CN112485240B - 一种非接触式空间超分辨相干拉曼光谱成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种突破光学衍射极限的非接触式无标记空间超分辨相干拉曼光谱成像方法。方法通过“泵浦‑耗尽‑探测”的光学测量方式，解决光学衍射效应对空间分辨率的限制，并利用超短脉冲激发相干拉曼过程，结合双光梳“泵浦‑探测”的宽带光谱测量方式，实现空间超分辨成像与宽带相干拉曼光谱测量的统一，最终实现对样品表面的非接触式超分辨相干拉曼光谱成像。
Description
技术领域
本发明涉及拉曼光谱测量与成像领域，尤其涉及一种非接触式空间超分辨相干拉曼光谱成像方法。
背景技术
相干拉曼光谱测量与成像技术是研究分子物理特性、化学反应动态过程、生物微观结构的重要手段，是无标记、高分辨生医成像的技术基础，同时也为工业活动提供了一种非接触式光学检测方法，因此具有极其重要的科学价值与应用前景。
相干拉曼光谱技术主要包括相干反斯托克斯拉曼技术(CARS)和受激拉曼光谱技术(SRS)；其基本原理是通过多光子过程诱发分子的振动能级跃迁，并辐射出频率蓝移的反斯托克斯光(CARS)或引发激发光强度的涨落(SRS)；特点是信号具有极好的时间与空间相干特性。该特点使其探测方向上的拉曼信号强度相对于普通拉曼散射有了数量级的提升，因此相干拉曼技术也是弱信号探测和成像的重要手段。
此外，与检测分子偶极矩变化的红外光谱不同，相干拉曼过程主要基于分子振动时产生的极化率变化，因此在很大程度上不会受到水分子吸收效应的影响，更适合于活体生物细胞(组织)成像诊断和工业过程的光学监测。
相干拉曼光谱与成像技术通过测量分子(或化学键)的拉曼特征谱线(指纹光谱)来实现对目标物质的识别和定性、定量分析。然而，对于复杂分子体系(如生物细胞、DNA)而言，分子或化学键的指纹峰分布情况错综复杂，且在分子间相互作用或环境作用下存在峰位移动的情况，因此通过对单一指纹峰的测量无法准确判断分子的种类、状态及其动态过程。
另一方面，拉曼成像的空间分辨率是决定其在化学、生物医学等领域的应用价值的关键因素。目前的空间超分辨成像主要依赖于荧光标记方法，和基于纳米结构的表面增强拉曼技术。基于荧光标记法的技术主要有受激发射损耗显微镜技术和光激活定位显微镜技术，适用范围有限，且无法提供宽带分子特征光谱信息。基于纳米结构的表面增强拉曼技术可以实现近场超分辨分子成像，但是实施条件苛刻，且探针必需与物质表面接触。这种方式不可避免地增加了样品制备的难度，且对目标样品的选择具有明显地局限性，因此很大程度上限制了其在生物医学研究中的应用。
综上所述，目前的超分辨光学诊断技术难以摆脱对接触式探针或荧光标记物的依赖，且无法做到宽带分子指纹光谱测量与超分辨光学成像的统一。
发明内容：
针对上述现有技术的缺点，提出了一种非接触条件下实现突破光学衍射极限的空间超分辨相干拉曼光谱成像方法。方法通过“泵浦-耗尽-探测”的光学测量方式，解决光学衍射效应对空间分辨率的限制，并利用超短脉冲激发相干拉曼过程，结合双光梳“泵浦-探测”的宽带光谱测量方式，实现空间超分辨成像与宽带相干拉曼光谱测量的统一，最终实现对样品表面的非接触式超分辨相干拉曼光谱成像。
本发明目的实现由以下技术方案完成：
本发明提供了一种非接触式空间超分辨相干拉曼光谱成像方法，利用两台重复频率有微小差别(重复频率差小于1kHz)的飞秒光梳作为光源，其中一台光梳，分成两路，分别作为泵浦光和“耗尽”光，且两路光之间存在延时t；另一台光梳用作探测光。“耗尽”光经过一个相位板，形成空间分布为圆环状的光斑。三束光共线，并通过显微物镜聚焦于待测样品表面；利用“泵浦-耗尽-探测”构架，产生突破光学衍射极限的光斑照亮样品；利用相干拉曼过程，产生波长蓝移的反斯托克斯光；利用双光梳“泵浦-探测”技术，实现相干拉曼光谱的快速测量；利用点扫描的方式，实现样品表面的超分辨高光谱成像。
具体来说：
这里的飞秒光梳光源，是指脉冲重复频率被精确锁定(控制精度优于1MHz)的飞秒锁模脉冲光源(1fs＝10-15s)。光源的光谱宽度全宽(comb)决定了可测量相干拉曼信号的谱宽(Raman＝comb)。脉冲宽度()越小，光谱全宽越宽(comb＝2×0.44/(·c)，以高斯脉冲为例)，则可测拉曼光谱范围越宽。其中，c为真空中光速。
