CN112240880A - 一种实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像方法及装置，包括(1)获得两束同步且相位锁定的第一脉冲光源λ₁和第二脉冲光源λ₂；(2)对第一脉冲光源λ₁进行倍频处理，对经过强度调制后的第二脉冲光源λ₂进行倍频处理，实现将其波长减半并获得第三脉冲激光λ₃和第四脉冲激光λ₄；(3)对第四脉冲激光λ₄进行延迟处理使其与第三脉冲激光λ₃实现时间域匹配，并对时间域匹配的第三脉冲激光λ₃和第四脉冲激光λ₄进行合束处理实现空间域的完全匹配；(4)将合束后的第三脉冲激光λ₃和第四脉冲激光λ₄同时耦合进入单模保偏光纤；(5)对由单模保偏光纤传输的光与样本作用后产生的光信号进行处理，并获得显微图像。本发明实现了空间分辨率的提高。

Description

一种实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像方法及装置

技术领域

本发明属于生物医学及光学成像技术领域，更具体地，涉及一种实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像方法及装置。

背景技术

光学显微成像技术已成为生物医学研究的基石，能够在研究细胞结构探测及功能的同时对感兴趣的细胞或组织具有最小的侵入性。当前，荧光显微镜发展如日中天，基于荧光标记的显微成像技术可以通过对外源标记分子的操控，间接实现包括蛋白质、核酸在内的多种生物分子的特异性超分辨成像。但是过大的荧光蛋白标签会影响生物分子的活性，过宽的荧光谱线限制了多色标记的发展，且荧光的漂白特性未得到很好的解决。因此，急需免标记技术对细胞内活跃的生化反应、代谢活动以及小分子生物代谢产物进行高分辨的精确定位分析。

然而，由于光学衍射极限的限制，能应用于细胞或组织的超高分辨成像技术仍面临巨大挑战。近年来，能够直接探测固有生物分子，产生图像对比度的无标记高分辨显微成像技术有了飞速的发展。包括红外吸收显微镜和自发拉曼散射显微镜在内的无标记分子振动显微镜都可以利用分子固有的化学键振动成像，但是，波长较长的近红外激发光限制了红外吸收显微镜的空间分辨率，较低的成像灵敏度限制了自发拉曼显微镜的成像速度。相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微镜虽然有较高的成像灵敏度，但是受强非共振背景信号的干扰，CARS的光谱不同于自发拉曼光谱，这就导致了光谱的复杂化以及图像解释上的困难，同样限制了检测灵敏度。

随着技术的发展，为了提高成像灵敏度，同时克服非共振背景的干扰，受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering，SRS)显微成像技术逐渐成熟，该技术对生物体的成像速度更快，灵敏度更高。然而，SRS作为一种无标记分子振动成像技术，其空间分辨率一直被限制在300纳米左右。因此，能够突破180纳米传统空间分辨极限的无标记超高分辨光学成像一直是成像领域开拓的重要方向。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像方法及装置，旨在解决无侵入性的免标记光学成像领域，空间分辨率长期限制在300纳米左右，无法对精细结构进行成像的问题。

本发明提供了一种实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像方法，包括下述步骤：

(1)获得两束同步且相位锁定的第一脉冲光源λ₁和第二脉冲光源λ₂，并对所述第二脉冲激光λ₂进行正弦型强度调制；

(2)通过第一晶体对所述第一脉冲光源λ₁进行倍频处理，通过第二晶体对经过强度调制后的第二脉冲光源λ₂进行倍频处理，在保证重复频率且偏振模式不变的条件下，实现将其波长减半并获得同步且相位锁定的第三脉冲激光λ₃和第四脉冲激光λ₄；

(3)对所述第四脉冲激光λ₄进行延迟处理使其与所述第三脉冲激光λ₃实现时间域匹配，并对时间域匹配的第三脉冲激光λ₃和第四脉冲激光λ₄进行合束处理，实现空间域的完全匹配；

(4)将合束后的第三脉冲激光λ₃和第四脉冲激光λ₄同时耦合进入单模保偏光纤，保证两束光绝对的共线性，稳定性以及良好的高斯模式；

(5)由所述单模保偏光纤传输的光与样本作用后产生的光信号进行处理，并获得显微图像。

本发明还提供了一种实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像方法，包括下述步骤：

(1)获得两束同步且相位锁定的第一脉冲光源λ₁和第二脉冲光源λ₂；

(2)对所述第二激光脉冲λ₂进行正弦型强度调制并获得第三脉冲激光λ₃和第四脉冲激光λ₄，其中第三脉冲激光λ₃为零级光，第四脉冲激光λ₄为一级光；

(3)通过第一晶体对第一脉冲激光λ₁进行倍频处理，通过第二晶体对所述第三脉冲激光λ₃进行倍频处理，通过第三晶体对所述第四脉冲激光λ₄进行倍频处理，在保证重复频率且偏振模式不变的条件下实现波长减半，并分别获得同步且相位锁定的第五脉冲激光λ₅、第六脉冲激光λ₆和第七脉冲激光λ₇；

