JP2020525811A - 多焦点構造化照明顕微鏡システム及び方法 - Google Patents

Abstract

試料の多焦点パターンを生成するための、多焦点選択照明顕微鏡（ＳＩＭ）の様々な実施形態（３００、４００、５００）が開示される。多焦点ＳＩＭシステムの実施形態（３００、４００、５００）は、試料を完全に走査する多焦点パターンの順序に従って、生成された各多焦点パターンに合焦、スケーリング及び加算の動作を行い、高解像複合画像を生成する。

Description

本明細書は、多焦点構造化照明顕微鏡法に関し、特に、試料の多焦点パターンから得られる複数の多焦点蛍光発光を生成するための多焦点構造化照明顕微鏡システム及び方法に関する。

従来の蛍光顕微鏡法には、「回折限界」と称される光の波長による分解能の制限がある。これは、試料が蛍光を発光し、顕微鏡で検出されるとき、典型的な励起及び発光波長において、横方向分解能を約２００ｎｍ、軸方向分解能を約５００ｎｍに制限する。共焦点顕微鏡法は、点照明と空間ピンホール配置を使用して、焦点面より厚い試片からの非合焦発光を排除することにより、光学分解能を回折限界以上に向上させる光学イメージング技術である。これにより、厳密なピンホール閉鎖を必要とする方法を用いて、回折限界より１．４１倍の解像度で画像を送達する。残念なことに、ピンホールの閉鎖は試料から放出される光の信号レベルを低下させ、この特定の超分解能方法が非実用的となるほどである。加えて、共焦点顕微鏡では、顕微鏡の照明ビームからの励起とピンホール／検出器とのアライメントを完全にする必要がある。それは、ピンホールの位置がずれると検出される光信号が減少して弱くなり、また試料自体の軸方向の光学セクショニングを低減させる結果となるからである。このように、共焦点顕微鏡のアライメント不良は、光信号の低減を生じさせ得る。

共焦点顕微鏡の分解能向上の方法として、カメラ画像の画素のような検出器のアレイを使用して、アレイ内の各検出器が個別の共焦点画像を生成する方法が見出されている。検出器のアレイが十分に小さければ、形成されるそれぞれの共焦点画像は、厳密に閉じられたピンホールを有する共焦点顕微鏡により形成される同様の共焦点画像と等価でありうる。例えば、共焦点画像が適切にアライメントされる場合には、回折で制約される顕微鏡が達成する分解能の１．４１倍となり得る。加えて、デコンボリューションにより、画像分解能はさらに向上する。しかしながら、試料の２次元平面全体に亘って単一の励起点しか走査されないために、試料の走査可能な速度と、それに続く試料の蛍光発光の検出が制限され、この検出器アレイ構成の制約となる。

構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）と称される、別のタイプの顕微鏡法は、空間変調した励起強度によって試料を照射する。これが試料の異なる位置に並進及び回転されて、各並進及び回転ごとに広視野画像が取得される。ＲＡＷ画像を適切に処理することによって、従来の広視野顕微鏡法の２倍の横方向分解能を有する、最終画像がもたらされる。そのようなＳＩＭシステムは、従来の顕微鏡の２倍の空間分解能を有する画像を生成するが、複数のＲＡＷ画像のそれぞれの取得に時間を要するために、最終画像を生成するときに依然として時間分解能が犠牲にされる。ＳＩＭはまた非合焦ぼけの排除に使用可能である。これは、「光学セクショニング（ｏｐｔｉｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）」として知られている。ただし、そのような光学セクショニングはコンピュータを用いて行なわれるために、ショットノイズ（ポアソンノイズ）の影響を受ける。したがって、背景の蛍光がこのショットノイズへ寄与して合焦信号を超える可能性がある場合には、ＳＩＭは厚い試料や著しく染色された試料には不適当である。

したがって当技術分野においては、走査速度を犠牲にすることなく各高分解能画像を得るための、試料の多焦点励起パターンを生成し、かつＳＩＭ画像を破損する可能性のあるショットノイズに耐性のある、構造化照明顕微鏡システムが必要とされる。

一実施形態において、顕微鏡システムは、
単一光ビームを伝送するための光源と、
単一光ビームを複数の光ビームに分割して、多焦点パターンを形成するためのビームスプリッタと、
を含んでもよい。スキャナは、多焦点パターンを形成する複数の光ビームを試料上に走査して、各多焦点パターンからの複数の蛍光発光を試料に生成させるようにする。次に、合焦構成要素は、各多焦点パターンから生じる複数の蛍光発光の非合焦蛍光発光を物理的に遮断するように構成された開口を画定し、合焦した蛍光発光を開口を通して通過させる。さらに、スケーリング構成要素は、各多焦点パターンから生じる複数の合焦した蛍光発光を縮小して、複数の合焦した蛍光発光のそれぞれを所定の係数だけ縮小し、各多焦点パターンから生じる複数のスケーリングされた合焦蛍光発光を生成させる。加算構成要素は、複数のスケーリングされた合焦蛍光発光のそれぞれを加算し、複数の加算・スケーリングされた合焦蛍光発光を生成する。それが、複数の加算・スケーリングされた合焦蛍光発光の複合画像を形成する。

別の実施形態では、顕微鏡システムには、
単一光ビームを伝送する光源と、
単一光ビームを複数の光ビームに分割して複数の多焦点パターンを形成し、複数の多焦点パターンのそれぞれが複数の焦点を画定する、ビームスプリッタと、
複数の多焦点パターンのそれぞれによって試料が複数の蛍光発光を生成できるように、複数の多焦点パターンのそれぞれを形成する複数の光ビームを試料上に走査し、複数の多焦点パターンのそれぞれは複数の蛍光焦点を画定する、スキャナと、
多焦点パターンのそれぞれから生じる複数の蛍光発光を収集するための検出器と、
検出器で収集された多焦点蛍光発光を処理するための処理システムであって、複数の収集された多焦点蛍光発光を格納するためのデータベースと動作可能に通信するプロセッサを備える処理システムと、
が含まれてよい。
ここで、プロセッサは、複数の多焦点パターンのそれぞれから生じる非合焦蛍光発光を除去して、複数の多焦点パターンのそれぞれから生じる合焦蛍光発光のみを残す。次いで、プロセッサは、局所縮小動作において、複数の多焦点パターンのそれぞれから生じる合焦蛍光発光をスケーリングする。多焦点パターンのそれぞれから生じる複数の蛍光発光のそれぞれは、複数の蛍光発光が縮小してスケーリングされた合焦蛍光発光を生成する際に、多焦点パターンから生じる別の複数の蛍光発光から同一の比例距離を維持する。そうしてプロセッサは、複数の多焦点合焦蛍光発光を加算して、複合画像を生成する。

さらに別の実施形態では、多焦点構造化照明顕微鏡のための方法が、
単一光ビームを発生させることと、
単一光ビームを複数の光ビームに分割することであって、複数の光ビームのそれぞれの焦点が複数の多焦点パターンを形成することと、
複数の多焦点パターンのそれぞれを形成する複数の光ビームで試料を照明することであって、照明された試料は、複数の多焦点パターンのそれぞれから生じる複数の蛍光発光を生成することと、
ピンホール動作を行なうことであって、ピンホール動作の間は複数の蛍光発光からの非合焦蛍光発光が遮断され、複数の蛍光発光からの合焦蛍光発光のみが通過可能となることと、
複数の多焦点パターンから生じる複数の合焦蛍光発光の各焦点を所定の係数によってスケーリングし、複数の多焦点パターンから生じる複数のスケーリングされた合焦蛍光発光を生成することと、
複数のスケーリングされた合焦蛍光発光のそれぞれを加算して複合画像を形成することと、を含んでもよい。

さらに別の実施形態では、顕微鏡システムが、
単一光ビームを伝送する光源と、
単一光ビームを、少なくとも１つの多焦点パターンを形成するために複数の光ビームに分割する、第１のマイクロレンズアレイと、
少なくとも１つの多焦点パターンを形成する複数の光ビームを試料上へ走査して、試料が少なくとも１つの多焦点パターンのそれぞれにより複数の蛍光発光を生成するようにするスキャナと、
を含んでもよい。
さらに、ピンホールアレイが、少なくとも１つの多焦点パターンのそれぞれに対して非合焦蛍光発光を遮断し、合焦蛍光発光をピンホールアレイ通過可能とする。第２のマイクロレンズが、半分の倍率を有する複数の光ビームの非倒立像を生成し、スキャナが複数の光ビームの非倒立像を再走査する。最後に、カメラが走査された非倒立像をキャプチャする。

