CN103930769A - 用于跟踪样品中的粒子特别是单分子的方法和设备 - Google Patents
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Abstract
为了跟踪样品(3)中的粒子(2)的运动,粒子(2)被光(4)驱动以发射光子,并且检测由粒子(2)发射的光子。施加到样品(3)上的光(4)包括具有在空间上限定的最低强度区(19)的光强度分布(18);并且通过相对于样品(3)移动强度分布(18)使得由粒子(2)发射的光子的速率保持最小来利用光的强度分布(18)的最低强度区(19)跟踪粒子(2)。
Description
技术领域
本发明涉及一种跟踪样品中粒子运动的方法,所述粒子当经受光照射时被驱动以发射光子,并且所述方法包括检测由所述粒子发射的光子。此外,本发明涉及一种用于执行这种方法的设备,其包括构造成提供光的光源和构造成检测光子的检测器。
在样品中的运动被跟踪的粒子可以是单分子、一起运动的一组分子、合成物、量子点、反射金粒子等。
由经受光照射的粒子发射光子的潜在过程可以是荧光过程。然而,许多其它过程也可以用作发射光子的基础,例如光的散射。
引起光子发射的相应处理可以与要跟踪的粒子自身的属性相关,或者与用于标记要跟踪的粒子的标记物、特别是染料相关。
背景技术
根据跟踪样品中单一分子的运动的已知方法,分子受光激发以发射光子,利用对样品成像的二维检测器来检测分子所发射的光子。然后从检测器所检测到的光子的空间分布来确定分子的当前位置。利用检测器的适当像素密度,能够从光子的空间分布以比衍射极限更高的空间分辨率来确定分子的当前位置。然而,以超出衍射极限的空间分辨率跟踪粒子的附加要求是对于分子的每个位置,即在分子改变其位置之前,可以检测到更多数量的光子。这是因为以下事实:如果在分子发射更多数量光子的整个时间段上分子位置保持不变的话,更多数量的光子仅仅提高在确定分子位置中所实现的空间分辨率。
空间分辨率由围绕分子位置的圆的半径Δr给出,从来自成像于检测器上的分子的光子的衍射图案的强度中心确定分子位置。分子的真实位置位于该圆内部。半径Δr由下式给出:
Δr=FWHM/N1/2 (1)
并且决定于所检测到的光子的数量N以及衍射图案的半高宽FWHM。
由于跟踪单一分子的运动的该已知方法对于样品中分子的每个位置需要大量N的光子,分子受到大的应力,这导致使分子漂白的风险增大。在漂白过程中,正处于受激状态的分子发生化学变化,使得在漂白之后分子不再提供光子。除了光化学漂白之外,还有可能使已经受强烈激发或多次激发而发射光子的分子转移到亚稳暗态。分子可能在一段时间之后从亚稳暗态返回。然而,与此同时分子不能发射任何用于继续跟踪分子所需的光子。
相应地,仅仅存在一些适合在该公知方法中使用的分子,即只有一些所谓荧光染料或荧光体。很多荧光体过快地漂白,因此其运动或被荧光体标记的分子的运动在很长时间段内或者在样品内移动的更长距离内不能被跟踪到。
对于上述方法,从分子发射的光子被二维检测器检测到的位置的分布来确定分子位置。该方法被称为定位法。除定位法之外的另一方法利用所谓STED或RESOLFT荧光显微镜法来实现。这里,样品中的分子被有效激发而发射光子的空间区域被减小到比衍射极限更小的尺寸。因此,从样品发射的光子可以归因于该尺寸缩小的特定的空间区域,而无关于检测到光子的位置并且无关于检测到的光子的数量。在实践中,通过施加与荧光抑制光的相干光束的干涉图案叠加的聚焦激发光束来实现有效激发分子发射光子的空间区域的缩小。该干涉图案包括位于激发光束的焦点处的零点。对于荧光抑制光束的高绝对强度,荧光抑制光的强度在除了零点之外的任何位置超出饱和强度Is,从而在除了零点之外的任何位置基本上阻止样品中的分子发射光子。所得到的空间分辨率通过下式给出:
Δr=λ/(n sinα(1+I/IS)1/2) (2),
其中I是样品中的干涉图案的最高强度。
在STED荧光显微镜法中,通过受激发射来实现抑制荧光。在RESOLFT荧光显微镜法的情况下,通过暂时将分子转移到分子不能发荧光的确认状态来实现抑制荧光。因为在STED荧光显微镜法中需要荧光抑制光的高绝对强度,所以将所使用的荧光体漂白的风险相对较高。对于RESOLFT荧光显微镜法,荧光抑制光的相对低强度已经足够。然而,该方法只能与可以转换到荧光体不能发荧光的确认状态的特定荧光体一起应用。
