CN115552223A - 用于确定样品中分子的位置的方法、计算机程序和设备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于借助定位显微镜确定样品中两个或更多个相互间隔的分子在一个或多个空间方向上的位置的方法、具有指令的计算机程序以及设备。此外，本发明还涉及一种定位显微镜，其使用根据本发明的设备。为了确定分子的位置，使用由于相干光的干涉而产生的光分布。在该方法中，使用具有多个可切换像素的第一光调制器生成多个光分布(S1)。第一光调制器布置在定位显微镜的成像平面中。每个光分布具有局部的强度最小值和与之邻接的强度增加区域。利用相应的光分布照射(S2)两个或更多个分子中的每一个。对于每个光分布，针对光分布的不同定位检测(S4)由分子发出的光子。在此，所述光分布相互无关地定位(S3)。最后，基于针对光分布的不同定位检测到的光子，推导(S5)出分子的位置。

Description

用于确定样品中分子的位置的方法、计算机程序和设备
本发明涉及一种用于确定样品中分子的位置的方法、具有指令的计算机程序以及设备。本发明尤其涉及一种借助定位显微镜来确定在样品中两个或更多个相互间隔的分子沿一个或多个空间方向的位置的方法、具有指令的计算机程序以及设备，其中，为确定所述分子的位置，使用由相干光的干涉而生成的光分布。此外，本发明还涉及一种定位显微镜，其使用根据本发明的设备。
MINFLUX显微成像涉及定位显微镜的技术应用。在样品中荧光团的定位是借助结构化的激光分布完成的。术语MINFLUX所依据的方案在于，用最小数量的荧光光子确定分子的坐标(英文：minimal emission fluxes)。MINFLUX显微成像的基本特征在于，荧光团的激发分别以如下方式进行，即，待定位的荧光团总是靠近激发光分布的最小值或在最小值中放置，所述最小值理想地是零点，其中，激发光分布必须具有与最小值相邻的强度增加区域。由此在获得关于相应的发射荧光团的位置的信息方面实现了荧光光子的更好的利用。这也适用于荧光团随时间移动的应用。由DE 10 201 1 055 367 B4、US 2014/0042340 A1和DE 10 201 3 114 860 B3已知MINFLUX显微成像的原理。
DE 10 2011 055 367 B4描述了一种用于跟踪样品中的颗粒的运动的方法。在该方法中，利用光促使颗粒发射光子，并且记录由颗粒发射的光子。在此，光以具有空间受限的最小值的强度分布对准样品。最小值跟踪在样品中移动的颗粒，其方式是，强度分布相对于样品移动，使得由颗粒发射的光子的比率保持最小。
在US 2014/0042340 A1中补充地描述了，可以基于颗粒在样品的区段中的停留时间从被跟踪的颗粒的痕迹获得图像。此外，在该文献中描述，为了跟踪颗粒，也可以合理地使用激发光分布与关断光分布的组合，特别是通过激发射线来激发被激发的荧光团的光的分布。在此，两个光分布的局部中央最小值应彼此重合。在跟踪始终处于两个光分布的共同的最小值中的颗粒时，阻止到达光分布的影响区域中的其他荧光团发射荧光，从而不干扰对应跟踪的颗粒的跟踪。
文献DE 10 2013 114 860 B3描述了一种用于确定样品中物质的分子的位置的方法。各个分子处于荧光状态并且在激发光下被激发以发射荧光，其中激发光的强度分布具有至少一个零点。针对激发光的强度分布的至少一个零点的不同位置记录源自被激发的各个分子的荧光。然后由荧光的强度相对于激发光的强度分布的至少一个零点的位置的变化曲线导出各个分子的位置。
在此基础上形成一系列关于信息收集的细化。关于MINFLUX显微成像的详细描述可以参见文献F.Balzarotti等人的“Nanometer resolution imaging and tracking offluorescent molecules with minimal photon fluxes”[1]。为了能够借助于MINFLUX显微成像定位荧光团，原则上必须将大量位置中的强度最小值和强度最大值相对于荧光团的位置定位。为此，在预备步骤中，以较低的第一准确度估计荧光团的位置。这可以借助于常规的定位显微镜、例如PALM(光敏定位显微镜)或STORM(随机光学重建显微镜)来实现，或者借助其他已知方法、例如基于对结构化照明装置的使用来实现。随后，将激发光的强度分布定位在已知位置处，所述已知位置被选择为使得荧光团接近强度分布的最小值。荧光团的荧光应答被测量。对于强度分布的一个或多个另外的位置重复相同的内容。借助于类似于三角测量方法的强度比的评估，可以更精确地确定荧光团的位置。原则上，荧光团离激发最小值越远或者说荧光团越朝强度增加范围移动，发射率就越高。该更准确地确定的位置现在可以用作重复前述步骤的顺序的起始位置，其中，所述位置可以更靠近荧光团的估计位置。尤其考虑到跟踪荧光团的移动，也可以使用在荧光团朝强度增加范围移动或移动到最小值时发射率的变化，以便估计荧光团的移动。
MINFLUX显微成像的一些方面在文献US 2019/0235220 A1、US 2019/0234882 A1和US 2019/0234879 A1中公开。
US 2019/0235220 A1描述了一种用于确定荧光团位置的方法，其中仅需要少量或最小数量的位置(在所述位置处放置强度最小值)。强度最小值在应确定荧光团的位置的每个空间方向上在强度增加区域的两侧相邻。
US 2019/0234882 A1描述了一种方法，其中使用由第一MINFLUX步骤获得的位置信息，以便在后续步骤中将强度光分布的最小值分别更靠近荧光团地放置并且由此导出更精确的位置信息。
US 2019/0234879 A1描述了一种方法，其中将强度最小值非常快速地放置在荧光团的估计位置周围的多个位置处。然后，如果在某一个位置处被确定出更高的发射率，则该位置被推进得更接近假定的最小值。该方法特别适用于观测荧光团的移动。
借助MINFLUX显微成像能够通过实验室方法以仅1nm的不可靠性在两个空间方向上确定荧光团的位置，也即定位的准确性类似于荧光团本身的尺寸。如果要以给定的测量不可靠性确定单个荧光团的位置，则为此需要较之通过常规定位显微成像的确定位置相比更短的时间。然而MINFLUX显微成像的弊端在于，迄今对大量荧光团的位置确定需要大时间成本。
在所有定位显微成像的方法中高度准确地确定各个荧光团的位置。通过大量这种定位的集合则可以建立样品的图像，该图像具有较之通过阿贝极限(Abbe-Limits)规定的宽视场成像的极限分辨率远远更精细的分辨率。这种精细分辨的显微成像方法被称为超分辨率显微成像方法或被称为纳米显微成像方法。
另一种显微成像方法能够实现略低于经典阿贝极限的分辨率或者具体地允许按照阿贝极限的一半大小的结构的分辨率，所述另一种显微成像方法以术语SIM(SIM：Structured Illumination Microscopy；结构化照明纤维成像)已知，例如参考文献M.G.L.Gustafsson的“Surpassing the lateral resolution limit by a factor of twousing structured illumination microscopy”[2]。在此，在宽视场中的样品被周期性变化的强度分布加载，该强度分布的周期大约相当于成像系统的衍射极限。由此产生的荧光在宽视场探测器上成像。随后，强度分布相对于样品偏移小于样品中的图案的周期，通常偏移三分之一的周期，并且再次拍摄图像。这些步骤将再次重复。所拍摄的荧光图像彼此不同，其中，差异源于照明光分布相对于荧光团的未知的、但对于所有图像都相同的分布的已知位移。由图像的集合可以计算出荧光团的未知的分布。为了获得在多个空间方向上的分辨率，必须旋转光栅。在M.G.L.Gustafsson的论文“Nonlinear structured-illuminationmicroscopy:Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimitedresolution”[3]中，以SSIM(SSIM：Saturated Structured Illumination Microscopy；具有结构化照明和饱和的显微镜)为名描述了该方法至少扩展至理论上不受限的分辨率。
