CN118010692A - 一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置 - Google Patents
一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118010692A CN118010692A CN202410120530.3A CN202410120530A CN118010692A CN 118010692 A CN118010692 A CN 118010692A CN 202410120530 A CN202410120530 A CN 202410120530A CN 118010692 A CN118010692 A CN 118010692A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- light
- positioning
- lattice
- illumination
- molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000005286 illumination Methods 0.000 title claims abstract description 93
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims abstract description 43
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000003491 array Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 34
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 19
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 14
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 102100029469 WD repeat and HMG-box DNA-binding protein 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710097421 WD repeat and HMG-box DNA-binding protein 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 claims description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 6
- 230000010363 phase shift Effects 0.000 description 6
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 5
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005672 electromagnetic field Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 208000007578 phototoxic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000018 phototoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229920013655 poly(bisphenol-A sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 238000010869 super-resolution microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Microscoopes, Condenser (AREA)
Abstract
本发明提供一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,包括:激发光光路模块,包括依次布置的:光源系统;晶格光产生系统,其设置为产生4束激发光束,并将激发光束转换为傅里叶空间频率级次光,激发光束用于在干涉时产生矩形阵列形式的晶格光的照明光斑;和晶格光斑传递系统,将傅里叶空间频率级次光传递至物镜的后焦面,以在物镜的前焦面形成的晶格光的光斑,利用晶格光的照明光斑实现对样品的照明激发;荧光探测光路模块,提取出样品激发后的荧光信号,得到单分子定位图像。本发明的单分子定位显微成像装置能够实现高分辨率和高定位通量的单分子定位检测。
Description
技术领域
本发明属于光学超分辨显微成像领域,特别设计一种使用调制光斑用于照明和定位单分子荧光的显微成像方法和装置。
背景技术
单分子定位显微镜(SMLM)是一种通过定位稀疏闪烁荧光分子来打破衍射极限的技术。随机光学重构显微术、光活化定位显微术和DNA-PAINT等是SMLM方法的代表性技术。这些技术也对化学和细胞生物学的进步做出了重要贡献。在SMLM中,分辨率和定位通量是极其重要的参数,它们极大地影响图像质量。根据SMLM的原理,SMLM的分辨率与检测到的光子总数密切相关。更高的光子计数可以更准确地拟合单分子荧光点扩散函数(PSF),从而提高亚像素位置的定位精度。因此,许多技术方案都致力于提高光子收集效率。可行的解决方案包括增加额外的荧光收集物镜,使用更亮的探针,使用氧清除系统。然而,即使使用了这些技术,通过SMLM实现5纳米分子尺度的分辨率仍然具有挑战性。
近年来,采用结构光图案照明的方案,出现了MINFLUX、MINSTED、SIMFLUX、ROSE等新的单分子定位技术。MINFLUX以有限的总信号光子数实现了1纳米三维定位精度。它已在单分子追踪和超高分辨率成像中获得了多项研究成果。然而,MINFLUX的点扫描系统限制了其成像视场(FOV),通常为几微米。受到MINFLUX思想的启发,SIMFLUX和ROSE采用了宽场干涉条纹图案作为定位光束。这些技术提供了几十微米的FOV,并且与传统SMLM相比,实现了近两倍的横向分辨率增强。保持宽场SMLM的定位分辨率和定位通量,干涉条纹照明图案也可以在轴向上扩展。Mod-Loc通过扫描和定位带有倾斜干涉条纹的单个分子,获得了15.6纳米的轴向分辨率。类似地,通过采用纵向照明条纹图案,ROSE-Z在z方向上获得了5.6纳米的分辨率。总之,这些进展证明利用时空调制激发光图案来定位单个分子的位置,是提高SMLM分辨率的有效方法。
其中,MINFLUX、MINSTED,是基于单点检测器开发的超分辨显微术,定位精度高,但是定位通量比较低一次只能定位一个点,所以定位视野(FOV)小;SIMFLUX、ROSE也是基于相机探测器的宽场定位方案,一次能定位很多点,定位通量高,但是SIMFLUX、ROSE使用的是条纹光定位,进一步开发的潜力不足。
传统的单分子定位荧光显微镜由于受到荧光光子数的限制,其分辨率一般会被限制在20nm左右,综合各种分辨率提升方法,如使用双物镜、氧去除系统、更亮的荧光探针等方案,其分辨率也很难达到5nm的尺度。使用结构光作为单分子显微镜的照明和定位光斑,已经被证明是一种切实可用的提升单分子定位精度的方案。晶格光是一种特殊的结构光斑,已经在晶格光片显微镜、晶格光结构光照明显微镜中得到应用。
利用特殊的照明图案来增强显微镜性能是显微镜工程的常见思路。晶格光指的是由特定方向的有限数目入射激光的相干叠加形成的结构化照明图案。在理想情况下,晶格光斑是一种非衍射的光束图案,借助其较高的图案对比度和穿透深度,能够增强显微镜性能。晶格光已经成功地在光片显微镜中作为照明光束使用,并获得了高分辨率、高速度和低光毒性的显微图像。原则上,在保留晶格光斑的优点的同时,晶格光斑也可以被用作SMLM中的照明和定位光束,以实现高分辨率和定位通量。
相关文献:
1.Gu,L.,Li,Y.,Zhang,S.et al.Molecular resolution imaging byrepetitive optical selective exposure.Nat Methods 16,1114–1118(2019).