(4)将所述第五脉冲激光λ₅、所述第六脉冲激光λ₆和所述第七脉冲激光λ₇分别耦合进入单模保偏光纤以保证三束激光绝对的共线性，稳定性以及良好的高斯模式；

(5)对经过单模保偏光纤传输的所述第六脉冲激光λ₆和第七脉冲激光λ₇分别进行延迟处理使其均与所述第五脉冲激光λ₅实现时间域匹配；

(6)对时间域匹配的所述第六脉冲激光λ₆涡旋玻片(中心波长为520纳米，高斯基模TEM00，拓扑荷数1，衍射效率90％)进行相位整形并获得涡旋光；

(7)对所述第五脉冲激光λ₅、所述涡旋光和延迟后的第七脉冲激光λ₇进行合束处理，实现空间域的匹配；

(8)将合束后的激光与样本作用后产生的光信号进行处理，并获得显微图像。

其中，第一脉冲光源和所述第二脉冲光源的波长和偏振方向均不同。

在本发明实施例中，第一晶体的中心波长范围为700nm～1100nm切割角为26.1°，采用近红外镀膜。进一步优选地，第一晶体的中心波长为900nm。

在本发明实施例中，第二晶体的中心波长范围为900nm～1100nm切割角为23.3°，采用近红外镀膜。进一步优选地，第二晶体的中心波长为1040nm。

本发明还提供了一种实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像装置，包括：激光光源、声光调制器、第一晶体、第二晶体、时间延迟器、合束器、单模保偏光纤、显微镜和光电收集模块；激光光源用于输出第一脉冲光源和第二脉冲光源；第一晶体的输入端连接至激光光源的第一输出端，第一晶体用于对所述第一脉冲光源进行倍频处理并输出第三脉冲激光；声光调制器的输入端连接至所述激光光源的第二输出端，声光调制器用于对第二脉冲光源进行高频强度调制并输出正弦型开关激光；第二晶体的输入端连接至声光调制器输出端，第二晶体用于对高频调制后的近红外激光进行倍频处理并输出光子能量加倍的可见光范围的第四脉冲激光；时间延迟器的输入端连接至第二晶体的输出端，时间延迟器用于改变第四脉冲激光的光程，进行第三脉冲激光和第四脉冲激光时间域上的相互匹配，并使第四脉冲激光时间域上连续可调，用于受激拉曼光谱成像；合束器的第一输入端连接至第一晶体的输出端，第二输入端连接至时间延迟器的输出端，合束器用于将第三脉冲光源和第四脉冲光源进行合束后实现空间域的完全匹配；单模保偏光纤的输入端连接至所述合束器的输出端，所述单模保偏光纤用于将合束后的脉冲激光进行时域上的展宽、频域上的色散、以及空间域上的高斯整形；显微镜的输入端连接至所述单模保偏光纤的输出端，所述显微镜用于搜索并定位样本上待成像的目标区域，将单模保偏光纤输出的激光聚焦到样本平面并对目标区域进行逐点扫描，输出各点的信号光；光电收集模块用于接收显微镜传出的光信号，将其转化为电信号并将所述电信号转化为图片。

本发明还提供了一种实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像装置，包括：激光光源、声光调制器、第一晶体、第二晶体、第三晶体、第一单模保偏光纤、第二单模保偏光纤、第三单模保偏光纤、第一时间延迟器、第二时间延迟器、螺旋相位板、合束器、显微镜和光电收集模块；激光光源用于输出第一脉冲光源和第二脉冲光源；第一晶体的输入端连接至激光光源的第一输出端，第一晶体用于对第一脉冲光源进行倍频处理并输出第五脉冲光源；声光调制器的输入端连接至激光光源的第二输出端，声光调制器用于对第二脉冲光源进行高频强度调制并输出正弦型开关且开关方向相反的第三脉冲激光和第四脉冲激光；第二晶体的输入端连接至声光调制器输出端，第二晶体用于对第三脉冲激光进行倍频处理并输出光子能量加倍的可见光范围的第六脉冲激光；第三晶体的输入端连接至声光调制器输出端，第三晶体用于对第四脉冲激光进行倍频处理并输出光子能量加倍的可见光范围的第七脉冲激光；第一单模保偏光纤的输入端连接至第一晶体的输出端，第一单模保偏光纤用于引入线性啁啾，并保证第五脉冲激光在时域上的展宽、频域上的色散以及空间域上的高斯整形；第二单模保偏光纤的输入端连接至第二晶体的输出端，第二单模保偏光纤用于引入线性啁啾，并保证第六脉冲激光在时域上的展宽、频域上的色散以及空间域上的高斯整形；第三单模保偏光纤的输入端连接至第三晶体的输出端，第三单模保偏光纤用于引入线性啁啾，并保证第七脉冲激光在时域上的展宽、频域上的色散以及空间域上的高斯整形；第一时间延迟器的输入端连接至第二单模保偏光纤的输出端，第一时间延迟器用于保证第六脉冲激光和第五脉冲激光在时间域的完全匹配；第二时间延迟器的输入端连接至第三单模保偏光纤的输出端，第二时间延迟器用于保证第七脉冲激光和第五脉冲激光在时间域的完全匹配；螺旋相位板的输入端连接至所述第一时间延迟器的输出端，螺旋相位板用于将第六脉冲激光整形为涡旋光；合束器的第一输入端连接至第一单模保偏光纤的输出端，合束器的第二输入端连接至螺旋相位板的输出端，合束器的第三输入端连接至第二时间延迟器的输出端，合束器用于保证第五脉冲激光，第六脉冲激光和第七脉冲激光在空间域的完全匹配；显微镜的输入端连接至所述合束器的输出端，所述显微镜用于将合束后的激光聚焦于样本平面，并采用点扫描的方式采集聚焦平面的信号；光电收集模块用于接收显微镜传输的光信号，将其转化为电信号并将所述电信号转化为图片。

更进一步地，第一脉冲光源和第二脉冲光源的波长和偏振方向均不同；第三脉冲光源和第四脉冲光源同步且相位锁定。

其中，第一晶体的中心波长范围为700nm～1100nm切割角为26.1°，镀近红外增透膜，增加光的利用率。进一步优选地，第一晶体的中心波长为900nm。

其中，第二晶体的中心波长范围为900nm～1100nm切割角为23.3°，镀近红外增透膜。进一步优选地，第二晶体的中心波长为1040nm。

更进一步地，时间延迟器包括：一对夹角为90°的可见光镀膜反射镜与一个移动方向与入射激光同向的电动位移平台，所述反射镜用于反射入射光，并保证出射光的方向与入射光呈180°夹角；所述电动位移平台用于沿入射光或出射光方向连续可调地移动反射镜对，在改变光程的同时，保证出射光的指向性不变。

更进一步地，单模保偏光纤的长度范围为0.2米～0.5米；进一步优选地，单模保偏光纤的长度可以设置为0.3米长的单模保偏光纤，0.3米的光纤长度使两束激光有了不同程度的色散，在时域上被展宽，并产生相互匹配的啁啾系数，保证了超光谱成像的光谱分辨率。

本发明在原有的正向调制光上叠加反向调制光，达到让信号消失的目的；通过这个原理将反向调制光整型为涡旋光，就可以达到如下目的：样本上的聚焦光斑外围的信号消失，中心的信号保留，从而缩小有效聚焦光斑的体积，实现超分辨成像。

本发明通过双波长倍频技术使成像所使用的激发光波长减半，实现空间分辨率的提高，并进一步基于调制补偿的方法，抑制样本平面上的焦点外围信号，减小了有效光斑体积，进一步提高横向分辨率，并首次实现了横向分辨率接近60纳米的近共振增强的无标记受激拉曼散射显微成像技术，其图像衬度直接来源于毫摩尔量级的低浓度的内源性生物分子。另外，该系统的成像灵敏度相比传统受激拉曼显微镜提高了约23倍，使小范围内(小于100纳米)的化学分析成为可能。