用于实现超分辨率的另一概念被称为ROSE(ROSE：Repetitive opticalselective exposure；重复光学选择性曝光)，其例如由L.Gu等人的论文“Molecularresolution imaging by repetitive optical selective exposure”[4]已知。在这种将定位显微成像与结构化照明相结合的方法中，以多个基于干涉的条状强度分布顺序地激发单独的荧光分子，并且基于顺序探测的荧光借助于比率式的位置确定来定位所述荧光分子。与具有相同光子预算的常规定位显微成像相比，这能够实现定位精度的大约两倍的改进。为生成干涉条纹图案，利用振幅调制器调制和分割激光束。通过探测光路中的切换装置实现快速探测，所述切换装置将激发序列的各个强度分布的荧光分别引导至同一CCD探测器(CCD：Charge Coupled Device；电荷耦合器件)的不同区域上。
L.Reymond等人的论文“Simple：Structured Illumination based PointLocalization Estimator with Enhanced Precision”[5]以术语SIMPLE(SIMPLE：Structured Illumination Based Point Localization Estimator；基于结构化照明的点定位估计器)也描述了一种方法，其与传统的重心估计方法相比实现了单分子定位精度的两倍提高。SIMPLE还将SIM方案与比率定位结合起来，使用精确的相移正弦波图案作为纳米标尺，根据20μm尺寸的视场上光子数的变化同时进行粒子定位。所述正弦波图案借助微镜致动器生成。
J.Cnossen等人的论文“Localization microscopy at doubled precision withpatterned illumination”[6]描述了一种称为SIMFLUX的方法，该方法将重心估计和由正弦照明图案引起的光子数变化结合在常规宽视场成像设备中，以提取关于典型微米范围视场的位置信息。在定位时，除了摄像机上的位置信息之外，还使用了有关激发强度图案在探测时间点的相应位置的信息。作者指出，如果激发强度图案的位置不是在整个周期内移动，而是仅在较小的范围内移动，则原则上可以实现与MINFLUX相同的分辨率提高。根据相关的补充说明，这适用于相对于所使用的激发强度图案的中间相位具有特定位置的荧光团。
US 2019/0353912 A1描述了用于光束成形和扫描的设备。该设备包括带有多个微镜的数字微镜设备(DMD)。利用所述微镜设备能够调节激光束的焦点沿着激光束的传播方向的轴向位置和焦点在垂直于运动方向的平面上的侧向位置。所述设备可以例如应用于超分辨显微镜中。
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于确定样品中分子的位置的改进方案，由此降低用于多个荧光团的定位确定的时间成本。
所述技术问题通过带有权利要求1的技术特征的方法、带有权利要求19的技术特征的计算机程序、带有权利要求20的技术特征的设备以及带有权利要求21的技术特征的显微镜解决。本发明的有利的设计方案是从属权利要求的技术方案。
根据本发明的第一方面，所述方法用于借助定位显微镜来确定在样品中两个或更多个相互间隔的分子的沿一个或多个空间方向的位置，其中，为确定所述分子的位置，使用由相干光的干涉而生成的光分布，所述方法包括以下步骤：
-在使用具有多个可切换的像素的第一光调制器的情况下，生成多个光分布，所述第一光调制器布置在定位显微镜的成像平面中，其中，每个光分布都具有局部的强度最小值(或称为最小强度)和与其邻接的强度增加区域；
-分别(或者说相应地)利用一个光分布照射两个或更多个分子中的每一个；
-对于每个光分布，针对光分布的不同定位检测由分子发出的光子，其中，所述光分布相互无关地定位；并且
-基于针对光分布的不同定位检测到的光子推导出分子的位置。
根据本发明的另一方面，计算机程序包括指令，在被计算机执行时，所述指令促使计算机实施以下步骤来借助定位显微镜来确定在样品中两个或更多个相互间隔的分子沿一个或多个空间方向的位置的方法，其中，为确定所述分子的位置，使用由相干光的干涉而生成的光分布：
-在使用具有多个可切换的像素的第一光调制器的情况下，生成多个光分布，所述第一光调制器布置在定位显微镜的成像平面中，其中，每个光分布都具有局部的强度最小值和与其邻接的强度增加区域；
-分别利用一个光分布照射两个或更多个分子中的每一个；
-对于每个光分布，针对光分布的不同定位检测由分子发出的光子，其中，所述光分布相互无关地定位；并且
-基于针对光分布的不同定位检测到的光子推导出分子的位置。
术语“计算机”在此应当宽泛地理解。计算机尤其还包括微控制器、嵌入式系统和其它基于处理器的数据处理装置。
该计算机程序可以例如被提供用于电子的调取，或者可以存储在计算机可读的存储介质上。
根据本发明的另一方面，所述设备用于借助定位显微镜来确定在样品中两个或更多个相互间隔的分子的沿一个或多个空间方向的位置，其中，为确定所述分子的位置，使用由相干光的干涉而生成的光分布，所述设备包括：
-控制单元，其设计用于，控制具有多个可切换的像素的第一光调制器，所述第一光调制器布置在定位显微镜的成像平面中，用于生成多个相互无关地(或者说相互独立地)定位的光分布，其中，每个光分布都具有局部的强度最小值和与其邻接的强度增加区域；和
-评估单元，其设计用于，基于为了相应的光分布的不同定位、针对每个光分布由分子发出的光子来推导出分子的位置。
在根据本发明的技术方案中使用多个光分布，以便借助定位显微镜使多个分子或者荧光团的位置确定并行。为此目的，借助光调制器生成各单独的光分布，所述光调制器布置在定位显微镜的成像平面中。光分布能够通过光调制器的相应控制在此相互无关地定位。通过对分子的并行检测，显著降低了用于扫描样品的时间成本。检测到的分子或荧光团必须为了检测被同时活化并具有能够允许同时的限制衍射的探测的间距。在光分布中需要最小间距。如果在时间片段内活性分子在样品的区域中为此具有过小的间距，则这些活性分子在该时间片段内不被观察到。在本发明的技术方案，分别观察到多个分子或荧光团，其彼此相距如此远，使得光分布不接触。
通常使用荧光团实施MINFLUX显微成像，荧光团“闪烁”，即在能发出荧光的状态和不能发出荧光的状态之间变化。在此，状态之间的变换可以要么在固定设置的环境条件下纯粹随机地进行，要么通过切换过程、也即通过去激活光或通过激活光或者通过用于使所有分子去激活的去激活光与将少量分子激活的激活光的组合引发。因此可能的是，分别在一个定位区域中仅一个荧光团是可发出荧光的，但是总体上整个样品仍然可以在使用大多数荧光团的情况下成像。合适的荧光团和用于可切换的荧光团的切换方法对于本领域技术人员来说是已知的。