一般而言,像STED或RESOLFT荧光显微镜法之类的方法适合跟踪样品中粒子的运动,这是因为该粒子是在粒子被有效激发而发射荧光的在空间上尺寸减小了的区域内被跟踪。检测粒子是否仍然位于粒子可以被有效激发而发射荧光的空间尺寸缩小的区域内,并因此确定粒子的位置将仅仅是可能的,因为被跟踪粒子所发射的光子的速率将连续最大化。尽管根据该方法进行跟踪所需的光子比连续定位粒子所需的光子更少,适于在更长距离上跟踪运动的粒子和标记的数量不能显著增大。此外,在STED或RESOLFT荧光显微镜法中,必须施加不同的光束来提供激发光和荧光抑制光。这需要付出附加的努力,因为不同的光束具有不同的波长并且因为这些不同的光束必须小心地空间上对准。
从DE2546952A1得知一种基于所谓衰减全反射的光学系统,该方法被用于跟踪样品中粒子的运动。根据DE2546952A1,使样品经受用于驱动粒子发射光子的光。因为用于照明样品的光的强度分布不是均匀的而是空间调制的,粒子的运动导致所发射光子数量的相应波动。因此,考虑到强度分布的调制,可以从检测到的所发射光子的波动,即检测器信号的调制,来判断粒子的运动。然而,沿着恒定光强度的路径运动的粒子的运动不能被跟踪到。特别是,从不经受光或很少经受光的粒子不能被跟踪到。相反,为了采用从DE2546952A1得知的光学系统跟踪样品中粒子的运动,必需使粒子经常地经受光。因此,不能有效地降低使粒子或标记粒子的标记漂白的风险,而是不得不接受该风险。
仍然需要一种跟踪样品中粒子的运动的方法和装置,其中,即使在更长的时间段内或者粒子在样品中移动的更长的距离内跟踪粒子的运动,使粒子或标记粒子的标记漂白的风险也保持较低。
发明内容
本发明涉及一种跟踪样品中粒子运动的方法,所述粒子当经受光照射时被驱动以发射光子。所述方法包括形成光以提供包括在空间上限定的最低强度区的光强度分布。所述光强度分布被施加到样品,使得粒子位于所述光强度分布的在空间上限定的最低强度区中。由粒子发射的光子被检测,并且光强度分布相对于样品进行移动,使得由粒子发射的光子的速率保持最小。采用这种方式,粒子被光强度分布的最低强度区跟踪。
此外,本发明涉及一种用于跟踪样品中粒子的运动的设备。所述设备包括:光源,其构造为提供用于驱动粒子发射光子的光,所述光源包括光束成形装置,其构造成以包括在空间上限定的最低强度区的强度分布施加光到样品;检测器,其构造成检测由粒子发射的光子,并提供表示检测到的光子的速率的信号;以及光束偏转装置,其构造成相对于样品移动强度分布,并基于所述检测器的信号而受到控制,使得所述检测器检测到的光子的速率保持最小,以便利用最低强度区跟踪运动的粒子。
本发明的有利的进一步开发来源于权利要求书、说明书和附图。说明书中提到的特征的优点和多个特征组合的优点仅仅用作实例,并且可以被选择性地或附加地使用,而根据本发明的实施例并非必须实现这些优点。在不改变由所附权利要求限定的保护范围的情况下,关于原始申请和专利的公开内容下列内容适用:可以从附图中,特别是从多个部件相对于彼此的所示设计和尺寸以及从它们的相对布置和它们的操作性连接来获得其它特征。本发明不同实施例的特征的组合或独立于所选引用权利要求的不同权利要求的特征的组合也是可以的,并且目的明确地附在此处。这还涉及在不同附图中示出的特征或描述附图时提到的特征。这些特征也可以与不同权利要求的特征相结合。此外,可能的是,本发明的其它实施例不具有权利要求书中提到的所有特征。这些实施例甚至可能不具有独立权利要求中提到的所有特征。
附图说明
在下文中,参考附图中示出的优选示例性实施例进一步解释和描述本发明。
图1示出用于执行根据本发明的方法的一实施例的根据本发明的设备的示例性实施例。
图2示出用于执行根据本发明的方法的另一实施例的根据本发明的设备的另一示例性实施例。
图3示出在用于驱动粒子发射光子的强度分布的最低强度区域中的粒子。
图4示出根据图3的强度分布取决于沿线轮廓的位置的强度;另外,示出了由根据图3的粒子发射的光子的产生速率。
图5示出在粒子的运动离开根据图3的位置后的情况;和