附图说明

图1为本发明的近共振可见光受激拉曼原理图，其中(a)为可见光近共振受激拉曼能级图，(b)为高分辨受激拉曼原理图，(c)为焦点的有效点扩散函数示意图，(d)为高分辨受激拉曼成像探测原理图。

图2为本发明的高分辨受激拉曼显微成像装置，其中(a)为高分辨受激拉曼成像装置示意图，(b)为三维扫描成像原理图。

图3为本发明提供的高分辨受激拉曼显微成像装置的结构示意图。

图4为本发明的超分辨受激拉曼显微成像装置，其中(a)为高分辨受激拉曼成像装置示意图，(b)为调制补偿原理图。

图5为本发明提供的超分辨受激拉曼显微成像装置的结构示意图。

图6为本发明提供的显微成像装置中显微镜的结构示意图。

图7为本发明提供的显微成像装置中光电收集模块的结构示意图。

图8为本发明提供的骨肉瘤细胞高分辨成像图，其中(a)为传统受激拉曼成像图，(b)为高分辨受激拉曼成像图，(c)为分辨率分析结果。

图9为本发明提供的细胞与组织的超分辨三维成像，其中(a)为海拉细胞三维扫描成像截面，(b)为脑组织中神经纤维束的三维成像。

图10为本发明提供的大范围脑组织高分辨高光谱受激拉曼显微成像图，其中(a)为鼠脑组织切片图，(b)为高分辨脑片成像图，(c)为脑片中不同成分的化学分析谱，(d)为大范围脑片的高分辨成像图。

图11为本发明提供的石墨烯的超分辨受激拉曼显微成像图，其中(a)为传统受激拉曼成像图，(b)为超分辨受激拉曼成像图，(c)(d)分别为(a)(b)的放大图，(e)为分辨率分析结果。

图12为本发明提供的集成电路的超分辨受激拉曼显微成像图，其中(a)为传统受激拉曼成像图，(b)为超分辨受激拉曼成像图，(c)为分辨率分析结果，(d)为芯片的三维结构。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限于本发明。

本发明提出的实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像方法，基于BBO(偏硼酸钡)晶体倍频以及调制补偿的可见光波段受激拉曼成像实现了横向分辨率接近60纳米的近共振增强无标记显微成像，填补了无标记超分辨显微成像领域的空白。

为实现上述目的，本发明提供的实现近共振增强无标记超分辨显微成像方法，包括以下步骤：

(1)激光器输出两束同步或相位锁定的脉冲光源λ₁、λ₂，其中λ₁和λ₂代表有着不同波长和偏振方向的两束光脉冲；

(2)激光λ₁和λ₂分别经过晶体BBO₁(中心波长为900nm，切割角26.1°，近红外镀膜)和BBO₂(中心波长为1040nm，切割角23.3°，近红外镀膜)倍频，在保证重复频率，偏振模式不变的条件下，将波长减半，得到两束同步且相位锁定的脉冲激光λ₃、λ₄，其中λ₃、λ₄分别为λ₁和λ₂波长的一半；

(3)其中一束脉冲激光λ₄配有时间延迟器。该时间延迟器由一对夹角为90°的可见光镀膜反射镜与一个移动方向与入射激光同向的电动位移平台组成。通过该装置，进行两束激光λ₃和λ₄的时域匹配，并经声光/电光调制器等进行强度调制；

(4)脉冲激光λ₃和脉冲激光λ₄经含有低通二向色镜的合束器达到空间域的完全匹配；

(5)合束后的脉冲激光λ₃和脉冲激光λ₄同时耦合进入0.3米长的单模保偏光纤，以保证两束光绝对的共线性，稳定性以及较好的高斯模式。0.3米的光纤长度使两束激光有了不同程度的色散，在时域上被展宽，并产生相互匹配的啁啾系数，保证了超光谱成像的光谱分辨率；

(6)利用单模保偏光纤引入线性啁啾，建立了一套基于光谱聚焦方法的高光谱SRS显微成像装置；

(7)光与样本作用后的光信号经光电二极管采集后，经由锁相放大器解调并放大，并产生数字信息。该信息进一步经过数字采集卡采集并输入电脑，经Labview程序处理后，形成最终图像；

(8)样本分子被光子能量更高的激光激发时，拉曼散射截面变大，成像灵敏度相比传统SRS显微镜有较大提高；

在本发明实施例中，当样本未经标记处理时，两束脉冲激光激发样本中内源分子发出信号。当样本经过荧光染料处理时，两束脉冲激光激发样本中外源标记物中分子的信号。只有两束脉冲激光λ₁、λ₂同时作用时才可激发样本。

在本发明实施例中，当样本吸收峰与激发波长接近时，两束脉冲激光激发样本的瞬态吸收信号。只有两束脉冲激光λ₁、λ₂同时作用时才可激发样本。

在本发明实施例中，受激拉曼显微镜的空间分辨率由激光波长以及物镜数值孔径决定。脉冲光源可进行三倍频或四倍频等，物镜的数值孔径可大于1.49。

在本发明实施例中，超分辨受激拉曼显微镜成像模式包括受激拉曼散射(SRS)成像、相干反斯托克斯拉曼(CARS)成像、泵浦探针(Pump-probe)成像、瞬态吸收(TA)成像、光声成像(PAI)、单色双光子荧光(TPF)成像、双色双光子荧光(2C2P-TPF)成像、双光子吸收(TPA)成像、二次谐波(SHG)成像、三次谐波(THG)成像、激发态吸收(ESA)成像、受激辐射(SE)成像以及基态损耗(GSD)成像。

基于上述方法，本发明还提出了一种基于调制补偿原理，利用与斯托克斯光调制方向相反的涡旋光消减样本平面上焦点外围的信号，减小有效光斑体积，并实现超分辨的受激拉曼成像的系统。其特殊之处在于，一束斯托克斯光经涡旋相位板整形为涡旋光，并被施加与原有斯托克斯光方向相反的强度调制，实现样本上焦点外围的调制补偿，使焦点外围的受激拉曼信号无法被解调，进而不能被探测，从而达到缩小有效光斑体积的目的，实现超分辨成像。

在本发明实施例中，超分辨受激拉曼成像的横向分辨率由焦点光斑的束腰半径决定；采用二维激光扫描实现超分辨受激拉曼二维成像；光电收集系统包括聚光镜，探测器，所述探测器采用光电二极管；结合光学调制和锁相放大技术对信号进行放大。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