光调制器在成像平面中布置的优点在于，在样品中光分布的移动能够通过结构或图案在成像平面中的光调制器上的直接成像特别简单且由此迅速地实现。光分布的个性化的移动对应于图案在光调制器上的个性化的移动。可以非常迅速地计算出分别所需的移动，由此实现高决策速度。
根据本发明的一个方面，在定位显微镜的傅里叶平面中布置了用于影响光分布的第二光调制器。第二光调制器尤其设计用于阻挡个别的衍射级。通过第二光调制器能够有针对性地进一步影响由第一光调制器生成的光分布。如果由第一光调制器例如产生多个衍射级，则可以通过第二光调制器滤除不应在进一步的光路中使用的那些衍射级。在此，滤波可以根据情况进行调整，从而实现大的灵活性。
根据本发明的一个方面，第一光调制器是振幅调制器或相位调制器。优选地，第一光调制器是可在两个固定状态之间切换的光调制器。二进制的光调制器具有的优点是，它们非常迅速，而模拟的相位调制器(如通常在全息方法中使用的那样)明显更慢。光调制器可以例如实现为液晶调制器或微机电调制器、尤其实现为微镜阵列。这种光调制器可商购获得，易于实现并且能够实现30kHz至50kHz的帧速率。预计未来将实现更高的帧速率。示例性地，可以使用具有1920×1080或2560×1600可切换像素的光调制器。
根据本发明的一个方面，为了产生光分布，借助第一光调制器的可切换像素构造一维或二维结构。优选地，所述一维结构为栅格结构，所述二维结构为环形结构。通过每个一维的栅格结构，在样品中实现由相继的强度最大值和强度最小值构成的类似栅格的光分布，利用所述光分布能够确定例如荧光团在一个空间方向上的位置。为了位置确定，尤其可以使用中心的强度最大值和两个相邻的强度最大值中的一个或两个最亮的强度最大值连同位于所选择的最大值之间的强度最小值。为了在两个空间方向上的位置确定，必须附加地提供其它取向的光分布。通过环形结构可以实现以所谓的“局部空心光束”形式的光分布，也就是说该光分布的形式为：该光分布具有在三个空间方向上受限的零点并且利用该光分布能够实现在三个空间方向上的位置确定。另一可行方案是产生呈甜甜圈形式的光分布，即产生这样的光分布：所述光分布具有在两个空间方向上受限的零点并且利用所述光分布实现在两个空间方向上的位置确定的光分布。为此目的，可以在第一光调制器上显示点或盘。此外，随后还使用静态或动态相位调制器，如从STED显微成像(STED：StimulatedEmission Depletion；受激辐射损耗)中已知的那样，用于调制(或者说显现)相位斜坡。
根据本发明的一个方面，为了定位光分布，借助第一光调制器的可切换像素构造的一维或二维结构发生移动。在此，结构的位移优选小于结构的结构元件的尺寸，其中，结构元件的尺寸在两个维度上都大于像素的尺寸。例如，利用像素构成的栅格线可以具有十个像素的线宽。如果光学系统设计成使得由此得到样品中的光分布的250nm的周期，则栅格线围绕一个像素的移动导致样品中的光分布的25nm的移动。
根据本发明的一个方面，为了以光分布相继的位置确定，通过改变所属的一维或二维结构的结构特性来改变光分布的强度曲线。例如，通过改变一维结构的栅格常数和/或纵横比或二维结构的孔直径，可以改变邻接于局部强度最小值的强度增加区域的边缘陡度。通过用于相继的位置确定或测量的光分布的变化，可以逐步地提高位置确定的准确度。以这种方式，分子或荧光团的位置可以在具有多个变焦级的迭代步骤中越来越准确地确定。尤其在使用二进制光调制器的情况下可以非常快速地执行这种迭代的位置确定。
根据本发明的一个方面，光分布由不同的部分光分布在时间上的叠加产生。为此，例如可以在相继的步骤中使由第一光调制器产生的干涉图案的不同衍射级发生干涉，由此分别形成部分光分布，所述部分光分布在一定程度上具有倾斜的轴线。倾斜的方向取决于哪些衍射级发生干涉。如果所形成的部分光分布在时间上叠加，则产生三维加成的光分布，所述光分布在轴向方向上在倾斜轴线的交点的位置处具有最小值，强度增加区域邻接所述最小值。通过在两个子光分布之间沿径向方向的相对移动，也即通过所属结构在第一光调制器上的移动，可以使交点进而使最小值的位置沿轴向方向移动。这允许在三个维度中非常快速地确定分子或荧光团的位置。
根据本发明的一个方面，借助于至少一个光分布检测样品中的标记以确定漂移。替代地，可以从连续测量中测量的分子位置的相同方向的变化来确定漂移。当不仅要确定分子的位置，而且要从连续的测量中确定分子的运动时，这些方法是特别有利的。如果检测到固定定位标记的运动，则可以校正所测量的分子运动。然而，为此目的，需要在样品中提供合适的标记物。在MINFLUX显微成像中，这种标记物可以例如是荧光团，因为其由于MINFLUX原理而几乎不褪色。为了提供标记物，可以例如利用局部空心光束从着色的结构中、例如在被不可切换荧光团着色的固定细胞内的纤维中使一球粒(bead)脱色。如果对某个位置照射一段时间，那么该点附近的纤维就脱色。通过该方式可以生成原则上任意小的、持续发光的光斑。这例如可以具有40nm至100nm的尺寸，然后随后在使用MINFlUX原理的情况下被轻柔地定位。然而，替代地，也可以从多个分子的相同方向的运动推断出，在样品和测量装置之间发生了相对位移。然后可以通过运动的相同方向部分来校正各个分子的测得的运动。
根据本发明的一个方面，样品中的光分布具有在0.5μm至4μm范围内的横向尺寸。业已表明，在样品中的光分布的这些尺寸的情况下实现可靠的位置确定并且同时能够实现多个的可彼此无关地定位的光分布。
在本发明的一个实施方式中，可以在应用根据MINFLUX原理的定位之前，估计活性的发光体或荧光团的位置，其方式在于，优选借助于第一光调制器产生一维的栅格状照明光分布的序列，其中,该序列的每个照明光分布涵盖相同的多个数量的分离的荧光团。多个荧光团的位置可以优选地通过如现有技术中作为SIMPLE、SIMFLUX或ROSE已知的方法来估计。随后，针对多个荧光团中的多个荧光团或针对所有荧光团同时分别根据MINFLUX原理进行更精确的定位。
在本发明的一个实施方式中，首先可以利用合适波长的光分布在使用合适的投射图案的情况下将荧光团有针对性地仅在确定的区域中置于能荧光的状态中，或者有针对性地在部分区域中保持在能荧光的状态中。为此，除了上述微栅和甜甜圈之外，还可以使用其他基本图案。特别地，光分布可以整体地或局部地是点阵。此外，例如通过在灰度操作中使用DMD，具有连续变化的加成光强度的连续面状的照明图案是可能的，所述照明图案与待观察结构的密度分布相匹配，从而可以有针对性地在活化的分子上产生期望的密度分布。在此，在使用相应的荧光团的情况下，例如对于激活(或称为活化)，优选地在成像平面中使用与对于随后的激发相同的光调制器。
也可以使用不同的光分布的序列或组合，例如激活光的具有如此适配的强度分布的图案的序列，使得非活化的荧光团在强度最大值的区域中以合适的概率切换到活化状态；以及使用去激活光的相应的图案的序列，所述去激活光的图案在激活光的强度最大值的区域中具有零点并且因此在那里将荧光团保持在活化状态中。本领域技术人员原则上已知的是，将激活光调整至仅激活合适的少量荧光团。随后则可以在这样准备的区域中并行地使用MINFLUX原理。
也就是说要关注的是，从一开始就相当准确地知道荧光团在何处可以处于可发出荧光的状态，或者说在哪些区域中能发出荧光的荧光团的密度适合于单荧光团检测，并且然后利用子多个部分栅格(Teilgitter)能够相互无关地移动的事实。
