DE102011055367B4 - Verfahren und Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels, insbesondere eines einzelnen Moleküls, in einer Probe - Google Patents

Verfahren und Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels, insbesondere eines einzelnen Moleküls, in einer Probe Download PDF

Info

Publication number
DE102011055367B4
DE102011055367B4 DE102011055367.3A DE102011055367A DE102011055367B4 DE 102011055367 B4 DE102011055367 B4 DE 102011055367B4 DE 102011055367 A DE102011055367 A DE 102011055367A DE 102011055367 B4 DE102011055367 B4 DE 102011055367B4
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
particle
light
sample
photons
minimum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE102011055367.3A
Other languages
English (en)
Other versions
DE102011055367A1 (de
Inventor
Stefan W. Hell
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to DE102011055367.3A priority Critical patent/DE102011055367B4/de
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority to EP12788175.3A priority patent/EP2780694B1/de
Priority to PCT/EP2012/072375 priority patent/WO2013072273A1/en
Priority to CN201280055918.5A priority patent/CN103930769B/zh
Priority to JP2014540501A priority patent/JP6078889B2/ja
Priority to RU2014124189A priority patent/RU2610928C2/ru
Publication of DE102011055367A1 publication Critical patent/DE102011055367A1/de
Priority to US14/050,583 priority patent/US9291562B2/en
Application granted granted Critical
Publication of DE102011055367B4 publication Critical patent/DE102011055367B4/de
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/04—Investigating sedimentation of particle suspensions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1434—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

Verfahren zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels (2) in einer Probe (3), wobei der Partikel (2) mit Licht (4) zur Emission von Photonen veranlasst wird und wobei von dem Partikel (2) emittierte Photonen registriert werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (4) mit einer ein räumlich begrenztes Minimum (19) aufweisenden Intensitätsverteilung (18) auf die Probe (3) gerichtet wird und dass das Minimum (18) dem sich in der Probe (3) bewegenden Partikel (2) nachgeführt wird, indem die Intensitätsverteilung (18) so gegenüber der Probe (3) verschoben wird, dass eine Rate der von dem Partikel (2) emittierten Photonen minimal bleibt.