(1)本发明提供的一种基于光学倍频和调制补偿的空间分辨率接近60纳米的无标记可见光受激拉曼显微成像方法，其高分辨率图像的对比度直接来源于毫摩尔量级的低浓度内源性生物分子，可以直接对天然生物分子成像。

(2)本发明所使用激发光源的光子能量增强了一倍，基于激发光子能量的提高，受激拉曼过程中的虚态能量接近电子跃迁能量，发生了近共振效应，拉曼散射截面变大，从而提高了受激拉曼效应对内源性生物分子探测的灵敏度。更高的成像灵敏度使对无标记的细胞和组织中毫摩尔量级的低浓度内源生物分子的高分辨成像成为可能。并可以绘制精确的三维分子图谱，根据丰富的拉曼光谱跟踪活细胞和生物体中的分子动态。可以在病理检测方面对组织中包括在内的低浓度小分子代谢产物进行观测，鉴定肿瘤边界，帮助医生进行精确的手术导航。

(3)本发明利用光纤纤芯的熔融石英材料在可见光波段的高色散效应，实现了基于光纤的高光谱成像。基于光纤的光谱聚焦技术实现了在完整组织中小于200纳米的微小范围内进行基于拉曼光谱的化学分析，实现了光学成像在医学领域的进一步应用。

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。为了更清楚的说明本发明的实用意义，在具体实施例里，所举的例子为常用且较佳的方案，但是并不局限于此。

本发明提出的一种实现近共振的无标记超分辨受激拉曼显微成像方法；近共振原理如图1(a)所示。当激发光能量靠近分子跃迁能量时，发生近共振拉曼效应，此时的拉曼散射截面更强，散射效率更高。在采用近红外激光驱动相干拉曼跃迁的近红外光受激拉曼显微镜中，中间虚态与生物分子的电子激发态能量相差较远。相比较而言，在由可见激光驱动的近共振受激拉曼跃迁中，虚态能量更加接近电子激发态能量，对于C-H键而言，相干跃迁效率在理论上提高了约50倍。

高分辨受激拉曼原理如图1(b)所示，两束激发光λ₁和λ₂分别经过晶体BBO₁(中心波长为900nm，切割角26.1°，近红外镀膜)和BBO₂(中心波长为1040nm，切割角23.3°，近红外镀膜)倍频，在保证重复频率，偏振模式不变的条件下，将波长减半，得到两束同步且相位锁定的脉冲激光λ₃、λ₄，用于激发样本。焦点的有效点扩散函数如图1(c)所示，通用地，焦点处有效点扩散函数(PSF)半高宽由以下公式计算：

其中λ_em表示可见光SRS激发光的波长卷积，N.A.表示物镜数值孔径。通过使用可见波段的激发光(450nm&520nm)以及高数值孔径(1.49)的油浸物镜，基于激发波长的缩短以及物镜数值孔径的增加，有效PSF半高宽可由传统的～300纳米提高到～100纳米。

高分辨受激拉曼成像探测原理如图1(d)所示，为了探测高分辨受激拉曼散射信号，斯托克斯光经过胜过调制器后实现约2兆赫兹的高频强度调制，通过光电二极管探测泵浦光的光强信号后转换为电信号，进一步经锁相放大器解调，探测到受激拉曼损耗过程中引起的光强变化，该电信号被数字采集卡采集后，输出到电脑并获得最终图像。

激光光源是显微成像装置的重要组成部分，激光光源应具有两路以上输出，其中至少一路输出波长可调，但是还未有可见光或波长更短的商用双输出飞秒激光器可供使用。通过BBO晶体对激光光源进行倍频后，可以达到130纳米或更高的空间分辨率。为了保证受激拉曼信号强度，输出脉冲宽度应小于10皮秒。与皮秒激光相比，飞秒激光的光谱里含有更加丰富的频率成分，是实现高光谱成像的理想光源。以飞秒光源为例，激光器输出两束脉宽约100飞秒的同步光源，经BBO晶体倍频以及光纤展宽后，时间脉宽为1皮秒左右。为了在避免低频噪声的影响的同时保证成像速度，激光光源重复频率应大于2兆赫兹，以便采用高频调制的方式探测激光能量的微弱变化量。用于实现高频调制的器件通常有声光调制器和电光调制器。实验中使用光电二极管和锁相放大器的组合来探测并解调出激光能量的变化。显微成像装置可以选择使用正置或倒置显微镜，扫描器件可以选择检流计振镜，也可以使用快速的共振振镜。

由于SRS图像是基于生物分子固有分子振动的成像，应用SRS高分辨技术观察到的细胞精细结构与荧光超分辨方法看到的散点结构不同，更容易观察到整体而连贯的细胞结构。和其它多光子成像技术相似，SRS效应只发生在两束光重叠的地方，这种非线性效应带来了天然的三维(3D)层析成像能力，免除了现有超分辨显微镜所受到背景荧光的强烈干扰，无需在光路中加针孔，就可以对未经标记的临床组织进行分子水平的高分辨断层成像。通过轴向扫描物镜，可以获得样本的三维信息。

采用激光扫描成像，显微成像方法包括：

(1)激光器输出两束具有相同重复频率，相同相位且时间同步的脉冲激光λ₁、λ₂；

(2)脉冲激光λ₁、λ₂分别经过BBO晶体倍频后，产生两束波长更小，且具有相同重复频率、相位和偏振的同步脉冲激光λ₃、λ₄。脉冲λ₃、λ₄经物镜聚焦后激发样本时，只有焦点区域产生受激拉曼信号。双波长成像系统的横向分辨率取决于两束激发波长和物镜的数值孔径。此外，对于SRS效应而言，由于非线性效应仅在焦斑中心产生，符合激发强度的二次依赖关系，因此空间分辨率增加了

倍。根据Rayleigh判据，可见光SRS系统的空间分辨率可描述为

其中λ_em表示可见光受激拉曼的激发光波长，N.A.是物镜的数值孔径。因此可以通过改变激发波长或物镜的数值孔径实现横向分辨率的选择。对于C-H分子键成像，可以将1040纳米的飞秒激光倍频至520纳米，将900纳米的激光倍频至450纳米，对应的拉曼位移在～3000波数，同时采用高功率油浸物镜(N.A.1.49)，系统的理论空间分辨率可达130纳米；