图6示出强度分布跟随粒子的运动之后的情况。
具体实施方式
根据本发明的方法,施加到样品的光强度分布包括在空间上限定的最低强度区。如同用在STED或RESOLFT荧光显微镜法中的荧光抑制光的情形,优选通过相干光束的干涉图案形成该强度分布,其中在空间上限定的最低强度区是干涉图案的零点。因此,最低强度区可设置有小的空间尺寸。特别地,最低强度区的空间尺寸可以小于衍射极限。与STED和RESOLFT荧光显微镜法相比,在根据本发明的方法中,显示这种特殊强度分布的光不用于抑制荧光而是用于驱动在样品中被跟踪的粒子发射光子。此外,不利用强度分布的最低强度区对样品进行扫描,而是仅仅相对于样品连续地移动强度分布,使得随后检测到的由粒子发射的光子的速率最小化。光子的最小速率对应于粒子仍位于光强度分布的最低强度区的位置处的事实。随着最低强度区外部的光强度的急剧增加,并且通过利用这种急剧增加相对于粒子在样品中的当前位置快速跟踪该强度分布,可以在显著低于衍射极限的空间分辨率下跟踪粒子的运动。在根据本发明的方法中,不要求粒子发射许多光子。因此,漂白粒子的风险大大降低。因此,即使易于漂白的粒子也可以在更长的时间段内或者粒子在样品中移动的更长距离内被跟踪。此外,与基于STED或RESOLFT荧光显微镜法的方法相比,在根据本发明的方法中样品仅仅经受包括该最低强度区的强度分布。因此,光在空间上或关于其波长都不必与另一光束对准。正因为这样,采用根据本发明的方法的光学装置明显没有STED或RESOLFT荧光光学显微镜那么复杂。与STED和RESOLFT荧光显微镜法相比,存在另一个差异:根据本发明的方法,具有最低强度区的光强度分布的较小绝对强度已经足够,只要该光强度分布导致已经处于其最低强度区之外的低强度下的光子发射即可。尤其是,不要求为了实现衍射极限之下的空间分辨率而在零点以外实现激发发射的饱和。相反,在许多情况下,优选的是,随着与零点的距离增加激发可识别地增加。最后但并非最不重要的,本发明的突出特征在于,由被跟踪的粒子发射的光子的数量减到最少,因此,粒子漂白的风险也最小化了。
为了连续地使由检测器检测到的光子的速率最小化而相对于即关于样品移动或偏转强度分布可以基于试错法。即,强度分布在试验的基础上小步地移动。如果移动导致检测到的光子的速率与所发射光子的速率类似地减小,则强度分布进一步在相同的方向上移动。在相反的情况下,如果移动导致检测到的光子的速率增加,则强度分布被移动到另一方向,例如相反的方向。类似于由关键字“循迹算法”和“模糊逻辑”所表示的各种合适的算法和实施例对于本领域技术人员是可用的。
根据STED或RESOLFT荧光显微镜法,用于形成荧光抑制光的包括最低强度区的光强度分布的各种技术是已知的。这些技术中的任一个也可以用在根据本发明的方法中。为了仅给出一些实例,相位滤波器、空间光调制器、4pi结构等可以用于形成包括最低强度区的光强度分布。
为了相对于样品移动或偏转具有最低强度区的光强度分布,可以类似于从STED和RESOLFT荧光显微镜法已知的那样应用扫描仪。例如,这种扫描仪包括声光或电光反射镜、旋转镜、压电致动器,利用这些扫描仪样品相对于致动物镜的光束或压电致动器被调整,并且利用这些扫描仪光束相对于样品被调整。
应该注意的是,作为偏转光强度分布的替代方式或附加方式,相对于样品移动具有最低强度区的光强度分布也可以通过使样品关于具有最低强度区的光强度分布移位来完成。相对于样品移动具有最低强度区的光强度分布仅仅需要具有最低强度区的光强度分布与样品之间的相对移动。具体地说,可以通过使光强度分布偏转来实现相对于样品在x方向和y方向上移动具有最低强度区的光强度分布,并且通过使样品移位来实现相对于样品在z方向上移动具有最低强度区的光强度分布。z方向可以是与样品表面的主延展面垂直的方向,光强度分布通过该主延展面施加到样品,并且x方向和y方向可以沿着或平行于该主延展面延伸。
根据本发明的方法,光强度分布的最低强度区可以在空间上以一维、二维或三维进行限定,即最低强度区可以沿着平面、沿着线或围绕点延伸。为了跟踪粒子的运动,在限定最低强度区的维度的所有方向上相对于样品移动或偏转强度分布。在最低强度区未限定的方向上的移动将不会导致由粒子发射的光子的速率减小,并因此不能被有效地使用。这也意味着,粒子在这个方向上的运动不能被跟踪。因此,该方向优选地被定向,使得粒子在该方向上的运动不是预期的。在许多情况下,样品中粒子的运动总是被限制到沿着特定结构的方向。在二维样品的情况下,粒子在第三维的方向上的运动根据原理被省略。