Description

  • TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels in einer Probe, wobei der Partikel mit Licht zur Emission von Photonen veranlasst wird und wobei von dem Partikel emittierten Photonen registriert werden. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf eine Vorrichtung zur Durchführung eines solchen Verfahrens mit einer Lichtquelle für das Licht und mit einem Detektor, um die Photonen zu registrieren.
  • Der Partikel dessen Bewegung in der Probe verfolgt wird, kann ein einzelnes Molekül, eine sich gemeinsam bewegende Gruppe von Molekülen, ein Komplex, ein Quantum-Dot, ein reflektierender Goldpartikel oder dergleichen sein. Der Prozess, aufgrund dessen der Partikel durch das Licht zur Emission von Potonen gebracht wird, wird häufig Fluoreszenz sein. Grundsätzlich sind aber auch andere Prozesse, einschließlich Streuung des Lichts, als Grundlage der Emission der Photonen nutzbar. Dabei kann der jeweilige Prozess, der zu der Emission der Photonen führt, unmittelbar mit dem zu verfolgenden Partikel oder mit einem Marker, insbesondere einem Farbstoff, verknüpft sein, mit dem der Partikel markiert ist.
  • STAND DER TECHNIK
  • Zum Verfolgen einer Bewegung eines einzelnen Moleküls in einer Probe ist es bekannt, das Molekül mit Licht zur Emission von Photonen anzuregen und die von dem Molekül emittierten Photonen mit einem die Probe abbildenden zweidimensionalen Detektor zu registrieren, um die momentane Position des Moleküls aus der räumlichen Verteilung abzuleiten, in der die Photonen von dem Detektor registriert werden. Dabei kann bei geeigneter Abstimmung der Pixeldichte des Detektors aus der räumlichen Verteilung der Photonen mit höherer räumlicher Auflösung als der Beugungsgrenze auf die aktuelle Position des Moleküls geschlossen werden.
  • Weitere Voraussetzung hierfür ist jedoch, dass für jede Position des Moleküls eine größere Anzahl von Photonen registriert werden kann, weil aus einer Mehrzahl von registrierten Photonen nur dann mit einer verbesserten räumlichen Auflösung auf den Ort des Moleküls geschlossen werden kann, wenn dieser über die Registrierung der Photonen hinweg unverändert geblieben ist. Die räumliche Auflösung ausgedrückt als der Radius Δr, innerhalb dessen sich die wahre Position eines Moleküls um die nach dem Schwerpunkt des Beugungsmusters des Moleküls auf dem Detektor bestimmte Position befindet, hängt dabei gemäß Δr = FWHM/N1/2 (1) von der Anzahl N der registrierten Photonen und der Halbwertsbreite FWHM des Beugungsmusters ab.
  • Da das bekannte Verfahren zum Verfolgen einer Bewegung eines einzelnen Moleküls also eine große Anzahl N von Photonen für jede zu erfassende Position des Moleküls in der Probe benötigt, wird das Molekül bei diesem Verfahren erheblich beansprucht, woraus eine hohe Gefahr des Bleichens des Moleküls resultiert. Beim Bleichen verändert sich das Molekül aus einem angeregten Zustand heraus chemisch, so dass keine Photonen von ihm mehr erhalten werden können. Neben diesem photochemischen Bleichen kann ein Molekül, das häufig zur Emission von Photonen angeregt wird, auch in einen metastabilen Dunkelzustand gelangen, aus dem es zwar nach längerer Zeit wieder zurückkehrt, in dem es jedoch zwischenzeitlich keine Photonen mehr emittiert, mit deren Hilfe seine Position erfasst werden kann.
  • Aus den voranstehenden Gründen sind nur wenige Moleküle, d. h. nur wenige sogenannte Fluoreszenzfarbstoffe, zur Verwendung bei dem bekannten Verfahren geeignet. Viele Fluoreszenzfarbstoffe bleichen zu schnell, um ihre Bewegung oder die Bewegung eines mit ihnen markierten Moleküls über einen längeren Zeitraum oder Weg in der Probe verfolgen zu können.
  • Während bei den voranstehend geschilderten Verfahren die Position des Moleküls aus der Verteilung der Positionen, an denen die von dem Molekül emittierten Photonen von einem zweidimensionalen Detektor registriert werden, abgeleitet wird, wobei dieses Vorgehen als Lokalisation bezeichnet wird, wird bei der STED- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie der räumliche Bereich, in dem Moleküle in einer Probe effektiv zur Emission von Photonen angeregt werden, bis unter die Beugungsgrenze hinab eingegrenzt. So können aus der Probe heraus emittierte Photonen unabhängig von dem Ort ihrer Registrierung und ihrer Anzahl diesem räumlichen Bereich zugeordnet werden. Konkret erfolgt die Eingrenzung des Bereichs der effektiven Anregung zur Emission von Photonen dadurch, dass ein fokussierter Anregungslichtstrahl mit einem Interferenzmuster aus kohärenten Fluoreszenzverhinderungslichtstrahlen überlagert wird, das am Fokuspunkt des Anregungslichtstrahls eine Nullstelle aufweist. Bei hoher absoluter Intensität der Fluoreszenzverhinderungslichtstrahlen steigt die Intensität des Fluoreszenzverhinderungslichts im Randbereich der Nullstelle sofort auf einen Sättigungsgrenzwert IS an, ab dem die Emission von Photonen durch Moleküle in der Probe im Wesentlichen vollständig verhindert wird. Dabei gilt für die erzielbare Ortsauflösung Δr = λ/(nsinα(1 + I/IS)1/2) (2), wobei I die maximale Intensität der Fluoreszenzverhinderungslichtstrahlen in der Probe ist,
  • Die Fluoreszenzverhinderung erfolgt bei der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie durch stimulierte Emission. Bei der RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie erfolgt sie durch vorübergehendes Umschalten der Moleküle in einen nichtfluoreszenzfähigen Konformationszustand. Die Gefahr des Bleichens verwendeter Farbstoffe ist bei der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie durch die notwendigerweise hohe absolute Intensität des Fluoreszenzverhinderungslichts relativ groß. Bei der RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie werden zwar keine besonders hohen Intensitäten des Fluoreszenzverhinderungslichts benötigt, hier sind jedoch spezielle, ein Umschalten in den nichtfluoreszenzfähigen Konformationszustand erlaubende Fluoreszenzfarbstoffe erforderlich.
  • Grundsätzlich wäre es zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels in einer Probe denkbar, diesem mit einem räumlich reduzierten Bereich der effektiven Anregung zur Emission von Fluoreszenzlicht nachzufahren, wie er sich bei der STED- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie ergibt. Dabei wäre zu jedem Zeitpunkt die Rate der Photonen, die von dem verfolgten Partikel emittiert werden, zu maximieren, um die Schlussfolgerung treffen zu können, dass sich der Partikel in dem räumlich reduzierten Bereich der effektiven Anregung zur Emission von Fluoreszenzlicht befindet. Zwar müsste dabei nicht jeweils eine so große Anzahl von Photonen wie bei der Lokalisation von dem Partikel registriert werden. Dennoch ließe sich die Anzahl der verwendbaren Partikel und Marker gegenüber dem zuvor beschriebenen bekannten Verfahren zum Verfolgen einer Bewegung eines einzelnen Moleküls über längere Strecken nicht wesentlich erhöhen. Zudem wären wie bei der STED- und RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie unterschiedliche und sowohl räumlich als auch bezüglich ihrer Wellenlänge aufeinander abgestimmte Anregungs- und Fluoreszenzverhinderungslichtstrahlen einzusetzen.
  • Die Druckschrift DE 25 46 952 A1 betrifft ein optisches System zur Untersuchung der Bewegung von Partikeln in einer Probe. Die Probe wird mit Licht beleuchtet, das die Partikel zur Emission von Photonen, d. h. von Fluoreszenzlicht oder Streulicht, veranlasst. Die Beleuchtung der Probe mit dem Licht erfolgt unter abgeschwächter Totalreflektion (ATR) mit einer räumlich modulierten Intensitätsverteilung. Durch die räumlich modulierte Intensitätsverteilung wird erreicht, dass eine Bewegung eines Partikels zu einer Modulation des von dem Partikel emittierten Fluoreszenz- oder Streulichts führt. Unter Berücksichtigung der räumlichen Modulation der Intensitätsverteilung kann anhand der detektierten Modulation des emittierten Fluoreszenz- oder Streulichts auf die Bewegung des Partikels geschlossen werden. Bewegt sich das Partikel entlang einer Trajektorie, bei der es einer gleichbleibenden Lichtintensität ausgesetzt ist, kann die Bewegung des Partikels mit dem optischen System aus DE 25 46 952 A1 allerdings nicht erfasst werden. Insbesondere kann ein Partikel, das sich nur in einem Bereich verschwindend geringer Lichtintensität befindet, mit dem optischen System nicht verfolgt werden. Vielmehr muss der Partikel bei seiner Bewegung Bereiche unterschiedlicher Lichtintensität passieren, damit die Bewegung des Partikels in der Probe mit dem optischen System erfasst werden kann. Entsprechend muss auch mit dem optischen System aus DE 25 46 952 A1 die Gefahr des Bleichens des Partikels in Kauf genommen werden.
  • AUFGABE DER ERFINDUNG
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels in einer Probe aufzuzeigen, bei denen die Gefahr des Bleichens des Partikels oder seines Markers auch bei der Verfolgung seiner Bewegung über einen längeren Zeitraum und längere Strecken gering bleibt, indem sie mit einer minimalen Anzahl von emittierten Photonen auskommen.
  • LÖSUNG
  • Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 10 gelöst. Die abhängigen Patentansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels in einer Probe, wobei das Partikel mit Licht zur Emission von Photonen veranlasst wird und wobei von dem Partikel emittierten Photonen registriert werden, wird das Licht mit einer ein räumlich begrenztes Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet und das Minimum wird dem sich in der Probe bewegenden Partikel nachgeführt, indem die Intensitätsverteilung so gegenüber der Probe verschoben wird, dass eine Rate der von dem Partikel emittierten Photonen minimal bleibt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren macht von einer Intensitätsverteilung Gebrauch, die ein räumlich begrenztes Minimum aufweist. Wie bei dem Fluoreszenzverhinderungslicht in der STED- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie wird diese Intensitätsverteilung vorzugsweise als Interferenzmuster kohärenter Lichtstrahlen ausgebildet, wobei das räumlich begrenzte Minimum eine Nullstelle des Interferenzmusters ist. Die räumlichen Abmessungen des Minimums können so besonders klein gehalten werden, insbesondere kleiner als die Beugungsgrenze. Anders als bei der STED- und RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie wird das Licht mit dieser speziellen Intensitätsverteilung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren aber nicht zur Verhinderung von Fluoreszenz genutzt, sondern um den zu verfolgenden Partikel in der Probe zur Emission von Photonen zu veranlassen. Zudem wird die Probe nicht mit dem Minimum der Intensitätsverteilung abgescannt, sondern die Intensitätsverteilung wird gegenüber der Probe fortlaufend so verschoben, dass die Rate der von dem Partikel emittierten und registrierten Photonen minimiert wird. Dies weist jeweils darauf hin, dass sich der Partikel weiter am Ort des Minimums der Intensitätsverteilung befindet. Bei außerhalb des Minimums steil ansteigender Intensität des Lichts und hierauf basierend schneller Nachführung der Intensitätsverteilung bezüglich der aktuellen Position des Partikels in der Probe kann mit dem neuen Verfahren die Bewegung des Partikels mit einer räumlichen Auflösung deutlich unterhalb der