(3)为了增强受激拉曼显微成像装置的灵敏度，可以选择采用高频调制，使信号中掺杂的噪声接近散粒噪声极限。将光源发出的其中一束飞秒脉冲λ₂经过声光调制器或电光调制器，并产生～2兆赫兹正弦调制。用光电二极管的共振电路检测的另一束飞秒激光λ₁的增量，该电路可选择性的放大与λ₂调制频率相同的信号。为了增大二极管的饱和功率，应为其装配有高压反向偏置电压。光电二极管输出的交流信号通过数字锁相放大器解调，最终由数据采集卡完成采集，并用于重建图像；

(4)将脉冲激光λ₄经过时间延迟器，通过调节精度为0.1～10微米的直线电机或者音圈驱动控制移动平台，实现与脉冲激光λ₃之间的相对时间调节；

(5)受激拉曼成像具有基于拉曼特征光谱的分子靶向能力。光路系统中引入的单模保偏光纤将脉宽为±5纳米，带宽分别为100飞秒和220飞秒的泵浦激光以及斯托克斯激光同时在时间上展宽，如图2(a)。当改变脉冲激光λ₄的时间延迟时，两束激光在时域上的重合发生改变，所对应的拉曼位移Ω也随之改变。通过扫描时间延迟，可以获取不同波数下的受激拉曼图像，从而实现高光谱受激拉曼成像，对图像中不同生物分子同时进行特异性成像，获取它们的空间与时间分布。

(6)两束脉冲激光λ₃和λ₄经过一根短的单模保偏光纤实现空间域上的重叠后，进入正置或倒置显微镜。在显微镜中，可以经过二维振镜实现X，Y平面扫描，也可以通过振镜进行X轴扫描，通过样本台进行Y轴扫描，结合压电陶瓷轴向扫描物镜，实现三维成像，如图2(b)所示。

如图3所示，本发明实施例提供的实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像装置包括：激光光源、声光调制器、第一晶体、第二晶体、时间延迟器、合束器、单模保偏光纤、显微镜和光电收集模块；激光光源用于输出第一脉冲光源和第二脉冲光源；第一晶体的输入端连接至激光光源的第一输出端，第一晶体用于对第一脉冲光源进行倍频处理并输出第三脉冲光源；声光调制器的输入端连接至激光光源的第二输出端，声光调制器用于对第二脉冲光源进行高频强度调制，调制并输出频率为2兆赫兹的正弦型开关激光；第二晶体的输入端连接至声光调制器输出端，第二晶体用于对高频调制后的近红外激光进行倍频处理并输出光子能量加倍的，可见光范围的激光；时间延迟器的输入端连接至第二晶体的输出端，时间延迟器用于改变斯托克斯光的光程，进行泵浦光和斯托克斯光时域上的相互匹配，并输出光程连续可调的第四脉冲光源，用于受激拉曼光谱成像；合束器的第一输入端连接至第一晶体的输出端，第二输入端连接至时间延迟器的输出端，合束器用于将第三脉冲光源和第四脉冲光源进行合束后实现空间域的完全匹配；单模保偏光纤的输入端连接至合束器的输出端，单模保偏光纤用于将合束后的脉冲光源进行时域上的展宽，频域上的色散，以及空间域上的高斯整形，并传输给显微镜；显微镜的输入端连接至单模保偏光纤的输出端，显微镜用于搜索并定位样本上待成像的目标区域，通过物镜，将单模保偏光纤输出的激光聚焦到样本平面，并通过振镜对目标区域进行逐点扫描，并将各点的信号光传输给光电收集模块；光电收集模块用于接收显微镜传出的光信号，通过光电二极管将光信号转化为电信号，并通过共振放大电路放大该信号，所获得的电信号传输给数字锁相放大器，经由数字锁相放大器解调后的电信号输入到数字采集卡，并转化为数字信号输入电脑。最终，在电脑端与振镜同步的Labview采集程序将数字信号转化为图片。

在本发明实施例中，还可以通过去调制焦点外围信号实现超分辨受激拉曼显微成像，具体实施方法如图4(a)所示，具体包括以下步骤：

(1)激光器输出两束同步或相位锁定的脉冲光源λ₁、λ₂，其中λ₁和λ₂代表不同特性的两束脉冲激光；

(2)脉冲激光λ₂经声光调制器进行调制频率为2兆赫兹的强度调制，得到脉冲激光λ₃和λ₄，其中λ₃为零级光，λ₄为一级光；

(3)三束激光λ₁、λ₃和λ₄分别经过晶体BBO₁(中心波长为900nm，切割角26.1°，近红外镀膜)，BBO₂(中心波长为1040nm，切割角23.3°，近红外镀膜)和BBO₃(中心波长为1040nm，切割角23.3°，近红外镀膜)倍频，在保证重复频率，偏振模式不变的条件下，将波长减半，得到三束同步且相位锁定的脉冲激光λ₅、λ₆和λ₇；