2.Cnossen,J.,Hinsdale,T.,Thorsen,et al.Localization microscopy atdoubled precision with patterned illumination.Nat Methods 17,59–63(2020).
3.基于三维照明调制的双物镜单分子荧光显微成像方法和装置,申请号202110928164.0。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,以实现高分辨率和高定位通量的单分子定位检测。
为了实现上述目的,本发明提供一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,包括:激发光光路模块,包括依次布置的:光源系统,设置为产生激光光束;晶格光产生系统,其设置为产生4束激发光束,并将激发光束转换为傅里叶空间频率级次光,所述激发光束用于在干涉时产生矩形阵列形式的晶格光的照明光斑;和晶格光斑传递系统,设置为将傅里叶空间频率级次光传递至物镜的后焦面,以在物镜的前焦面形成的晶格光的光斑,利用晶格光的照明光斑实现对样品的照明激发;以及荧光探测光路模块,其设置为提取出样品激发后的荧光信号,得到单分子定位图像。
所述晶格光产生系统还设置为精确快速调制晶格光的照明光斑的X方向和Y方向的相位。
所述晶格光产生系统包括在第一光轴上依次布置的二维光栅、傅里叶变换透镜、分束器、高速空间光调制器,以及分束器下游的空间滤波器;
二维光栅设置为在接收激光光束后衍射产生两行两列的4束激发光束,4束激发光束用于在汇聚时干涉形成矩形阵列形式的晶格光的照明光斑;傅里叶变换透镜设置为将形成的晶格光进行光学傅里叶变换,以形成4束傅里叶空间频率级次光;所述分束器设置为使得来自傅里叶变换透镜的光透过以被高速空间光调制器接收且使得来自高速空间光调制器的光反射至第二光轴,从而分离经过高速空间光调制器调制和未经调制的光束;所述高速空间光调制器的靶面具有两行两列的4个靶面区域,其设置为通过4个靶面区域分别对4束傅里叶空间频率级次光进行随时间快速切换的相位调制;所述空间滤波器设置为对傅里叶空间频率级次光,通过空间滤波的方法滤出所述高速空间光调制器的靶面区域的第一对角线上的+1级次的2束傅里叶空间频率级次光,和所述高速空间光调制器的靶面区域的第二对角线上的-1级次的2束傅里叶空间频率级次光。
所述高速空间光调制器的靶面区域的傅里叶空间频率级次光的相位按照左上靶面区域减右下靶面区域的相位差依次为0,2π/3,4π/3,且右上靶面区域减左下靶面区域的相位差依次为0,2π/3,4π/3的相位差时序来调制,从而组合共形成9组相位调制方式。
所述晶格光斑传递系统包括位于分束器的下游且在第二光轴上依次排布的所述的第一传递透镜、第二传递透镜、第三传递透镜和反射镜,以及与反射镜一同位于第三光轴上的套筒透镜和物镜,所述傅里叶空间频率级次光成像于所述物镜的后焦面,且样品位于所述物镜的前焦面;第一传递透镜与第二传递透镜构成4f系统,用于将调制后的傅里叶空间频率级次光的像传递到第三传递透镜的前焦面;第三传递透镜和套筒透镜构成4f系统,用于将第二传递透镜传递的傅里叶空间频率级次光的像传递至物镜后焦面,物镜用于将4束傅里叶空间频率级次光聚焦在物镜的前焦面,以干涉形成晶格光的照明光斑。
所述空间滤波器位于第二传递透镜和第三传递透镜之间。
所述荧光探测光路模块包括依次布置于第四光轴上的二向色镜、荧光滤片和相机;所述二向色镜设于套筒透镜和反射镜之间,其设置为将来自套筒透镜的荧光反射至荧光滤片。
所述荧光探测光路模块设置为在每次所述高速空间光调制器切换相位时,触发一次采集,以获得不同相位的单分子定位图像。
所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置还包括数据处理模块,所述数据处理模块设置为对获得的不同相位的单分子定位图像进行处理,重建得到最终的超分辨图像。
所述数据处理模块设置为执行如下步骤:
读取单分子定位图像;
进行高斯拟合定位,得到高斯拟合定位的信息;
根据单分子定位图像中的单分子的荧光信号亮度确定单分子的初相位;
结合单分子的初相位和高斯拟合定位的信息确定每一个单分子的周期序数,根据单分子的周期序数和初相位,得到单分子的相位定位信息;
通过将获得高斯拟合定位的信息和单分子的相位定位信息进行线性拟合,实现X方向上的高斯定位-相位定位对齐和Y方向上的高斯定位-相位定位对齐,得到单分子的精确位置;
进行X方向上的相位拼接和Y方向上的相位拼接,以将不同的单分子定位图像中的单分子精确定位的位置进行拼接,最终获得超高分辨的单分子定位图,所述单分子定位图包括单分子的空间位置坐标;
将单分子定位图中的单分子的空间位置坐标映射到一图像上,将该图像作为超分辨图像输出。
本发明的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,相较于传统的均匀照明的单分子定位显微术,本发明通过使用晶格光,能够将传统单分子定位显微镜的分辨率提升2.4倍;此外,本发明拓展了结构光照明用于单分子定位显微镜的适用范围,将照明光斑拓展至二维结构光照明,为后续使用单一三维结构光斑研发三维单分子定位显微镜提供技术思路。单一三维结构光斑,仪器更加稳定,光路更加简单,多通道配准更加简单。