更なる実施形態では、顕微鏡システムには、
単一光ビームを伝送する光源と、
単一光ビームを、多焦点パターンを形成する複数の光ビームに分割するためのマイクロレンズアレイを有する回転ディスクと、
多焦点パターンのそれぞれに対して、複数の光ビームの内の非合焦光ビームを遮断し、かつ複数の光ビームの内の合焦光ビームを、ピンホールアレイを有する回転ディスクを通過させるための、ピンホールアレイを有する回転ディスクであって、マイクロレンズアレイを有する回転ディスクが、ピンホールアレイを有する回転ディスクとタンデム式に回転して、複数の光ビームを試料を横断して走査して複数の蛍光発光を生成するようにする、回転ディスクと、
試料により生成された各多焦点パターンにおける複数の蛍光発光の画像をキャプチャするためのカメラと、
を含んでもよい。

別の実施形態において、顕微鏡システムは、
単一光ビームを伝送するための光源と、
単一光ビームを複数の光ビームに分割して多焦点パターンを形成するための、第１の方向に回転しかつ光軸に沿って位置する、集束マイクロレンズアレイを有する第１の回転ディスクと、
多焦点パターンのそれぞれに対して、複数の光ビームの非合焦の光ビームを遮断し、かつ複数の光ビームの合焦した光ビームを、ピンホールアレイを有する回転ディスクを通過させるための、第１の方向に回転しかつ光軸に沿って位置する、ピンホールアレイを有する第２の回転ディスクと、
第１の方向に回転しかつ光軸に沿って位置する、発散マイクロレンズアレイを有する第３の回転ディスクと、
を備える。
ここで、集束マイクロレンズアレイを有する第１の回転ディスクと、ピンホールアレイを有する第２の回転ディスクと、発散マイクロレンズアレイを有する第３の回転ディスクは、相互に同期して回転する。

更なる目的、利点及び新規の特徴は、以下の説明に記載されるか、または図面及び以下の詳細な説明の検討により当業者には明らかとなるであろう。

多焦点構造化照明（ＭＳＩＭ）システムにおける多焦点パターン生成の一方法を示す、簡略ブロック図である。 多焦点ＳＩＭシステムの別の実施形態における、多焦点パターン生成の別の方法を示す簡略ブロック図である。 図１の多焦点ＳＩＭシステムの一実施形態のための種々の構成要素を示す簡略図である。 図２の多焦点ＳＩＭシステムの一実施形態のための種々の構成要素を示す簡略図である。 複数の焦点を有する多焦点パターンを示す簡略図である。 試料から放出される、多焦点パターンにより生じる合焦した蛍光発光をスケーリングするスケーリング動作を示す簡略図である。 図４の多焦点ＳＩＭシステムの処理システムによる、スケーリングと加算動作を行なうための一方法を示すフローチャートである。 処理システムの非合焦蛍光排除、スケーリング及び加算動作を実行するときの格子ベクトル取得の一方法を示すフローチャートである。 処理システムの非合焦蛍光排除、スケーリング及び加算動作を実行するときのオフセットベクトル取得すの一方法を示すフローチャートである。 処理システムの非合焦蛍光排除、スケーリング及び加算動作を実行するシフトベクトル取得の一方法を示すフローチャートである。 処理システムの非合焦蛍光排除、スケーリング及び加算動作を実行するときのピンホールマスキングの一方法を示すフローチャートである。 処理システムの非合焦蛍光排除、スケーリング及び加算動作を実行するときのスケーリングと局所縮小の一方法を示すフローチャートである。 処理システムの非合焦蛍光排除、スケーリング及び加算動作を実行するときの加算の一方法を示すフローチャートである。 多焦点ＳＩＭシステムの一実施形態のテスト時に使用する照射システムを示す簡略図である。 フルオロマウント内に埋め込まれた試料の種々の画像を示す図である。 フルオロマウント内に埋め込まれた二重標識された３次元試料の種々の画像を示す図である。 ピンホール合焦、スケーリング及び３次元デコンボリューション後の、多焦点照射システムを使用した試料の種々の画像を示す図である。 掃引フィールドハードウェアＭＳＩＭシステムの実施形態を示す簡略図である。 掃引フィールドＭＳＩＭシステムによる微小管の超解像度画像の図である。 回転ディスク共焦点顕微鏡システムの一実施形態を示す簡略図である。 回転ディスクＭＳＩＭシステムの一実施形態を示す簡略図である。

図面間での対応する参照文字は対応する要素を示す。図面で使用されている見出しは、特許請求の範囲を制限するものと解釈すべきではない。

現代の顕微鏡法では、単一細胞の検査には、空間的にパターン化された光で試料の蛍光を励起し、それを検出して１つ以上の画像を処理して、従来の広視野顕微鏡画像の２倍の分解能を有する超分解能画像を生成する、構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）が使用され得る。ただし、ＳＩＭシステムは（各超分解能画像を得るために複数のＲＡＷ画像を要する）高分解能になるほど速度が犠牲となる。さらに、ＳＩＭシステムにおける光学セクショニングはコンピュータにより行われるので、蛍光の背景に固有なショットノイズの影響を受けやすい。これにより検査可能な試料の厚さが制限され、より厚い資料を検査するには他の顕微鏡手法を使用することが必要となる。例えば、共焦点顕微鏡システムでは、試料から放出される放出光の内の特定の焦点からの光のみをシステムが検出可能とするピンホール構成を用いて、非合焦光を物理的に排除する。それにより、ＳＩＭシステムで達成できるよりも相対的に厚い試料の、高コントラストの光学セクショニング画像が生成される。共焦点顕微鏡はまた、従来の広視野顕微鏡に比べて高い分解能を提供可能である。ただし、この共焦点顕微鏡による高い画像分解能はピンホール構成を停止することにより達成され、その結果、試料から検出される蛍光放射信号が対応して著しく低減する。修正された共焦点顕微鏡では、放射信号強度を犠牲にせずに、ＳＩＭ顕微鏡の分解能レベルまで画像解像度が改善されることが示されている。しかしながら、この顕微鏡によって達成される走査速度は遅く、研究目的に対しては非実用的である。

それゆえ、本明細書に提示の多焦点ＳＩＭ（ＭＳＩＭ）システムの実施形態は、高走査速度における高画像分解能及び従来の顕微鏡イメージングシステムに必要な信号強度の達成に係わる課題に対処し、かつ厚い試料において、現在市販されているＳＩＭシステムよりも優れた性能を提供する、特定のハードウェア部品、性質及び特性を含む。本明細書に記載のＭＳＩＭシステムは、試料から撮影された各画像が、従来の共焦点顕微鏡及びＳＩＭシステムに係わる顕著な信号損失なしで高分解能画像を生成するための多焦点励起パターンを生成する、ハードウェア構成部品の様々な実施形態を含む。さらに、ＭＳＩＭシステムではスケーリング、ピンホール動作、及び加算ステップを、構造化照明顕微鏡で行われるようなプロセッサやソフトウェア構成を使用して行うのではなく、ピンホールミラーやマイクロレンズアレイなどのハードウェア構成だけを使用して実行する。多焦点ＳＩＭシステム及び方法の更なる詳細を、以下に詳しく述べる。

図を参照すると、多焦点ＳＩＭ（ＭＳＩＭ）の様々な実施形態が示されており、図１〜図２１においてはその全体を１００、２００、３００、４００、５００で表す。図１には、ＭＳＩＭシステムの１つの一般的な実施形態が１００として示されている。ＭＳＩＭシステム１００は、照射パターン生成動作１０２を行い、単一光ビームを複数の光ビームに分割して１つ以上の多焦点パターンを発生させる。多焦点パターンのそれぞれは、複数の光ビームのそれぞれに対する焦点配列を画定する。例えば、多焦点パターン１７０の一実施例の簡略化した図を、図５に示す。一実施形態では、多焦点パターン１７０には、複数の光ビームによって画定される特定の多焦点パターン１７０に配列された、複数の焦点１７２が含まれ得る。各多焦点パターン１７０は、複数の光ビームに対して焦点の異なる配列を画定して、多焦点パターン１７０が、焦点１７２の所与の密度に対して、任意の２つの最近接焦点１７２間の距離を最大化し、それによってクロストークを最小化するようにする。本明細書で使用されるように、クロストークという用語は、他の焦点からの励起及び蛍光を、当該焦点を焦点とするかのように見えさせる、近接する光ビームの能力を指す。スキャン動作１０４では、各多焦点照射パターン内の複数の光ビームが、照射されている試料１０６上をラスタ走査されて、試料１０６から複数の蛍光発光を放出させる。試料１０６から放出される蛍光発光は、逆の走査動作１０８においてラスタ走査されて、複数の蛍光発光が、合焦動作１１０における非合焦蛍光発光除去のために元の方向に戻される。合焦動作１１０において、非合焦蛍光発光は遮断され、合焦蛍光発光のみが処理のために通過される。