所述的“泵浦-耗尽-探测”测量方式，是指将三束光聚焦于样品表面后，先通过泵浦光梳脉冲激发样品分子的拉曼跃迁，紧接着利用时间间隔为t的环形“耗尽”脉冲通过多光子共振过程使激发光外围的分子回到振动基态，再用探测光脉冲照亮样品表面时，探测光脉冲只会与激发光中心(未被“耗尽”脉冲照射的)高振动能级分子相互作用，产生反斯托克斯光信号。该信号的空间尺寸为泵浦光斑尺寸减去“耗尽”光斑尺寸。由于在显微系统聚焦下泵浦光斑到达衍射极限，因此减去圆环状“耗尽”光斑后，剩下的中心光斑即为突破光学衍射极限的超分辨空间光斑。其中，时间间隔t需小于分子高能振动态的能级寿命，通常在10ps以内。
所述双光梳“泵浦-探测”技术(图2)，是指采用两台重复频率为fr和fr+f的光梳(其中重复频率f差小于1kHz)，分别作为泵浦光(图2中Ⅰ)和探测光(图2中Ⅲ)。泵浦与探测光脉冲的时间延时为N·f/fr2，其中N表示脉冲对的个数。泵浦光梳通过双光子过程激发样品分子的拉曼振动跃迁(跃迁频率为vib)，如图2中Ⅱ所示。分子的振动，引发了样品折射率的改变(如图2中Ⅳ所示)，其变化频率随即被探测光脉冲所感应，并通过多普勒效应发生光频移，其中红移光即相干斯托克斯信号(CRSR)，蓝移光为相干反斯托克斯信号(CARS)。样品折射率的变化导致CRSR和CARS信号的强度调制(图2中Ⅴ)，其调制频率为fmod(＝vib·f/fr)。这种调制在时间域上表现为周期变化的干涉信号，通过雪崩光电二极管探测器探测该干涉信号，并对信号进行傅里叶变换，即可以获得相应的分子能级光谱信息。其测量时间为T，需大于一个调制周期(1/fmod)，通常为微秒量级，因此可以实现对分子样品拉曼特征谱的快速测量。其中，可测量的相干拉曼光谱范围为泵浦光的光谱全宽(单位为光频率)，光谱分辨率为(1/T)·(fr/f)·A，A为傅里叶变换采用的窗口函数，以三角函数窗口为例，A＝1.78。
所述的点扫描方式，是指将样品放置于精度在纳米量级的二维平移台上，通过沿二维轴线步进移动平移台，实现对样品空间位置的扫描成像。其中，每一个位置点对应的是一段宽带相干拉曼光谱。
本发明具有如下有益效果：
1、与传统空间超分辨的拉曼成像技术相比，本发明采用了基于超短光梳脉冲的“泵浦-耗尽-探测”测量方式，可以实现无需荧光标记、非接触式的空间超分辨相干拉曼成像。
2、本发明采用三束光梳脉冲，分别为重复频率为fr的泵浦光，延时为t的“耗尽”光，以及重复频率相差f的探测光，激发样品产生相干拉曼辐射，通过双光梳“泵浦-探测”技术实现对辐射光谱(对应于分子拉曼能级)的测量，实现了空间超分辨成像与宽谱带相干拉曼光谱测量的融合，有助于对多组分、多种类样品成分与空间信息的拾取。
附图说明
图1是“泵浦-耗尽-探测”测量方式的多脉冲相干拉曼原理图
图2是双光梳“泵浦-探测”相干拉曼原理图
图3是本发明的一种对样品分子的非接触式空间超分辨高光谱成像方法的实施例1的装置结构示意图。
图4是本发明的一种对样品分子的非接触式空间超分辨高光谱成像方法的实施例2的装置结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式，其目的仅在于更好地理解本发明的研究内容而非限制本发明的保护范围。
如图1-4所示，图中符号分别表示：a、空间光斑，b、中心分子，c、周围分子，Ⅰ、重复频率为fr的泵浦光梳，Ⅱ、折射率调制，Ⅲ、重复频率为fr+f的探测光梳，Ⅳ、分子振动时域图，Ⅴ、CARS信号，Ⅵ、干涉信号，101、第一光梳光源，102、第二光梳光源，201、第一分束镜，202、第一反射镜，203、相位板，204、延迟线装置，205、第二反射镜，206、第二分束镜，207、第三反射镜，208、第三分束镜，209、双色镜，210、第一聚焦透镜，211、样品，212、短通滤光片，213、第二聚焦透镜，214、雪崩光电二极管探测器，215、第四分束镜。
具体实施如下：