Beugungsgrenze verfolgt werden, ohne dass der Partikel hierfür viele Photonen zu emittieren braucht. Entsprechend ist die Gefahr eines Bleichens des Partikels stark reduziert. In der Konsequenz können auch gegenüber Bleichen empfindliche Partikel über längere Zeiträume bzw. längere Strecken in der Probe problemlos verfolgt werden. Gegenüber Methoden der STED- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie kommt hinzu, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nur die das Minimum aufweisende Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet wird und so weder räumlich noch bezüglich ihrer Wellenlänge mit einem weiteren Lichtstrahl abgestimmt werden muss. Hieraus resultiert auch ein optischer Aufbau der deutlich weniger komplex ist, als derjenige eines STED- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskops. Noch ein wesentlicher Unterschied des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber der STED- und auch der RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie ist es, dass die absolute Intensität des Lichts mit der das Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung vergleichsweise gering ausfallen kann, wenn sie bereits bei geringen Intensitäten außerhalb ihrer Nullstelle zur Emission von Photonen führt. Eine Sättigung der Anregung zur Emission außerhalb der Nullstelle muss in jedem Fall auch für eine räumliche Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze nicht angestrebt werden. Vielmehr ist häufig ein erkennbarer Anstieg dieser Anregung von der Nullstelle weg günstig. Letztlich gehört es bereits zu den kennzeichnenden Merkmalen der Erfindung, dass die Anzahl der von dem verfolgten Partikel emittierten Photonen und so zugleich die Gefahr seinen Bleichens minimiert wird.
  • Das Verschieben der Intensitätsverteilung gegenüber der Probe zur fortlaufenden Minimierung der Rate der von dem Detektor registrierten Photonen kann auf einem Trial- and Error-Verfahren basieren. Das heißt, die Intensitätsverteilung wird probeweise in kleinen Schritten verschoben. Wenn sich durch die Verschiebung eine Reduktion der Rate der registrierten Photonen ergibt, die ein Maß für die Rate der emittierten Photonen ist, wird die Verschiebung in derselben Richtung fortgesetzt. Im anderen Fall wird die Verschiebung einer anderen Richtung, zum Beispiel der Gegenrichtung, probiert. Dem Fachmann sind hierzu unter den Schlagworten ”Tracking-Verfahren” und ”Fuzzy-Logik” verschiedene Detailausgestaltungsmöglichkeiten bekannt.
  • Von der STED- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie kann der Fachmann aber alle Maßnahmen übernehmen, die dort zur Formung einer ein Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung von Fluoreszenzverhinderungslicht bekannt sind. Hierzu zählen Phasenplatten, Spatial Light Modulatoren, 4 Pi-Anordnungen und dergleichen.
  • Auch für die Verlagerung der Intensitätsverteilung mit dem Minimum gegenüber der Probe kann auf Scanner zurückgegriffen werden, wie sie aus der STED- und RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie bekannt sind. Hierzu zählen zum Beispiel akusto-optische oder elektro-optische Reflektoren, Drehspiegel oder an dem jeweiligen Objektiv angreifende Piezosteller, die die Lichtstrahlen gegenüber der Probe ausrichten, oder Piezosteller, die die Probe gegenüber den Lichtstrahlen ausrichten.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Minimum der Intensitätsverteilung ein-, zwei- oder dreidimensional begrenzt sein, d. h. es kann eine Ebene, eine Linie oder einen Punkt beschreiben. Beim Verfolgen der Bewegung des Partikels wird die Intensitätsverteilung dann in all den Richtungen der Dimensionen gegenüber der Probe verschoben, in denen das Minimum begrenzt ist. Eine Verschiebung in einer Richtung, in der das Minimum nicht begrenzt ist, kann zu keiner Veränderung der Rate der von dem Partikel emittierten Photonen führen und ist daher nicht sinnvoll. Dies ist gleichbedeutend damit, dass in dieser Richtung die Bewegung des Partikels auch nicht verfolgt werden kann. Diese Richtung ist also vorzugsweise so auszurichten, dass in ihr keine Bewegung des Partikels zu erwarten ist. Vielfach sind Bewegungen von Partikeln in einer Probe sowieso auf solche längs einer bestimmten Struktur beschränkt. Bei einer zweidimensionalen Probe entfällt bereits grundsätzlich die Bewegung der Partikels in der dritten Dimension.
  • Es ist aber auch möglich, die Phasenbeziehung der Lichtstrahlen, aus denen die Intensitätsverteilung durch Interferenz generiert wird, zu modulieren, um das Minimum aus unterschiedlichen Richtungen ein- oder zweidimensional zu begrenzen. So kann bei der einen Phasenbeziehung das Minimum in einer x-y-Ebene ringförmig begrenzt sein, während es bei der anderen Phasenbeziehung in z-Richtung begrenzt ist. Alternativ können verschiedene aufeinander folgende Phasenbeziehungen zu in unterschiedlichen Richtungen ausgerichteten linien- oder flächenförmigen Minima führen, die als rotierende Streifen bezeichnet werden können und die einen Punkt oder eine Linie als räumliche Schnittmenge aufweisen. Wenn zwischen solchen verschiedenen Phasenbeziehungen schnell umgeschaltet wird und für jede Phasenbeziehung einzeln oder auch über die gesamte Variation der Phasenbeziehungen das Minimum der Rate der von dem Partikel emittierten Photonen aufgesucht wird, kann die Bewegung des Partikels in der Probe in allen drei Dimensionen verfolgt werden.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die Photonen, die von dem Partikel emittiert werden, ausschließlich mit einem Punktdetektor registriert werden, weil es primär auf die Rate dieser Photonen ankommt. Der aktuelle Ort des Partikels in der Probe kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren allein daraus bestimmt werden, welche Lage die Intensitätsverteilung mit dem Minimum aktuell gegenüber der Probe hat. Diese Lage ist aus der Stellung der Einrichtungen, mit denen die Intensitätsverteilung gegenüber der Probe verschoben wird, ableitbar, zum Beispiel aus den momentanen Stellungen der zum Verlagern der Intensitätsverteilung verwendeten Scanner. Die Lage der Intensitätsverteilung gegenüber der Probe kann aber auch direkt erfasst werden, indem beispielsweise ihr Bild auf einer die Probe abbildenden Kamera ausgewertet wird. Auch hierbei kann eine Auflösung jenseits der Beugungsgrenze erreicht werden.
  • Eine die Probe abbildende Kamera kann auch dazu genutzt werden, eine Ausgangslage des Partikels bei nicht räumlich strukturierter Beleuchtung der Probe mit dem zur Emission von Photonen veranlassenden Licht zu erfassen. Wenn dabei mehrer Photonen emittierende Partikel erkannt werden, die nicht getrennt verfolgbar sind, können die überzähligen mit den hohen Intensitäten der Intensitätsverteilung des Lichts in den an ihr Minimum angrenzenden Maxima photochemisch weggebleicht werden. Ein solches Wegbleichen störender Partikel kann auch erfolgen, wenn zum Beispiel mit der Kamera durch eine große Anzahl von emittierten Photonen weiter außerhalb des Minimums der Intensitätsverteilung des Lichts erkannt wird, dass sich nicht der verfolgte Partikel weiter weg bewegt hat, sondern ein anderer, gleichartiger Partikel seinen Weg kreuzt.
  • Eine die Probe abbildende Kamera kann weiterhin dazu genutzt werden, eine Richtung der Bewegung des Partikels aus den Orten abzuleiten, an denen die von dem Partikel emittierten Photonen mit der Kamera registriert werden. Dazu kann auch eine Lokalisation des Partikels aufgrund der Photonen durchgeführt werden, die er nach dem Verlassen des Minimums der Intensitätsverteilung des Lichts emittiert. Diese Lokalisation muss aber nicht mit besonders hoher Genauigkeit durchgeführt werden und erfordert entsprechend nicht sehr viele Photonen von dem Partikel, weil sie nur der Bestimmung einer Richtung dient, in der das Minimum der Intensitätsverteilung des Lichts dem Partikel nachgeführt werden muss, während die Ortsauflösung durch die anschließende Minimierung der Rate der Photonen von dem Partikel und damit durch die Ausgestaltung des Minimums der Intensitätsverteilung des Lichts erreicht wird.
  • Da das erfindungsgemäße Verfahren auf eine Minimierung der Rate der von dem Partikel emittierten Photonen abstellt, gewinnt der Photonenuntergrund an Bedeutung, der zum Beispiel auf dem die Emission der Photonen veranlassenden Licht selbst oder auf Autofluoreszenz des Partikels beruhen kann. Zur Minimierung des Einflusses des Photonenuntergrunds beim Registrieren der von dem Partikel emittierten Photonen kann das Licht zur Veranlassung der Emission in Pulsen auf die Probe gerichtet werden und können von dem Partikel emittierte Photonen in einem begrenzten Zeitfenster nach jedem Puls des Lichts registriert werden. Das Zeitfenster oder Gate kann so gesetzt werden, dass sich ein maximales Signal-zu-Rauschen-Verhältnis ergibt.
  • Der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verfolgte Partikel kann auch ein schaltbarer Partikel, wie beispielsweise ein schaltbares Molekül sein, der mit dem zur Emission veranlassenden Licht zunächst aus einen Zustand, aus dem heraus er nicht zur Emission von Photonen veranlassbar ist, in einen fluoreszenzfähigen Zustand aktiviert wird, aus dem heraus er zur Emission von Photonen veranlassbar ist. Ein hierfür geeignetes Molekül ist unter dem Namen PADRON bekannt, bei dem es sich um eine Mutante des GFP handelt. In diesem Fall ist es zwar nicht zwingend, aber unter Umständen bevorzugt, wenn der Partikel möglichst schnell in seinen nicht fluoreszenzfähigen Dunkelzustand zurückkehrt, weil dadurch der die Rate der emittierten Photonen minimierende Effekt des Minimums der Intensitätsverteilung des zur Emission veranlassenden Lichts gefördert wird. Die Rückkehr in den Dunkelzustand kann spontan oder mit Unterstützung durch irgendein physikalisches oder chemisches Signal erfolgen, das nicht räumlich strukturiert zu sein braucht und daher vorzugsweise auch nicht räumlich strukturiert ist. Mit einer anderen Wellenlänge als derjenigen des zur Emission veranlassenden Lichts können ebenfalls genutzt werden, um beispielsweise eine geringe Konzentration der aktivierten und damit zur Emission von Photonen veranlassbaren Partikel in der Probe einzustellen, wie sie für jede Verfolgung einzelner Partikel Voraussetzung ist. Hierfür sind zum Beispiel ein als DRONPA bekanntes Molekül verwendbar, das eine andere Mutanten des GFP mit gegenüber PADRON umgekehrten Aktivierungsverhalten bei seiner Anregungswellenlänge ist.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch Bewegungen von zwei verschiedenen Partikeln verfolgt werden. Dazu wird Licht zweier unterschiedlicher Wellenlängen eingesetzt; und es werden Photonen mit einer für den jeweiligen Partikel charakteristischer Wellenlänge registriert. Diese Verfolgungen können mit bis auf ein gemeinsames Objektiv getrennten Einrichtungen erfolgen oder mit bis auf die jeweilige Lichtquelle gemeinsamen Einrichtungen, die schnell alternierend für beide Partikel genutzt, d. h. zwischen diesen umgeschaltet werden.
  • Eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer Lichtquelle für das Licht Veranlassung des Partikels zur Emission von Photonen und einem Detektor, um die von dem Partikel emittierten Photonen zu registrieren, weist Strahlformungsmittel in der Lichtquelle auf, um das Licht mit einer ein räumlich begrenztes Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung auf die Probe zu richten. Weiterhin sind in Anhängigkeit von dem Signal des Detektors angesteuerte Strahlverlagerungsmittel vorgesehen, die das Minimum der Intensitätsverteilung dem sich bewegenden Partikel nachführen, indem sie die Intensitätsverteilung so gegenüber der Probe verschieben, dass eine Rate der von dem Detektor registrierten Photonen minimal bleibt.
  • Die Lichtquelle der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann kohärente Lichtstrahlen zu einem Interferenzmuster mit einer Nullstelle am Ort des Minimums überlagern. Zur Modulation der Phasenbeziehung der Lichtstrahlen kann die Lichtquelle einen dynamisch ansteuerbaren Spatial Light Modulator aufweisen. Eine die Probe abbildende Kamera, die zum Beispiel genutzt werden kann, um bei nicht räumlich strukturierter Beleuchtung mit Licht zu schauen, wo sich ein zu verfolgender Partikel überhaupt innerhalb der Probe befindet, kann auch verwendet werden, um die Lage der Intensitätsverteilung bei der Verfolgung des Partikels in der Probe zu erfassen oder um die Richtung zu bestimmen, in der die Intensitätsverteilung dem Partikel nachzuführen ist. Zwei Lichtquellen für Licht unterschiedlicher Wellenlängen können vorgesehen sein, um Bewegungen von zwei verschiedenen Partikeln zu verfolgen. Für eine gleichzeitige Verfolgung können den beiden Lichtquellen jeweils eigene Strahlformungsmittel und Strahlauslenkungsmittel zugeordnet sein. Alternativ können gemeinsame Mittel von beiden Lichtquellen alternierend verwendet werden. Es versteht sich, dass auch noch mehr als zwei Lichtquellen zur gleichzeitigen oder schnell alternierenden Verfolgung von mehr als zwei Partikeln vorgesehen sein können.
  • Die Lichtquelle ist insbesondere eine gepulste Lichtquelle, wie beispielsweise ein Pulslaser, und richtet das Licht in Pulsen auf die Probe. Der Detektor ist darauf abgestimmt vorzugsweise mit einem Gate versehen oder gegated und so mit der gepulsten Lichtquelle synchronisiert, dass nach jedem Puls des Lichts die von dem Partikel emittierten Photonen mit maximalem Signal-zu-Rauschen-Verhältnis in einem begrenzten Zeitfenster registriert werden.
  • Obwohl eine erfindungsgemäße Vorrichtung durch die Verwendung von Licht nur zur Veranlassung von Emission grundsätzlich einen einfacheren Aufbau aufweisen kann, kann sie auch auf Basis eines vorhandenen STED- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskops realisiert werden. Bei diesem werden dann die sonst für die Fluoreszenzverhinderungsstrahlen verwendeten Strahlformungsmittel für das Licht verwendet, mit dem erfindungsgemäß eine Veranlassung zur Emission erfolgt. Zudem sind die Strahlverlagerungsmittel von einem Abscannen der Probe auf eine Verfolgung des Partikels durch Minimierung der von ihm registrierten Photonen umzustellen.
  • Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beigefügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert und beschrieben.
  • 1 illustriert einen möglichen Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • 2 illustriert einen weiteren möglichen Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • 3 illustriert einen Partikel im Bereich eines Minimums einer Intensitätsverteilung zur Veranlassung des Partikels zur Emission von Photonen.
  • 4 ist eine Auftragung der Intensität über dem Ort bei einem Schnitt durch die Intensitätsverteilung gemäß 3; weiterhin ist die resultierende Rate von Photonen dargestellt, die von dem Partikel gemäß 3 emittiert werden.
  • 5 zeigt die Situation nach einer Bewegung des Partikels aus seiner Position gemäß 3; und
  • 6 zeigt die Situation, nachdem mit der Intensitätsverteilung die Bewegung des Partikels nachvollzogen wurde.
  • FIGURENBESCHREIBUNG
  • Die Vorrichtung 1 gemäß 1 dient zur Verfolgung der Bewegung eines Partikels 2 in einer Probe 3. Der Partikel 2 ist zum Beispiel selbst ein Fluoreszenzfarbstoff oder mit einem solchen markiert. Der Fluoreszenzfarbstoff wird mit Licht 4 von einer Lichtquelle 5 zur Emission von Photonen veranlasst, aber im Wesentlichen nur außerhalb eines Minimums einer Intensitätsverteilung des Lichts 4 in der Probe 3. Diese Intensitätsverteilung wird im Zusammenhang mit den 3 bis 6 näher beschrieben werden. Die Lichtquelle 5 umfasst einen Laser 6, Strahlformungsmittel 7, um die gewünschte Intensitätsverteilung im Fokus eines Objektivs 8 einzustellen, sowie Strahlverlagerungsmittel 9, 10 und 11, um die Lage des Minimums der Intensitätsverteilung des Lichts 4 in der Probe 3 einzustellen. Die Strahlverlagerungsmittel 9 und 10 wirken unmittelbar auf das Licht 4 ein und verlagern das Minimum in x- und y-Richtung, d. h. seitlich zum Strahlengang, während die Strahlverlagerungsmittel 11 unmittelbar an der Probe 3 angreifen und das Minimum der Intensitätsverteilung des Lichts 4 gegenüber der Probe 3 in z-Richtung verschieben. Zum selektiven Registrieren von Licht, das von dem 2 emittiert wird, ist ein Punktdetektor 12 hinter einem dichroitischen Strahlteiler 13 vorgesehen, wobei der Strahlteiler 13 im Strahlengang zwischen dem Laser 6 und der Probe 3 angeordnet ist, und zwar vom Laser 6 aus vor den Strahlverlagerungsmitteln 9 und 10. Ein weiterer Strahlteiler 14 ist zwischen den Strahlverlagerungsmitteln 9 und 10 und dem Objektiv 8 angeordnet. Über den Strahlteiler 14 beobachtet eine Kamera 15 mit einem zweidimensionalen Detektor die Probe 3. Wenn mit Hilfe der Kamera 15 der Partikel 2 aufgrund der von ihm emittierten Photonen erstmalig lokalisiert ist, wozu die Probe 3 großflächig mit dem Licht 4 beaufschlagt werden kann, wird die Intensitätsverteilung des Lichts 4 so gegenüber dem Partikel 2 ausgerichtet, dass sich dieser am Ort des Minimums der Intensitätsverteilung des Lichts 4 befindet. Dass dies der Fall ist, wird anschleißend durch probeweise Verschiebungen der Intensitätsverteilung des Lichts 4 gegenüber der Probe 3 überprüft. Bei diesen Verschiebungen sollte die Rate der von dem Partikel 2 emittierten Photonen, die mit dem Punktdetektor 12 detektiert werden, ansteigen. Wenn die Rate hingegen abfällt, ist dies ein Indiz dafür, dass die Intensitätsverteilung des Lichts 4 mit ihrem Minimum dem Partikel 2 nachgeführt werden muss, weil sich dieses bewegt hat. Auch ein Anstieg der Rate der Photonen ohne Verlagerung der Intensitätsverteilung des Lichts 4 bedeutet, dass sich de Partikel 2 in der Probe 3 bewegt hat und die Intensitätsverteilung des Lichts 4 mit seinem Minimum dem Partikel 2 nachgeführt werden muss, bis die Rate der Photonen wieder ihr Minimum erreicht. Bei diesem Tracking-Verfahren werden die Strahlverlagerungsmittel 9 bis 11 in Abhängigkeit von dem Signal des Detektors 12 von einer Steuerung 16 angesteuert. Die dabei erfasste Lage bzw. Bewegung des Minimums der Intensitätsverteilung des Lichts 4 zeichnet die Bewegung des Partikels 2 in der Probe 3 nach. Das beschriebene Tracking-Verfahren kann dadurch unterstützt werden, dass eine Richtung der Bewegung des Partikels 2 aus den Orten abgeleitet wird, an denen die von dem Partikel 2 emittierten Photonen mit der Kamera 15 registriert werden.
  • In 1 ist angedeutet, dass die Steuerung 16 auch die Strahlformungsmittel 7 ansteuert. Konkret kann es sich bei diesen um einen Spatial Light Modulator handeln, mit dem verschiedene Intensitätsverteilungen des Lichts 4 in der Probe 3 eingestellt werden können, deren jeweilige Minima, die nur ein- oder zweidimensional begrenzt sind, einen übereinstimmenden Schnittpunkt aufweisen, mit dem der Partikel 2 in der Probe 3 verfolgt werden kann, um es bezüglich seiner Bewegung in der Probe 3 mit maximaler Ortsauflösung in allen drei Raumrichtungen zu verfolgen.
  • Die in 2 dargestellte Ausführungsform der Vorrichtung 1 weist statt des zusätzlichen Punktdetektors 12 nur die Kamera 15 als Detektor für das Licht auf, das von dem Partikel 2 in der Probe 3 emittiert wird. Die Probe 3 ist dabei eine rein zweidimensionale Probe. Die Intensitätsverteilung des Lichts 4 weist ein von einem ringförmigen Maximum umschlossenes zentrales Minimum auf, mit dem der Partikel 2 verfolgt wird. Diese donutförmige Intensitätsverteilung des Lichts 4 wird mit statischen Strahlformungsmitteln 7 eingestellt. In der Ebene der zweidimensionalen Probe 3 wird das Minimum der Intensitätsverteilung des Lichts 4 mit den Strahlverlagerungsmitteln 9 und 10 eingestellt, die direkt auf das Licht 4 einwirken. Die Kamera 15 ist hinter einem weiteren Objektiv 17 angeordnet, das dem Objektiv 8 über die Probe 3 hinweg gegenüberliegt. Sie dient hier auch dazu, die Lage der Intensitätsverteilung des Lichts 4 in der Probe 3 zu erfassen, um hieraus neben der aktuellen Stellung der Strahlverlagerungsmittel 9 und 10 zusätzlich auf die Lage des Minimums der Intensitätsverteilung des Lichts 4 in der Probe 3 zu schließen. Auch dies kann mit einer Genauigkeit jenseits der Brechungsgrenze erfolgen.
  • 3 skizziert die Intensitätsverteilung des Lichts 4 in der Probe 3, wobei sich der Partikel 2 in dem zentralen Minimum 19 der Intensitätsverteilung 18 befindet. 4 ist eine Auftragung der Intensität I der Intensitätsverteilung 18 (mit durchgezogener Linie) über einem Schnitt durch die Probe 3 gemäß 3 (in vergrößertem Maßstab). Neben der in Bezug auf das Minimum 19 symmetrischen und um das Minimum 19 herum im wesentlichen sinusförmigen Intensitätsverteilung 18 ist die resultierende Rate R der von dem Partikel 2 gemäß 3 emittierten Photonen (mit gestrichelter Linie) dargestellt, wenn der Partikel 2 mit den entsprechenden Intensitäten I des Lichts 4 beaufschlagt wird. Am Ort des Minimums 19 erreicht auch die Rate R ihr Minimum Rmin. Sobald der Partikel 2 dieses Minimum 19 verlässt, steigt die Rate R schnell auf ihren Maximalwert Rmax an. Dieser Effekt wird beim Verfolgen des Partikels 2 in der Probe 3 mit dem Minimum 19 der Intensitätsverteilung 18 ausgenutzt.
  • Wenn sich der Partikel 2 wie in 5 dargestellt gegenüber der Intensitätsverteilung 18 verlagert hat und dabei aus dem Minimum 19 herausbewegt, wird eine erhöhte Rate R der von dem Partikel 2 emittierten Photonen registriert. Durch probeweises Verschieben der Intensitätsverteilung 18 in der Probe 3 wird die Rate wieder vermindert bzw. minimal gehalten. Dadurch wird festgestellt, in welche Richtung sich der Partikel 2 bewegt hat und über welche Strecke, weil das Minimum der Rate genau dann wieder erreicht wird, wenn wie in 6 auch die Intensitätsverteilung 18 mit dem Minimum 19 in derselben Richtung über dieselbe Strecke gegenüber der Probe 3 bewegt wurde. Die Richtung, in der die Intensitätsverteilung 18 mit dem Minimum 19 dem Partikel 2 nachzuführen ist kann auch aus den Orten bestimmt werden, an denen die von dem Partikel 2 emittierten Photonen mit einer Kamera registriert werden.
  • Bezugszeichenliste
    • 1
    Vorrichtung
    2
    Partikel
    3
    Probe
    4
    Licht
    5
    Lichtquelle
    6
    Laser
    7
    Strahlformungsmittel
    8
    Objektiv
    9
    Strahlverlagerungsmittel
    10
    Strahlverlagerungsmittel
    11
    Strahlverlagerungsmittel
    12
    Punktdetektor
    13
    Strahlteiler
    14
    Strahlteiler
    15
    Kamera
    16
    Steuerung
    17
    Objektiv
    18
    Intensitätsverteilung
    19
    Minimum
    I
    Intensität
    R
    Rate