还可以通过干涉来调节用于提供光强分布来的光束的相位关系,以便在不同方向上一维或二维地限制最低强度区。例如,该相位关系可以在第一和第二相位关系之间改变,使得最低强度区的第一相位关系由xy平面中的环限定,并且最低强度区的第二相位关系被限定在z方向上。作为选择,不同的连续的相位关系可以导致被定向在不同方向上的线或平面状最低强度区。这些最低强度区可以被描述为旋转条,并且包括作为它们的空间交叉部的点或线。如果在这些相位关系之间快速转换,并且如果由粒子发射光子的速率的最小值对于每种相位关系单独地设置或者在相位关系的整个变化上设置,则粒子在样品中的运动可以在所有三个维度上被跟踪。
根据本发明的方法,由粒子发射的光子不必由二维检测器阵列进行检测。相反,使用点检测器用于检测光子就足够了,因为跟踪主要取决于这些光子的速率。可以从具有最低强度区的强度分布相对于样品的当前位置确定粒子在样品中的当前位置。该位置可以从移动强度分布的那些装置相对于样品的位置、例如通过用于移动强度分布的扫描仪的当前位置进行推断。还可以例如通过利用对样品成像的摄像机检测由粒子发射的光子,并且通过评估由摄像机上的这些光子组成的光强度分布的图像来直接确定强度分布相对于样品的位置。根据局部化原则,这种确定还允许实现衍射极限之外的分辨率。
另外,对样品成像的摄像机可以用于通过利用光照射样品来驱动粒子发射光子而确定该粒子的初始位置,而不需要在空间上构造所述光。在两个或更多个粒子被确定在发射光子并且不能彼此分开进行跟踪的情况下,可以通过有目的地施加存在于与最低强度区相邻的光强度分布的最高强度区中的高强度光来光化学地漂白剩余粒子。当例如通过摄像机识别出它不是已经移动的被跟踪的粒子而是经过被跟踪粒子的路径的类似种类的另一粒子时,扰动粒子的这种漂白也可以被应用。可以例如从巨大数量的被发射的光子进一步离开光的强度分布的最低强度区来推断这一点。
对样品成像的摄像机还可以从摄像机检测到的由粒子发射的光子的位置来确定粒子的运动方向。对于该确定,还可以执行粒子的定位,其中,基于当粒子离开光的强度分布的最低强度区时粒子发射的光子来进行这种定位。这里,不需要以高精度进行这种定位。因此,不需要粒子发射许多光子,因为所发射的光子仅仅用于确定光的强度分布的最低强度区为了跟随粒子而必须移动的方向。然而,所发射的光子没有必要用于实现跟踪粒子时期望的空间分辨率。相反,通过随后使粒子发射的光子的速率最小并因此通过形成和/或布置光强度分布的最低强度区来实现空间分辨率。
由于根据本发明的方法的目的是由粒子发射的光子的速率最小化,所以除了光子之外所检测到的背景也具有重要性。可以例如通过施加到样品上的光驱动粒子发射光子给出该背景或者由于粒子的自身荧光而给出该背景。为了使背景的影响最小化,驱动粒子发射光子的光可以以脉冲施加到样品上,并且可在光的每个脉冲之后在有限的时间间隔内检测由粒子发射的光子。该时间间隔或闸极可以被调整使得实现最大的信号噪声比。
根据本发明的方法也可以应用于跟踪可转换(switchable)的粒子,例如可转换的分子,其中用于驱动光子发射的光可以导致可转换分子从其中粒子不能被驱动来发射光子的状态到其中粒子能够被驱动来发射光子的荧光状态的激活。用于这种可转换分子的一个实例被称为PADRON,其是绿色荧光蛋白(GFP)的突变体。虽然不是必需的,但是如果粒子迅速返回到非荧光暗态则在该实施例中可以是优选的,这是由于这支持如下效果,即,在驱动光子发射的光的强度分布的最低强度区中实现所发射的光子的速率最小化。粒子返回到暗态可自发地发生,或者可以由任何物理或化学信号诱导。由于不需要该诱导信号被空间地构成,所以优选不被空间地构成。与驱动光子发射的光的波长相比另一波长的光也可以例如用来调整低浓度的被激活粒子,该低浓度的被激活粒子可被驱动来在样品中发射光子,这是对于所有单一粒子的跟踪来说所需要的。为此,可以使用所谓的DRONPA分子。DRONPA是GFP的另一种突变体并在其激发波长下具有与PADRON的特性相比相反的激活特性。
