CN111812831A - 具有在至少两个波长范围之间的区分功能的高分辨率扫描显微术 - Google Patents

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Abstract

针对高分辨率的扫描显微成像，试样(2)被利用照明辐射(5)以如下方式受激发射荧光辐射，使得照明辐射(5)集束到试样(2)中或上的一点上，以形成受衍射限制的光斑(14)。所述点受衍射限制地成像到具有位置分辨能力的平面检测器(19)上的衍射图(17)中，其中，平面检测器(19)具有对衍射图(17)的衍射结构加以分辨的位置分辨能力。试样(2)借助于具有小于光斑(14)直径一半的步进幅度的、不同的扫描位置来采样。基于平面扫描器(19)的数据以及基于对应上述数据的扫描位置产生试样(2)的图像，所述图像具有通过成像的分辨率极限来升高的分辨率。为了对试样(2)的荧光辐射中的至少两个预先确定的波长范围加以区分，在平面检测器(19)上针对至少两个预先确定的波长范围，产生相应数量的衍射艾里斑(30‑33)，所述衍射艾里斑沿侧向彼此错开，使得衍射图(17)由彼此错开的衍射艾里斑(30‑33)构成。在产生试样(2)的图像时，对衍射艾里斑(30‑33)加以评估。

Description

具有在至少两个波长范围之间的区分功能的高分辨率扫描显 微术
技术领域
本发明涉及一种用于对试样进行高分辨率扫描显微成像的方法，其中，试样利用照明辐射以如下方式受激发射荧光辐射，使得照明辐射集束到试样中或试样上的一点上，以形成受衍射限制的光斑，所述点受衍射限制地成像到对具有位置分辨能力的平面检测器上的衍射图中，其中，平面检测器具有位置分辨能力，其对衍射图的衍射结构加以分辨，所述点相对于试样以小于光斑直径一半的步进幅度推移到不同的扫描位置中，对平面检测器进行读取，基于平面扫描器的数据以及基于对应于上述数据的扫描位置产生试样的图像，所述图像具有超出成像的分辨率极限地升高的分辨率。
本发明还涉及一种用于对试样进行高分辨率扫描显微成像的显微镜，具有：用于容纳试样的试样腔室，试样能够受激发射荧光辐射；具有处在试样腔室中的焦平面和分辨率极限的光学器件；照明装置，照明装置具有用于输送照明辐射的输入端并且照明装置借助于光学器件以如下方式以照明辐射照射试样腔室，使得光学器件将照明辐射在焦平面内的一个点上集束成受衍射限制的光斑；成像装置，用于通过光学器件、受衍射限制地将焦平面内的所述点成像到具有位置分辨能力的平面检测器上的衍射图中，具有位置分辨能力的平面检测器处在与焦平面共轭的检测器平面中，其中，平面检测器具有对衍射图的衍射结构进行解析的位置分辨率；用于将所述点以小于光斑直径一半的步进幅度推移到不同的扫描位置中的扫描装置；用于读取平面检测器的评估装置，用以基于平面扫描器的数据以及基于对应上述数据的扫描位置来评估衍射图的衍射结构以及用以产生试样的图像，所述图像具有超出分辨率极限地升高的分辨率。
背景技术
用于研究生物样品的光显微术的传统的应用领域是照明显微术。在此情况下，一定的染料(所谓的磷光剂或荧光剂)被用于特定标记试样，例如细胞部分。试样利用代表激励辐射的照明辐射照射，由此受激的发光辐射利用适当的检测器检测得到。通过上述过程，可以在显微镜中显示各个不同地染色的细胞部分。当然也可以对样品的多个部分同时利用不同的、特定地附着到样品的不同结构上的染料来染色。这种方法被称为多重发光。也可以设置本身无需添加染料就能发光的试样。
在这里，发光如通常所见那样，被理解为磷光和荧光的上位概念，也就是检测两个过程。只要在这里提起荧光，这是以部分代表整体并且被理解为不受限制。
为了检测试样，同样已知的是，应用激光扫描显微镜(也简称LSM)，其借助于共焦检测装置(也被说成共焦LSM)或非线性的试样相互作用(所谓的多光子显微镜)仅对处在物镜的焦平面中的相应平面成像。获取光学切片，并且在试样的不同深度中对多个光学切片进行记录，实现了：生成三维图像，三维图像由不同光学切片组合而成。由此，激光扫描显微术适用于研究厚的样品。当然也可以应用发光显微术与激光扫描显微术的组合方案，其中，借助于LSM在不同的深度平面中使发光试样成像。
原则上，光学显微镜的光学分辨率(也就是LSM的分辨率)基于物理定律而受衍射限制。在这里，术语“高分辨率”被用于针对衍射极限的分辨率。
US5043570介绍了一种通过“过采样(oversampling)”提供分辨率的试验。这种方案不能明显改善显微镜衍射极限以下的分辨率。
借助于非线性的去布局
Figure BDA0002575219380000021
能够将分辨率相对于受衍射限制的共焦LSM提高至10倍。这种方法例如在US5866911中加以介绍。针对去布局，已知不同的方案，例如在DE4416558C2、US6633432或者DE10325460A1中加以介绍。
另一高分辨率的显微成像方法在US5867604中提到，其中，物体被以周期性结构扫描。类似的用于提高分辨率的方法在EP1157297B1中提到。结构化的照明利用非线性的过程，例如荧光饱和。这种方案需要用于产生图像的重构算法并且将用于一个图像的多幅照片进行评估。