对于每个待定位的荧光团也可以有利地使用激发光分布和去激活光分布的组合，其中去激活光是STED光。在此有利地，STED光分布的至少一个局部的中央最小值和激发光分布的最小值分别重合，STED光分布的最小值用于定位，也就是说，根据之前的位置估计，分别待定位的荧光团位于最小值内部。在此，多个光分布不必完全相对应。例如，作为STED光分布可以分别被选择为甜甜圈，并且作为激发光分布可以选择为一维的栅格。为了荧光团的定位，则激发光分布和STED光分布同时再定位，也即移动并且必要时再定向，或者可以使激发光分布再定位，而STED光分布保持位置固定，从而使得激发最小值分别多次不同地分别定位在STED最小值的区域内，或者可以使激发光分布保持位置固定，而STED光分布再定位。还可以考虑三种方案的组合。作为再定位的备选或补充，也可以改变激发光和/或STED光的光分布的尺寸和/或强度。例如可以一开始将具有空间更大尺寸的最小值的STED甜甜圈与激发光分布叠加，并且在随后的步骤中可以将该STED甜甜圈例如根据已经实现的定位准确度收窄和/或提高其强度。在所有在此所述情况下，为了生成两个光类型的光分布，优选每个光类型各使用一个光调制器，其分别布置在所属激发光路径或者STED光路径内的成像平面中。所述光路径可以沿光路方向观察例如借助合束器被合并，所述合束器可以是二向色构件。
在一种扩展方案中，使用激发光分布和去激活光分布的组合，其中去激活光是STED光，STED光分布具有局部最小值，而激发光分布不具有局部最小值。在该变型方案中，不实施Minflux原理，但仍基于针对光分布的不同定位所检测到的光子，优选借助于比率法来确定待定位的分子的位置。例如，可以使用可变换至保护状态的发光体或荧光体。这种发光体及其在特定STED方法中的用途例如由WO 2014 108455A1已知。在本发明的一个实施方式中，相应的发光体(其中一部分在样品的初始状态中处于可激发状态)利用切换光的分别具有局部最小值的光分布在所述最小值之外的区域中至少从可激发状态切换到保护状态。随后，样品可能被相应的光分布加载，所述光分布分别由激发光分布和STED光分布组成，其中，STED光分布分别具有最小值，所述最小值在位置上与相应的切换光分布的最小值重叠。切换光和STED光在其波长方面可以是相同的。以这种方式实现的是，在STED最小值内仅能以高概率激发单个发光体，所述发光体然后能利用比率法定位。在最小值之外，至少多个发光体处于保护状态，在该保护状态下，发光体既不被激发光也不被STED光脱色。通过使用STED光，防止在单组荧光团的定位过程中，与该组荧光团相邻的荧光团随机地变为可激发状态，并且干扰或阻止所涉及的荧光团的定位。
以相应的方式，也可以使用在初始状态下处于保护状态的荧光团。然后，这些可以借助于激活光分布局部地激活，所述激活光分布优选具有衍射受限的中心最大值，并且随后如所描述的那样借助于激发光和STED光的组合来定位。替代地，其定位也可以仅在使用激发光分布的情况下进行。
根据本发明的一个方面，通过分子发射的光子通过摄像机或光子计数器阵列来检测。在此，使用摄像机具有的优点在于，摄像机价格低廉并且能够实现快速读取。使用光子计数器的优点在于，光子计数器在探测光子时非常有效并且此外具有非常高的时间分辨率。光子计数器可以例如是单光子雪崩二极管(SPAD：Single-Photon Avalanche Diode)。
根据本发明的另一个方面，根据本发明的显微镜包括：
-光源，用于生成相干光；
-第一光调制器，具有多个可切换的像素，所述第一光调制器布置在显微镜的成像平面中，用于生成多个由相干光的干涉形成的光分布，其中，每个光分布都具有局部的强度最小值和与其邻接的强度增加区域；
-光学器件，用于分别利用一个光分布照射样品中两个或更多个相互间隔的分子；
-探测单元，用于检测针对光分布的不同定位由分子发出的光子，其中，所述光分布相互无关地定位；和
-根据本发明的用于确定两个或多个分子在一个或多个空间方向上的位置的设备。
本发明的其它特征由以下描述和所附权利要求结合附图得出。
图1示意性示出用于在一个或多个空间方向上确定样品中两个或更多个相互间隔的分子的位置的方法；
图2示出用于在一个或多个空间方向上确定样品中两个或更多个相互间隔的分子的位置的设备的第一实施方式；
图3示出用于在一个或多个空间方向上确定样品中两个或更多个相互间隔的分子的位置的设备的第二实施方式；
图4示出具有多个分子的样品；
图5示出在穿过光分布的横截面上的强度变化曲线；
图6示出显微镜的原理性构造，其中实施根据本发明的技术方案；
图7阐释借助具有多个像素的光调制器实现结构；
图8示出生成多个可相互无关地定位的光分布的第一示例；
图9示出生成多个可相互无关地定位的光分布的第二示例；
图10示出生成呈局部空心光束形式的光分布的示例，实施局部空心光束具有在三个空间方向上受限的零点；
图11示出生成多个可相互无关地定位的、呈局部空心光束形式的光分布的示例；
图12示出由不同局部光分布的时间叠加生成光分布的示例；
图13示出穿过用于叠加的干涉图案的轴向截面；并且
图14示出穿过根据图12针对局部光分布的不同横向移动生成的光分布的轴向截面。
为了更好地理解本发明的原理，以下借助附图更详细地阐述本发明的实施方式。当然，本发明不限于这些实施方式，并且描述的特征还能够被结合或调整，只要不脱离本发明的在所附权利要求中限定的保护范围即可。
图1示意性示出用于确定样品中两个或更多个在一个或多个空间方向上相互间隔的分子的位置的方法。为了确定分子的位置，使用由于相干光的干涉而产生的光分布。在该方法中，使用具有多个可切换像素的第一光调制器生成多个光分布S1。第一光调制器、例如振幅调制器或相位调制器被布置在定位显微镜的成像平面中并且优选可在两个固定状态之间切换。优选地，用于影响光分布的第二光调制器布置在傅里叶平面中，例如用于阻挡个别衍射级。每个光分布具有局部的强度最小值和与之邻接的强度增加区域。分别各利用一个光分布照射两个或更多个分子中的每一个S2。对于每个光分布，针对光分布的不同定位检测由分子发出的光子S4。在此，所述光分布相互无关地定位S3。最后，基于针对光分布的不同定位检测到的光子，推导出分子的位置S5。为了光分布的生成S1，能够借助第一光调制器的可切换的像素构造一维结构、例如栅格结构，或二维结构、例如环形结构。为了光分布的定位S3，随后移动所构造的结构。在此，结构的位移优选小于结构的结构元件(或者说结构元素)的尺寸，其中，结构元件的尺寸在两个维度上都大于像素的尺寸。结构元件在栅格结构的情况下是栅格线，在环形结构的情况下是环。在此，光分布也可以由相干光束的不同干涉图案的时间叠加生成。为此，例如在先后相继的步骤中，能够使由第一光调制器生成的干涉图案的不同衍射级发生干涉，并且所形成的干涉图案在轴向方向上相互移动。此外还存在的可能性在于，为了以光分布的先后相继的位置确定，通过改变所属的一维或二维结构的结构特性来改变光分布的强度曲线。例如，通过改变一维结构的栅格常数或二维结构的孔直径，可以改变邻接于局部强度最小值的强度增加区域的边缘陡度。多个光分布的可用性可以用于检测和补偿样品的漂移。例如，可以借助于至少一个光分布来检测样品中的标记物。作为备选，漂移可以在连续的测量中由分子的测量位置的相同方向的变化来确定。