根据本发明的方法还可以跟踪两个或更多个不同粒子的运动。为此,可以使用两种或更多种不同波长的光,并可以检测出其波长作为相应粒子的特征的光子。除了共同的物镜之外,可以利用单独的装置执行对两种或更多种不同粒子的这种跟踪。然而,这些装置也可共用除了相应光源之外的共同部件。所有共同部件然后可以以交替方式用于两个粒子,即,在跟踪一个粒子与跟踪另一个粒子之间转换。
一种根据本发明的设备包括:光源,其提供用于驱动粒子发射光子的光;和检测器,其检测由粒子发射的光子。该设备还包括位于光源中的光束成形装置,以便以包括在空间上限定的最低强度区的强度分布施加光到样品。此外,设置有依靠检测器的信号进行控制的光束偏转装置。这种依靠性构造成通过相对于样品移动或偏转光强度分布来保持由检测器检测到的光子的速率最小。因此,利用光强度分布的最低强度区跟踪运动的粒子。
根据本发明的设备的光源可叠加在最低强度区的位置处显示零点的干涉图案中干涉的相干光束。为了调制光束的相位关系,光源可以包括动态可控的空间光调制器。
可以设置摄像机用于对样品成像。该摄像机可以例如用来确定要跟踪的粒子在样品中的位置。对于该确定,样品可以经受无空间结构的光。当在样品中跟踪粒子时,摄像机还可用来确定光强度分布的位置。另外,摄像机可以用来确定为了跟踪粒子强度分布必须被移动的方向。
为了跟踪两种不同的粒子,可以设置提供不同波长的光的两种光源。用于同时进行跟踪,单独的光束成形装置和光束偏转装置可以被提供给每个光源。然而,还可以为两个光源提供以交替的方式使用的共用装置。还可以为了同时或快速地交替跟踪两个以上的粒子而提供两个以上的光源。
特别地,光源可以是类似于脉冲激光的脉冲光源,使得光以脉冲的方式被施加到样品。检测器于是可以设置有栅极并且与该脉冲光源同步,使得在光的每个脉冲之后在有限的时间间隔内以最大的信号噪声比检测由粒子发射的光子。
因为根据本发明的设备只需要提供用于驱动粒子进行发射的光,所以其设置可以保持简单。然而,也可基于(已存在的)STED或RESOLFT荧光显微镜实现根据本发明的设备。这里,用于抑制荧光的光束的光束成形装置可被用于光,根据本发明粒子由该光驱动以发射光子。此外,用于扫描样品的光束偏转装置可适于用来通过使检测到的光子的速率最小化来跟踪粒子。
现在更详细地参考附图,图1示出用于跟踪样品3中的粒子2的运动的设备1。例如,粒子2可以是荧光标记物,或粒子2可以利用这种荧光标记物进行标记。该荧光标记物被来自光源5的光4驱动以发射光子。这基本上仅发生在光4在样品3中强度分布的最低强度区的外部。将参考图3至6更详细地描述该强度分布。光源5包括:激光器6;光束成形装置7,其用于调节物镜8的聚焦体中所需的光强度分布;和光束偏转装置9、10和11,用于调节光4在样品3中强度分布的最低强度区的位置。光束偏转装置9和10直接作用于光4,并且在x和/或y方向上即在相对于光路的侧向上移动或偏转最低强度区。然而,光束偏转装置11直接作用于样品3,并且相对于样品3在z向上移动或偏转光4的强度分布的最低强度区。在分色光束分离器13之后设置有点检测器12,用于选择性地检测由粒子2发射的光子。光束分离器13设置在激光6和样品3之间的光路中,具体地设置在激光6与光束偏转装置9和10之间。另一光束分离器14设置在光束偏转装置9和10与物镜8之间。通过光束分离器14,包括二维检测器的摄像机15监视样品3。为了初始确定粒子2的位置,光4在大面积上施加到样品3,并且基于由粒子2所发射的并利用摄像机15成像的光子确定粒子2的位置。然后,相对于粒子2调整光4的强度分布,使得粒子2位于光4的强度分布的最低强度区的位置。通过基于试验相对于样品3移动光4的强度分布来检查粒子2确实位于最低强度区的位置处。通过这些移动,利用点检测器12检测到的由粒子2发射的光子的速率应增加。然而,速率下降表明:因为粒子2已移动,所以光4的强度分布已被调整以利用最低强度区跟踪粒子2。在光4的强度分布不移动的情况下光子的速率增加也意味着粒子2已在样品3中移动。于是,光4的强度分布必须移动,以便利用最低强度区跟踪粒子2,直到光子的速率再次到达其最小值。对于这种跟踪,光束偏转装置9至11由控制器16依靠检测器12的信号进行控制。跟踪过程中所确定的光4的强度分布的最低强度区的位置和/或移动类似于粒子2在样品3的运动。可以从利用摄像机15检测到的由粒子2发射的光子的那些位置,即粒子离开最低强度区的位置来确定粒子2的运动方向,以利用最低强度区维持粒子的跟踪。