晶格光是一种特种光斑,可以与贝塞尔光束的产生架构相结合,提升穿透深度、提高光斑对比度,为下一步的研发更高分辨率更高穿透深度的单分子定位显微术提供技术思路。
本发明的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置所描述的显微镜采用相机记录单分子荧光信号,因此其基本框架为基于相机的宽场荧光显微镜,能够提供与传统均匀光照明荧光显微镜的单分子荧光定位通量。
附图说明
图1是根据本发明的一个实施例的一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置的结构示意图;
图2是物镜的后焦面的激发光束的光斑的入射位置示意图,所述激发光束的光斑为空间滤波器的通光孔径的像,图中大圆代表显微镜物镜后焦面的螺纹口,小圆代表光斑入射的位置;
图3是高速空间光调制器的靶面上的用于接收并调制4束傅里叶空间频率级次光的相位的靶面区域的分布图;
图4是本发明的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置的数据处理模块的工作流程图。
具体实施方式
下面的描述为根据本发明的思路所设计的其中一个实施方式,其他方式也有可能可以实现,因此本发明不受限于下列实施方式的限制。
下面将详细描述本发明,本发明的附图为具体描述发明的其中一个实施案例,目标是解释说明本发明的基本要旨,并不限制本发明。
如图1所示为根据本发明的一个实施例的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,本发明的主要原理如下:
一般来说,在传统的单分子定位显微镜中,荧光分子会被均匀的照明光束激发。而对于晶格光照明单分子定位显微镜,四束相干的激发光束聚焦到物镜的后焦面,在物镜的后焦面是分离的四束光,经过聚焦后,四束光汇聚于前焦面,并在前焦面上通过四光束干涉产生一个晶格干涉图案(即晶格光的照明光斑),从而使用晶格光的照明光斑来定位单分子,四光束干涉的原理类似于双缝干涉,数学描述如下文的公式1和公式2所示。本发明的所有光学器件都是围绕晶格光来进行布置的,核心器件包括二维光栅5、空间滤波器8、高速空间光调制器9。
为了简单说明晶格光相位的调整方式,四光束干涉的通用公式如下:
其中,Ei和Ej代表电磁场振幅,Vij=ei·ej代表ith和jth波的干涉图案对比度(ei和ej偏振单位矢量).ki和kj是波矢量,r代表单分子位置矢量,和/>代表起始相位,i、j代表光束标号,是正整数。
对于晶格光照明单分子定位显微镜,我们使用矩形阵列形式的晶格光的照明光斑。矩形阵列形式的晶格光的照明光斑可以表示为:
其中,mx和my是晶格光的照明光斑在x和y方向上的调制深度,和/>分别是第一组和第二组对向传播光的初相位,用于编码x和y方向的位置,ψx和ψy是x方向和y方向上的相位偏移量。其中,x方向和y方向均位于与物镜光轴相垂直的面上。
由此,晶格光是四束光干涉得到的,通过改变对x方向和y方向上的相位偏移量ψx和ψy,晶格光的照明光斑会前后左右移动,在本发明中,晶格光的照明光斑的移动路径参见下文的公式(5)。
为了量化晶格光照明单分子定位显微镜的定位精度,以上述的数学描述为起点,我们计算了晶格光照明单分子定位显微镜的克拉美罗下界(CRLB),其定位精度如下:
σ为单分子点扩散函数的光斑尺寸,晶格光的激发光斑周期为在最优情况下/>取最大值,为2,此时最优定位精度为
与传统的单分子定位显微术相比较,上式(4)表明晶格光照明单分子定位显微镜能够提供优于传统单分子定位显微镜2.4倍的分辨率。
晶格光的照明光斑的亮度值和定位精度会在两个方向上变化。根据公式(3),当我们确定单个荧光分子的x坐标时,y位置上的低激发强度将降低分辨率。x的定位精度随不同的y位置而变化。在y方向的整个2π范围内,x的定位精度随着y位置靠近晶格光的最大亮度值而增加,而随着y位置靠近光斑的最小亮度值而减小。也就是说,定位精度分布呈对称的沙漏形状,最佳性能在晶格光的照明光斑的正中间。对于超分辨显微镜,实现整个视野(FOV)内均匀高定位精度至关重要。
因此,本发明还提供了一种基于平铺的策略,即裁剪图像的高分辨率区域,然后将它们拼接到最终的高分辨率图像中。
如图1所示,本发明的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置包括沿光路的走向依次布置的激发光光路模块、荧光探测光路模块和数据处理模块。
激发光光路模块包括依次布置的:
1)光源系统,其优选为具有光束整形功能的光源系统,所述光源系统设置为产生激光光束,并且优选为将激光光束整形成满足要求的激光光束,激光光束的要求包括且不限于:激光光束的光斑尺寸要与下游的空间滤波器8的通光孔径相配合、激光光束的光斑偏振方向要与下游的二维光栅5和高速空间光调制器9相配合。
在本实施例中,所述光源系统包括在第一光轴上依次布置的激光器或单模保偏光纤出射口1、激光器准直透镜2、起偏器3和半波片4。