各多焦点パターンによって生じる合焦する蛍光発光は、次いで、各蛍光発光を局所的に縮小させるスケーリング動作１１２を用いて、所定の係数によりスケーリングされる。図６に示すスケーリング動作１１２の一実施形態では、１つの多焦点パターン１７０内に生じた蛍光焦点１７２の局所縮小が生じる。例えば、多焦点パターン１７０内の蛍光焦点１７２Ａ及び１７２Ｂの、それぞれスケーリングされた蛍光焦点１７２Ａ’及び１７２Ｂ’への局所縮小は、蛍光焦点１７２Ａ及び１７２Ｂの幾何学的中心１７５間の距離３００と、蛍光焦点１７２Ａ及び１７２Ｂの距離３０２とが、多焦点パターン１７０の蛍光焦点１７２に適用されるスケーリングの程度に拘わらず同一に維持されるように行なわれる。言い換えると、スケーリング動作１１２は、蛍光焦点のそれぞれ間の相対距離を同一に維持しながら、蛍光焦点１７２を反転なしで局所的に縮小させる。スケーリング動作１１２の後、各多焦点照射パターンに対するスケーリングされた合焦蛍光発光は、次いで再走査動作１１４においてラスタ走査される。これにより、各多焦点パターンにより生じる縮小された合焦蛍光発光が、収集及び加算動作１１６において検出器による収集及び加算をされて、複合高分解能画像を生成する。

いくつかの実施形態において、収集及び加算動作１１６後、複合画像がデコンボリューション動作１１８を受けて、複合画像の分解能をさらに向上させる一定レベルのぼけ除去を行なってもよい。デコンボリューション動作１１８は、自由に利用可能なＰｉｏｔｙｒ Ｗｅｎｄｙｋｉｅｒの並列反復デコンボリューションプラグインなどの任意の従来のデコンボリューション動作１１８であってよい。

図２には、２００として示す多焦点ＳＩＭシステムの別の実施形態による、多焦点パターン生成の別の方法が図示されている。ＭＳＩＭシステム２００は、照射パターン発生動作２０２を行い、複数の光ビームから成る多焦点パターンを１つ以上生成するために、１つの光ビームを複数の光ビームへ分割する。走査動作２０４において、各多焦点パターンの複数の光ビームが試料２０６上にラスタ走査される。試料２０６は、多焦点パターンに応答して蛍光発光を生成し、それが収集動作２０８において検出される。収集動作２０８において、検出器は、合焦蛍光発光を収集し、収集されたデータを処理動作２１０を行なう処理システムに伝送する。処理動作２１０は、各多焦点パターン内の非合焦蛍光発光を除去し、残りの合焦蛍光発光をスケーリングし、次いで、スケーリングされた合焦蛍光発光を加算して、多焦点パターンによって生成された複数の蛍光発光から構成される複合画像を生成する。いくつかの実施形態においては、収集されたデータは、デコンボリューション動作１１８と類似のデコンボリューション動作２１２を受け、複合画像のぼけ除去を行って画像分解能をさらに向上させてもよい。

図３を参照すると、多焦点ＳＩＭシステム１００の一実施形態は、マイクロレンズアレイ等のビームスプリッタ１２４を通して伝送される単一光ビーム１２２を発生させるための、例えばレーザである照明源１２０を含んでもよい。ビームスプリッタ１２４は、単一光ビーム１２２を複数の光ビーム１２６に分割し、複数の光ビーム１２６のそれぞれが異なる焦点を有し、それが集合的に多焦点パターン１２８を形成する。いくつかの実施形態では、第１のレンズ１３０は、各多焦点パターン１２８を、ダイクロイックミラー１３２を介して方向Ａに、ガルバノメータなどの走査装置１３４上へ結像させて、走査動作１０４を行なう。

走査動作１０４の間、走査装置１３４は、試料１４４上への複数の光ビーム１２６の各多焦点パターン１２８を、第２のレンズ１３６、チューブレンズ１３８及び対物レンズ１４０の配列を通して、試料１４４上へラスタ走査する。

試料１４４が複数の光ビーム１２６の多焦点パターン１２８によって照射されることに応答して、試料１４４は、光ビーム１２６から成る多焦点パターン１２８によって生じる蛍光発光１４２を放出する。照射された試料１４４によって放出される、各多焦点パターン１２８に対する複数の蛍光発光１４２は、次に、対物レンズ１４０を通して捕捉され、チューブレンズ１３８及び第２のレンズ１３６を介して、走査装置１３４上に至る。ここで複数の蛍光発光１４２をラスタ走査することにより、複数の蛍光発光１４２のそれぞれを第２のレンズ１３６からダイクロイックミラー１３２上に、複数の光ビーム１２６がダイクロイックミラー１３２を直接通過する方向Ａとは反対の方向Ｂに、逆走査する。方向Ｂでは、複数の蛍光発光１４２は、ダイクロイックミラー１３２によって方向を変えられて、第３のレンズ１４６を通過する。そこで複数の蛍光発光１４２は次に、ピンホールアレイ１４８上に合焦されてピンホール動作１１０を行なう。

ピンホール動作１１０の間、ピンホールアレイ１４８は、非合焦蛍光発光１４２を物理的に遮断して排除し、合焦した蛍光発光１４２Ａのみにピンホールアレイ１４８を通過させる。一実施形態では、ピンホールアレイ１４８は、合焦した蛍光発光１４２Ａのみにピンホールアレイ１４８を通過させる一方、開口のうちの１つを通過しない、全ての蛍光発光１４２を遮断するように構成された、複数の開口を含んでもよい。

ピンホールアレイ１４８を通過後、複数の合焦した蛍光発光１４２Ａは、前述のスケーリング動作１１２を使用してスケーリングされる。これは、第２のマイクロレンズアレイ１５２と直列に配置された第１のマイクロレンズアレイ１５０を使用して、個別の多焦点パターン１２８に対して、各焦点を所定の係数、例えば係数２だけ局所的に縮小する。一実施形態では、第１のマイクロレンズアレイ１５０は、合焦した蛍光発光１４２Ａの多焦点パターン１２８をコリメートし、他方で、第２のマイクロレンズアレイ１５２は、コリメートされた合焦蛍光発光１４２Ａを受光し、そのコリメートされた合焦蛍光発光１４２Ａの焦点距離を修正して、各焦点を所定の係数だけ縮小して、多焦点パターン１２８の局所縮小を達成するようにする。いくつかの実施形態では、各多焦点パターン１２８によって生じたスケーリングされた合焦蛍光発光１４２Ｂは、次いで、第１のミラー１５４によって方向を変えられて第４のレンズ１５８を通過し、スケーリングされた合焦蛍光発光１４２Ｂが第２のミラー１５６上に合焦させられる。第２のミラー１５６は、スケーリングされた合焦蛍光発光１４２Ｂの方向を変え、発光フィルタ１６０を通過させる。ここで、特定の波長領域、例えば５１５ｎｍのスケーリングされた合焦蛍光発光１４２Ｂのみが、発光フィルタ１６０を通過することができる。スケーリングされた合焦蛍光発光１４２Ｂがフィルタ処理されると、走査装置１３４は、第５のレンズ１６２を通して検出器１６４上に蛍光発光１４２Ｂをラスタ走査する。そして各多焦点パターン１２８に対するスケーリングされた合焦蛍光発光１４２Ｂが収集され、合焦蛍光発光１４２Ｂが検出器１６４によって加算されて、複合画像１４３を生成するようになる。多焦点パターン１２８によって生じた蛍光発光１４２Ｂを収集するプロセスは、視野全体が照射されて、生じる全ての蛍光発光１４２Ｂが検出器１６４によって収集されるまで、繰り返される。

いくつかの実施形態では、検出器１６４はカメラであって、スケーリングされた合焦蛍光発光１４２Ｂが、検出器１６４上でラスタ走査されている間は、全視野が照射されて収集する全データが受信されるまで、収集のためにシャッタが開放されて露出されたままでよい。