Claims (18)

  1. Verfahren zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels (2) in einer Probe (3), wobei der Partikel (2) mit Licht (4) zur Emission von Photonen veranlasst wird und wobei von dem Partikel (2) emittierte Photonen registriert werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (4) mit einer ein räumlich begrenztes Minimum (19) aufweisenden Intensitätsverteilung (18) auf die Probe (3) gerichtet wird und dass das Minimum (18) dem sich in der Probe (3) bewegenden Partikel (2) nachgeführt wird, indem die Intensitätsverteilung (18) so gegenüber der Probe (3) verschoben wird, dass eine Rate der von dem Partikel (2) emittierten Photonen minimal bleibt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Minimum (19) ein-, zwei- oder dreidimensional begrenzt ist und dass die Intensitätsverteilung (18) in den Richtungen der Dimensionen gegenüber der Probe (2) verschoben wird, in denen das Minimum (19) begrenzt ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsverteilung (18) als ein Interferenzmuster kohärenter Lichtstrahlen ausgebildet wird und dass als Minimum (19) eine Nullstelle des Interferenzmusters verwendet wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Phasenbeziehung der Lichtstrahlen moduliert wird, um das Minimum (19) aus unterschiedlichen Richtungen ein- oder zweidimensional zu begrenzen.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Photonen mit einem Punktdetektor (12) registriert werden.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (3) mit einer Kamera (15) abgebildet wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Ausgangslage des Partikels (2) bei nicht räumlich strukturierter Beleuchtung der Probe mit dem Licht (4) mit der Kamera (15) erfasst wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Lage der Intensitätsverteilung (18) gegenüber der Probe (3) mit der Kamera (15) verfolgt wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Richtung der Bewegung des Partikels (2) aus den Orten abgeleitet wird, an denen die von dem Partikel (2) emittierten Photonen mit der Kamera (15) registriert werden.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (4) in Pulsen auf die Probe gerichtet wird und dass von dem Partikel emittierte Photonen in einem begrenzten Zeitfenster nach jedem Puls registriert werden.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Partikel mit dem Licht (4) zunächst aus einen Zustand, aus dem heraus er nicht zur Emission von Photonen veranlassbar ist, in einen Zustand aktiviert wird, aus dem heraus er zur Emission von Photonen veranlassbar ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass Bewegungen von zwei verschiedenen Partikeln (2) gleichzeitig oder schnell alternierend mit Licht (4) zweier unterschiedlicher Wellenlängen verfolgt werden.
  13. Vorrichtung (1) zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels (2) in einer Probe (3) mit einer Lichtquelle (5), um den Partikel (2) mit Licht (4) zur Emission von Photonen zu veranlassen, und mit einem Detektor (12, 15), um von dem Partikel (2) emittierte Photonen zu registrieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (5) Strahlformungsmittel (7) aufweist, um das Licht (4) mit einer ein räumlich begrenztes Minimum (19) aufweisenden Intensitätsverteilung (18) auf die Probe (3) zu richten, und dass in Abhängigkeit von dem Signal des Detektors (12, 15) angesteuerte Strahlverlagerungsmittel (9 bis 11) angeordnet sind, die das Minimum (19) dem sich bewegenden Partikel (2) nachführen, indem sie die Intensitätsverteilung (18) so gegenüber der Probe (3) verschieben, dass eine Rate der von dem Detektor (12, 15) registrierten Photonen minimal bleibt.
  14. Vorrichtung (1) nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (5) kohärente Lichtstrahlen zu einem Interferenzmuster mit einer Nullstelle am Ort des Minimums (19) überlagert.
  15. Vorrichtung (1) nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (5) einen zur Modulation der Phasenbeziehung der Lichtstrahlen ansteuerbaren Spatial Light Modulator aufweist.
  16. Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine die Probe (3) abbildende Kamera (15) angeordnet ist.
  17. Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (5) eine gepulste Lichtquelle ist, die das Licht (4) in Pulsen auf die Probe richtet, und dass der Detektor (12) ein mit der gepulsten Lichtquelle synchronisiertes Gate aufweist, um nach jedem Puls die von dem Partikel emittierten Photonen in einem begrenzten Zeitfenster zu registrieren.
  18. Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass zwei Lichtquellen für Licht unterschiedlicher Wellenlängen angeordnet sind, um Bewegungen von zwei verschiedenen Partikeln gleichzeitig oder schnell alternierend zu verfolgen.
DE102011055367.3A 2011-11-15 2011-11-15 Verfahren und Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels, insbesondere eines einzelnen Moleküls, in einer Probe Expired - Fee Related DE102011055367B4 (de)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102011055367.3A DE102011055367B4 (de) 2011-11-15 2011-11-15 Verfahren und Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels, insbesondere eines einzelnen Moleküls, in einer Probe
PCT/EP2012/072375 WO2013072273A1 (en) 2011-11-15 2012-11-12 Method of and apparatus for tracking a particle, particularly a single molecule, in a sample
CN201280055918.5A CN103930769B (zh) 2011-11-15 2012-11-12 用于跟踪样品中的粒子特别是单分子的方法和设备
JP2014540501A JP6078889B2 (ja) 2011-11-15 2012-11-12 サンプル内の粒子、特に単一分子を追跡する方法および装置
EP12788175.3A EP2780694B1 (de) 2011-11-15 2012-11-12 Verfahren und vorrichtung zur verfolgung einer partikel, insbesondere eines einzelnen moleküls, in einer probe
RU2014124189A RU2610928C2 (ru) 2011-11-15 2012-11-12 Способ и устройство для отслеживания в образце частицы, в частности одной молекулы
US14/050,583 US9291562B2 (en) 2011-11-15 2013-10-10 Method and apparatus for tracking a particle, particularly a single molecule, in a sample