在宽场中实现高分辨率的方法由WO2006127692和DE102006021317已知。以PALM简称的方法(光激活光学显微术(Photo Activated Light Microscopy))使用标记物质，标记物质能够借助于光学激活信号激活。仅在激活的状态下，标记物质能够利用激发辐射受激发出一定的荧光辐射。激活以如下方式执行，至少一定子集的被激活的标记分子与相邻的被激活的分子以如下方式间隔，这些标记分子以显微术的光学分辨率测量的方式被区分开或者可以事后区分。在吸收发光辐射之后，针对分离的分子能够获得其以受分辨率限制为条件的辐射分布的中心，并且由此以相比于原来实现的光学成像更高的精度计算确定分子的位置。为了对整个试样成像，通过引入激发辐射将子集的标记分子加以区分、后续的激发和荧光辐射成像以如下时长重复，直至使尽可能所有标记分子一次性在一个子集中获得并且被分离。
其他高分辨率的方法在Hell的“Far-Field Optical Nanoscopy(远场光学显微术)”Science 316，1153-1158,2007中有所介绍。
这种方法和显微镜由EP2317362A1已知。涉及这种类型的文献在其中图5所示而且介绍的实施方式中，将对试样受衍射限制的照明与平面检测器相组合，其中，扫描装置以如下方式设计，利用光斑照明的点的衍射图以平面检测器为基础。这种结构被称为所谓的“共聚焦(de-scanned)”检测结构。这种检测器结构通常以如下方式实现，在照明装置和成像装置与试样之间布置有扫描装置，扫描装置使光路转向。这样，这种扫描装置作用于照明光斑，也作用于以照明光斑照亮的点的受衍射限制的成像，使得在成像装置中，在扫描装置之后，光路固定不动。针对这种扫描装置的可替换方案是能够运动的试样台的应用，试样台移动试样。这样，衍射图像静止于平面检测装置上。在EP2317362A1的方案中，平面检测器设有如下的位置分辨率，其与成像比例相关地实现衍射图的过采样，并且允许：对衍射图的衍射结构进行采样或者说解析。
EP2317362A1设置如下的实施方式，其中，可以进行颜色分析。为此，设置有多个检测器，所述检测器处在相应的光谱波道中，所述光谱波道由二色性分色器形成。这种方案对于激光扫描显微术长期以来已经已知。但这种方案具有缺陷，针对每个色彩波道需要设置具有相应检测器的相应的分色器。在常规的激光扫描显微术(其使用了在共焦孔板(所谓的小孔)后方的不具有位置分辨能力的检测器)中，这种要求基本上没有问题，在应用根据EP2317362A1的过采样的平面检测器中，则明显产生耗费，这时，这种平面检测器昂贵。此外，按照EP2317362A1的过采样原理，多个平面检测器必须彼此在亚像素水平上精确地校准，因为否则在各个色彩波道所产生的图像之间颜色偏差，这种颜色偏差的原因在于，对于高分辨率的图像，平面检测器的数据被移动到以小于光斑直径的步进量移动的扫描位置中。仅当平面检测器在所有色彩波道中相对于光轴以亚像素水平的精度调校时，各个色彩波道的图像才彼此匹配。
发明内容
因此，本发明的目的在于，以如下方式改进开头所述类型的方法或显微镜，使得能够获得颜色信息，同时针对多个色彩波道的调校耗费被降低或者甚至省去。
按照本发明，所述目的利用一种用于对试样进行高分辨率扫描显微成像的方法来实现，其中，试样利用照明辐射以如下方式受激发射荧光辐射，使得照明辐射集束到试样中或上的一点上，以形成受衍射限制的光斑，所述点受衍射限制地成像到对具有位置分辨能力的平面检测器上的衍射图中，其中，平面检测器具有其对衍射图的衍射结构加以分辨的位置分辨能力，所述点相对于试样以小于光斑直径一半的步进幅度推移到不同的扫描位置中，对平面检测器进行读取，基于平面扫描器的数据以及基于对应于上述数据的扫描位置产生试样的图像，所述图像具有超出成像的分辨率极限的分辨率，为了对试样的荧光辐射中的至少两个预先确定的波长范围加以区分，借助于光谱选择性的元件在平面检测器上针对至少两个预先确定的波长范围，产生相应数量的衍射艾里斑，其沿侧向彼此错开，使得衍射图由彼此错开的衍射艾里斑构成，衍射艾里斑完全处在平面检测器上，在产生试样图像时，对衍射艾里斑加以评估。
所述目的还利用一种用于高分辨率扫描显微成像的显微镜来实现，其具有：用于容纳试样的试样腔室，试样能够受激发射荧光辐射；具有处在试样腔室中的焦平面和分辨率极限的光学器件；照明装置，照明装置具有用于输送照明辐射的输入端并且照明装置借助于光学器件以如下方式以照明辐射照射试样腔室，使得光学器件将照明辐射在焦平面内的一个点上集束成受衍射限制的光斑；成像装置，用于通过光学器件、受衍射限制地将焦平面内的所述点成像到具有位置分辨能力的平面检测器上的衍射图中，具有位置分辨能力的平面检测器处在与焦平面共轭的检测器平面中，其中，平面检测器具有对衍射图的衍射结构进行分辨的位置分辨能力或者说进行解析的位置分辨率；用于将所述点以小于光斑直径一半的步进幅度推移到不同的扫描位置中的扫描装置；用于读取平面检测器的评估装置，用以基于平面扫描器的数据以及基于对应上述数据的扫描位置来评估衍射图的衍射结构以及用以产生试样的图像，所述图像具有超出分辨率极限的分辨率，显微镜为了区分试样的荧光辐射中的至少两个预先确定的波长范围而具有光谱选择性的元件，所述光谱选择性的元件在平面检测器上针对至少两个预先确定的波长范围产生相应数量的衍射艾里斑，其沿侧向彼此错开，使得衍射图由彼此错开的衍射艾里斑构成，平面检测器和光谱选择性的元件以如下方式设计，使得衍射艾里斑完全处在平面检测器上，并且评估单元在产生试样图像时，对衍射艾里斑加以评估。