いくつかの実施形態では、複合画像１４３は、ぼけ除去機能を行って各複合画像１４３の解像度を向上させるデコンボリューション動作１１８を遂行する、処理システム１６６に伝送される。

図４を参照すると、多焦点パターン２２３を生成するための多焦点ＳＩＭシステム２００の一実施形態は、単一光ビーム２０３を生成する照明源２０１を含んでもよい。単一光ビームは、ビーム拡大器２０５を通して伝送されて拡大された光ビーム２０３を形成する。それがビーム操向ミラー２０７で反射されて走査動作２０４を遂行する。そこでは拡大光ビーム２０３がビームスプリッタ２０９、例えば市販のデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）または掃引フィールド共焦点ユニット上へ走査される。いくつかの実施形態では、ＤＭＤは、多焦点パターン２２３上の照射スポットを各焦点とする多焦点パターン２２３の生成及びスイッチを行う。各照射スポットは、拡大された光ビーム２０３の一部が単一ＤＭＤミラー画素から反射されるようになった、ＯＮ位置にある単一ＤＭＤミラー画素によって生成される。ビームスプリッタ２０９は、照射パターン生成動作２０２を行ない、走査される拡大光ビーム２０３を複数の拡大された光ビーム２０３Ａに分割する。これらが集合的に一連の多焦点パターン２２３を形成する。各多焦点パターン２２３の複数の拡大光ビーム２０３Ａは、第１のチューブレンズ２１１を通って、方向Ｃに沿ってダイクロイックミラー２１３を直接通過する。

ダイクロイックミラー２１３を直接通過した後、拡大光ビーム２０３Ａは試料２１７の試料照射２０６のために対物レンズ２１５によって試料平面上に合焦され、試料２１７から放出される複数の蛍光発光２２２を発生させる。収集動作２０８において、蛍光発光２２２は、対物レンズ２１５を通して方向Ｃに垂直な方向Ｄに沿って戻されて、ダイクロイックミラー２１３上に合焦される。そして各多焦点パターン２２３に対する蛍光発光２２２が方向を変えられて、第２のチューブレンズ２１９を通過するようにされる。第２のチューブレンズ２１９は、蛍光発光２２２を検出器２２１上に合焦させる。そうして、各多焦点パターン２２３を収集データ２２７の形で収集して、非合焦光を排除し、スケーリングと加算の動作２１０を行なう処理システム２２５に伝送する。多焦点パターンのそれぞれによる蛍光発光２２２の収集プロセスは、視野全体が照射されるまで繰り返される。いくつかの実施形態では、処理システム２２５は検出器２２１と動作可能に通信するプロセッサ２３０を含み、以下により詳細を述べるような命令を実行することによってコンピュータ可読媒体等のデータベース２３２内に格納された収集データ２２７を、処理してもよい。

一実施形態では、処理システム２２５は、非合焦蛍光発光２２２を排除し、収集データ２２７処理のためのコンピュータ化された手順を用いて、各多焦点パターン２２３に対する収集データ２２７に、スケーリング及び加算動作２１０を行なう。図７には、処理システム２２５を用いた、非合焦蛍光排除、スケーリング及び加算動作２１０を実行する一方法がフローチャートで示されている。ブロック１０００では、処理システム２２５は、多焦点照射パターン２２３の自動格子検出を行なう。具体的には、自動格子検出は、種々の蛍光焦点のピンホールマスキング及び局所縮小を行なうために、特定の多焦点パターン２２３の各照明焦点の位置を判定する。例えば、自動格子検出は５つのベクトルを判定し、画像取得系列における、特定の多焦点パターン２２３に対する各蛍光発光２２２の全焦点の位置を完全に規定する。いくつかの実施形態では、５つのベクトルは、格子ベクトル、シフトベクトル及びオフセットベクトルであってよい。２つの格子ベクトルは、任意の２つの隣接する照射スポット（例えば、焦点）間の２次元変位を規定する。したがって、格子ベクトルだけ変位した任意の格子点は、別の格子点上に来る。熱シフトのため、各照射スポットの正確な場所は、時間と共に変動しうるので、収集されたデータ２２７からの測定された各データセットに対して全ベクトルを正確に抽出すれば、以下の方法論を用いて、最良の結果が提供される。

図８には、処理システム２２５が、非合焦排除、スケーリング及び加算動作２１０を行なうときに、収集されたデータ２２７の各測定データセットに対する全ベクトルを正確に抽出する方法を示す。オフセットベクトルは、処理システム２２５によって処理されている任意の１つの画像取得系列において、多焦点パターンの中心に最も近い照明スポットの絶対位置を規定する。シフトベクトルは、特定の多焦点パターン２２３の各照射スポットが連続する画像間で移動した距離を規定する。多焦点パターン２２３は、２次元平面でラスタ走査されるため、「高速」シフトベクトルが動作２１０の全ステップに適用され、「高」シフトベクトルが１行の照射を完了すると「低速」シフトベクトルが適用される。本明細書で使用されるように、用語「高速」シフトベクトルは、単一行内の格子点を規定し、用語「低速」シフトベクトルは、連続する行を規定する。ブロック２０００において、特定の多焦点パターン２２３から捕捉された蛍光１４２Ｂを表す各ＲＡＷ画像は、Ｈａｎｎウィンドウ（フーリエ領域内のリンギングを防止する）を乗じて、フーリエ変換される。ブロック２００２において、得られたフーリエ振幅を平均化して、フーリエ空間内のピーク位置の高い信号対雑音測定値を求める。ブロック２００４において、平均化された結果として生じるフーリエ振幅が、バンドパスフィルタを介してフィルタ処理される。ブロック２００６において、フーリエ領域内のスパイクまたはピークの探索が行われる。加算されたフーリエ振幅に対するＲＡＷ画像は、ピークの周期的格子であると予測されるため、格子要素または雑音のいずれかであるフーリエ極大値を判定することによって、各周期格子の次元化が行なわれる。ブロック２００８において、予測される周波数の倍数またはその近傍におけるピーク強度を計算により探索することで、３つの最も低い空間周波数ピークの高調波が決定される。ブロック２０１０において、高調波を伴う３つの最低空間周波数ピークの位置が与えられると、格子ベクトルを構成するベクトル和及び差におけるピークの探索が行なわれる。本方法では、周期格子内のピークは、各格子点が整数個のフーリエ格子ベクトルのベクトル和に位置する、同一格子内の他のピーク位置を予測する。ブロック２０１２において、処理システム２２５は、得られた連立方程式を線形二乗法によって解き、３つの格子ベクトルを求める。フーリエ領域内のいかなる単一ピークも、雑音または画素化により、ある程度の位置誤差を有するものである。最小二乗法を利用することにより、各ピークにより提供される情報が、格子次元のより正確な測定を生成する。ブロック２０１４において、処理システム２２５が格子ベクトルを加算して誤差ベクトルを決定し、次いで、各フーリエ格子ベクトルから、誤差ベクトルの３分の１を減算する。ブロック２０１６において、２つのフーリエ格子ベクトルのうちの任意の２つが選択及び変換されて、実空間の格子ベクトルが求められる。多焦点照射パターンに対する２つの格子ベクトルを求めることで、オフセットベクトル及びシフトベクトルの測定が実質的に容易になることが分かった。

図９には、処理システム２２５が、非合焦ぼけ排除、スケーリング及び加算動作２１０を行なうときの、オフセットベクトルの決定方法を示す。ブロック３０００において、第１のＲＡＷ画像をメディアンフィルタ処理する。ブロック３００２において、測定された格子ベクトルからの点の格子を、オフセットベクトルをゼロとして構築する。ブロック３００４において、各格子点に中心を持つ小画像の組を、サブ画素センタリングのための補間を使用して、メディアンフィルタ処理されたＲＡＷ画像から抽出する。ブロック３００６において、小画像を平均化して、「格子平均」画像を形成する。ブロック３００８において、格子平均画像内の最大輝度画素を決定する。ブロック３０１０において、格子平均画像内の各強度ピークのサブ画素位置を、補間手法を用いて推定する。