(4)脉冲激光λ₅、λ₆和λ₇分别耦合进入单模保偏光纤，以保证激光的稳定性以及较好的高斯模式；

(5)脉冲激光λ₆和λ₇配有时间延迟器，进行三束激光的时域匹配。该时间延迟器由一对夹角为90°的可见光镀膜反射镜与一个移动方向与入射激光同向的电动位移平台组成；

(6)脉冲激光λ₆经过涡旋玻片(使用波长为520纳米，高斯基模TEM00，拓扑荷数1，衍射效率90％)产生涡旋光；

(7)经含有低通二向色镜的合束器后，脉冲激光λ₅、λ₆和λ₇达到时域和空间域的完全匹配；

(8)利用单模保偏光纤引入线性啁啾，建立了一套基于光谱聚焦方法的高光谱SRS显微成像装置；

(9)只有两束脉冲激光λ₃和λ₄在空间和时间同时重叠时才能产生信号，信号经锁相放大后，提供图像信息；

(10)通过物镜扫描模块改变物镜的高度，实现扫描聚焦平面的改变，实现三维堆栈扫描。

实现超分辨的原理为，在成像焦点处，利用脉冲激光λ₆经过涡旋玻片产生的反调制涡旋光补偿λ₇的正调制，实现调制补偿，从而使焦点外围信号无法被探测，如图4(b)所示。

如图5所示，本发明实施例提供的实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像装置包括：激光光源、声光调制器、第一晶体、第二晶体、第三晶体、第一单模保偏光纤、第二单模保偏光纤、第三单模保偏光纤、第一时间延迟器、第二时间延迟器、螺旋相位板、合束器、显微镜和光电收集模块；其中，激光光源用于输出第一脉冲光源和第二脉冲光源；第一晶体的输入端连接至激光光源的第一输出端，第一晶体用于对第一脉冲光源进行倍频处理并输出第五脉冲光源；声光调制器的输入端连接至激光光源的第二输出端，声光调制器用于对第二脉冲光源进行高频强度调制并输出正弦型开关且开关方向相反的第三脉冲激光和第四脉冲激光；第二晶体的输入端连接至所述声光调制器输出端，第二晶体用于对第三脉冲激光进行倍频处理并输出光子能量加倍的可见光范围的第六脉冲激光；第三晶体的输入端连接至声光调制器输出端，第三晶体用于对第四脉冲激光进行倍频处理并输出光子能量加倍的可见光范围的第七脉冲激光；第一单模保偏光纤的输入端连接至第一晶体的输出端，第一单模保偏光纤用于引入线性啁啾，并保证第五脉冲激光在时域上的展宽、频域上的色散以及空间域上的高斯整形；第二单模保偏光纤的输入端连接至第二晶体的输出端，第二单模保偏光纤用于引入线性啁啾，并保证第六脉冲激光在时域上的展宽、频域上的色散以及空间域上的高斯整形；第三单模保偏光纤的输入端连接至所述第三晶体的输出端，第三单模保偏光纤用于引入线性啁啾，并保证第七脉冲激光在时域上的展宽、频域上的色散以及空间域上的高斯整形；第一时间延迟器的输入端连接至第二单模保偏光纤的输出端，第一时间延迟器用于保证第六脉冲激光和第五脉冲激光在时间域的完全匹配；第二时间延迟器的输入端连接至第三单模保偏光纤的输出端，第二时间延迟器用于保证第七脉冲激光和第五脉冲激光在时间域的完全匹配；螺旋相位板的输入端连接至第一时间延迟器的输出端，螺旋相位板用于将第六脉冲激光整形为涡旋光；合束器的第一输入端连接至所述第一单模保偏光纤的输出端，合束器的第二输入端连接至螺旋相位板的输出端，合束器的第三输入端连接至第二时间延迟器的输出端，合束器用于保证第五脉冲激光，第六脉冲激光和第七脉冲激光在空间域的完全匹配；显微镜的输入端连接至所述合束器的输出端，显微镜用于将合束后的激光聚焦于样本平面，并采用点扫描的方式采集聚焦平面的信号；光电收集模块用于接收显微镜传输的光信号，将其转化为电信号并将所述电信号转化为图片。

该超分辨受激拉曼显微成像装置的工作过程如下：

(1)获得两束同步且相位锁定的第一脉冲光源λ₁和第二脉冲光源λ₂；

(2)声光调制器对所述第二激光脉冲λ₂进行正弦型强度调制，并获得第三脉冲激光λ₃和第四脉冲激光λ₄，其中第三脉冲激光λ₃为零级光，第四脉冲激光λ₄为一级光；

(3)第一脉冲激光λ₁、第三脉冲激光λ₃和第四脉冲激光λ₄分别经过第一晶体BBO₁(中心波长为900nm，切割角26.1°，镀近红外增透膜)，第二晶体BBO₂(中心波长为1040nm，切割角23.3°，镀近红外增透膜)和第三晶体BBO₃(中心波长为1040nm，切割角23.3°，镀近红外增透膜)进行倍频处理，在保证重复频率且偏振模式不变的条件下，实现波长减半，并获得同步且相位锁定的第五脉冲激光λ₅、第六脉冲激光λ₆和第七脉冲激光λ₇；

(4)第五脉冲激光λ₅、第六脉冲激光λ₆和第七脉冲激光λ₇分别耦合进入单模保偏光纤，以保证三束激光绝对的共线性，稳定性以及良好的高斯模式；

(5)对第六脉冲激光λ₆和第七脉冲激光λ₇进行延迟处理使得其均与所述第五脉冲激光λ₅实现时间域匹配；

(6)第六脉冲激光λ₆经过涡旋玻片(使用波长为520纳米，高斯基模TEM00，拓扑荷数1，衍射效率90％)进行相位整形，并获得涡旋光；

(7)对第五脉冲激光λ₅、第六脉冲激光λ₆和第七脉冲激光λ₇进行合束处理，实现空间域的匹配；

(8)光与样本作用后的光信号经光电二极管采集后，经由锁相放大器解调并放大，并产生数字信息，对所述数字信息进行处理后获得图像。

如图6所示，显微镜包括扫描振镜、物镜和聚光镜，其中，显微镜的输入端连接至单模保偏光纤的输出端，显微镜用于搜索并定位样本上待成像的目标区域，通过物镜将单模保偏光纤输出的激光聚焦到样本平面，并通过振镜对目标区域进行逐点扫描，并将各点的信号光传输给光电收集模块。

如图7所示，光电收集模块包括：光电二极管、锁相放大器、声光调制器、数据采集卡和数据处理模块，光电二极管的输入端连接至所述显微镜的输出端，锁相放大器的第一输入端连接至光电二极管的第一输出端，锁相放大器的第二输入端连接至声光调制器的输出端，数据采集卡的第一输入端连接至光电二极管的第二输出端，数据采集卡的第二输入端连接至锁相放大器的输出端，数据处理模块的输入端连接至数据采集卡的输出端；工作时，通过光电二极管将光信号转化为电信号，所获得的电信号经由锁相放大器解调后输入至数字采集卡，并转化为数字信号输入数据处理模块，在数据处理模块中与振镜同步的Labview采集程序将数字信号转化为图片。

为了更进一步的说明本发明实施例提供的显微成像方法及装置，现结合具体实例详述如下：

实施例一：无标记神经元的高分辨成像

对于受激拉曼成像，当两束激光的频率差Δω与分子振动频率匹配时，分子跃迁速率被激发，拉曼信号得到受激放大。通过改变激发波长或光谱聚焦方法等，可以实现对C-H键，C＝C键等不同分子键的成像。以激光波长为520nm&450nm为例，通过光谱聚焦技术可以实现2800～3050cm^-1范围的化学成像，其中包括C-H₂分子键、C-H₃分子键、＝C-H分子键。

图8(a)展示了通过传统基于近红外激光的受激拉曼显微镜获得的培养骨肉瘤细胞的图像。图8(b)展示了本发明基于可见激光的受激拉曼显微镜获得的骨肉瘤细胞的图像，该图像在对比度和空间分辨率方面都发生了显著的改善。图中展示了骨肉瘤细胞的精细结构，细胞核外的网状结构清晰可见。如图8(b)所示，由于脂滴中含有大量的C-H分子键，所以信号较其它部位强。8(c)展示了细胞中一滴脂滴的放大图和相应的强度曲线。经高斯拟合后得到，该脂滴大小为113纳米，和理论相符。