本发明仅利用一个平面检测器同时实现了分辨率提升以及光谱图像信息，方式为：衍射图像在检测器上被分为至少两个彼此相互移位的衍射艾里斑。为此，使用光谱选择性的元件。每个衍射艾里斑对应一个波长范围(也称为色彩波道)。
由此，所述方法和所述显微镜实现了：区分至少两个波长范围。试样的图像以LSM常见的方式通过以所述点位对样品加以采样拍摄多幅分图，这些分图分别对应其他采样点、也就是其他采样位置。
衍射艾里斑当光束在圆形遮光边上发生衍射时产生。衍射艾里斑显现出中心，衍射艾里斑被辐射强度逐渐降低的环包围。根据几何光学器件的定律完美的显微镜本身(也就是无成像差错)可以将一个点不精确地成像到一点上，而是通过光在孔径上的衍射，仅成像为不明晰的光斑。这称为受衍射限制的成像。相同的情况对于点的受衍射限制的照明适用。两个点可以在传统的辐射光学器件中根据所谓的瑞利判据来区分，这时，其在衍射图中的成像最大值至少围绕衍射艾里斑的半径r彼此分离而置。光斑的形状互反地依赖于孔径的形状，特别是其尺寸反过来与孔径的尺寸成正比。衍射艾里斑的尺寸由第一类型贝塞尔函数的第一零位置得出，其零位置大致处于r＝0.6098处。衍射艾里斑(也就是中央衍射斑)根据英国天文学家乔治·比德尔·艾里(George Biddell Airy)的名字也称为艾里斑。在扫描显微术中，在照明时以及在成像时，由对光学器件的圆形轮廓所得的孔径是圆形的。因为衍射艾里斑的尺寸还依赖于波长，所以艾里斑的尺寸在用来激发的、受衍射限制的照明中小于在发生斯托克斯移位的、也就是波长较长的荧光发光的情况中的尺寸。
术语“受衍射限制”应当在这里不限于根据阿贝理论的衍射极限，而是也可以涉及如下情况，其中，基于真实的缺陷或限制，理论上的最大值推荐约为20％。这样，分图也具有如下结构，其在这里称为衍射结构。衍射结构被过采样。
为了能够利用尽可能成本低廉的检测器来工作，在本发明的一种实施方式中足够的是，衍射艾里斑彼此相叠，但是并没有完全重叠。在此，重叠区域应当优选以如下方式设置，每个衍射艾里斑的中心处在其他衍射艾里斑之外。也就是说，对于两个衍射艾里斑而言，其中心在平面检测器上处于不被其他衍射艾里斑遮盖的区域中。对于多个衍射艾里斑，这一点同样适用。这种要求对于最多四个衍射艾里斑的情况而言，能够很容易满足。
检测器尺寸可以保持得尽可能小，这时，光谱选择性的元件在色谱上以如下方式设计，彼此相对错开的衍射艾里斑具有相同尺寸。这如上所述那样，基于衍射艾里斑的与波长相关的尺寸仅以如下方式实现，光谱选择性的元件执行相应的尺寸修正，尺寸修正将较长波长的波长范围的衍射艾里斑相对于较短波长的衍射艾里斑缩小。当这种色谱修正不成功时，对应不同波长范围的衍射艾里斑大小不同，这通过衍射艾里斑彼此并排沿侧向移位优选得到补偿，以便将衍射艾里斑的中心分开，也就是所述中心不处在其他衍射艾里斑内部。
对应波长范围的衍射艾里斑的产生可以按照不同方式实现。在第一变型中，光谱选择性的元件或光谱分离在平面检测器前面并且光路的照明辐射所经过的部分中进行。这样，成像辐射通过直至光谱选择性的元件的光路，在光谱选择性的元件上，衍射图被分成各个波长范围衍射艾里斑。在第二变型中，光谱分离在照明或照明装置中进行，方式为：成像不涉及光谱分离。按照这种方式，试样中的光斑已经按照多个沿侧向彼此错开的衍射艾里斑的形式产生。
在第一个提到的变型中，光谱分离仅影响到试样的荧光反馈。在第二变型中，仅影响到试样的荧光激发。由此，第一变型区分出以不同颜色发荧光的试样的色彩波道。相反，第二变型分辨出试样的在不同波长范围中能够被激发的组成部分。两个变型意味着：光谱选择性的元件处在一部分仅被成像装置或照明装置照射的光路中，而不是由二者一起照射。与此不同地，也可以考虑布置在光路的共同部分中的方案。
本发明的核心在于，波长范围在空间上就衍射艾里斑在平面检测器上的位置方面得到区分。因为在平面检测器上存在静止图像(所谓的解析结构)，所以与相应的波长范围(也称为色彩波道)相对应的衍射艾里斑的位置是已知的，当产生图像时，可能将同时拍摄的波长范围混淆。按照这种方式，对多个色彩波道的同时拍摄利用唯一的平面检测器就能实现。
因为在根据EP2317362A1的重构方法中，基于以小于光斑尺寸的步进幅度进行扫描移位，针对试样中的各个点存在多次测量，所以获得了在需要列出而且解答的方程组中获得超定的解，使得不仅针对各个点的位置表达和强度能够以高分辨率给出，而且也能够对波长范围(也就是颜色)加以表达。
在本发明的特别有利的改进方案中，彼此相对移位的衍射艾里斑的位置在所对应的波长范围方面能够通过可调设计的光谱选择性的元件来匹配。按照这种方式，色彩波道能够以如下方式调整，使得所希望的波长范围得以区分。