其中,激光器或单模保偏光纤出射口1设置为提供单分子照明的激光光束,其中由于激光光束用于激发荧光分子发出荧光,激光光束的光强要满足激发光功率要求。激光准直透镜2设置为将发散的激光光束整形成具有特定光斑尺寸(如10毫米)的平行光束。起偏器3设置为重新塑形激光光束的偏振方向,半波片4设置为用于旋转激光光束的照明光斑的角度,使之适配于下游的二维光栅5和高速空间光调制器9。
2)晶格光产生系统,其设置为产生激发光束,并将激发光束转换为傅里叶空间频率级次光,所述激发光束用于在干涉时产生矩形阵列形式的晶格光的照明光斑;并且晶格光产生系统优选为精确快速调制晶格光的照明光斑的X和Y方向的相位。
在本实施例中,所述晶格光产生系统包括在第一光轴上依次布置的二维光栅5、傅里叶变换透镜6、分束器7、高速空间光调制器9,以及分束器7下游的空间滤波器8。
其中,二维光栅5设置为在接收激光光束后衍射产生两行两列的4束激发光束,4束激发光束用于在汇聚时干涉形成矩形阵列形式的晶格光的照明光斑。二维光栅5只是将一束激光分为4束相同功率的激光吗,4束相同功率的光干涉可以形成晶格光.,在本实施例中,4束激发光束之间的初相位差是是0。尽管4束相同功率的光干涉可以直接形成晶格光无需后续调制,但照在样品上的晶格光需要调制。
傅里叶变换透镜6设置为将形成的晶格光进行光学傅里叶变换,以形成4束傅里叶空间频率级次光,从而在衍射后能够形成光点。
所述分束器7设置为使得来自傅里叶变换透镜6的光透过以被高速空间光调制器9接收且使得来自高速空间光调制器9的光反射至第二光轴,从而分离经过高速空间光调制器9调制和未经调制的光束。所述分束器7优选为非偏振分束器,且优选为使用50:50分束器。
所述高速空间光调制器9的靶面具有两行两列的4个靶面区域,其设置为通过4个靶面区域分别对4束傅里叶空间频率级次光进行随时间快速切换的相位调制。
所述高速空间光调制器9的靶面上用于接收并调制4束傅里叶空间频率级次光的相位的靶面区域的分布如图3所示,同一对角线的2个靶面区域的视为一组靶面区域,第一对角线的靶面区域(即左上、右下靶面区域)对应+1级次的傅里叶空间频率级次光(其作为第一组和第二组对向传播光中的其中一组),且第二对角线的靶面区域(即右上、左下靶面区域)对应-1级次的傅里叶空间频率级次光(其作为第一组和第二组对向传播光中的另一组)。
所述高速空间光调制器9可以采用数字微镜镜器件(DMD)或空间光调制器(SLM),相应地,通过数字微镜镜器件(DMD)或空间光调制器(SLM)来控制相位。由此,入射的一束激光经二维光栅分成4束激发光束,经过傅里叶变换透镜6后每一束傅里叶空间频率级次光分别照射到DMD或SLM的一个靶面区域上,每一束激发光束都可以通过DMD或SLM控制相位,在本实施例中,选择的是通过控制对向传播光的光程来调制相位差。
所述高速空间光调制器9需要进行外部电信号控制。具体来说,使用嵌入式程序模块输出的外部电信号来控制左上靶面区域、右上靶面区域、左下靶面区域、右下靶面区域的傅里叶空间频率级次光的相位,这些靶面区域的傅里叶空间频率级次光的相位按照左上靶面区域减右下靶面区域的相位差依次为(0,2π/3,4π/3),右上靶面区域减左下靶面区域的相位差依次为(0,2π/3,4π/3)的相位差时序来调制,从而组合共形成9组相位调制方式(即9个相位步)。所述荧光探测光路模块设置为在每次所述高速空间光调制器9切换相位时,触发一次采集(即移动到一个相位步就采集一张图像),得到与晶格光的照明光斑相对应的荧光信号。
ψx和ψy是x方向和y方向上的相位偏移量,ψx对应于左上靶面区域减右下靶面区域的相位差和右上靶面区域减左下靶面区域的相位差中的一个,ψy对应于左上靶面区域减右下靶面区域的相位差和右上靶面区域减左下靶面区域的相位差中的另一个,都可以不影响技术的成立。
根据上文的公式(2),ψx=0时,使用SLM或DMD调整ψy的相位为(0,2π/3,4π/3),如第一列所示。同理,第二列,ψx=2π/3时,调整ψy的相位为(0,2π/3,4π/3)。同理,第三列ψx=4π/3时,调整ψy的相位为(0,2π/3,4π/3)。
由此,本发明提出了一种基于平铺的策略,按照基于平铺的策略,进行了九个相位步的移动,其相位移动的路由矩阵如下所示:
其中,ψx和ψy是x方向和y方向上的相位偏移量。
在本实施例中,可以认为第一组和第二组对向传播光的初相位和/>的值为0;因此,在上文的公式(2)中,所述高速空间光调制器9实际上就是调整两个余弦函数的相位,使晶格光的照明光斑前后左右移动,或者说扫描。
所述空间滤波器8设置为对傅里叶空间频率级次光,通过空间滤波的方法滤出第一对角线上的+1级次的2束傅里叶空间频率级次光,第二对角线上的-1级次的2束傅里叶空间频率级次光,从而挡掉不需要的光斑。
空间滤波器8的通光孔径与图2所示的物镜的后焦面的激发光束的入射位置相同。具体来说,所述激发光束的光斑为空间滤波器的通光孔径的像,因此,激发光束的光斑的入射位置与空间滤波器的通光孔径的位置类似。由此,在物镜的后焦面处形成如图2所示的激发光束的光斑,其传递至物镜的前焦面并在物镜的前焦面干涉形成晶格光。