图2示出设备20的第一实施方式的简化示意图，其用于确定样品中两个或更多个相互间隔的分子在一个或多个空间方向上的位置。设备20具有接口21，控制单元22通过所述接口控制具有多个可切换的像素的第一光调制器7，以便生成多个可相互无关地定位的光分布。第一光调制器7(例如振幅调制器或相位调制器)被布置在定位显微镜的成像平面中并且优选可在两个固定状态之间切换。每个光分布具有局部的强度最小值和与之邻接的强度增加区域。此外，控制单元22可以通过所述接口21控制布置在傅里叶平面中的第二光调制器12，用于影响光分布，例如阻止个别衍射级，并且控制单元可以通过所述接口控制光源15。评估单元23通过所述接口21接收探测单元16的数据，利用所述探测单元检测由分子发出的光子。基于为了相应光分布的不同定位而针对每个光分布由分子发出的光子，评估单元23推导出分子的位置。为了光分布的生成，能够借助第一光调制器的可切换的像素构造一维结构、例如栅格结构，或二维结构、例如环形结构。为了光分布的定位，随后移动所构造的结构。在此，结构的位移优选小于结构的结构元件的尺寸，其中，结构元件的尺寸在两个维度上都大于像素的尺寸。结构元件在栅格结构的情况下是栅格线，在环形结构的情况下是环。在此，光分布也可以由相干光束的不同干涉图案的时间叠加生成。为此，例如在先后相继的步骤中，能够使由第一光调制器生成的干涉图案的不同衍射级发生干涉，并且所形成的干涉图案在轴向方向上相互移动。此外还存在的可能性在于，为了以光分布的先后相继的位置确定，通过改变所属的一维或二维结构的结构特性来改变光分布的强度曲线。例如，通过改变一维结构的栅格常数或二维结构的孔直径，可以改变邻接于局部强度最小值的强度增加区域的边缘陡度。多个光分布的可用性可以用于检测和补偿样品的漂移。例如，可以借助于至少一个光分布来检测样品中的标记物。作为备选，漂移可以在连续的测量中由分子的测量位置的相同方向的变化来确定。
控制单元22和评估单元23可以被监控单元24控制。通过用户接口26可以在必要时改变控制单元22、评估单元23或监控单元24的设置。在设备20中产生的数据可以在需要时存储在设备20的存储器25中，以便例如进行后续评估或者由设备20的部件使用。控制单元22、评估单元23以及监控单元24可以实施为固定的硬件，例如实施为集成电路。然而其当然可以部分或完全组合或作为软件被实施，所述软件在合适的处理器、例如在CPU或GPU上运行。接口21也可以实施为独立的输入端和输出端形式。
图3示出设备30的第二实施方式的简化示意图，其用于确定样品中两个或更多个相互间隔的分子在一个或多个空间方向上的位置。设备30具有处理器32和存储器31。设备30例如是微控制器、计算机或嵌入式系统。在存储器31中存储有指令，这些指令在由处理器32执行时使设备30实施根据所述方法之一的步骤。因此，存储在存储器31中的指令体现由处理器32可执行的程序，该程序实现按照本发明的方法。设备30具有用于接收信息的输入端33。由处理器32生成的数据通过输出端34提供。此外，这些数据能够被存储在存储器31中。输入端33和输出端34可以组合成双向接口。
处理器32可以包括一个或多个处理器单元、例如微处理器、数字信号处理器或其组合。
所述实施方式的存储器25、31可以具有易失的或不易失的存储区域，并且包括不同的存储设备和存储介质，例如硬盘、光学存储介质或半导体存储器。
图4示出具有多个分子2样品1。示例性地示出五个分子2，应确定所述分子的位置P1至P5。为此目的，分子2被荧光团标记，或者分子2直接是荧光团。荧光团能够被合适波长的光激发，以发出光子。在MINFLUX显微成像中，荧光团的激发分别由此进行，即，待定位的荧光团总是靠近为激发所使用的光分布的最小值或在最小值中放置，其中，所述光分布必须具有与最小值相邻的强度增加区域。由此在获得关于相应的发射荧光团的位置的信息方面实现了荧光光子的更好的利用。理想地，激发光分布的最小值是零点。
图5示出在穿过适用于根据本发明的技术方案的光分布4的横截面上的示例性强度变化曲线。绘制相对于光分布4内的位置(在此沿x轴)的强度I。光分布4的强度变化曲线具有中心的强度最小值5，在所述强度最小值两侧邻接有强度增加区域6。这种光分布4例如可以以甜甜圈形式的强度分布的形式实现。在此情况下，中心的强度最小值5在所有侧面上都被强度增加区域6包围，从而可以直接实现在二维上的位置确定。作为备选，这种光分布4也可以实施为条纹栅格的干涉图案。在此情况下，光分布4具有一个以上的强度最小值，然而仅使用其中一个。此外，强度增加区域6仅在两个相对置的侧面上与强度最小值5邻接，从而对于在两个维度中的位置确定需要相应旋转的条纹栅格。如下面进一步阐述的那样，只要强度分布沿着射束传播方向适当地变化，还能实现在三维中的位置确定。
图6示出了显微镜40的示例性原理结构，其中实施根据本发明的技术方案。光源15、例如激光器发出例如波长为640nm的相干光3。相干光3射到第一光调制器7上，所述第一光调制器布置在成像平面中并且具有多个可切换的像素，例如1920×1080或2560×1600的像素。借助于第一光调制器7可以产生多个可相互无关地定位的光分布，其方式是，可切换的像素构成一维的或二维的结构。从第一光调制器7发出的光利用透镜14成像在傅立叶平面13中，第二光调制器12位于傅立叶平面13中。第二光调制器用于影响光分布，其方式例如为，第二光调制器遮挡个别的衍射级。从第二光调制器12发出的光通过另外的透镜14成像到样品中并且可以在那里用于位置确定。由样品1中的分子发出的光子为此经由分束器17、例如波长选择性分束器朝探测单元16偏转并且由该检测单元检测。探测单元16可以是摄像机，例如具有2048×2048像素的摄像机。考虑到用于扫描的奈奎斯特准则，64μm×40μm的视场仅需要640×400像素，因此可以更快地读出，也可以考虑使用多个波长。
第一光调制器7、第二光调制器12和光源15由根据本发明的用于确定分子位置的设备20操控，所述设备此外还评估探测单元16的数据。出于简明起见，定位显微镜40的其他部件、例如用于影响透镜14或样品1的偏振或运动的部件未在图6中示出。这些部件是本领域技术人员已知的，并且同样也能够被设备20控制。
理想地是图6所示的结构，其中，多个元件分别准确地处于成像平面11或傅里叶平面13中。可行的结构还在于，其中仅近似满足这两点。在此，沿轴向方向可容忍的偏差随着元件周围的光学器件的瑞利长度缩放，所述瑞利长度沿射束方向观察不仅与激光器本身的射束质量相关，而且还与上游的光学器件的焦距相关，并与从物平面方向观察沿射束方向处于下游的光学器件相关。
在实践中最简单地可实现的是，将第二光调制器12作为空间滤波器在透镜14的焦平面中置于第一光调制器7之后，并且此外将第一光调制器7置于相对于物平面的成像平面中。在其他位置处与理想状态的偏差基本上可以被轻易容忍，然而当然极其简单的是，理想地构建从第一光调制器7经由透镜14直至空间滤波器12的构造。通常，STED显微镜由具有内置物镜和相关联的管透镜的显微镜支架构成。在此已知的是，(虚拟的)后焦平面位于哪个位置处。这在实践中通常被称为瞳孔平面或简称为瞳孔。该平面是其他的光学器件必须参考的平面，即，如果要在物平面中准直地照明，则入射光束必须聚焦到该平面中(该平面则最终位于或无论如何能够位于物镜的几何尺寸内)，也即入射光束必须设置为，在没有物镜的情况下，入射光束就会在该处构成焦点。该平面同时也是场分布应处于的平面，其傅里叶变换的场分布应处于物体中。在实践中，当物镜被移除时，可以将点源放置在该平面中并通过管透镜成像。然后，精确地在点源成像的位置处获得与傅里叶平面共轭的平面，该平面恰好又是傅里叶平面。随后可以容易地确定其他傅里叶平面13或成像平面11。