按照本发明的方案也可以按照并行的形式针对多个光斑同时执行，这正如针对激光扫描显微术已知那样。这样，试样上的多个点位被扫描采样，并且多个点位的分图彼此并排静止处在检测平面中。后面的说明示例性集中在对单个点状光斑的采样。但这不应理解为是限制，所阐释的特征和原则在意义上也适用于并行采样多个点状光斑，正如针对线状光斑所用那样。后面的方案当然仅横向于线延伸受到衍射限制，使得说明的相关特征仅沿一个方向(横向于线延伸)地适用。
试样的所希望的区域的成像如在常见的LSM中那样以扫描的方式实现。因为照明和成像或相应的装置具有共同的光学扫描装置，所述光学扫描装置将光斑导引通过试样，同时再次与检测器相关地解析与光斑重合的、在其上对试样成像的点，所以可以将对焦光学器件设置在照明和成像装置的共同部分中。对焦光学器件实现了：将衍射图与平面检测器的尺寸相匹配，并且附加地将能够提供的照明辐射在无边缘损耗的情况下完全耦合输入到能够通过选择物镜来改变的物镜光瞳中。
分图的衍射结构的分辨率附加地实现了：获知光斑的运动方向，沿着所述方向在采样试样期间移动。运动方向虽然原则上由扫描装置的结构(例如扫描镜或能够运动的试样台)已知，但是在这里获得以机械为条件的残余不精确性。这可以通过借助于互相关对检测器阵列的各个像素信号加以评估来消除。在此，利用的是，被照明的点与彼此并排而置的图像像素相关地在试样中基于受衍射限制的成像按照一定程度相叠，但其中心不挨着设置。当这种图像像素的信号经过互相关时，能够降低或完全消除由于扫描机构的不可避免的公差而存在的不精确度。
只要在这里介绍一种方法，控制装置就在显微镜工作时实现方法步骤。
不言而喻的是，前面提到的而且后面还有阐释的特征不仅用在所给出的组合中，而且也能够以其他组合或者单独使用，而不离开本发明的范围。
附图说明
下面，例如借助于也公开了对于本发明关键的特征的附图详细阐释本发明。其中：
图1示出用于高分辨率显微成像的激光扫描显微镜的示意图；
图2示出在图1的显微镜中所使用的平面检测器的放大图；
图3至图6示出衍射图的图示，衍射图在图1的显微镜工作时以不同的实施方式出现在平面检测器上，以及
图7示出照明衍射图的图示，其在照明试样时能够以图1的显微镜的实施方式出现。
具体实施方式
图1示意示出激光扫描显微镜1，激光扫描显微镜被设计用于对试样2进行显微成像。激光扫描显微镜(在下面简称为LSM)由控制装置C控制，并且包括照明光路3以及成像光路4。照明光路照亮试验2中的一个点位，成像光路4受衍射限制地对所述点位进行成像，用以检测。照明光路3和成像光路4共用一个光学器件。
试样2的照明在LSM1中借助于所提供的激光光束5来实现，激光光束借助于未进一步在功能上需要的转向镜6和透镜7耦合输入到镜8上。镜8负责将激光光束5以反射角透射到耦合输入元件上，例如发射滤片9上。为了概览图示表达，针对激光光束5仅绘出其主轴。
当在发射滤片9上发射之后，激光光束5借助于扫描装置10双轴偏转，并且借助于透镜11和12通过物镜13作为受衍射限制的光斑14聚焦到试样2中的焦平面29中。在此，光斑在图1的图示中呈点状，但也可以是线状的光斑。当在成像装置中又存在静止的光束之后，在光斑14的位置(例如点)上激发出的荧光辐射从焦平面29经物镜13、透镜11和12再次导引至扫描装置10。静止的光束穿过发射滤片9投射，反射滤片在这里附加地具有如下功能，使光斑14中的荧光辐射在其波长方面得到选择，激光光束5的例如能够用作激发辐射的照明辐射被阻挡。透镜16负责用于总体上将光斑14的位置成像到受衍射限制的衍射图17中，所述衍射图处在检测平面18中。检测平面18是焦平面29的共轭平面，在其中存在试样2中的光斑14。
光斑14的衍射图17在检测平面18中由平面检测器19拍摄，平面检测器的示例实施方案在下面借助于图2详细阐释。在这里重要的是，平面检测器19在空间上对检测平面18中的点位14的受衍射限制的图像17进行解析，也就是实现过采样
Figure BDA0002575219380000091
控制装置C控制LSM1的所有部件，特别是扫描装置10和平面检测器19。控制装置针对不同的扫描位置采集各个图像17的数据，分析其衍射结构并且产生试样2的高分辨率的总图。
图1的LSM针对在试样上采样的唯一的光斑14示例示出。但也可以用于根据线形光斑进行采样，线形光斑例如垂直于图1的图页平面延伸。同样可行的是，图1的LSM1以如下方式实施，多个彼此并排的点状光斑在试样中得到采样。其相应的衍射图17则同样彼此并排地处在检测平面18中。平面检测器19则相应设计用于对检测平面18中彼此并排的衍射图17加以检测。