図１０には、処理システム２２５が、非合焦ぼけ排除、スケーリング及び加算動作２１０を行なうときの、シフトベクトルの決定方法を示す。ブロック４０００において、予測されるフーリエピーク位置の組を、測定したフーリエ格子ベクトルから構築する。ブロック４００２において、変換された収集データ２２７の各画像番号に対して抽出位相を抽出する。ブロック４００４において、処理システム５２５は、各一連の多焦点パターン２２３を位相アンラップして２πジャンプを除去する。各ＲＡＷ画像のフーリエ変換の振幅は、ＲＡＷ画像のシフトには依存しないことに注意した。シフトに関する情報は、フーリエ変換の位相にエンコードされる。ブロック４００６において、処理システム２２５は、２次元系列の各位相系列を走査パターンと同一次元の２次元アレイ（例えば、１６画素×１４画素）に再成形する。各位相系列の再成形後、ブロック４００８において、「高速」及び「低速」方向の両方において、各位相系列の平均勾配を直線フィットする。検出された連続する各ＲＡＷ画像では、照射は、ＸＦＡＳＴだけシフトする。各行の終りで、照射はまたＸＳＬＯＷだけシフトする。ＲＡＷ画像がＸだけシフトすると、ｋに位置するフーリエ空間内のピークの位相は、ｋ＊Ｘだけシフトする。ブロック４０１０において、処理システム２２５は、ＸＦＡＳＴとＸＳＬＯＷに関して得られた連立方程式を解く。ブロック４０１２において、多焦点パターン２２３の系列の最初と最後のフレームに対してオフセットベクトルを構築する。最初のフレームのオフセットベクトルの計算と同一のプロセスを使用する、最後のフレームに対するオフセットベクトルの計算により、推定精度を大幅に向上させる強い制約が提供される。ブロック４０１４において、予測されるオフセットベクトルが、ＸＦＡＳＴとＸＳＬＯＷに対する現在の推定に基づいて構築される。予測されたオフセットベクトルが構築されると、２つのベクトルの差を誤差ベクトルとして判定し、それを走査内のＲＡＷ画像の数によって除算してＸＳＬＯＷから減算する。

図１１には、処理システム２２５が、非合焦ぼけ、スケーリング及び加算動作２１０を行なうときの、非合焦ぼけ排除のためのピンホールマスキング法を示す。ブロック５０００において、上記で決定されたベクトルに基づく一組の予測照射位置を、収集動作２０８の間に収集された各ＲＡＷ画像に対して構築する。ブロック５００２において、各照射位置を中心とするより小さいサブ画像を、補間手法を使用して抽出し、次いで、ブロック５００４において、各中心サブ画像を、２次元ガウスマスクによって処理システム５２５で乗算する。これらのプロセスステップは、物理的ピンホールの効果をシミュレートする。ブロック５００６において、各サブ画像から任意で背景を減算し、中心のサブ画像を較正データによって与えられる補正係数で乗算してもよい。ブロック５００８において、個々のホット画素を、処理システム５２５によって任意でメディアンフィルタ処理してもよい。

図１２には、処理システム２２５が、非合焦ぼけ排除、スケーリング及び加算動作２１０を行なうときの、スケーリング及び局所縮小を行なう方法を示す。ブロック６０００において、マスクされた各サブ画像を再サンプリングして、マスクされたサブ画像を約２分の１に縮小する。ブロック６００２において、スケーリングされマスクされた各サブ画像を、ＲＡＷ画像の処理に追加する。

図１３には、処理システム２２５が、非合焦ぼけ排除、スケーリング及び加算動作２１０を行なうときの、加算方法を示す。ブロック７０００において、処理されたＲＡＷ画像を加算して、複合画像を形成する。ブロック７００２において、ＲＡＷ画像を任意で加算して、計算された「広視野」画像を生成してもよい。

非合焦ぼけ排除、スケーリング及び加算動作２１０によって生成されて得られる複合画像は、従来の広視野顕微鏡によって生成される典型的広視野画像より√２倍優れた分解能を有することが示された。非合焦ぼけ排除、スケーリング及び加算動作２１０によって、
従来の回転ディスクまたは掃引フィールドの共焦点顕微鏡と同様に、光学セクショニングが大幅に改善される。

図１８には、符号３００で示されたＭＳＩＭシステムの一実施形態を示す。ＭＳＩＭシステム３００は掃引フィールドのハードウェア構成であって、上記で説明したＭＳＩＭシステム１００及び２００と同程度の分解能向上が達成される。ＭＳＩＭシステム３００と、ＭＳＩＭシステム１００及び２００との大きな相違点は、スケーリング、ピンホール処理及び加算のステップが、ＭＳＩＭシステム３００では、ＭＳＩＭシステム１００及び２００で必要としたソフトウェアではなく、ハードウェアを用いて達成されることである。この実施形態において、ＭＳＩＭシステム３００には光ビーム３０５を放出する光源３０２が含まれ、光ビームが集束（＋）マイクロレンズアレイ３０４を通って伝送されて、得られる集束光ビームが、第１の走査レンズ３０６を介して中継されて、ガルバノミラー３０８で走査された後に第２の走査レンズ３１０を通過する。ここで、第１の走査レンズ３０６と第２の走査レンズ３１０とは中間画像面に対して４ｆ構成となっている。

さらに示すように、ガルバノミラー３０８は第１と第２の走査レンズ３０６、３１０の間の焦点に位置することができ、励起焦点を試料面３１６上で掃引し、画像視野をカバーする掃引フィールド励起を生成する。さらに、チューブレンズ３１２と対物レンズ３１４の望遠鏡構成が、第２の走査レンズ３１０と試料面３１６の間に配置される。これにより中間ステージを縮小して、ガルバノミラー３０８によって試料面３１６を横断して掃引される、励起焦点のアレイが形成される。試料面３１６を横断して掃引される励起焦点により生成される蛍光が、対物レンズ３１４とチューブレンズ３１２の同じ光路を逆進する。これはガルバノミラー３０８により逆スキャンされ、集束マイクロレンズアレイ３０４と第１の走査レンズ３１０との間に位置するダイクロイックミラー３１８によって転向される。転向されると、蛍光発光はピンホールアレイ３２０を通過し、それによって非合焦蛍光発光が大幅に低減される。

結果として得られる合焦した蛍光発光は次に、第１のリレーレンズ３２２から成る４ｆ望遠ペアを用いて中継されて合焦した蛍光発光を第１のミラー３２４上に合焦させる。それが合焦した蛍光発光を転向させて第２のリレーレンズ３３０に送る。次いで第２のミラー３２６と第３のミラー３２８で相次いで転向されて第２の集束（＋）マイクロレンズアレイ３３２に至る。一実施形態において、第２の集束（＋）マイクロレンズアレイ３３２は、第２のリレーレンズ３３０が生成する焦点よりも１焦点距離ほど前に配置されて、それによって、蛍光発光焦点の１／２の倍率の正立（非倒立）像が形成されてもよい。この正立像が次に４ｆ構成に配置された第３の走査レンズ３３４と第４の走査レンズ３３６によるもう１つの望遠鏡構成を通って中継される。ここで正立像は第３の走査レンズ３３４と第４の走査レンズ３３６の間の焦点に配置されたガルバノミラー３０８により再走査されてもよい。放射フィルタ３４０を有するカメラ３３８が最終画像をキャプチャする。ＭＳＩＭシステム３００は、固定されたＵ２ＯＳ細胞内のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ｎｍ標識微小管を示す図１９のような高解像度画像を生成可能である。各微小管の外見上の幅は約２００ｎｍである。図１９に示す画像は、画像の分解能をさらに向上させることが期待される後処理のデコンボリューションを行っていないＲＡＷ画像である。

図２０は、符号４００で示された回転ディスク共焦点顕微鏡システムの一例を示す。システム４００には、集束（＋）マイクロレンズアレイを有する回転ディスク４０４を通過し、その次に整合ピンホールアレイを有する回転ディスク４０６を通過する光ビームを生成するための光源４０２が含まれてよい。結果として得られる励起は、チューブレンズ４０８と対物レンズ４１０の光学構成により、試料４１２上に結像される。この構成では、集束（＋）マイクロレンズアレイを有する回転ディスク４０４と、整合ピンホールアレイを有する回転ディスク４０６の両方の回転がタンデム式に行われ、その結果生成される励起焦点が試料４１２の視野をカバーする。次に試料４１２から発する蛍光発光は、対物レンズ４１０、チューブレンズ４０８、及び整合ピンホールアレイを有する回転ディスク４０６を通過して戻る。その後、蛍光発光はダイクロイックミラー４１４で転向されて蛍光発光が望遠鏡構成４１６を通過し、放射フィルタ４１８を介してカメラ４２０でキャプチャされる。