在图1中,表明控制器16还控制光束成形装置7。实际上,光束成形装置7可以是空间光调制器,光4在样品3中的不同强度分布可通过该空间光调制器进行适当调整。这些光强度分布的最低强度区分别被限定在一个或两个维度中,并且只包括可以在样品3中跟踪粒子2的相交的公共点。该实施例能够利用在所有三个维度的最大空间分辨率关于粒子2在样品3中的运动来跟踪粒子2。
图2所示的设备1的实施例不包括根据图1的点检测器12。这里,只有摄像机15用于检测由样品3中的粒子2发射的光子。另外,样品3是基本上只在两个维度上延伸的样品。光4的强度分布包括由环状最高强度区围绕的用于跟踪粒子2的中央最低强度区。在静态光束成形装置7的帮助下产生光4的这种环形强度分布。光4的强度分布的最低强度区利用直接作用于光4的光束偏转装置9和10设置在二维样品3的平面中。摄像机15布置在另一物镜17之后,物镜17布置在样品3的与物镜8相反的侧。这里,摄像机15另外用来确定光4在样品3中的强度分布的位置。一方面,这允许确定光束偏转装置9和10的当前位置。另一方面,这可以用来确定光4在样品中强度分布的最低强度区的位置。特别地,还可以在超出衍射极限的空间分辨率下确定样品中最低强度区的位置。
图3示意性示出光4在样品3中的强度分布,粒子2位于光强度分布18的中央最低强度区19处。图4是示出光强度分布18(直线)沿着通过根据图3的样品3的线轮廓的强度I的曲线图(以增加的比例)。在最低强度区19的区域,光强度分布18具有关于最低强度区19对称的基本上正弦的弯曲。除了光强度分布18之外,图4示出假设粒子2经受光4的对应强度I时由粒子2所发射的光子的产生速率R(虚线)。在最低强度区19的位置处,速率R也具有其最小值Rmin。只要粒子2离开该最低强度区19,速率R就迅速增大。特别地,即使在离最低强度区19的小距离处,速率R也已经达到接近或等于其最大值Rmax的值。这种行为有利地用于在高的空间分辨率下以光强度分布18的最低强度区19跟踪样品3中的粒子2。
当粒子2已相对于强度分布18改变其位置并且如图5所示离开最低强度区19时,由粒子2发射的光子的增大速率R被检测到。通过基于试验在样品3中移动强度分布18,速率再次降低,并保持最小。采用这种方式,确定粒子2已经运动的方向和距离,因为如图6所示在具有最低强度区19的光强度分布18已经相对于样品3在相同的方向上移动并且移动相同的距离之前速率的最小值没有达到。还可以从利用摄像机检测到的由粒子2发射的光子的位置确定具有最低强度区19的强度分布18为了跟踪粒子2必须移动的方向。
附图标记列表
1 设备
2 粒子
3 样品
4 光
5 光源
6 激光
7 光束成形装置
8 物镜
9 光束偏转装置
10 光束偏转装置
11 光束偏转装置
12 点检测器
13 光束分离器
14 光束分离器
15 摄像机
16 控制器
17 物镜
18 强度分布
19 最低强度区
I 强度
R 速率
Claims (20)
1.一种跟踪样品(3)中粒子(2)运动的方法,所述粒子(2)当经受光(4)照射时被驱动以发射光子,所述方法包括:
-形成光,以提供包括在空间上限定的最低强度区(19)的光强度分布(18),
-将所述光强度分布(18)施加到样品(3),使得粒子(2)位于所述光强度分布(18)的所述在空间上限定的最低强度区(19)中,
-检测由该粒子(2)发射的光子,以及