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102011055367.3A DE102011055367B4 (de) 2011-11-15 2011-11-15 Verfahren und Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels, insbesondere eines einzelnen Moleküls, in einer Probe

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE102011055367A1 DE102011055367A1 (de) 2013-05-16
DE102011055367B4 true DE102011055367B4 (de) 2017-02-09

Family

ID=47215534

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102011055367.3A Expired - Fee Related DE102011055367B4 (de) 2011-11-15 2011-11-15 Verfahren und Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels, insbesondere eines einzelnen Moleküls, in einer Probe

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP2780694B1 (de)
JP (1) JP6078889B2 (de)
CN (1) CN103930769B (de)
DE (1) DE102011055367B4 (de)
RU (1) RU2610928C2 (de)
WO (1) WO2013072273A1 (de)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021239679A1 (de) 2020-05-26 2021-12-02 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, computerprogramm und vorrichtung zum bestimmen von positionen von molekülen in einer probe
DE102020127385B3 (de) 2020-10-16 2022-03-10 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur lichtmikroskopischen Multiskalen-Aufnahme biologischer Proben
WO2022112155A1 (de) 2020-11-24 2022-06-02 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zur aufnahme nanoskopischer bilder mehrfach gefärbter proben
WO2022152785A1 (de) 2021-01-13 2022-07-21 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zur hochaufgelösten ortsbestimmung eines einzelnen farbstoffmoleküls in mehreren raumrichtungen