图7阐释借助具有多个像素8的光调制器7实现结构9。在此，图7a)示出具有多个结构元件10的结构9，在此情况下是条纹栅格。结构元件10因此是单独的栅格线。图7b)示出各个栅格线的放大局部。栅格线由第一光调制器7的多个像素8组成，也即结构元件10的尺寸在两个维度上大于像素8的尺寸。为定位光分布，由光调制器7实现的结构9发生移动，也即各个结构元件10在此以像素尺寸的整数倍移动。在二进制光调制器7中，结构的最小移动通过像素尺寸规定，并且由此小于结构元件10的尺寸。亚像素移动例如可以通过倾斜的图案(混叠效应)、穿孔图案或多级式或模拟调制器、必要时结合额外的傅里叶滤波器实现。
图8示出生成多个可相互无关地定位的光分布的第一示例。在此，图8a)示出由第一光调制器实现的结构，在此情况下是两个条纹栅格，其分别具有四个栅格线。图8b)示出在傅里叶平面中所属的干涉图案。在此，在该实例中干涉图案的0级被第二光调制器阻挡，这在图8c)中示出。在之后的流程中，干涉图案的+1级和-1级发生干涉，这在样品的平面中、也即在xy平面中导致图8b)所示的干涉图案。为了位置确定，尤其可以分别使用±1级的强度最小值和与之邻接的强度最大值、也即0级和±1级的强度最大值，其近似地具有相同的最大强度。
图9示出生成多个可相互无关地定位的光分布的第二示例。在此，图9a)示出由第一光调制器实现的结构，在此情况下是两个条纹栅格，其分别具有仅两个栅格线。该条纹栅格的横向尺寸小于图8所示的示例中的情况。图9b)也示出在傅里叶平面中所属的干涉图案。在此，如前所述，在该实例中干涉图案的0级被第二光调制器阻挡，这在图9)中示出。在之后的流程中，干涉图案的+1级和-1级发生干涉，这在样品的平面中导致图9d)所示的干涉图案。为了位置确定，也可以尤其使用±1级的强度最小值和与之邻接的0级和±1级的强度最大值。虽然这些强度最大值具有不同的最大强度，但是这些偏差还不会导致对位置确定的损害。
图10示出生成呈局部空心光束形式的光分布的示例。在此，图10a)示出由第一光调制器实现的结构，在此情况下是环形结构。图10b)示出在傅里叶平面中所属的干涉图案。在样品的平面中形成图10c)所示的图像。中心的强度最小值从各个侧面被强度最大值包围。在轴向方向上、也即在射束传播方向上形成在图10c)中作为xz平面中的截面示出的强度变化曲线。如图清楚所示，该光分布也具有沿轴向方向的强度最小值，强度增加区域邻接该强度最小值。该光分布由此允许在三个维度上的位置确定。为此，例如样品可以沿轴向方向移动。作为备选，还可以在光路中布置额外地动态聚焦的元件，利用所述元件能够使光分布沿轴向方向移动，例如可变形的反射镜。
图11示出生成多个可相互无关地定位的、呈局部空心光束形式的光分布的示例。在此，图11a)示出由第一光调制器实现的结构，在此情况下是九个可相互无关地定位的环形结构。图11b)示出在傅里叶平面中所属的干涉图案。在样品的平面中形成图11c)所示的图像。在所有九个光分布中，中心的强度最小值在所有侧面上被强度最大值包围。在轴向方向上形成在图11c)中作为xz平面中的截面示出的强度变化曲线。如图清楚所示，所有光分布也具有沿轴向方向的强度最小值，强度增加区域邻接该强度最小值，从而能够实现在三个维度上的位置确定。
图12示出由不同局部光分布的时间叠加生成光分布的示例。在此，图12a)示出由第一光调制器实现的结构，在此情况下是具有两个栅格线的条纹栅格。图12b)示出在傅里叶平面中所属的干涉图案。在此，在该实例中干涉图案的+1级被第二光调制器阻挡，这在图12c)中示出。在之后的流程中，干涉图案的0级和-1级发生干涉，这在样品的平面中、也即在xy平面中导致图12b)所示的部分光分布。如图清楚所示，形成了具有一个强度最小值和从两侧与之邻接的强度最大值的光分布。与之类似地，随后在傅里叶平面中通过第二光调制器阻挡干涉图案的-1级，从而在后续的流程中使干涉图案的0级和+1级发生干涉。在此情况下应注意的是沿轴向方向的强度变化曲线，其在图13中作为xz平面中的截面被示出。在此，图13a)示出干涉图案的0级与-1级之间的干涉的强度变化曲线，图13b)示出干涉图案的0级与+1级之间的干涉的强度变化曲线。如图清楚所示，部分光分布分别在一定程度上具有在图13a)和图13b)中以点状线示出的倾斜轴线。两个部分光分布在时间上叠加，也即光分布以短时间间隔辐射至样品的相同个位置，图14b)中所示的强度变化曲线又作为xz平面中的截面。如图清楚所示，该叠加的光分布也具有沿轴向方向的强度最小值，强度增加区域邻接该强度最小值。如图14b)和图14c)所示，该强度最小值能够在轴向方向上移动，其方式在于，两个部分光分布彼此相互沿径向方向移动。
参考文献
[1]F.Balzarotti et al.:“Nanometer resolution imaging and tracking offluorescent molecules with minimal photon fluxes”,Science,第355(2017)卷,第606-612页。
[2]M.G.L.Gustafsson:“Surpassing the lateral resolution limit byafactor of two using structured illumination microscopy”,Journal ofMicroscopy,第198(2000)卷,第82-87页。
[3]M.G.L.Gustafsson:“Nonlinear structured-illumination microscopy:Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution”,Proceedings of the National Academy of Sciences,第102(2005)卷,第13081-13086页。
[4]L.Gu et al.:，，Molecular resolution imaging by repetitive opticalselective exposure”,Nature Methods,第16(2019)卷,第1114-1118页。
[5]L.Reymond et al.:“SIMPLE:Structured illumination based pointlocalization estimator with enhanced precision”,Optics Express,第27(2019)卷,第24578-24590页。
[6]J.Cnossen et al.:“Localization microscopy at doubled precisionwith patterned illumination”,Nature Methods,第17(2020)卷,第59-63页。
附图标记清单
1 样品
2 分子
3 相干光
4 光分布
5 强度最小值
6 强度增加区域
7 第一光调制器
8 像素
9 结构
10 结构元件
11 成像平面
12 第二光调制器
13 傅里叶平面
14 透镜
15 光源
16 探测单元
17 分束器
20 设备
21 接口
22 控制单元
23 评估单元
24 监控单元
25 存储器
26 用户接口
30 设备
31 存储器
32 处理器
33 输入端
34 输出端
40 显微镜
Pi 位置
S1 生成多个光分布
S2 分别利用光分布照射分子
S3 相互无关地定位光分布
S4 检测针对光分布的不同定位所发出的光子
S5 基于所发出的光子推导分子的位置。