为了避免从高速空间光调制器9回到分束器7的光受到空间滤波器8的影响,在本实施例中,所述空间滤波器8设于晶格光产生系统下游的晶格光斑传递系统中。
3)晶格光斑传递系统,设置为将傅里叶空间频率级次光传递至物镜16的后焦面,以在物镜16的前焦面形成的晶格光的光斑,利用晶格光的照明光斑实现对样品的照明激发,从而将样品中荧光分子的强度按照晶格光的照明光斑的强度进行调制。
在本实施例中,所述晶格光斑传递系统包括位于分束器7的下游且在第二光轴上依次排布的所述的第一传递透镜10、第二传递透镜11、第三传递透镜12和反射镜13,以及与反射镜13一同位于第三光轴上的套筒透镜15和物镜16,所述傅里叶空间频率级次光成像于所述物镜16的后焦面,且样品位于所述物镜16的前焦面。
其中,所述空间滤波器8位于第二传递透镜11和第三传递透镜12之间。
其中,第一传递透镜10与第二传递透镜11构成4f系统,将调制后的傅里叶空间频率级次光的像传递到第三传递透镜的前焦面。第三传递透镜12和套筒透镜15构成4f系统,将第二传递透镜11传递过来的傅里叶空间频率级次光的像传递至物镜后焦面,物镜16用于将4束傅里叶空间频率级次光聚焦在物镜的前焦面(即样品上),以干涉形成晶格光的照明光斑。
荧光探测光路模块设置为提取出样品激发后的荧光信号,得到单分子定位图像。这里的单分子指的是单个荧光分子。
在本实施例中,所述荧光探测光路模块包括依次布置于第四光轴上的二向色镜14、荧光滤片17和相机18;所述二向色镜14设于套筒透镜15和反射镜13之间,其设置为将来自套筒透镜15的荧光反射至荧光滤片17。
其中,上文的物镜用于收集荧光信号,上文的套筒透镜用于将物镜收集到的荧光信号成像;二向色镜14用于反射荧光信号,将其与激发光路分开;荧光滤片17,主要作用是滤出荧光信号;相机18,主要作用是将单分子定位图像由光学图像转换成数字化的图像,以进行下一步的数字图像处理。
所述荧光探测光路模块设置为在每次所述高速空间光调制器9切换相位时,触发一次采集,以获得不同相位的单分子定位图像,即触发相机18采集与照明光斑相对应的荧光信号。
所述数据处理模块设置为对获得的不同相位的单分子定位图像进行处理,重建得到最终的超分辨图像。
所述数据处理模块对应的流程框图如图4所示。
如图4所示,所述数据处理模块设置为执行如下步骤:
步骤S1:读取单分子定位图像;即,读取相机采集得到的tif文件,以将获得的单分子定位图像读入到计算机内存;
步骤S2:进行漂移矫正;即,矫正由于热胀冷缩或者机械振动等带来的横向位移偏差;
漂移矫正可以采用多种已有的算法,如互相关算法。
步骤S3:进行高斯拟合定位,得到单分子定位图像中每个单分子的荧光点扩散函数的中心作为高斯拟合定位的信息;即,使用二维高斯函数对荧光点扩散函数进行拟合,获得每个荧光点扩散函数的中心;
由于晶格光定位只能在一个周期内获得精确位置,步骤S3得到的高斯拟合定位的信息用于在后文区分晶格光定位的属于哪个周期。
二维高斯函数的公式为:
其中,xc和yc是荧光分子的真实位置,σ相机上荧光分子的大小。
步骤S4:根据单分子定位图像中的单分子的荧光信号亮度确定单分子的初相位;
即,考虑到每个单分子定位图像所采用的晶格光的相位的不同,提取各个单分子定位图像中的单分子的荧光信号亮度,并拟合出单分子对应的第一组和第二组对向传播光的初相位和/>根据第一组和第二组对向传播光的初相位/>和/>计算出单分子在晶格光的照明光斑中的空间位置。
具有一个周期的余弦函数,知道其初相位,就知道其所处的x位置。如上文所述,由于晶格光在x和y方向上是余弦函数(晶格光的照明光斑是二维余弦函数),使用空间光调制器控制其x相位ψx变化,晶格光的照明光斑在x方向上移动,晶格光的照明光斑在单分子位置也会有一个激发光亮度,激发光越亮,单分子荧光信号越亮,根据单分子的荧光信号亮度使用余弦函数拟合就能获得单分子的初相位(即第一组和第二组对向传播光的初相位和),初相位能够转换成单分子在晶格光斑中的位置,但不能确定单分子处在第几个周期,所以需要使用高斯定位确定其在第几个周期。
单分子的初相位的拟合公式是上文的公式(2),拟合得到的单分子的初相位是第一组和第二组对向传播光的初相位和/>根据公式(2),从三个亮度中能拟合一个余弦函数,获得一个初相位,并将换成空间位置,公式/>
步骤S5:结合单分子的初相位和高斯拟合定位的信息确定每一个单分子的周期序数,根据单分子的周期序数和初相位,得到单分子的相位定位信息;
计算相位步骤只能获得荧光分子处于激发光场的初相位,不能获得此相位的处于激发场的第几周期,计算周期步骤会综合计算的相位与高斯拟合定位的信息(即上文的单分子的荧光点扩散函数的中心),从而确定每一个荧光单分子的周期序数和初相位。
具体来说,晶格光斑的周期是确定的,比如200纳米,如果高斯定位对一个点的定位是(x=1020,y=2056)说明其在x坐标上位于1020/200=第五周期,更精确的位置信息由单分子对应的初相位来确定;
步骤S6:通过将获得高斯拟合定位的信息和单分子的相位定位信息进行线性拟合,实现X方向上的高斯定位-相位定位对齐和Y方向上的高斯定位-相位定位对齐,得到单分子的精确位置。
实际上高斯拟合定位的信息和单分子的相位定位信息是同一个参数,在同一个周期里,两者应该是一样的,但是高斯拟合定位的信息的精度低,所以两者会有偏差,在进行线性拟合时,把单分子的相位定位信息作为x坐标,高斯定位作为y坐标,可以绘制一张图,两者基本按照直线分布,使用如下关系式拟合:高斯定位=k*相位定位+b,并把尽可能多的点拉到这条直线上,从而获得单分子的精确位置。
步骤S7:进行X方向上的相位拼接和Y方向上的相位拼接,以将不同的单分子定位图像中的单分子精确定位的位置进行拼接,最终获得超高分辨的单分子定位图,所述单分子定位图包括单分子的空间位置坐标;
主要思想是把识别并切割高分辨率的位置,并将他们合并成一张图。
步骤S8:超分辨图像重建;即,将单分子定位图中的单分子的空间位置坐标映射到一图像上,将该图像作为超分辨图像输出。
本发明的方法也叫LatticeFLUX是基于相机探测器的宽场定位方案,一次能定位很多点,定位通量高,定位视野大,定位分辨率虽然没有MINFLUX、MINSTED高,但比传统的单分子定位显微镜高。此外,本发明使用的是晶格光定位,与SIMFLUX、ROSE的技术参数相差不大(相同的分辨率,相同的定位通量),但理论上拥有更大的开发潜能,如穿透深度更深等。
本发明的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,相较于传统的均匀照明的单分子定位显微术,本发明通过使用晶格光,能够将传统单分子定位显微镜的分辨率提升2.4倍;此外,本发明拓展了结构光照明用于单分子定位显微镜的适用范围,将照明光斑拓展至二维结构光照明,为后续使用单一三维结构光斑研发三维单分子定位显微镜提供技术思路。单一三维结构光斑,仪器更加稳定,光路更加简单,多通道配准更加简单。1.晶格光是一种特种光斑,可以与贝塞尔光束的产生架构相结合,提升穿透深度、提高光斑对比度,为下一步的研发更高分辨率更高穿透深度的单分子定位显微术提供技术思路。
本发明的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置所描述的显微镜采用相机记录单分子荧光信号,因此其基本框架为基于相机的宽场荧光显微镜,能够提供与传统均匀光照明荧光显微镜的单分子荧光定位通量。
本发明的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置主要贡献是将矩形阵列形式的晶格光的照明光斑引入到单分子定位超分辨领域。但是晶格光光斑是一个具有二维空间结构的光斑,相对于传统的条纹结构光需要对解决如下技术问题:1.当对荧光点扩散函数的x方向进行定位时,晶格光照明的不均匀性会导致在沿着y方向的x坐标定位不均匀。2.由于晶格光二维定位不均匀的问题,需要设计晶格光的相移扫描路径,以满足于后续的数据处理流程。相对于文献中使用条纹光对单分点扩散函数进行定位,本方案使用矩形阵列形式的晶格光的照明光斑增加此晶格光后需要解决上述的两个问题。
本发明还提供了一种基于平铺的策略,具体来说,通过改变对x方向和y方向上的相位偏移量ψx和ψy来改变晶格光的照明光斑的移动路径,随后裁剪图像的高分辨率区域,然后将它们拼接到最终的高分辨率图像中。在这个移动路径中,相位增量和移动步数在x和y方向上都是相等的。在本实施例中,按照上面每个相位拍摄一张图,按照公式(5)对应的相位移动的路由矩阵来拍摄得到具有行方向相位移动的三幅定位图像,使用具有行方向相位移动的三幅定位图像来确定单分子的x位置(即,使用公式2前半部分拟合,后半部分置为常数项;同理,使用具有列方向相位移动的三幅定位图像来确定y位置。通过这些相位移动,图像的最佳性能部分也会发生移动。本发明从中提取高定位精度的区域,然后将它们融合到最终图像中。通过九个相位图像序列可以获得具有最高精度的单分子的二维定位。结果显示,使用这种策略,我们从模拟图像序列中获得了几乎均匀的理论定位精度,在FOV(视场角)上几乎提高了2.4倍的分辨率。
以上所述的,仅为本发明的较佳实施例,并非用以限定本发明的范围,本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰,皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
Claims (10)
1.一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,其特征在于,包括:
激发光光路模块,包括依次布置的:
光源系统,设置为产生激光光束;
晶格光产生系统,其设置为产生4束激发光束,并将激发光束转换为傅里叶空间频率级次光,所述激发光束用于在干涉时产生矩形阵列形式的晶格光的照明光斑;和
晶格光斑传递系统,设置为将傅里叶空间频率级次光传递至物镜的后焦面,以在物镜的前焦面形成的晶格光的光斑,利用晶格光的照明光斑实现对样品的照明激发;以及
荧光探测光路模块,其设置为提取出样品激发后的荧光信号,得到单分子定位图像。
2.根据权利要求1所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,其特征在于,所述晶格光产生系统还设置为精确快速调制晶格光的照明光斑的X方向和Y方向的相位。