平面检测器19放大地在图2中示出。平面检测器由光导纤维束20构成，光导纤维束对检测器阵列24馈给。光导纤维束20由单光导纤维21构成。光导纤维21的端部形成光导纤维束输入端22，其处在检测平面18中。光导纤维21的各个端部由此代表由其拍摄光斑14的衍射图17的像素。因为光斑14在图1的实施方式中例如为点状点位，衍射图17是艾里斑，艾里斑的伸展处在图1和图2中图示出的检测平面18的圆形内部。需要指出的是，图1在此方面获得简化。光导显微术输入端22的伸展如此大，使得由此遮盖衍射图的伸展。光导显微术20中的各个光导纤维21在其输出端上被设置为不同于光导纤维束输入端22上的几何布置方案，也就是呈纵向延伸的插头23的形式，光导纤维21的输出端方面的端部彼此并排地处在这种插头中。插头23与检测器行24的几何结构相匹配地设计，也就是光导纤维21的每个输出端方面的端部恰好处在检测器行24的像素25前方。
需要指出的是，根据图2的平面检测器19的实施方案是纯示例性的。原则上对于显微镜1足够的是如下的平面显微镜19，这种平面显微镜在检测器平面18中执行对衍射图17的过采样，衍射图在焦平面29中产生以照明点位14照明的点受衍射限制的成像。特别是可以在平面检测器19中也指的是检测平面18中矩形的检测器平面，正如其在下面介绍的图4至图6中的情况那样。
在显微镜1的说明中，迄今未提到元件15。其指的是光谱选择性的元件，其布置在成像装置4中或照明装置3中。光谱选择性的元件15在图1的图示中针对照明装置3中的结构仅虚线示出。在下面，首先对成型装置4中光谱选择性的元件15的作用和结构加以阐释。
在没有光谱选择性的元件15的情况下，在对利用光斑14照亮的点在焦平面29中受衍射限制地成像时，在所对应的共轭检测平面18中产生衍射图17，衍射图基于物镜13的圆形的孔径而是衍射艾里斑。这种衍射艾里斑的产生一般性地在说明书中已经介绍。对于显微术，如其在EP2317362A1中介绍那样，通过的衍射图17过采样，对其结构加以分析，在结合具有小于光斑14的最小尺寸的步进幅度的扫描位置下，可以实现超越受衍射限制的成像的分辨率极限的结构解析度。为了阐释可以考虑对两个在焦平面29中以受衍射限制的分辨率不能检测到的紧密程度并排而置的部位进行观察。在利用小于(在理想实验中为圆形的)光斑的直径的步进幅度扫描光斑14时，首先两个部位中的一个达到光斑14。该第一部位进入光斑14越多，衍射图17中的辐射强度就越大。光斑14基于其受衍射限制的特性而朝向中心强度增大。由此，衍射图14中的辐射强度随着所观察的第一部位逐渐移入光斑14的中心而增大。当光斑14的中心移位超出所观察的部位时，该第一部位的辐射强度再次降低。当理想设定的第二部位不相邻时，衍射图17中的辐射强度再度逐渐消失，其中，衍射图17中辐射强度的升高和降低与光斑14的照明强度的分布(在考虑到步进幅度和第一部位的荧光敏感性的情况下)具有精确的相关性。但因为这时第二部位紧密相邻的存在，所以第二部位同样有助于对衍射图17的荧光辐射，具体来讲，光斑14的中心距第二部位越近，辐射强度就越大。其他方面，针对第二部位恰适用针对第一部位的相同方案。这样，针对步进位置，在衍射图17中的照明强度获得不同于存在单独的发荧光的部位的情况。通过评估平面检测器19的数据以及顾及到当前的扫描位置，则能够以数学方法获得：焦平面29中的两个部位发荧光以及以多大间距发荧光，尽管这两个利用受衍射限制的分辨率本身不能得到单独分辨。在本领域技术人员已知的方案中，为了评估平面检测器19的数据，针对每个扫描位置列出包含多个未知数的方程，特别是包含焦平面29中的部位的强度和间距。通过多个扫描位置，获得方程组，方程组是超定的并且允许：获知辐射强度和间距，也就是由此也获知发荧光的部位的位置。这在下面还要详细阐释。
高分辨率显微成像的原理利用显微镜1在这里进行如下展开：光谱选择性的元件15在相对于焦平面29共轭的检测平面18中以如下方式改变衍射图17：针对两个波长范围(色彩波道)产生两个彼此相对移位的衍射艾里斑。由此，作为衍射图代表的是图3中所示的情况。在示例标绘为像素22的方形阵列的平面检测器19上，两个衍射艾里斑30、31彼此相对移位地设置，其中，其中一个衍射艾里斑30对应于第一色彩波道，第二衍射艾里斑31对应于第二色彩波道。色彩波道的波长极限通过光谱选择性的元件来限定，光谱选择性的元件因此在一个实施方式中与预先确定的色彩波道(波长范围)相匹配地选定。衍射艾里斑30、31在一种实施方案中彼此相对以如下方式错位，使得其中心(通过大圆点标示)处在相应其他衍射艾里斑的相叠区域之外。
衍射艾里斑30和31的组合构成衍射图17，也就是衍射艾里斑在显微成像期间在空间上不移动。在根据EP2317362的显微镜中原来作为唯一的衍射艾里斑存在的衍射图17在这时被两个衍射艾里斑30和31替代。
当再次理想地观察两个处在焦平面29中的、间隔紧密的部位时，这两个部位利用受衍射限制的成像方式基本不能被分辨出来，在显微镜1中基于光谱选择性的元件15调整出如下的表现，当假设第一色彩波道中的第一部位与衍射艾里斑30相对应地，并且第二色彩波道中的第二部位对应衍射艾里31地，发出荧光：一旦光斑14检测到第一部位，在衍射图17中第一衍射艾里斑30就被照亮。相反，第二衍射艾里斑31还是暗的，因为只要第二部位也没被光斑14照亮，就没有辐射在第二色彩波道中到达。衍射艾里斑30中的强度一直升高，直到第一部位被光斑14的中心检测到。这样，第一色彩波道的衍射艾里斑30中的强度最大。类似的情况下适用于衍射艾里斑31和第二色彩波道以及第二部位。这样，在光斑14经过所述两个部位时，实现了第一衍射艾里斑30的变亮和变暗，以及第二衍射艾里斑31在时间上稍迟出现的变亮和变暗。