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9291562B2 (en) 2011-11-15 2016-03-22 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Method and apparatus for tracking a particle, particularly a single molecule, in a sample
DE102013114860B3 (de) 2013-12-23 2015-05-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Orte einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe
DE102015105018A1 (de) * 2015-03-31 2016-10-06 Laser-Laboratorium Göttingen e.V. Verfahren und Rasterfluoreszenzlichtmikroskop zum mehrdimensional hochauflösenden Abbilden einer Struktur oder eines Wegs eines Partikels in einer Probe
DE102016117096C5 (de) * 2015-09-22 2023-11-30 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum hochaufgelösten lokalen Abbilden einer Struktur in einer Probe
JP7027316B2 (ja) 2016-03-07 2022-03-01 マックス－プランク－ゲゼルシャフト ツア フェルデルング デア ヴィッセンシャフテン イー．ヴイ． 多数の対象の対象固有の場所間の輸送方法
DE102016119263B4 (de) 2016-10-10 2018-06-07 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe
DE102016119264B4 (de) 2016-10-10 2018-05-30 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe
WO2018069283A1 (de) 2016-10-10 2018-04-19 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum räumlich hochauflösenden bestimmen des orts eines vereinzelten, mit anregungslicht zur emission von lumineszenzlicht anregbaren moleküls in einer probe
DE102016119262B4 (de) 2016-10-10 2018-06-07 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe
DE102017104736B9 (de) * 2017-03-07 2020-06-25 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zum räumlichen Messen nanoskaliger Strukturen
DE102017126128A1 (de) 2017-11-08 2019-05-09 Endress+Hauser SE+Co. KG System und Verfahren zur ortsaufgelösten Bestimmung von zumindest einer physikalischen oder chemischen Prozessgröße
DE102017011843A1 (de) 2017-12-21 2019-06-27 Horst Wochnowski Initialisierung von chemischen, physikalisch-chemischen und/oder physikalischen Reaktionen mittels eines angefangenen und nicht zu Ende geführten STED-Prozesses mit einer örtlichen Auflösung unterhalb des klassischen optischen Auflösungsgrenze mit Anwendungen aus der Biochemie
DE102018203833A1 (de) * 2018-03-14 2019-09-19 Bayerische Motoren Werke Aktiengesellschaft Verfahren und Vorrichtung zum Untersuchen eines Bauteils für ein Kraftfahrzeug
EP3857284B1 (de) 2018-09-27 2023-12-27 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und vorrichtung zur erzeugung und verschiebung einer lichtintensitätsverteilung in einem fokusbereich einer objektivlinse
CN109444473B (zh) * 2018-12-24 2021-06-15 中国电子科技集团公司第十三研究所 线宽标准样片及线宽标准样片中标准线条的循迹方法
DE102019008304B8 (de) 2019-11-29 2021-06-02 Abberior Instruments Gmbh Fluoreszenzmikroskop mit stabilisierter Justage und Verwendung einer Baugruppe zur Aufrüstung eines Fluoreszenzmikroskops
DE102019135033A1 (de) 2019-12-19 2021-06-24 Friedrich-Schiller-Universität Jena Erzeugen eines Lichtfeldes mit mehreren lokalisierten Nullstellen
US20230204514A1 (en) 2020-05-26 2023-06-29 Abberior Instruments Gmbh Method and device for determining positions of molecules in a sample
EP4193208A1 (de) 2020-08-07 2023-06-14 Abberior Instruments GmbH Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur lokalisierung eines emitters in einer probe
EP4067878A1 (de) 2021-04-01 2022-10-05 Abberior Instruments GmbH Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur lokalisierung eines emitters in einer probe
DE102020134495B4 (de) 2020-12-21 2024-02-15 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Mikroskop zur Aufnahme von Trajektorien einzelner Partikel in einer Probe
KR102485567B1 (ko) * 2021-02-26 2023-01-05 연세대학교 산학협력단 광 주사 기반의 정량 위상 이미징 장치 및 방법
EP4075180A1 (de) 2021-04-13 2022-10-19 Abberior Instruments GmbH Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur bestimmung einer position von mindestens einem sender in einer probe
DE102021005684A1 (de) 2021-11-16 2023-05-17 Jörn Volkher Wochnowski STED-Verfahren mit Hohllichtwellenleitern
EP4215970A1 (de) 2022-01-21 2023-07-26 Leica Microsystems CMS GmbH Mikroskop zur lokalisierung von einzelpartikeln
DE102022119327B4 (de) 2022-08-02 2024-03-14 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur lokalisierung vereinzelter emitter in einer probe
DE102022119304A1 (de) 2022-08-02 2024-02-08 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur lokalisierung vereinzelter emitter in einer probe
DE102022119332B3 (de) 2022-08-02 2023-12-28 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, lichtmikroskop und computerprogramm zum lokalisieren oder verfolgen von emittern in einer probe
DE102022120952B4 (de) 2022-08-18 2024-03-14 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zum simultanen verfolgen zweier emitter
DE102022123632A1 (de) 2022-09-15 2024-03-21 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, lichtmikroskop und computerprogramm zur lokalisierung oder zum verfolgen von emittern in einer probe

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2546952A1 (de) 1974-10-24 1976-04-29 Block Engineering Vorrichtung zur feststellung submikrometrisch bemessener partikel
US3960449A (en) 1975-06-05 1976-06-01 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Measurement of angular dependence of scattered light in a flowing stream
DE19935047A1 (de) 1999-07-26 2001-02-22 Johannes L J Frank Multidimensionale Dynamische Cytofluorophorese (MDCFP)
DE10053747A1 (de) 2000-10-30 2002-05-23 Deutsches Krebsforsch Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung zweier Fluoreszenz-Emissionen mit einem Einlaser-Durchflußzytometer
US20020152040A1 (en) 1999-07-14 2002-10-17 Dennis Majoe Position and orientation detection system
US6498645B1 (en) 2000-11-05 2002-12-24 Julius Z. Knapp Inspection of liquid injectable products for contaminating particles
US20050179896A1 (en) 2004-02-13 2005-08-18 Girvin Kenneth L. Method and apparatus for operating a laser in an extinction-type optical particle detector
US20070284516A1 (en) 2003-09-19 2007-12-13 Bustamante Carlos J Optical trap utilizing a pivoting optical fiber
US20090015831A1 (en) 2001-02-23 2009-01-15 Juan Yguerabide Methods for providing extended dynamic range in analyte assays
DE102007033737A1 (de) 2007-07-18 2009-01-22 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum Bestimmen eines Messwerts auf der Basis von Einzelmolekülereignissen
US20100225913A1 (en) 2004-03-06 2010-09-09 Michael Trainer Methods and apparatus for determining characteristics of particles
DE102009019013A1 (de) 2009-04-27 2010-10-28 DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gemeinnützige GmbH Verfahren zum Selektieren, Screening, von Blut und/oder Serum auf granulozytäre Antikörper bei umfangreicher Spenderpopulation
US20110222062A1 (en) 2008-02-01 2011-09-15 Palo Alto Research Center Incorporated Analyzers with time variation based on color-coded spatial modulation
US20120134682A1 (en) 2007-05-08 2012-05-31 The Boeing Company Method and apparatus for clearing an optical channel

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5495105A (en) * 1992-02-20 1996-02-27 Canon Kabushiki Kaisha Method and apparatus for particle manipulation, and measuring apparatus utilizing the same
US5793478A (en) * 1996-11-19 1998-08-11 Sandia Corporation Apparatus for measuring particle properties
RU2154815C2 (ru) * 1998-05-20 2000-08-20 Яскевич Геннадий Федорович Способ исследования микрообъектов
US20030007894A1 (en) * 2001-04-27 2003-01-09 Genoptix Methods and apparatus for use of optical forces for identification, characterization and/or sorting of particles
US7437912B2 (en) * 2004-07-19 2008-10-21 Integrated Sensing Systems, Inc. Device and method for sensing rheological properties of a fluid
WO2006061947A1 (ja) * 2004-12-08 2006-06-15 Osaka University 蛍光顕微鏡及び観察方法
GB0428044D0 (en) * 2004-12-22 2005-01-26 Perkinelmer Ltd A method and apparatus for analysing a dynamic sample
EP1907826B2 (de) * 2005-07-22 2020-11-25 Carl Zeiss MicroImaging GmbH Auflösungsgesteigerte lumineszenz-mikroskopie
JP4763485B2 (ja) * 2006-03-15 2011-08-31 株式会社日立ハイテクノロジーズ 蛍光検出装置
US7847923B2 (en) * 2006-09-29 2010-12-07 Millipore Corporation Differentiation of flow cytometry pulses and applications
US7498551B2 (en) * 2006-10-06 2009-03-03 Los Alamos National Security, Llc Apparatus and method for tracking a molecule or particle in three dimensions
WO2009115108A1 (en) * 2008-03-19 2009-09-24 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg A method and an apparatus for localization of single dye molecules in the fluorescent microscopy
JP5699421B2 (ja) * 2008-09-16 2015-04-08 横河電機株式会社 顕微鏡装置
DE102009005953A1 (de) * 2009-01-19 2010-07-22 Universität Tübingen Verfahren und System zur Charakterisierung einer Probe mittels bildgebender Fluoreszenzmikroskopie
CN101877130A (zh) * 2009-04-29 2010-11-03 中国科学院自动化研究所 复杂场景下基于粒子滤波器的运动目标跟踪方法
CN101655460B (zh) * 2009-08-28 2011-06-22 山西大学 用于快速光学跟踪单分子的方法及其装置
WO2011099269A1 (ja) * 2010-02-10 2011-08-18 国立大学法人大阪大学 顕微鏡及び観察方法
CN102063580B (zh) * 2010-12-24 2012-10-17 山西大学 纳米环境下单分子动力学的虚拟现实仿真系统和方法