Claims (21)

1.一种用于借助定位显微镜(40)来确定在样品(1)中两个或更多个相互间隔的分子(2)沿一个或多个空间方向的位置(Pi)的方法，其中，为确定所述分子(2)的位置(Pi)，使用由相干光的干涉而生成的光分布(4)，所述方法包括以下步骤：
-在使用具有大量可切换的像素(8)的第一调制器(7)的情况下生成(S1)多个光分布(4)，所述第一光调制器布置在定位显微镜(40)的成像平面(11)中，其中，每个光分布(4)都具有局部的强度最小值(5)和与其邻接的强度增加区域(6)；
-分别利用一个光分布(4)照射(S)两个或更多个分子(2)中的每一个；
-对于每个光分布(4)，针对光分布(4)的不同定位检测由分子(2)发出的光子，其中，所述光分布(4)相互无关地定位(S3)；并且
-基于针对光分布(4)的不同定位检测到的光子推导(S5)出分子(2)的位置(Pi)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在定位显微镜(40)的傅里叶平面(13)中布置用于影响光分布(4)的第二光调制器(12)。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述第二光调制器(12)设计用于阻挡个别的衍射级。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一光调制器(7)是振幅调制器或者相位调制器。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述第一光调制器(7)是可在两个固定状态之间切换的光调制器。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，为了生成(S1)光分布(4)，借助第一光调制器(7)的可切换的像素(8)构造一维的结构或二维的结构(9)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述一维的结构(9)是栅格结构，而所述二维的结构(9)是环形结构。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，为了定位(S1)光分布(4)，借助第一光调制器(7)的可切换的像素(8)构造的结构(9)发生移动。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，结构(9)的移动小于所述结构(9)的结构元件(10)的尺寸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述结构(9)的结构元件(10)的尺寸在两个维度上大于像素(8)的尺寸。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其中，为了利用光分布(4)进行相继的位置确定，通过改变所属的一维的结构或二维的结构(9)的结构特性来改变光分布(4)的强度变化曲线。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，通过改变一维的结构的栅格常数和/或纵横比或二维的结构的孔直径，改变邻接于局部的强度最小值(5)的强度增加区域(6)的边缘陡度。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述光分布(4)由不同的部分光分布的时间叠加形成。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述部分光分布由通过第一光调制器(7)生成的干涉图案的不同衍射级的干涉形成。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，借助于至少一个光分布(4)检测样品(1)中的标记物(6)以确定漂移。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，通过分子(2)在先后依次的测量中测得的位置(Pi)的相同方向的变化确定漂移。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，样品(1)中的光分布(4)具有在0.5μm至4μm范围内的横向尺寸。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，通过分子(2)发出的光子通过摄像机或光子计数器阵列来检测(S4)。
19.一种具有指令的计算机程序，所述指令在被计算机执行时促使计算机实施根据权利要求1至18中任一项所述的方法的步骤，用于借助定位显微镜(40)来确定在样品(1)中两个或更多个相互间隔的分子(2)沿一个或多个空间方向的位置(Pi)。
20.一种用于借助定位显微镜(40)来确定在样品(1)中两个或更多个相互间隔的分子(2)的沿一个或多个空间方向的位置(Pi)的设备(20)，其中，为确定所述分子(2)的位置(Pi)，使用由相干光的干涉而生成的光分布(4)，所述设备具有：
-控制单元(22)，其设计用于，控制具有大量可切换的像素(8)的第一光调制器(7)，所述第一光调制器布置在定位显微镜(40)的成像平面(11)中，用于生成(S1)多个可相互无关地定位的光分布(4)，其中，每个光分布(4)都具有局部的强度最小值(5)和与其邻接的强度增加区域(6)；和
-评估单元(23)，其设计用于，基于为了相应的光分布(4)的不同定位、针对每个光分布(4)由分子(2)发出的光子来推导(S5)出分子(2)的位置(Pi)。
21.一种显微镜(40)，其具有：
-光源(15)，用于生成相干光(3)；
-第一光调制器(7)，具有大量可切换的像素(8)，所述第一光调制器布置在显微镜(40)的成像平面(11)中，用于生成(S1)多个由相干光的干涉形成的光分布(4)，其中，每个光分布(4)都具有局部的强度最小值(5)和与其邻接的强度增加区域(6)；
-光学器件(14)，用于分别利用一个光分布(4)照射(S2)样品(1)中两个或更多个相互间隔的分子(2)；
-探测单元(16)，用于检测(S4)针对光分布(4)的不同定位由分子(2)发出的光子，其中，所述光分布(4)能够相互无关地定位；和
-根据权利要求20所述的用于确定两个或多个分子(2)在一个或多个空间方向上的位置(Pi)的设备(20)。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102020134495B4 (de) 2020-12-21 2024-02-15 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Mikroskop zur Aufnahme von Trajektorien einzelner Partikel in einer Probe
DE102022119332B3 (de) 2022-08-02 2023-12-28 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, lichtmikroskop und computerprogramm zum lokalisieren oder verfolgen von emittern in einer probe