对平面检测器19的数据在与扫描位置相组合下进行的评估实现了：针对每个扫描位置列出方程，其不仅包含两个部位的位置和荧光强度，还包括对第一还是第二部位在第一或第二色彩波道中(前提是对应关系当然是未知的)被照亮给出预判。通过多个扫描位置获得超定的方程组，这实现了：也获知发光的部位与两个色彩波道的附加对应关系。
按照这种方式，显微镜1和所对应的显微成像方法在高分辨率的图中的两个波长范围(色彩波道)之间进行区分，并且在无附加检测器的情况下获得双色图像。
需要指出的是，衍射艾里斑30和31的间距在显微成像时保持恒定，特别是间距不表示颜色信息。其仅用于使衍射艾里斑30和31在空间上不完全重叠而置，因为这样衍射艾里斑就区分不开了。
当然也能够以如下方式区分衍射艾里斑不发生交叠。但这样就需要相对较大的检测器。
衍射艾里斑30和31在光谱选择性的元件15的实施方式中，如其针对图3所用那样，具有相同的直径。但在说明书的通用部分中提到的是，衍射艾里斑的尺寸与波长相关。因此，可以实际预计出：较短波长的衍射光斑(例如衍射艾里斑30)必须具有比较长波长的衍射艾里斑(例如衍射艾里斑31)更大的直径。这种情况也存在于图4中。在图3中，没有给出这种情况，因为光谱选择性的元件15在辐射被分光时产生色谱补偿，这使得衍射艾里斑30和31尽管其色彩波道不同，也是一样大的。
所介绍的方案不仅限于两个波长范围(色彩波道)的应用。图5示出具有第三色彩波道31的结构，在图6中叶存在第四色彩波道33。开头所述的内容在这里同样类似适用。因此，多个色彩波道是可行的，因为基于多个扫描位置，所获得的方程组以如下方式超定，可以说还有存在用于其他呈色彩波道类型的未知量的位置。
在迄今的介绍中，出发点在于，光谱选择性的元件15处在成像装置4中并且在那里是光路的一部分，其仅用于成像。换言之，光谱选择性的元件5在本实施方式中不被照明辐射穿过。由光谱选择性的元件15通过衍射艾里斑彼此相对移位而产生的色彩波道由此是发射荧光的试样的色彩波道。显微镜或显微成像方法的这种实施方式将荧光辐射在其波长范围(色彩波道方面)做出区分。
但是，光谱选择性的元件15也可以布置在照明装置3中。这种结构在图1中以虚线示出。这样，光谱选择性的元件处在光路的仅被照明辐射穿过的区域中，由此其不影响成像，而是仅影响照明。这样，光谱选择性的元件15将光斑14分成两个照明衍射艾里斑34、35，正如在图7的图示中所示那样。由此，照明光路中的光谱选择性的元件15给出了照明色彩波道，相反，光谱选择性的元件15在成像光路中的布置产生了检测色彩波道。由此，试样不再被一个例如衍射艾里斑照亮，而是被两个彼此错开的照明衍射艾里斑34和35照亮。这样，由此也在平面检测器19上获得了如图3中的情况，其中，衍射艾里斑30和31在这时不再对应于荧光辐射的不同色彩波道，也就是试样2的荧光应答，而是对应于激发的不同色彩波道，也就是试样2的荧光敏感度。在其他方面，借助于图3至图6针对光谱选择性的元件15在成像装置4中的布置阐释的所有变型同样也能够用于光谱选择性的元件15在照明装置3中的可替换的布置。但基于其他几何位置，一般光谱选择性的元件15的设计在成像装置4的结构中看起来不同于在照明装置3中的结构。原则上，可以针对光谱选择性的元件，考虑多个具有色谱效果的元件，例如楔、棱镜、反射镜或双合透镜。
在针对上面提到的可替换方案的变型中，光谱选择性的元件15可也可以设置在光路的在照明时以及在成像时都经过的部分中，或者使用两个光谱选择性的元件15。按照这种方式可以在以一个波长同时激发两种颜色时，抑制发生串道。附加地，获得了针对校准测量的可行方案。
在将光谱选择性的元件15布置在照明装置3中时，可以出现如下情况，在利用两个或更多个色彩波道照明时，较短的照明波长在较长波长的照明所产生的荧光的波长范围中产生荧光信号。结果是，其中一个结构作为移位的阴影像再次出现。借助于适当的相关计算，可以确定并去除阴影像部分。
根据图3和图4的实施方式示出：优选的是，衍射艾里斑的移位沿着平面检测器19的对角线进行。因为这样平面检测器的面积能够得到最大程度利用。
在使用具有如在图2中示意示出的光导纤维的平面检测器19时，优选的是，以如下方式敷设纤维，使得两个衍射艾里斑的不交叠的区域引导到彼此尽可能相邻设置的检测器元件上，也就是衍射艾里斑30的不相叠的区域被引导到第一组检测器元件上，衍射艾里斑31的不相叠的区域被引导到第二组检测器元件上，其中，这两个组尽可能不相互交叉干扰。
为了更精确地阐释方程组列出的数学分析，为了导入，首先考虑如下情况，仅出现一种颜色，也就是缺少光谱选择性的元件15。当人们以O(r)标示物体，以E(r)标示激发的点扩散函数(PSF)，以打(r)标示检测的PSF时，作为针对每个像点的信号D(r，p)获得了下列方程式，其中r表示与光斑的位置p的间距：
Figure BDA0002575219380000151
关于位置p的傅里叶变换D(r，p)给出：