实施例二：无标记细胞与组织的原位三维高光谱成像

基于非线性效应，受激拉曼显微镜具有天然的光学切片成像能力。通过振镜扫描采集完一个XY层面之后，同步调节物镜Z轴高度，对下一平面进行成像。图9(a)为人源宫颈癌细胞(海拉细胞)的高分辨三维图像中不同高度下的横切面展示。细胞外形、核膜以及核仁的三维结构得到了清晰的呈现。图9(b)为脑组织的三维立体图像，该发明具有直接组织成像的能力。

本实施例二与实施例一的区别在于三维成像技术的应用。

实施例三：脑组织的大范围高分辨高光谱受激拉曼显微成像

由于消除离焦荧光背景的困难，完整组织的高分辨率成像对于荧光显微镜来说非常具有挑战性，但该问题不存在于受激拉曼显微镜。图10为未经处理的高分辨率C57小鼠脑组织成像结果。

图10(b)与图10(c)为小鼠脑组织切片的超光谱高分辨SRS成像。基于分辨率的提高，该发明可以在<200纳米的成像区域内对样本进行化学分析。如图10(d)，所成像的长条区域覆盖了皮层、海马区等脑区。

在可见光受激拉曼成像中，轴突在横截面上表现为直径约1微米的封闭圆圈，在纵截面上表现为两条平行曲线。如图10(d)，神经网络由交叉的纤维束组成，在海马区，轴突纤维束在各个方向的密度都非常大。我们可以从形态学或者信号大小的角度轻松分辨不同脑区间的分界线。

本实施例三与实施例一、实施例二的区别在对样本极小区域的化学分析以及大范围成像。

实施例四：二维材料的超分辨泵浦-探针成像

常用的一维或二维的材料也可以进行超分辨泵浦-探针成像，比如碳纳米管、硅纳米线、石墨烯等。超快激光瞬态吸收技术可以用于研究物质超快过程中的能量转移、化学键的生成与断裂、电荷转移、原子价电子的电离、构型、驰豫等。超快激光泵浦-探针技术是通过调节泵浦光脉冲和探针光脉冲到达样品的时间间隔，在不同的探测光脉冲相对于泵浦光脉冲的延迟时间的条件下，记录探测光通过样品后的光强度的变化情况，从而研究被激发样品的光学参量随延迟时间变化的规律。通过这种方式，泵浦-探测成像可以很好的记录材料的二维成像以及超快时间分辨的吸收光谱。图11显示了石墨烯的二维成像，展示了超分辨前、后的对比图像，具体地，(a)为传统受激拉曼成像图，(b)为超分辨受激拉曼成像图，(c)、(d)分别为(a)、(b)的放大图，(e)为分辨率分析结果。

本实施例四与实施例一、二、三的区别在超分辨成像手段。

实施例五：集成电路的超分辨成像

对于尺寸在几个纳米到几百纳米范围的集成电路，我们使用图5中的超分辨成像系统，可以很好的研究集成芯片的内部结构。由于工艺的要求，集成芯片一般是由底层的硅层以及上方的多层铜结构构成，通过该方法可以清晰的观察到芯片下方的硅的瞬态吸收信号以及上方铜由于光热现象产生的瞬态吸收信号。通过振镜扫描采集完一个层面之后，同步调节物镜的高度，对下一平面进行成像，可以观察到芯片整个的三维结构，同时可以对芯片内部走线的通断进行实时的表面检测。图12(a)～图12(b)为芯片内部铜的超分辨前后的对比结构，图12(c)为对应的分辨率大小，图12(d)为芯片的三维结构图像。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡任何背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置换方式，都包含在本发明要求的保护范围。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)获得两束同步且相位锁定的第一脉冲光源λ₁和第二脉冲光源λ₂，并对所述第二脉冲激光λ₂进行正弦型强度调制；

(2)通过第一晶体对所述第一脉冲光源λ₁进行倍频处理，通过第二晶体对经过强度调制后的第二脉冲光源λ₂进行倍频处理，在保证重复频率且偏振模式不变的条件下，实现将其波长减半并获得同步且相位锁定的第三脉冲激光λ₃和第四脉冲激光λ₄；

(3)对所述第四脉冲激光λ₄进行延迟处理使其与所述第三脉冲激光λ₃实现时间域匹配，并对时间域匹配的第三脉冲激光λ₃和第四脉冲激光λ₄进行合束处理，实现空间域的完全匹配；

(4)将合束后的第三脉冲激光λ₃和第四脉冲激光λ₄同时耦合进入单模保偏光纤以保证两束光绝对的共线性，稳定性以及良好的高斯模式；

(5)对由所述单模保偏光纤传输的光与样本作用后产生的光信号进行处理，并获得显微图像。

2.一种实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)获得两束同步且相位锁定的第一脉冲光源λ₁和第二脉冲光源λ₂；

(2)对所述第二激光脉冲λ₂进行正弦型强度调制并获得第三脉冲激光λ₃和第四脉冲激光λ₄，其中第三脉冲激光λ₃为零级光，第四脉冲激光λ₄为一级光；

(3)通过第一晶体对第一脉冲激光λ₁进行倍频处理，通过第二晶体对所述第三脉冲激光λ₃进行倍频处理，通过第三晶体对所述第四脉冲激光λ₄进行倍频处理，在保证重复频率且偏振模式不变的条件下实现波长减半，并分别获得同步且相位锁定的第五脉冲激光λ₅、第六脉冲激光λ₆和第七脉冲激光λ₇；

(4)将所述第五脉冲激光λ₅、所述第六脉冲激光λ₆和所述第七脉冲激光λ₇分别耦合进入单模保偏光纤以保证三束激光绝对的共线性，稳定性以及良好的高斯模式；

(5)对经过单模保偏光纤传输的所述第六脉冲激光λ₆和第七脉冲激光λ₇分别进行延迟处理使其均与所述第五脉冲激光λ₅实现时间域匹配；

(6)对时间域匹配的所述第六脉冲激光λ₆进行相位整形并获得涡旋光；

(7)对所述第五脉冲激光λ₅、所述涡旋光和延迟后的第七脉冲激光λ₇进行合束处理，实现空间域的匹配；

(8)对合束后的激光与样本作用后产生的光信号进行处理，并获得显微图像。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一脉冲光源和所述第二脉冲光源的波长和偏振方向均不同。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述第一晶体的中心波长范围为700nm～1100nm切割角为26.1°，镀近红外增透膜；