DE102022120952B4 (de) 2022-08-18 2024-03-14 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zum simultanen verfolgen zweier emitter

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10063276C2 (de) 2000-12-19 2002-11-07 Leica Microsystems Scanmikroskop
JP2005084266A (ja) 2003-09-05 2005-03-31 Kawasaki Heavy Ind Ltd 光制御装置および光制御方法
DE102007025688A1 (de) 2007-06-01 2008-12-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Wellenlängen- oder polarisationssensitiver optischer Aufbau und dessen Verwendung
WO2010084478A2 (en) 2009-01-24 2010-07-29 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) High-resolution microscopy and photolithography devices using focusing micromirrors
WO2012039636A2 (en) 2010-09-24 2012-03-29 Christian Soeller "3d localisation microscopy and 4d localisation microscopy and tracking methods and systems"
US9291562B2 (en) 2011-11-15 2016-03-22 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Method and apparatus for tracking a particle, particularly a single molecule, in a sample
DE102011055367B4 (de) 2011-11-15 2017-02-09 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels, insbesondere eines einzelnen Moleküls, in einer Probe
GB201217171D0 (en) 2012-08-23 2012-11-07 Isis Innovation Stimulated emission depletion microscopy
DE102013100172A1 (de) 2013-01-09 2014-07-10 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Luminophor aufweisenden Struktur einer Probe
WO2014136784A1 (ja) 2013-03-06 2014-09-12 浜松ホトニクス株式会社 蛍光受光装置および蛍光受光方法
EP2801854B1 (en) 2013-05-10 2017-07-19 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Method and apparatus for combination of localization microscopy and structured illumination microscopy
DE102013114860B3 (de) 2013-12-23 2015-05-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Orte einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe
DE102015002205A1 (de) 2015-02-24 2016-08-25 PicoQuant Innovations GmbH Mikroskopische Vorrichtung mit Verfahren zur verbesertem Analyse von Photonendaten
US10884250B2 (en) 2015-09-21 2021-01-05 The Chinese University Of Hong Kong Apparatus and method for laser beam shaping and scanning
US9632297B1 (en) 2015-11-04 2017-04-25 Abberior Instruments Gmbh Device for separately modulating the wave fronts of two components of a light beam and microscope comprising the device
EP3417331A4 (en) 2016-02-16 2019-10-30 Universite Laval METHOD AND SYSTEM FOR IMPROVING LATERAL RESOLUTION IN OPTICAL GRID MICROSCOPY
US11072160B2 (en) 2016-08-23 2021-07-27 Lawrence Livermore National Security, Llc System and method for stimulated emission depletion projection stereolithography
WO2018069283A1 (de) 2016-10-10 2018-04-19 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum räumlich hochauflösenden bestimmen des orts eines vereinzelten, mit anregungslicht zur emission von lumineszenzlicht anregbaren moleküls in einer probe
CN108181235B (zh) * 2017-11-18 2022-01-28 苏州国科医工科技发展(集团)有限公司 一种基于均匀结构光照明的sted并行显微成像系统
DE102018127281A1 (de) 2018-10-31 2020-04-30 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mikroskop und Verfahren zur Mikroskopie
CN110632045B (zh) 2019-09-10 2022-05-20 之江实验室 一种产生并行超分辨焦斑的方法和装置

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