D(r，ω)＝O(ω)FTr′{E(r′)H(r′+r)}
(2)
实域中的乘积给出傅里叶域中卷积：
Figure BDA0002575219380000152
当导入位置r上的支撑函数时：
EH(r，ω)＝FTr′{E(r′)H(r′+r)}
(4)
获得方程(2)
D(r，ω)＝O(ω)EH(r，ω)
(5)
平面检测器上的不同的位置r借助于维纳滤波器组合
Figure BDA0002575219380000153
其中，<|O(ω)|2>和<|n(ω)|2>是信号(“O”)和噪声(n)信号的相应的功率密度。已经事先给出的是，针对多个在平面检测器19的每个像素上混合的色彩波道，通过PSF给定的加权如下：
Figure BDA0002575219380000161
在该方程中，C是色彩波道技术下标，方程(7)作为矩阵获得：
[D(r，ω)]r，＝[Oc(ω)]c[EHc(r，ω)]c，r
(8)
当顾及到附加的噪声时，方程(8)设定为下式：
Figure BDA0002575219380000162
对象[Oc(ω)]c可以借助于算符[Gc(r，ω)]r，c获得，该算符将频率滤光与色彩波道分离组合起来：
Figure BDA0002575219380000163
如在对推导维纳滤波器时，在这时必须将针对每个频率和每个色彩波道重构的和有效的对象之间的二次间距最小化：
Figure BDA0002575219380000164
由此，在应用方程(9)的情况下获得：
E|{[Oc(ω)]c[EHc(r，ω)]c，r+[N(r，ω)]r}[Gc(r，ω)]r，c-[Oc(ω)]c|2＝min
(12)
在应用与推导维纳过滤器时相同的规则(本领域技术人员例如可以从http：//en.wikipedia.org/wiki/Wiener_deconvolution获得)的情况下，获得：
Figure BDA0002575219380000171
其中，[I]c和
Figure BDA0002575219380000178
是针对每个色彩波道和噪声的信号的光谱功率密度：
[I]c＝E|[Oc(ω)]c|2；[σ2]r＝E|[N(r，ω)]r|2
(14)
当荧光发射光谱叠加时，可行的是，在一个色彩波道中，物体的阴影从另一色彩波道中出现。这种阴影图被以与原本的色彩波道中的主图相同的检测PSF产生失真。由此，在波道c，Oc(ω)中检测到的图是与分配给不同的色彩波道的对象相对应的图
Figure BDA0002575219380000172
的叠加：
Figure BDA0002575219380000173
在此，[M]c是分离矩阵。对于例如两种颜色，获得的是：
Figure BDA0002575219380000174
当真图
Figure BDA0002575219380000175
的混合矩阵[M]c已知时，获得真图
Figure BDA0002575219380000177
是容易的。如果不是这样的话，真图
Figure BDA0002575219380000176
可以通过将所产生的图的互相关最小化来获得，也就是矩阵以如下方式确定：其数值针对最佳分离的对象确保最低程度的互相关。

Claims (16)

1.一种用于对试样(2)进行高分辨率扫描显微成像的方法，其中，
试样(2)利用照明辐射(5)以如下方式受激发射荧光辐射：使得照明辐射集束到试样(2)中或上的一点上，以形成受衍射限制的光斑(14)，
所述点受衍射限制地成像到具有位置分辨能力的平面检测器(19)上的由若干个衍射斑(30-33)构成的衍射图(17)中，其中，平面检测器(19)具有对所述衍射斑(30-33)的衍射结构加以分辨的位置分辨能力，
所述点相对于试样(2)以小于光斑(14)直径一半的步进幅度推移到不同的扫描位置中，
对平面检测器(19)进行读取，基于平面检测器(19)的数据以及基于对应于上述数据的扫描位置产生试样(2)的图像，所述试样的图像具有超出成像的分辨率极限的分辨率，
为了对所述荧光辐射中的至少两个预先确定的波长范围加以区分，所述点的成像通过光谱选择性的元件(15)产生所述衍射图(17)以包括数量与所述预先确定的波长范围的数量相应的若干个衍射斑(30-33)，其中每个衍射斑被分配给一个波长范围，
并且其中所述衍射斑沿侧向彼此错开，使得衍射图(17)由彼此错开的若干个衍射斑(30-33)构成，所述衍射斑(30-33)完全处在平面检测器(19)上并且在检测器(19)上发生交叠，但不是完全重叠，以及
在产生试样(2)的图像时，对衍射斑(30-33)通过以下方式加以评估，
-列出方程组，其中，为每个扫描位置列出一个方程，所述为每个扫描位置列出的一个方程的每个方程包括发荧光部位的位置、荧光强度和波长范围的分配，并且所述发荧光部位的位置、荧光强度和波长范围的分配作为未知值，以及