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2546952A1 (de) 1974-10-24 1976-04-29 Block Engineering Vorrichtung zur feststellung submikrometrisch bemessener partikel
US3960449A (en) 1975-06-05 1976-06-01 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Measurement of angular dependence of scattered light in a flowing stream
US20020152040A1 (en) 1999-07-14 2002-10-17 Dennis Majoe Position and orientation detection system
DE19935047A1 (de) 1999-07-26 2001-02-22 Johannes L J Frank Multidimensionale Dynamische Cytofluorophorese (MDCFP)
DE10053747A1 (de) 2000-10-30 2002-05-23 Deutsches Krebsforsch Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung zweier Fluoreszenz-Emissionen mit einem Einlaser-Durchflußzytometer
US6498645B1 (en) 2000-11-05 2002-12-24 Julius Z. Knapp Inspection of liquid injectable products for contaminating particles
US20090015831A1 (en) 2001-02-23 2009-01-15 Juan Yguerabide Methods for providing extended dynamic range in analyte assays
US20070284516A1 (en) 2003-09-19 2007-12-13 Bustamante Carlos J Optical trap utilizing a pivoting optical fiber
US20050179896A1 (en) 2004-02-13 2005-08-18 Girvin Kenneth L. Method and apparatus for operating a laser in an extinction-type optical particle detector
US20100225913A1 (en) 2004-03-06 2010-09-09 Michael Trainer Methods and apparatus for determining characteristics of particles
US20120134682A1 (en) 2007-05-08 2012-05-31 The Boeing Company Method and apparatus for clearing an optical channel
DE102007033737A1 (de) 2007-07-18 2009-01-22 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum Bestimmen eines Messwerts auf der Basis von Einzelmolekülereignissen
US20110222062A1 (en) 2008-02-01 2011-09-15 Palo Alto Research Center Incorporated Analyzers with time variation based on color-coded spatial modulation
DE102009019013A1 (de) 2009-04-27 2010-10-28 DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gemeinnützige GmbH Verfahren zum Selektieren, Screening, von Blut und/oder Serum auf granulozytäre Antikörper bei umfangreicher Spenderpopulation

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021239679A1 (de) 2020-05-26 2021-12-02 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, computerprogramm und vorrichtung zum bestimmen von positionen von molekülen in einer probe
DE102020113998A1 (de) 2020-05-26 2021-12-02 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, Computerprogramm und Vorrichtung zum Bestimmen von Positionen von Molekülen in einer Probe
DE102020127385B3 (de) 2020-10-16 2022-03-10 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur lichtmikroskopischen Multiskalen-Aufnahme biologischer Proben
WO2022079265A1 (de) 2020-10-16 2022-04-21 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zur lichtmikroskopischen multiskalenaufnahme biologischer proben
WO2022112155A1 (de) 2020-11-24 2022-06-02 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zur aufnahme nanoskopischer bilder mehrfach gefärbter proben
DE102020131047A1 (de) 2020-11-24 2022-06-09 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Aufnahme nanoskopischer Bilder mehrfach gefärbter Proben
WO2022152785A1 (de) 2021-01-13 2022-07-21 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zur hochaufgelösten ortsbestimmung eines einzelnen farbstoffmoleküls in mehreren raumrichtungen
DE102021100564A1 (de) 2021-01-13 2022-08-04 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur hochaufgelösten Ortsbestimmung eines einzelnen Farbstoffmoleküls in mehreren Raumrichtungen
DE102021100564B4 (de) 2021-01-13 2023-12-28 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur hochaufgelösten Ortsbestimmung eines einzelnen Farbstoffmoleküls in mehreren Raumrichtungen

Also Published As

Publication number Publication date
CN103930769B (zh) 2016-08-24
RU2610928C2 (ru) 2017-02-17
JP2014535059A (ja) 2014-12-25
DE102011055367A1 (de) 2013-05-16
CN103930769A (zh) 2014-07-16
EP2780694B1 (de) 2016-03-09
RU2014124189A (ru) 2015-12-27
WO2013072273A1 (en) 2013-05-23
EP2780694A1 (de) 2014-09-24
JP6078889B2 (ja) 2017-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102011055367B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels, insbesondere eines einzelnen Moleküls, in einer Probe
DE102016117096B4 (de) Verfahren zum hochaufgelösten lokalen Abbilden einer Struktur in einer Probe
DE102011000835B4 (de) Abtastmikroskop und Verfahren zur lichtmikroskopischen Abbildung eines Objektes
EP2102695B1 (de) Verfahren und anordnung zur parallelisierten mikroskopischen bildgebung
EP2245494B1 (de) Vorrichtung und verfahren zum räumlichen hochauflösenden abbilden einer struktur einer probe
EP3427036B1 (de) Verfahren zum hochaufgelösten lokalen abbilden einer struktur in einer probe, um reaktionen eines interessierenden objekts auf veränderte umgebungsbedingungen zu erfassen
DE4416558C2 (de) Verfahren zum optischen Messen eines Probenpunkts einer Probe und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
DE102016119263B4 (de) Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe
DE102016119264B4 (de) Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe
DE102006046369A1 (de) Auflösungsgesteigerte Lumineszenzmikroskopie
WO2009024529A1 (de) Sted-fluoreszenzmikroskopie mit zweiphotonen-anregung
DE102008054317A1 (de) Kombinationsmikroskopie
WO2014072049A1 (de) Lichtmikroskop und mikroskopieverfahren
EP1862839A1 (de) Mikroskop mit erhöhter Auflösung
WO2021239679A1 (de) Verfahren, computerprogramm und vorrichtung zum bestimmen von positionen von molekülen in einer probe
EP4288821A1 (de) Verfahren und lichtmikroskop zum hochaufgelösten untersuchen einer probe
WO2020114930A1 (de) Verfahren und vorrichtung zum nachweis von fluoreszenzsignalen in einer dreidimensionalen region einer probe
DE102015109305B3 (de) Rasterlumineszenzlichtmikroskop mit Gittern aus Lumineszenzverhinderungslicht und weiterem Licht
WO2016071033A1 (de) Verfahren zur erzeugung eines bildes einer probe
DE102011086230B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Beleuchtung und Detektion in der RESOLFT-Mikroskopie
DE102016104651A1 (de) Verfahren und Rasterfluoreszenzlichtmikroskop zum dreidimensional hochauflösenden Abbilden einer mit Fluorophoren markierten Struktur einer Probe
DE102017102604B4 (de) Verfahren zum Steuern eines Laserscanning-Mikroskops beim Abtasten einer Probe und Laserscanning-Mikroskop
EP2561393A1 (de) Verfahren zum untersuchen einer fluoreszierende farbstoffe enthaltenden probe mit hilfe eines mikroskops
DE102022119327B4 (de) Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur lokalisierung vereinzelter emitter in einer probe
DE102022112384B4 (de) Verfahren, lichtmikroskop und computerprogramm zum einstellen einer zeitverzögerung zwischen lichtpulsen

Legal Events

Date Code Title Description
R012 Request for examination validly filed
R016 Response to examination communication
R018 Grant decision by examination section/examining division
R119 Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee