，此时的焦斑中心相对于第一点探测器11是处于远离状态，因此，第一点探测器11接收到的光强比初始位置要小，则此时由第一点探测器11的信号I1(x,y,z,-vxM)和第二点探测器12的信号I2(x,y,z,+vxM)相减得到的差动信号I(x,y,z,vxM)相对于初始位置的差动信号减小。同理，当被测样品3沿着z轴向远离物镜方向移动时，此时探测面上的焦斑位置如图3(4)和(5)所示，焦斑中心趋近于第一点探测器11，第一点探测器11接收到的光强比初始位置大，而第二点探测器12接收到的光强比初始位置要小，则此时的差动信号I(x,y,z,vxM)相对于初始位置的差动信号增大。驱动被测样品3沿着z轴作轴向扫描运动，将第一点探测器11和第二点探测器12探测到的信号进行差动相减，即可得到双轴差动共焦显微技术的响应函数I(x,y,z,vxM)。图3中的曲线27是双轴差动共焦显微技术的轴向响应函数I(x,y,z,vxM)的示意图。
其余测量方法与装置与实施例1相同。
以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上的改动都是本发明的保护范围。
Claims (10)
1.高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法，采用双轴差动共焦的方式对被测样品进行图谱成像，其特征在于：
1)照明物镜(2)与采集物镜(7)对称分布在测量面法线(5)两侧，并且照明光轴(4)与测量面法线(5)的夹角为θ1(6)，采集光轴(20)与测量面法线(5)的夹角为θ2(37)，以测量面法线(5)方向为测量轴线，建立系统坐标系(x,y,z)，其中θ1＝θ2；
2)激发光经由照明物镜(2)聚焦到被测样品(3)上，激发出瑞利光和载有被测样品光谱特性的拉曼散射光，轴向即z向移动被测样品(3)使瑞利光及对应被测样品(3)不同区域的拉曼散射光被反射进入采集物镜(7)，并被采集物镜(7)会聚到二向色分光系统(8)，光束经二向色分光系统(8)分光后，拉曼散射光和瑞利光相互分离，瑞利光被二向色分光系统(8)反射进入差动探测系统(15)，拉曼散射光透射过二向色分光系统(8)进入光谱探测系统(19)获得光谱信号I(λ)，λ为波长；
3)对进入差动探测系统(15)的瑞利光进行差动处理，其中，差动探测系统(15)中两个相同的探测系统(11、12)对称放置于测量光轴(13)两侧，利用针孔横向偏移可使双轴共焦显微系统的轴向响应特性曲线产生相移的特性拟合出相应的差动共焦曲线(27)，并获得差动信号I(x,y,z,vxM)，其中vxM是针孔横向偏移量，利用差动共焦曲线过零点与焦点位置精确对应的特性，通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点O位置，实现被测样品的高空间分辨的焦点定位；
4)将被测样品(3)移动至焦点O处，重新获取焦点O处的光谱信号I(λ)；
5)利用数据处理系统(21)将获得的差动信号I(x,y,z,vxM)和光谱信号I(λ)进行数据融合处理，以获得样品的位置信息和光谱信息的四维测量信息I(x,y,z,λ)；
6)完成上述步骤后，对被测样品(3)进行横向扫描，即x、y方向，将被测样品(3)移动到下一个点重复步骤2)、3)、4)、5)；
7)单独处理瑞利光的信号时，获得高空间分辨的三维尺度层析图像；单独处理拉曼散射光的信号时，获得光谱图像；同时处理瑞利光和拉曼散射光的信号时，获得高空间分辨的微区图谱层析成像，即被测样品几何位置信息和光谱信息的“图谱合一”。
2.根据权利要求1所述的高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法，其特征在于：差动探测系统(15)中的两个相同的探测系统(11、12)还可以是单一的探测系统即第一探测器(22)，数据处理系统(21)从第一探测器(22)上获取焦斑图案(16)后，计算出此时焦斑图案(16)的中心，以此中心作为坐标原点，建立探测器像面上的坐标系(xd′,yd′)，在xd′轴上对称设置两个具有相同半径的圆形针孔(23、24)对焦斑图案(16)进行分割探测，分别为第一虚拟针孔(24)和第二虚拟针孔(23)，其位置分别对应上述两个探测系统(11、12)，当对被测样品(3)进行扫描时，数据处理系统(21)分别计算出第一虚拟针孔(24)和第二虚拟针孔(23)范围内像素灰度总和，得到强度响应。
3.根据权利要求1所述的高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法，其特征在于：所述激发光是偏振光束：线偏光、圆偏光、径向偏振光；或是由光瞳滤波技术生成的结构光束。
4.根据权利要求1所述的高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法，其特征在于：光谱探测系统还可以探测荧光、布里渊散射光和康普顿散射光。
5.高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像装置，包括光源(1)，照明物镜(2)，采集物镜(7)和三维扫描工作台(26)，其特征在于：还包括准直扩束镜(25)二向色分光系统(8)，差动探测系统(15)和光谱探测系统(19)；其中，照明物镜(2)和采集物镜(7)对称地布局在测量面法线(5)两侧，照明光轴(4)与测量面法线(5)的夹角为θ1(6)，采集光轴(20)与测量面法线(5)的夹角为θ2(37)，其中θ1＝θ2，准直扩束镜(25)和照明物镜(2)依次放在光源(1)的出射光线方向，采集物镜(7)和二向色分光系统(8)依次放在被测样品(3)的反射光线方向，差动探测系统(15)放置在二向色分光系统(8)的反射方向，光谱探测系统(19)放在二向色分光系统(8)透射方向。
6.根据权利要求5所述的高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像装置，其特征在于：还包括在准直扩束镜(25)和照明物镜(2)之间加入照明端光瞳滤波器(28)，或者在采集物镜(7)和差动探测系统(15)之间加入采集端光瞳滤波器(30)，或者在准直扩束镜(25)和照明物镜(2)之间加入照明端光瞳滤波器(28)同时在采集物镜(7)和差动探测系统(15)之间加入采集端光瞳滤波器(30)。
7.根据权利要求5或6所述的高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像装置，其特征在于：还包括在准直扩束镜(25)和照明物镜(2)之间加入偏振调制装置(29)，或者在照明物镜(2)和照明端光瞳滤波器(28)之间加入偏振调制装置(29)。
8.根据权利要求5或6所述的高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像装置，其特征在于：差动探测系统(15)的探测装置是CCD探测器，或者是两个参数相同的点探测器。
9.根据权利要求5所述的高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像装置，其特征在于：还包括最后进行数据融合处理的数据处理系统(21)。
10.根据权利要求5或6所述的高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像装置，其特征在于：光谱探测系统(19)可以是共焦光谱探测装置，包括第一聚光镜(31)、位于第一聚光镜焦点处的针孔(32)、第二聚光镜(33)、位于第二聚光镜(33)焦点处的光谱仪(34)及光谱仪(34)后的第二探测器(35)；还可以是普通光谱探测装置，包括第二聚光镜(33)、位于第二聚光镜(33)焦点处的光谱仪(34)及光谱仪(34)后的第二探测器(35)。
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