-解出所述方程组以生成所述试样(2)在所述波长范围内的图像。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，光谱选择性的元件(15)将衍射斑(30-33)在平面检测器(19)上以如下方式隔开间距：使得每个衍射斑(30-33)的中心都处在其他一个或多个衍射斑(30-33)的外部。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，光谱选择性的元件(15)在色谱上以如下方式修正：使得彼此错开的衍射斑(30-33)具有相同的尺寸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，光谱选择性的元件(15)仅对照明以如下方式产生影响：使得光斑(14)由照明衍射斑(34、35)构成，所述照明衍射斑沿侧向彼此错开。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，光谱选择性的元件(15)仅对成像产生影响。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，光谱选择性的元件(15)布置在平面检测器(19)的前面。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述点通过推移试样(2)而相对于试样(2)被推移到不同的扫描位置中。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，沿侧向彼此错开的衍射斑(30-33)处在共同的像平面中。
9.一种用于高分辨率扫描显微成像的显微镜，具有：
用于容纳试样(2)的试样腔室，所述试样能够受激发射荧光辐射；
具有处在试样腔室中的焦平面(29)和分辨率极限的光学器件(11-13)；
照明装置(3)，所述照明装置具有用于输送照明辐射(5)的输入端(6)并且所述照明装置借助于光学器件(11-13)以如下方式以照明辐射(5)照射试样腔室：使得光学器件(11-13)将照明辐射(5)在焦平面(29)内的一个点上集束成受衍射限制的光斑(14)；
成像装置(4)，用于通过光学器件(11-13)受衍射限制地将焦平面(29)内的所述点成像到具有位置分辨能力的平面检测器(19)上的由若干个衍射斑(30-33)构成的衍射图(17)中，所述具有位置分辨能力的平面检测器处在与焦平面(29)共轭的检测器平面(18)中，其中，平面检测器(19)具有对所述衍射斑(30-33)的衍射结构加以分辨的位置分辨能力；
用于将所述点以小于光斑(14)直径一半的步进幅度推移到不同的扫描位置中的扫描装置(10)；
用于读取平面检测器(19)的评估装置(C)，用以基于平面扫描器(19)的数据以及基于对应于上述数据的扫描位置来评估所述衍射斑(30-33)的衍射结构以及用以产生试样(2)的图像，所述试样的图像具有超出分辨率极限的分辨率，
其中，显微镜(1)为了区分所述荧光辐射中的至少两个预先确定的波长范围而具有光谱选择性的元件(15)，所述光谱选择性的元件(15)产生所述衍射图(17)以包括数量与所述至少两个预先确定的波长范围的数量相应的所述若干个衍射斑(30-33)，其中每个衍射斑被分配给一个波长范围，所述衍射斑沿侧向彼此错开，使得衍射图(17)由彼此错开的若干个衍射斑(30-33)构成，
其中，平面检测器(19)和光谱选择性的元件(15)以如下方式设计：使得衍射斑(30-33)完全处在平面检测器上并且在平面检测器(19)上发生交叠，但是不完全重叠，并且
其中，评估单元(C)在产生试样(2)的图像时，其通过以下方式对衍射斑(30-33)加以评估，
-列出方程组，其中，为每个扫描位置列出一个方程，所述为每个扫描位置列出的一个方程的每个方程包括发荧光部位的位置、荧光强度和波长范围的分配，并且所述发荧光部位的位置、荧光强度和波长范围的分配作为未知值，以及
-解出所述方程组以生成所述试样(2)在所述波长范围内的图像。
10.根据权利要求9所述的显微镜，其中，光谱选择性的元件(15)将衍射斑(30-33)在平面检测器(19)上以如下方式隔开间距：使得每个衍射斑(30-33)的中心都处在其他一个或多个衍射斑(30-33)的外部。
11.根据权利要求9所述的显微镜，其中，光谱选择性的元件(15)在色谱上以如下方式修正：使得彼此错开的衍射斑(30-33)具有相同的尺寸。
12.根据权利要求9所述的显微镜，其中，光谱选择性的元件(15)布置在照明装置(3)中，但不布置在也用于成像的光学器件(11-13)中，使得光斑(14)由照明衍射斑(34、35)构成，所述照明衍射斑沿侧向彼此错开。
13.根据权利要求9所述的显微镜，其中，光谱选择性的元件(15)布置在成像装置(4)中，但不布置在也用于照明的光学器件(11-13)中。
14.根据权利要求9所述的显微镜，其中，扫描装置是用于在试样容腔中移动试样的试样台。
15.根据权利要求9所述的显微镜，其中，光谱选择性的元件(15)是光栅、棱镜、楔形板和/或双合透镜。
16.根据权利要求9所述的显微镜，其中，沿侧向彼此错开的衍射斑(30-33)处在共同的像平面中。
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