实施例1：第一光梳光源101和第二光梳光源102为两台中心波长为800nm，10fs的激光器(对应傅里叶变换极限光谱全宽，即可测拉曼光谱宽度，为188nm，或2942cm-1)，重复频率分别为100MHz，以及100MHz+10Hz。第一光梳光源101产生的光经过第一分束镜201。其中一路经过第一反射镜202反射，作为泵浦光，另一路经过相位板203，产生环形光斑，并经过延迟线装置204和第二反射镜205，作为与泵浦光的延时为t的“耗尽”光。其中，延迟线装置204包括两面反射镜和一个一维平移台，通过移动一维平移台可以控制泵浦光和“耗尽”光的延时t(＝1ps)。两路光在第二分束镜206处共线，并且第二光梳光源102产生的探测光，经过第三反射镜207在第三分束镜208处与前两路光共线。这三束光以背向探测的方式经过第一聚焦透镜210聚焦，照射到样品211上。样品211置于精度在纳米量级的二维平移台上，通过沿二维轴线步进移动平移台，实现对样品空间位置的扫描成像。在相干拉曼效应作用下，样品产生的反斯托克斯信号被双色镜209反射，通过740nm的短通滤光片212和第二聚焦透镜213，聚焦到雪崩光电二极管探测器214上进行快速成像。
实施例2：第一光梳光源101和第二光梳光源102为两台中心波长为800nm，10fs的激光器，重复频率分别为100MHz，以及100MHz+10Hz，第三光梳光源为一台中心波长为700nm，10fs的激光器，重复频率为100MHz+20Hz。第一光梳光源101产生的光经过第一分束镜201。其中一路经过第一反射镜202反射，作为泵浦光，另一路经过相位板203，产生环形光斑，并经过延迟线装置204和第二反射镜205，作为与泵浦光的延时为t的“耗尽”光。其中，延迟线装置204包括两面反射镜和一个一维平移台，通过移动一维平移台可以控制泵浦光和“耗尽”光的延时t(＝1ps)。两路光在第二分束镜206处共线，并且第二光梳光源102产生的探测光，经过第三反射镜207在第三分束镜208处与前两路光共线。这三束光以背向探测的方式经过第一聚焦透镜210聚焦，照射到样品211上。样品211置于精度在纳米量级的二维平移台上，通过沿二维轴线步进移动平移台，实现对样品空间位置的扫描成像。在相干拉曼效应作用下，样品产生的反斯托克斯信号被双色镜209反射，通过740nm的短通滤光片212，并在第四分束镜215处与第三光梳光源产生的本振光合束，一起经过第二聚焦透镜213，聚焦到雪崩光电二极管探测器214上进行快速多维相干拉曼光谱成像。
显然，本技术领域中的普通技术人员应当认识到，上述实施例仅用于说明本发明，而并非用作对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对上述实施例的变化、变型均不排除在本发明的权利要求书范围之外。
Claims (3)
1.一种非接触式无标记空间超分辨相干拉曼光谱成像方法，其特征在于，利用两台重复频率有微小差别的飞秒光梳光源，产生三路泵浦、耗尽、探测光，其中泵浦、耗尽光脉冲源自同一台光梳，彼此存在延时t，其中，t<10ps，且耗尽光为圆环形光斑；探测光由另一台光梳提供，三束光由显微透镜聚焦于样品表面，泵浦光激发分子的拉曼跃迁，耗尽光使部分受激分子回到基态，探测光对未被耗尽光照射的分子进行相干拉曼探测，产生反斯托克斯光信号，再由高速超灵敏探测器探测，由数据采集卡记录，此时，双光梳泵浦-探测技术的使用，实现相干拉曼光谱的快速测量，最后，通过逐点扫描样品的方式，实现对其表面的多维相干拉曼光谱成像。
2.根据权利要求1所述的一种非接触式无标记空间超分辨相干拉曼光谱成像方法，其特征在于，采用了两台重复频率有微小差别的飞秒光梳光源，其中重复频率f<1kHz，所述飞秒光梳指脉冲重复频率被精确锁定且控制精度优于1MHz的飞秒锁模脉冲光源，同时，两台光梳的输出被分成三路光束，分别是泵浦、耗尽、探测光；泵浦、耗尽光脉冲源自同一台光梳，彼此存在延时t，且耗尽光为圆环形光斑；探测脉冲由另一台光梳提供。
3.根据权利要求1所述的一种非接触式无标记空间超分辨相干拉曼光谱成像方法，其特征在于，泵浦-耗尽-探测测量方式，是指将三束光聚焦于样品表面后，先通过泵浦光梳脉冲激发样品分子的拉曼跃迁，紧接着利用时间间隔为t的环形耗尽脉冲使激发光外围的分子回到振动基态，再用探测光脉冲照亮样品表面时，探测光脉冲只会与激发光中心高振动能级分子相互作用，产生反斯托克斯光信号，所述激发光中心未被耗尽脉冲照射，该信号的空间尺寸为泵浦光斑尺寸减去耗尽光斑尺寸，由于在显微系统聚焦下泵浦光斑到达衍射极限，因此减去圆环状耗尽光斑后，剩下的中心光斑即为突破光学衍射极限的超分辨空间光斑。
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