-相对于样品(3)移动所述光强度分布(18),使得由粒子(2)发射的光子的速率保持最小,其中所述粒子(2)通过所述光强度分布(18)的最低强度区(19)进行跟踪。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述光强度分布(18)的最低强度区(19)在空间上以至少一个空间维度进行限定,并且所述光强度分布(18)被相对于样品(3)在空间地限定出所述最低强度区(19)的所有维度方向上移动。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述光被形成以利用光的相干光束的干涉图案提供光强度分布(18),并且所述最低强度区(19)是干涉图案的零点。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述相干光束的相位关系被调制以从不同方向在空间上限定所述最低强度区(19)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中,利用点检测器(12)检测所述光子。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中,利用摄像机(15)对所述样品(3)成像。
7.根据权利要求6所述的方法,其中,当样品(3)均匀地经受光照射时,利用所述摄像机(15)确定所述粒子(2)的起始位置。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其中,由摄像机(15)跟踪所述光强度分布(18)相对于所述样品(3)的位置。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法,其中,通过利用摄像机(15)检测到的由粒子(2)发射的光子的位置来确定粒子(2)的运动方向。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中,光(4)以脉冲施加到样品上,并且在每个脉冲之后在有限的时间间隔内检测由粒子(2)发射的光子。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中,所述粒子被光(4)从所述粒子不能被驱动以发射光子的第一状态激活到所述粒子能够被驱动以发射光子的第二状态。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中,利用两种不同波长的光(4)同时或交替地跟踪两个不同的粒子(2)的运动。
13.一种用于跟踪样品(3)中粒子(2)运动的设备(1),所述设备(1)包括:
-光源(5),其构造为提供用于驱动粒子(2)发射光子的光,所述光源(5)包括光束成形装置(7),其构造成以包括在空间上限定的最低强度区(19)的强度分布(18)施加光(4)到样品(3),
-检测器(12,15),其构造成检测由粒子(2)发射的光子并提供表示检测到的光子的速率的信号,以及
-光束偏转装置(9至11),其构造成相对于样品(3)移动强度分布(18),并基于所述检测器(12,15)的信号而受到控制,使得所述检测器(12,15)检测到的光子的速率保持最小,以便利用最低强度区(19)跟踪运动的粒子(2)。
14.根据权利要求13所述的设备(1),其中,所述光源(5)叠加多个相干光束,以在最低强度区(19)的位置处形成包括零点的干涉图案。
15.根据权利要求14所述的设备(1),其中,所述光源(5)包括用于调制所述多个光束的相位关系的可控空间光调制器。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的设备(1),其中,所述检测器是点检测器(12)。
17.根据权利要求13至15中任一项所述的设备(1),其中,所述检测器(12)是摄像机(15)。
18.根据权利要求13至16中任一项所述的设备(1),还包括构造成对样品(3)成像的摄像机(15)。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的设备(1),其中,所述光源(5)是以脉冲施加光(4)到样品的脉冲光源,并且所述检测器(12)包括与所述脉冲光源同步的栅极,其构造成在每个脉冲之后在有限的时间间隔内检测由粒子发射的光子。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的设备(1),其中,设置有两个光源来提供不同波长的光,用于同时或交替地跟踪两个不同粒子的运动。
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