図２１では、図２０の回転ディスクシステム４００の改造に基づく、回転ディスク多焦点構造化照明顕微鏡を有する、符号５００で示すＭＳＩＭシステムの別の実施形態が示されている。一実施形態において、従来の回転ディスク共焦点顕微鏡が１つの大きな改造により解像度倍化装置に変換される。ＭＳＩＭシステム５００には光源５０２が含まれて光ビームを生成し、光ビームがダイクロイックミラー５０４によって転向されて集束（＋）マイクロレンズアレイ５０６を有する回転ディスクとその次にピンホールアレイを有する回転ディスク５０８を通過する。そうしてチューブレンズ５１０と対物レンズ５１２により試料５１４上に合焦される。試料５１４が照射されると、試料５１４で生成された蛍光発光が対物レンズ５１２とチューブレンズ５１０とを逆方向に通過する。これらのレンズにより蛍光発光は集束されて、集束（＋）マイクロレンズアレイを有する回転ディスク５０６とピンホールアレイを有する回転ディスク５０８とに同期して回転し、かつ光軸上に配置された、発散（−）マイクロレンズアレイを有する回転ディスク５１６を通過する。その後蛍光発光は望遠鏡構成５１８を通過して、放射フィルタ５２２でフィルタリングされた後にカメラ５２０でキャプチャされる。一実施形態において、発散（−）マイクロレンズアレイを有する回転ディスク５１６は、集束（＋）マイクロレンズアレイを有する回転ディスク５０６と同数のマイクロレンズを有する必要があり、かつこれらのマイクロレンズは、各回転ディスク５０６、５１６上で同一空間位置に配置される必要がある。いくつかの実施形態において、発散（−）マイクロレンズアレイを有する回転ディスク５１６のマイクロレンズが、集束（＋）マイクロレンズアレイを有する回転ディスク５０６の半分の焦点距離を有し、これらの回転ディスク５０６と５１６が焦点距離の差だけ離間していれば、この構成は倍率１／２のガリレイ望遠鏡となる。そのような望遠鏡が、形成された正立の縮小像から適切な距離で配置される場合、回転ディスク５１６と５０６がカメラ露光に同期して回転することににより、解像度倍化のために必要な所望のピンホール動作、スケーリング動作及び加算動作が遂行される。回転ディスク構成のＭＳＩＭシステム５００の重要な利点の１つは、発光光学部品の数が１７ではなく９へと大幅に低減されることである。別の利点は、発散（−）マイクロレンズアレイを有する回転ディスク５１６が容易に製造可能であるとすれば、ＭＳＩＭシステム３００、４００及び５００の光学設定は、従来の掃引フィールド顕微鏡よりもはるかに容易にアライメントできる可能性があり、ＭＳＩＭ技術の回転ディスクへの移行が容易に可能となる。
試験

生物学的撮像のための多焦点ＳＩＭシステム２００の可能性を調べるために、フルオロマウントに埋め込まれたヒト骨肉腫（Ｕ２ＯＳ）細胞中の抗体標識された微小管を撮像した。以下は、照射システム（図１４）、顕微鏡システム、試料調製、及びキャプチャ画像のデータ処理の説明である。多焦点パターンをデコンボリューションと組み合わせて使用することにより、撮像レート１Ｈｚで、横方向に１４５ｎｍ、軸方向に４００ｎｍまでの分解能で種々の試料を調査することが可能であった。従来の構造化照明顕微鏡システムと比較して、多焦点ＳＩＭシステム２００は、従来の構造化照明顕微鏡システムより５〜８倍厚い試料の３次元画像を提供した。本調査では、カバーガラス表面から４５μｍを超える深さにある、生きた遺伝子組み換えゼブラフィッシュの胚の中にある微小管を撮像した。さらに、生きた線虫の胚におけるＧＦＰ標識ヒストンの４次元ＳＩＭデータセットを得た。

試験には、本照射点位置としてほぼ正三角形の周期格子を用いた。それは、この特定のパターンが、所与の点密度に対して任意の２つの最近接近傍間の距離を最大化し、それによってクロストークを最小化するからである。多焦点照射パターンは、一度に１デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）ピクセルだけ並進させた。これは試料面における１２０ｎｍのステップサイズに対応した。より大きいステップにすると試料が均等に照明されず、目に見える縞模様のアーチファクトをもたらし、より小さいステップでは画質の向上なしに取得時間と照射量が増大した。

市販の倒立顕微鏡上にマウントされた試料上に多焦点パターンを結像し、科学グレードの相補型金属酸化膜半導体カメラ（ｓＣＭＯＳ）を使用して各多焦点パターン位置ごとに１つのＲＡＷ画像を記録した。照射点間の間隔を変えることによって、取得速度をセクショニング品質とトレードオフ可能である。広く離間された焦点はクロストークが少ないが、試料を均等に照射するためには追加の多焦点照射パターン必要とすることが分かった。対照的に、焦点の密度が高いほどクロストークは大きいが、それに応じて、試料を均等に照射するために必要な多焦点パターンは少ない。走査点間が水平に１６画素、垂直に１４画素だけ分離した多焦点パターンが、調査した生物学的サンプルにおいて良好な結果を提供することを見出した。４８０画素×４８０画素の視野に対して２２２Ｈｚで取得した２２４のＲＡＷ露光が、約１Ｈｚの超分解能画像取得速度に対応した。

生物学的撮像に対する多焦点ＳＩＭシステム２００の可能性を調べるために、図１５の画像に示すようにフルオロマウントに埋め込まれたヒト骨肉腫（Ｕ２ＯＳ）細胞中の抗体標識された微小管を撮像した。広視野画像と比較して、ＳＩＭシステム２００によって生成された多焦点照射、ピンホール処理、加算、及びスケーリングされた画像は、画像コントラストを含めて画像分解能を改善した。さらに、並列反復デコンボリューションによって得られる複合画像がさらに改善され、以前は回折によって隠されていた特徴を明らかにした。多焦点ＳＩＭシステム２００の画像における微小管の見掛け上の半値全幅（ＦＷＨＭ）強度は１４５ｎｍであり、これは広視野撮像と比較して２倍の改善であった。１１０ｎｍサブ回折ビーズにおける類似実験でも、この結果が確認された（多焦点ＳＩＭシステム２００ＦＷＨＭ１４６＋／−１５ｎｍ；広視野ＦＷＨＭ２８４＋／−３２ｎｍ、Ｎ＝８０ビーズ）。４８μｍｘ４９μｍの視野に対する総取得時間は約１ｓであり、これは、各顕微鏡システムに対して同じ２２２ＨｚのＲＡＷ画像フレーム速度を仮定して、従来の画像走査顕微鏡（ＩＳＭ）システムの６５００倍の改善であった。

二重標識された３次元試料に対する多焦点ＳＩＭシステム２００の適合性もまた、図１６の試料に示すように調査した。フルオロマウントに埋め込まれた固定細胞上の画像のＺスタックを使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で免疫標識した微小管及びＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで染色したミトコンドリアが、３．７μｍ厚の体積として得られ、個々の切片は１００ｎｍだけ分離した。同一の総照射線量で得られた広視野画像と比較して、３次元多焦点ＳＩＭシステム２００の画像は、（デジタルピンホールを介した）物理的除去及び（３次元デコンボリューションを介した）計算上の除去とを組み合わせた非合焦光の除去により、驚異的な画像コントラストの増加をもたらした。

多焦点ＳＩＭシステム２００によって生成された複合画像結果は、広視野撮像に対して分解能を約２倍改善させた。すなわち、微小管及び「虫状」ミトコンドリアをより良好に解像した。例えば、個々のミトコンドリアの末端におけるサブ回折ボイドのより良好な解像が、２００ｎｍ超で分離された微小管ペアを含めて達成された。微小管は約４００ｎｍの見掛け上の軸方向ＦＷＨＭを有していたので、意外にも、多焦点ＳＩＭシステム２００は軸方向分解能もまた広視野画像に対して約２倍改善させた。この結果は、１００ｎｍサブ回折ビーズにおいても確認された（多焦点ＳＩＭシステムＦＷＨＭ４０２＋／−４９ｎｍ；広視野８２６＋／−８３ｎｍ、Ｎ＝８０ビーズ）。

ＭＳＩＭシステム２００を、より厚い生体試料の３次元撮像にも適用した。そこでは、そうでなければ合焦光信号を圧倒するであろう非合焦光を、ピンホール動作によって物理的に排除する。この能力を実証するために、微小管を標識したＧＦＰ導入遺伝子を発現する、生きた固定化ゼブラフィッシュの胚を撮像した。