3.根据权利要求1所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,其特征在于,所述晶格光产生系统包括在第一光轴上依次布置的二维光栅、傅里叶变换透镜、分束器、高速空间光调制器,以及分束器下游的空间滤波器;
二维光栅设置为在接收激光光束后衍射产生两行两列的4束激发光束,4束激发光束用于在汇聚时干涉形成矩形阵列形式的晶格光的照明光斑;傅里叶变换透镜设置为将形成的晶格光进行光学傅里叶变换,以形成4束傅里叶空间频率级次光;所述分束器设置为使得来自傅里叶变换透镜的光透过以被高速空间光调制器接收且使得来自高速空间光调制器的光反射至第二光轴,从而分离经过高速空间光调制器调制和未经调制的光束;所述高速空间光调制器的靶面具有两行两列的4个靶面区域,其设置为通过4个靶面区域分别对4束傅里叶空间频率级次光进行随时间快速切换的相位调制;所述空间滤波器设置为对傅里叶空间频率级次光,通过空间滤波的方法滤出所述高速空间光调制器的靶面区域的第一对角线上的+1级次的2束傅里叶空间频率级次光,和所述高速空间光调制器的靶面区域的第二对角线上的-1级次的2束傅里叶空间频率级次光。
4.根据权利要求3所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,其特征在于,所述高速空间光调制器的靶面区域的傅里叶空间频率级次光的相位按照左上靶面区域减右下靶面区域的相位差依次为0,2π/3,4π/3,且右上靶面区域减左下靶面区域的相位差依次为0,2π/3,4π/3的相位差时序来调制,从而组合共形成9组相位调制方式。
5.根据权利要求3所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,其特征在于,所述晶格光斑传递系统包括位于分束器的下游且在第二光轴上依次排布的所述的第一传递透镜、第二传递透镜、第三传递透镜和反射镜,以及与反射镜一同位于第三光轴上的套筒透镜和物镜,所述傅里叶空间频率级次光成像于所述物镜的后焦面,且样品位于所述物镜的前焦面;
第一传递透镜与第二传递透镜构成4f系统,用于将调制后的傅里叶空间频率级次光的像传递到第三传递透镜的前焦面;第三传递透镜和套筒透镜构成4f系统,用于将第二传递透镜传递的傅里叶空间频率级次光的像传递至物镜后焦面,物镜用于将4束傅里叶空间频率级次光聚焦在物镜的前焦面,以干涉形成晶格光的照明光斑。
6.根据权利要求5所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,其特征在于,所述空间滤波器位于第二传递透镜和第三传递透镜之间。
7.根据权利要求1所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,其特征在于,所述荧光探测光路模块包括依次布置于第四光轴上的二向色镜、荧光滤片和相机;所述二向色镜设于套筒透镜和反射镜之间,其设置为将来自套筒透镜的荧光反射至荧光滤片。
8.根据权利要求7所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,其特征在于,所述荧光探测光路模块设置为在每次所述高速空间光调制器切换相位时,触发一次采集,以获得不同相位的单分子定位图像。
9.根据权利要求1所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,其特征在于,还包括数据处理模块,所述数据处理模块设置为对获得的不同相位的单分子定位图像进行处理,重建得到最终的超分辨图像。
10.根据权利要求1所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置,其特征在于,所述数据处理模块设置为执行如下步骤:
读取单分子定位图像;
进行高斯拟合定位,得到高斯拟合定位的信息;
根据单分子定位图像中的单分子的荧光信号亮度确定单分子的初相位;
结合单分子的初相位和高斯拟合定位的信息确定每一个单分子的周期序数,根据单分子的周期序数和初相位,得到单分子的相位定位信息;
通过将获得高斯拟合定位的信息和单分子的相位定位信息进行线性拟合,实现X方向上的高斯定位-相位定位对齐和Y方向上的高斯定位-相位定位对齐,得到单分子的精确位置;
进行X方向上的相位拼接和Y方向上的相位拼接,以将不同的单分子定位图像中的单分子精确定位的位置进行拼接,最终获得超高分辨的单分子定位图,所述单分子定位图包括单分子的空间位置坐标;
将单分子定位图中的单分子的空间位置坐标映射到一图像上,将该图像作为超分辨图像输出。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410120530.3A CN118010692A (zh) | 2024-01-29 | 2024-01-29 | 一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410120530.3A CN118010692A (zh) | 2024-01-29 | 2024-01-29 | 一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN118010692A true CN118010692A (zh) | 2024-05-10 |