所述第二晶体的中心波长范围为900nm～1100nm，切割角为23.3°，镀近红外增透膜。

5.一种实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像装置，其特征在于，包括：激光光源、声光调制器、第一晶体、第二晶体、时间延迟器、合束器、单模保偏光纤、显微镜和光电收集模块；

所述激光光源用于输出第一脉冲光源和第二脉冲光源；

所述第一晶体的输入端连接至所述激光光源的第一输出端，所述第一晶体用于对所述第一脉冲光源进行倍频处理并输出第三脉冲激光；

所述声光调制器的输入端连接至所述激光光源的第二输出端，所述声光调制器用于对所述第二脉冲光源进行高频强度调制并输出正弦型开关激光；

所述第二晶体的输入端连接至所述声光调制器输出端，所述第二晶体用于对高频调制后的近红外激光进行倍频处理并输出光子能量加倍的可见光范围的第四脉冲激光；

所述时间延迟器的输入端连接至所述第二晶体的输出端，所述时间延迟器用于改变第四脉冲激光的光程，进行第三脉冲激光和第四脉冲激光时间域上的相互匹配，并使第四脉冲激光连续可调，用于受激拉曼光谱成像；

所述合束器的第一输入端连接至所述第一晶体的输出端，第二输入端连接至所述时间延迟器的输出端，所述合束器用于将所述第三脉冲光源和第四脉冲光源进行合束后实现空间域的完全匹配；

所述单模保偏光纤的输入端连接至所述合束器的输出端，所述单模保偏光纤用于将合束后的脉冲激光进行时域上的展宽、频域上的色散、以及空间域上的高斯整形；

所述显微镜的输入端连接至所述单模保偏光纤的输出端，所述显微镜用于定位样本上待成像的目标区域，将单模保偏光纤输出的激光聚焦到样本平面并对目标区域进行逐点扫描，输出各点的信号光；

所述光电收集模块用于接收显微镜传出的光信号，将其转化为电信号并将所述电信号转化为图片。

6.一种实现近共振增强的超分辨受激拉曼显微成像装置，其特征在于，包括：激光光源、声光调制器、第一晶体、第二晶体、第三晶体、第一单模保偏光纤、第二单模保偏光纤、第三单模保偏光纤、第一时间延迟器、第二时间延迟器、螺旋相位板、合束器、显微镜和光电收集模块；

所述激光光源用于输出第一脉冲光源和第二脉冲光源；

所述第一晶体的输入端连接至所述激光光源的第一输出端，所述第一晶体用于对所述第一脉冲光源进行倍频处理并输出第五脉冲光源；

所述声光调制器的输入端连接至所述激光光源的第二输出端，所述声光调制器用于对所述第二脉冲光源进行高频强度调制并输出正弦型开关且开关方向相反的第三脉冲激光和第四脉冲激光，其中第三脉冲激光为零级光，第四脉冲激光为一级光；

所述第二晶体的输入端连接至所述声光调制器输出端，所述第二晶体用于对所述第三脉冲激光进行倍频处理并输出光子能量加倍的可见光范围的第六脉冲激光；

所述第三晶体的输入端连接至所述声光调制器输出端，所述第三晶体用于对所述第四脉冲激光进行倍频处理并输出光子能量加倍的可见光范围的第七脉冲激光；

所述第一单模保偏光纤的输入端连接至所述第一晶体的输出端，所述第一单模保偏光纤用于引入线性啁啾，并保证第五脉冲激光在时域上的展宽、频域上的色散以及空间域上的高斯整形；

所述第二单模保偏光纤的输入端连接至所述第二晶体的输出端，所述第二单模保偏光纤用于引入线性啁啾，并保证第六脉冲激光在时域上的展宽、频域上的色散以及空间域上的高斯整形；

所述第三单模保偏光纤的输入端连接至所述第三晶体的输出端，所述第三单模保偏光纤用于引入线性啁啾，并保证第七脉冲激光在时域上的展宽、频域上的色散以及空间域上的高斯整形；

所述第一时间延迟器的输入端连接至所述第二单模保偏光纤的输出端，所述第一时间延迟器用于保证第六脉冲激光和第五脉冲激光在时间域的完全匹配；

所述第二时间延迟器的输入端连接至所述第三单模保偏光纤的输出端，所述第二时间延迟器用于保证第七脉冲激光和第五脉冲激光在时间域的完全匹配；

所述螺旋相位板的输入端连接至所述第一时间延迟器的输出端，所述螺旋相位板用于将第六脉冲激光整形为涡旋光；

所述合束器的第一输入端连接至所述第一单模保偏光纤的输出端，所述合束器的第二输入端连接至所述螺旋相位板的输出端，所述合束器的第三输入端连接至所述第二时间延迟器的输出端，所述合束器用于保证第五脉冲激光，第六脉冲激光和第七脉冲激光在空间域的完全匹配；

所述显微镜的输入端连接至所述合束器的输出端，所述显微镜用于将合束后的激光聚焦于样本平面，并采用点扫描的方式采集聚焦平面的信号；

所述光电收集模块用于接收显微镜传输的光信号，将其转化为电信号，并将所述电信号转化为图片。

7.如权利要求5或6所述的超分辨受激拉曼显微成像装置，其特征在于，所述第一脉冲光源和所述第二脉冲光源的波长和偏振方向均不同；所述第三脉冲激光和第四脉冲激光同步且相位锁定。

8.如权利要求5-7任一项所述的超分辨受激拉曼显微成像装置，其特征在于，所述第一晶体的中心波长范围为700nm～1100nm切割角为26.1°，镀近红外增透膜；

所述第二晶体的中心波长范围为900nm～1100nm，切割角为23.3°，镀近红外增透膜。

9.如权利要求5所述的超分辨受激拉曼显微成像装置，其特征在于，所述时间延迟器包括：一对夹角为90°的可见光镀膜反射镜与一个移动方向与入射激光同向的电动位移平台，所述反射镜用于反射入射光，并保证出射光的方向与入射光呈180°夹角；所述电动位移平台用于沿入射光或出射光方向连续可调地移动反射镜对，在改变光程的同时，保证出射光的指向性不变。

10.如权利要求5所述的超分辨受激拉曼显微成像装置，其特征在于，所述单模保偏光纤为0.2米～0.5米长的单模保偏光纤，光纤作为一种色散介质，使两束激光有了不同程度的色散，在时域上被展宽，并产生相互匹配的啁啾系数，保证了超光谱成像的光谱分辨率。

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