多焦点ＳＩＭシステム２００による多焦点照射を使用して、２４１個のスライスを、２次元撮像速度１Ｈｚ、０．２μｍ間隔で取得した。ピンホール合焦、スケーリング及び３次元デコンボリューションの後、４８．２μｍ厚の体積が、図１７に示す試料の画像のように達成された。２つの隣接する体節間の境界、体節境界に沿った微小管の整列、及び発達中の筋細胞の核に対応する微小管なしの領域、などの構造的特徴を、スタックの中にはっきりと見ることができる。本スタック内の連続するより深部の核のｚ−位置の評価から、撮像体積は６〜７個の細胞層を含むことが示唆される。

１つの試験では、多焦点ＳＩＭシステム２００の撮像速度で、画像内に著しい動きのぼけを伴わずに、表皮内の分裂細胞がキャプチャされた。多焦点ＳＩＭシステム２００の分解能向上は、体積全体を通して維持され、細胞分裂部位における微小管ペア間の分離は、２００ｎｍより良好に解像され、表皮内の微小管は、横方向に１７５＋／−３３ｎｍ（Ｎ＝３０）及び軸方向に４９６＋／−６５ｎｍ（Ｎ＝２１）の横方向ＦＷＨＭを有していた。
照射システム

照射システムでは、全光学系は、機械振動を最小化するために、光学テーブル（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｉｂｒａｐｌａｎｅ Ｍｏｄｅｌ ＃５７０４−３６６０−２３ＳＰＬ）に取り付けた。蛍光を励起するために、２つのレーザ、すなわち、１５０ｍＷ、５６１ｎｍレーザ（５６１、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｓａｐｐｈｉｒｅ ５６１−１５０ ＣＷ ＣＤＲＨ）及び２００ｍＷ、４８８ｎｍレーザ（４８８、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｓａｐｐｈｉｒｅ ４８８−２００ ＣＤＲＨ）を使用した。各レーザの後に置かれた機械的シャッタ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ，ＳＨ０５及びＳＣ１０）を、照射を制御するために使用した。ビームは、ダイクロイックミラー（ＤＣ、Ｃｈｒｏｍａ、５２５ｄｃｘｒｕ）と組み合わせて、２つの色消しレンズ（Ｅｄｍｕｎｄ、ｆ＝３０ｍｍ、ＮＴ４９−３５２−ＩＮＫ及びＴｈｏｒｌａｂｓ、ｆ＝２００ｍｍ、ＡＣ２５４−２００−Ａ−ＭＬ）から構成されたビーム拡大器を用いて、６．７倍に拡大した。拡大したビームを、法線から２４度傾いたデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ，Ｄｉｇｉｔａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｄ４１００ ＤＬＰ０．５５” ＸＧＡ）に向けて、ＯＮ位置において、マイクロミラーが出力ビームをＤＭＤ面に垂直に傾斜させた。得られた照射パターンの中心次数を、４ｆ構成にアライメントされたビーム縮小器（Ｔｈｏｒｌａｂｓ、ｆ＝７５ｍｍ、ＡＣ２５４−０７５−Ａ−ＭＬ及びｆ＝５０ｍｍ、ＡＣ２５４−０５０−Ａ−ＭＬ）を用いて１．５倍縮小して、ＤＭＤ面が顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＩＸ−８１）内部の１８０ｍｍチューブレンズの後焦点面に再結像させた。これらの要素を、図１４に示す。顕微鏡の左側ポートに入射後、ＤＭＤと照射される試料との間で全体として９０倍縮小するために、ビームは順次、（ｉ）チューブレンズ、（ｉｉ）ダイクロイックミラー（Ｃｈｒｏｍａ、ｚｔ４０５／４８８／５６１）、（ｉｉｉ）６０倍対物レンズ（単一細胞に対して、Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＰｌａｎＡｐｏ、ＮＡ１．４５ＴＩＲＦ、ゼブラフィッシュ及び虫の胚に対して、ＵＰＬＳＡＰＯ ６０ＸＳ、ＮＡ１．３）を通過した。試料における照射は、直径約５０μｍの円形領域をカバーした。
顕微鏡システム

構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）撮像は、左右両側のポートと、追加のＺ方向圧電ステージ（２００μｍ範囲、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ＰＺ−２０００）を備えた自動ＸＹステージとを備えるＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１倒立顕微鏡で行なった。ＤＭＤによって生成されたパターン化励起（例えば、多焦点照射パターン）が、左側ポートから顕微鏡に導入された。照射された試料により放出された蛍光は、対物レンズで収集され、ダイクロイックミラー（Ｃｈｒｏｍａ、ｚｔ４０５／４８８／５６１）で反射され、顕微鏡内部の１８０ｎｍチューブレンズを通過して、ポンプ光を排除するように適切にフィルタ処理され（Ｓｅｍｒｏｃｋ、ＬＰ０２−４８８ＲＥ−２５及びＮＦ０３−５６１Ｅ−２５）、右側ポート上に搭載された科学グレード相補型金属酸化膜半導体（ｓＣＭＯＳ）カメラ（Ｃｏｏｋｅ、ｐｃｏ．ｅｄｇｅ）を用いて検出された。ｓＣＭＯＳを光学軸に沿って正しくアライメントすることが、回折限界に近い性能の達成に重要であった。１０倍のドライ対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＣＰｌａｎＦｌ１０ｘ、０．３ＮＡ）での撮像において、カメラの正確な配置を補助するために、典型的には、軸方向アライメント誤差に対して敏感な光学系である６０倍対物レンズを用いた。固定照射パターン（ＳＩＭで使用するものと同様）を蛍光レーキ試料上に置き、カメラを光学軸に沿って並進させて各照射スポットの見かけのサイズを最小にした。
試料調製

Ｕ２ＯＳ細胞を、エタノール滅菌清浄した＃１．５の２５ｍｍ直径のカバーガラス（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、６４−０７１５）上で、標準的成長媒体（ＤＭＥＭ−ＨＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１９６０）、ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１３６０）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３５０５０）、及び１０％熱不活性化したウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１０８２））中で、培養した。微小管用の試料を染色するために、細胞を、０．５％グルタルアルデヒド、０．３７％ホルムアルデヒド、及び０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の混合物で、細胞骨格緩衝液（ＣＢ、１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１３８ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０１％ＮａＮ３、及び１６０ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ、ｐＨ６．１）中に固定した。固定後、細胞を、ＣＢで洗浄し、１００ｎｍグリシンでクエンチし、ＣＢで洗浄し、抗体希釈緩衝液（ＡｂＤｉｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｎＭＴｒｉｓ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％ＮａＮ３、及び２％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）中でブリックした。一次モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３２−２５００）を、ＡｂＤｉｌ中で２μｇ／ｍＬまで希釈した細胞とともに室温で１時間インキュベートした。一次抗体インキュベーション後、細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄した後、ＡｂＤｉｌ中で１：２００に希釈した二次Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ−１１００１）と共に細胞を１時間インキュベートした。

２色実験のための試料は、固定に先だって製造業者の指示に従って、最初にＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍ−７５１２）で染色した。ミトコンドリア標識後、上記の手順概要を用いて微小管を染色した。全ての試料を、フルオロマウントＧ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｉｓ，１７９８４−２５）内において、標準的２５ｍｍ×７５ｍｍのガラススライド（ＳＰＩｓｕｐｐｌｉｅｄｓ、＃０１２５１−ＡＢ）にマウントし、マニキュア液を用いてシールした。
ａ）サブ回折ビーズ

黄緑色または赤色蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｆ８８０３、１１０ｎｍ直径；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｆ８８０１、１００ｎｍ直径）を、全ての点広がり関数（ＰＳＦ）測定のために使用した。ビーズを、１：１３００（蒸留水中１：２００及びエタノール中１：１３）のストック濃度から希釈し、清浄化したカバーガラス上に広げた。エタノールを蒸発させるために５分間風乾した後、カバーガラスを蒸留水中で２回洗浄して、付着していないビーズを除去した。再び風乾した後、ビーズを、ガラススライド上にフルオロマウントまたはシリコーンオイルでマウントし、マニキュア液でシールした。
ｂ）ゼブラフィッシュ試料

ゼブラフィッシュｄｃｌｋ２−ＧＦＰ導入遺伝子を保有するＴｇ（ＸｌＥｅｆ１ａ１：ｄｃｌｋ２−ＧＦＰ）ｉｏ００８胚を、図１６に示す厚いＭＳＩＭ実験に使用した。この系統を構築するために、導入遺伝子を含むプラスミドを、Ｔｏｌ２ ｍＲＮＡとともに、１細胞ゼブラフィッシュ胚に注入した。蛍光胚を成体まで育てて交配し、ＧＦＰ発現に関して産子をスクリーニングすることによって、生殖系列伝達について選択した。

Ｔｇ（ＸｌＥｄｆ１ａ１：ｄｃｌｋ２−ＧＦＰ）ｉｏ０００８胚を、自然産卵によって収集し、摂氏２８度に維持した。多焦点ＳＩＭシステム２００による撮像の前に、２４ｈｐｆの胚を、胚培地（１リットルｄｄＨ２Ｏあたり６０ｍｇのインスタント海塩（Ｐｅｔｓｍａｒｔ））中の最終濃度６００μＭのトリカイン（Ｓｉｇｍａ、Ｅ１０５２１０）で麻酔した。麻酔した胚を円形カバーガラス上に載せて、１％低融点アガロース（Ｃａｍｂｒｅｘ、５００８０）中に固定し、円形カバーガラスホルダ（ＡＳＩ、Ｉ−３０３３−２５Ｄ）内に配置して、胚培地で覆って室温で撮像した。
データ処理

前述した照明及び顕微鏡システムを使用したＲＡＷ画像取得の後、試料の収集されたＲＡＷ画像の各セットは、プログラミング言語Ｐｙｔｈｏｎで書かれたソフトウェアを有する処理システム２２５を使用して、超分解能画像に処理した。処理システム２２５によって採用された処理ステップは以下の通りであった。（ｉ）照射スポットの個々の位置を精密に決定するための自動格子検出、（ｉｉ）非合焦光を排除するための検出された各照射スポットの周囲のデジタルピンホールマスキング及び較正データを使用した光学的平坦化、（ｉｉｉ）分解能を√２改善するための、局所縮小（例えば、スケーリング）と、各照射スポットの周囲領域の再サンプリング、（ｉｖ）超分解能複合画像を生成するための、処理済みＲＡＷ画像の加算、及び（ｖ）完全２倍の分解能向上を復元するための従来のデコンボリューション技法の使用。これらのプロセスステップは、多焦点ＳＩＭシステム２００の処理システム２２５によって実行される合焦、スケーリング、及び加算動作２１０に関して上記でより詳細に論じられている。

特定の実施形態を図示し説明したが、当業者に明らかなように、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な修正を行い得ることを上記から理解されたい。そのような変更及び修正は、本明細書に添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲及び教示の範囲内である。

Claims (15)

1. 顕微鏡システム（３００）であって、
   単一光ビーム（３０５）を伝送するための光源（３０２）と、
   前記単一光ビーム（３０５）を、少なくとも１つの多焦点パターンを形成するための複数の光ビームに分割するための、第１のマイクロレンズアレイ（３０４）と、
   前記少なくとも１つの多焦点パターンを形成する、前記複数の光ビームを試料上へ走査して、前記試料が前記少なくとも１つの多焦点パターンのそれぞれにより複数の蛍光発光を生成するようにするスキャナ（３０８）と、
   前記少なくとも１つの多焦点パターンのそれぞれに対して、非合焦蛍光発光を遮断し、合焦蛍光発光のピンホールアレイ（３２０）通過を可能とさせる、ピンホールアレイ（３２０）と、
   半分の倍率を有する前記複数の光ビームの非倒立像を生成するための第２のマイクロレンズアレイ（３３２）であって、前記スキャナ（３０８）が前記複数の光ビームの前記非倒立像を再走査する、第２のマイクロレンズアレイ（３３２）と、
   前記走査された非倒立像をキャプチャするためのカメラ（３３８）と、
   を備える顕微鏡システム。
2. 前記第１のマイクロレンズアレイ（３０４）からの前記複数の光ビームを中間ステージ面に合焦させるための、第１と第２の走査レンズ（３０６、３１０）をさらに備える、請求項１に記載の顕微鏡システム（３００）。
3. 前記第１の走査レンズ（３０６）と前記第２の走査レンズ（３１０）は前記中間ステージ面に対して４ｆ構成である、請求項２に記載の顕微鏡システム（３００）。
4. 前記スキャナ（３０８）と前記試料との間に位置し、前記複数の光ビームの中間像面を縮小し、かつ前記試料を横断する前記少なくとも１つの多焦点パターンのそれぞれに対して前記複数の光ビームから励起焦点アレイを形成するための、対物レンズ（３１４）とチューブレンズ構成（３１２）をさらに備える、請求項２に記載の顕微鏡システム（３００）。
5. 前記スキャナ（３０８）はガルバノメトリックミラーを備える、請求項１に記載の顕微鏡システム（３００）。
6. 前記スキャナ（３０８）は第１の走査レンズ（３０６）と第２の走査レンズ（３１０）の間の焦点位置に位置し、前記第１の走査レンズ（３０６）は前記第１のマイクロレンズアレイ（３０４）と前記スキャナ（３０８）との間に位置し、前記第２の走査レンズ（３１０）は前記スキャナ（３０８）と前記試料との間に位置する、請求項１に記載の顕微鏡システム（３００）。
7. 前記ピンホールアレイ（３２０）と前記第２のマイクロレンズアレイ（３３２）の間に位置する、複数のリレーレンズ（３３０、３２２）とミラー（３２４、３２６、３２８）をさらに備える、請求項１に記載の顕微鏡システム（３００）。
8. 前記第１のマイクロレンズアレイ（３０４）と前記第２のマイクロレンズアレイ（３３２）は集束マイクロレンズである、請求項１に記載の顕微鏡システム（３００）。
9. 前記第２のマイクロレンズアレイ（３３２）と前記スキャナ（３０８）との間に位置する第３の走査レンズ（３３４）と、前記スキャナ（３０８）と前記カメラ（３３８）との間に位置する第４の走査レンズ（３３６）とをさらに備える、請求項１に記載の顕微鏡システム（３００）。
10. 前記第２の走査レンズ（３１０）と前記試料面（３１６）との間に位置するダイクロイックミラー（３１８）をさらに備える、請求項１に記載の顕微鏡システム（３００）。
11. 顕微鏡システム（５００）であって、
    単一光ビームを伝送するための光源（５０２）と、
    前記単一光ビームを多焦点パターンを形成する複数の光ビームに分割するための、第１の方向に回転しかつ光軸に沿って位置する、集束マイクロレンズアレイを有する第１の回転ディスク（５０６）と、
    多焦点パターンのそれぞれに対して、前記複数の光ビームの内の非合焦光ビームを遮断し、かつ前記複数の光ビームの内の合焦光ビームを、ピンホールアレイを有する回転ディスク（５０６）を通過させるための、第１の方向に回転しかつ光軸に沿って位置する、ピンホールアレイを有する第２の回転ディスク（５０８）と、
    第１の方向に回転しかつ光軸に沿って位置する、発散マイクロレンズアレイを有する第３の回転ディスク（５１６）と、
    を備え、
    集束マイクロレンズアレイを有する前記第１の回転ディスク（５０６）と、ピンホールアレイを有する前記第２の回転ディスク（５０８）と、発散マイクロレンズアレイを有する前記第３の回転ディスク（５１６）は、相互に同期して回転する、顕微鏡システム（５００）。
12. 発散マイクロレンズアレイを有する前記第３の回転ディスク（５１６）は、集束マイクロレンズアレイを有する前記第１の回転ディスク（５０６）に埋め込まれたマイクロレンズの半分の焦点距離を有するマイクロレンズを有する、請求項１１に記載の顕微鏡システム（５００）。
13. 発散マイクロレンズアレイを有する第３の回転ディスク（５１６）は、集束マイクロレンズアレイを有する前記第１の回転ディスク（５０６）と同数のマイクロレンズを有する、請求項１１に記載の顕微鏡システム（５００）。
14. 発散マイクロレンズアレイを有する前記第３の回転ディスク（５１６）のマイクロレンズは、集束マイクロレンズアレイを有する前記第１の回転ディスク（５０６））と同一空間位置に配置された、請求項１１に記載の顕微鏡システム（５００）。
15. 集束マイクロレンズアレイを有する前記第１の回転ディスク（５０６）と、ピンホールアレイを有する前記第２の回転ディスク（５０８）と、発散マイクロレンズアレイを有する前記第３の回転ディスク（５１６）は、倍率１／２のガリレイ望遠鏡が構成されるように、集束マイクロレンズアレイを有する前記第１の回転ディスク（５０６）と、ピンホールアレイを有する前記第２の回転ディスク（５０８）と、発散マイクロレンズアレイを有する前記第３の回転ディスク（５１６）の焦点距離の差だけ互いに離間している、請求項１３に記載の顕微鏡システム（５００）。