Family
ID=90945719
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202410120530.3A Pending CN118010692A (zh) | 2024-01-29 | 2024-01-29 | 一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN118010692A (zh) |
-
2024
- 2024-01-29 CN CN202410120530.3A patent/CN118010692A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107490562B (zh) | 利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统及其使用方法 | |
US8570650B2 (en) | Method and system for fast three-dimensional structured-illumination-microscopy imaging | |
CN108680544B (zh) | 一种结构化照明的光切片荧光显微成像方法和装置 | |
CN105659143B (zh) | 孔径扫描傅立叶重叠关联成像 | |
CN105784653B (zh) | 一种宽场超分辨荧光显微成像装置 | |
CN108982452B (zh) | 基于双螺旋点扩散函数的多焦点扫描三维成像方法及系统 | |
US20090219607A1 (en) | Method and apparatus for enhanced resolution microscopy of living biological nanostructures | |
CN106885796B (zh) | 一种超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统与方法 | |
CN112557359B (zh) | 基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像系统及方法 | |
JPWO2019044336A1 (ja) | ホログラフィック撮像装置および同装置に用いるデータ処理方法 | |
US20070268583A1 (en) | Method and microscope for high spatial resolution examination of samples | |
JP2018055082A (ja) | 変換装置、照明装置および光シート蛍光顕微鏡 | |
WO2011116178A1 (en) | Illumination apparatus optimized for synthetic aperture optics imaging using minimum selective excitation patterns | |
CN104111590B (zh) | 基于复合涡旋双瓣聚焦光斑的激光直写装置 | |
WO2015052936A1 (ja) | 構造化照明顕微鏡装置 | |
CN108181235B (zh) | 一种基于均匀结构光照明的sted并行显微成像系统 | |
CN113484296A (zh) | 基于结构光照明的超分辨扫描光场成像系统和方法 | |
CN116183568B (zh) | 一种三维结构光照明超分辨显微成像的高保真重构的方法和装置 | |
CN110824681B (zh) | 一种无扫描高超分辨光学三维显微成像方法 | |
CN106707485B (zh) | 一种小型结构光显微照明系统 | |
US11947098B2 (en) | Multi-focal light-sheet structured illumination fluorescence microscopy system | |
CN109870441B (zh) | 基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像方法和装置 | |
US8289622B2 (en) | System for the structured illumination of a sample | |
Abrashitova et al. | Multimode fiber ruler for detecting nanometric displacements | |
CN118010692A (zh) | 一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |