JP2000356746A

JP2000356746A - 暗視野熱レンズ顕微鏡分析方法とその装置

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Publication number: JP2000356746A
Application number: JP11168773A
Authority: JP
Inventors: Takehiko Kitamori; 武彦北森; Shiro Sawada; 嗣郎澤田; Manabu Tokeshi; 学渡慶次; Akihide Hibara; 彰秀火原
Original assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology
Current assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology
Priority date: 1999-06-15
Filing date: 1999-06-15
Publication date: 2000-12-26

Abstract

(57)【要約】【課題】高い分解能による超微量分析が可能となる分
析光学顕微鏡を提供する。【解決手段】光学顕微鏡に励起光（Ａ）と検出光
（Ｂ）を入射し、励起光が試料（１０）中に照射される
ことにより形成される熱レンズに検出光を入射し、熱レ
ンズによる検出光の拡散を測定し試料中の物質を検出を
行う熱レンズ顕微鏡であって、暗視野照明することによ
り、検出光の散乱光のみを抽出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、暗視野熱
レンズ顕微鏡分析方法とその装置に関するものである。
さらに詳しくは、この出願の発明は、光学顕微鏡系とし
て熱レンズ顕微鏡を構成し、微小空間内の超微量な試料
物質を高精度に高空間分解能で分析することを可能とす
る暗視野超微量分析方法とそのための装置に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術とその課題】半導体や生体試料、あるいは
各種の液体試料等の分析や測定を目的として分光分析法
が広く利用されてきている。しかし、これまでの分光分
析法では、微小空間での微量あるいは微小物質を分析す
る場合には、測定条件として真空が必要であったり、電
子ビームやイオンビームの利用等の使用にともなって、
試料が破壊ないし損傷される等の問題があった。また、
溶液あるいは生体組織中等の超微量の試料を扱う場合に
は、光学領域の顕微鏡の使用が必須となるが、高精度で
高い空間分解能での分析が必要とされるこのような光学
領域の顕微鏡として実際的に利用されているのはレーザ
ー蛍光顕微鏡に限られており、このため、分析の対象も
おのずとレーザー蛍光顕微鏡蛍光分子に限られている。
このような事情から、従来では、真空場を必要とするこ
とがなく、非接触、非損傷での分析が可能であって、し
かも分析対象が蛍光分子に限定されることなしに、高精
度で、高い空間分解能での分析が可能とされる光学顕微
鏡の実現が求められていた。

【０００３】そこで、従来より、これらの要求を満たす
ものとして光熱変換現象による熱レンズ効果を利用した
熱レンズ顕微鏡が注目されてきた。しかしながら、実際
には、光学顕微鏡として、つまり、接眼レンズと対物レ
ンズというレンズ構成による光学顕微鏡で熱レンズ顕微
鏡を実現することは極めて困難であった。

【０００４】熱レンズ顕微鏡では、励起光と検出光との
関係を、励起光が試料中に入射されることにより形成さ
れる熱レンズに検出光を入射し、試料透過後の検出光の
拡散から試料物質の検出を行うものとすることが欠かせ
ない。しかし、光学顕微鏡の構成では、励起光と検出光
の焦点位置が一致してしまうことから、上記の関係は、
実現困難であると考えられてきた。

【０００５】もちろん、これまでにもいくつかの工夫が
提案されている。しかし、いずれの場合も、操作が複雑
過ぎるなどの理由から、具体化されなかった。このよう
な状況において、この出願の発明者らにより、色収差の
あるレンズを対物レンズとして用いることが提案され、
最大空間分解能で１０ｎｍ程度の単一微粒子の測定が可
能となった。

【０００６】しかしながら、先端科学技術の研究開発に
おいて、さらに微小なスケールにおける分析を行うこと
が望まれており、特に、生体試料を扱う分野において
は、液相微小空間での単一クラスターの個別計測など、
超微小の試料を対象とした超微量分析への要求が高まっ
ている。これまで、熱レンズ顕微鏡においては、励起光
の光量が検出光の光量より遥かに大きいため、検出光の
みの抽出を実際に行うことは難しく、空間分解能を１０
ｎｍ以下にすることは、実際的には不可能であった。

【０００７】そこで、この出願の発明は、以上の通りの
事情に鑑みてなされたものであり、操作が単純であり、
かつ、測定対象が限定されることなく、高精度で高い空
間分解能による分析が光学顕微鏡の構成で可能となる、
新しい熱レンズ顕微鏡超微量分析方法とその装置を提供
することを課題としている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、第１には、光学顕微鏡に
おいて、励起光を入射し、励起光が試料中に照射される
ことにより形成される熱レンズに検出光を入射し、熱レ
ンズによる検出光の拡散を測定することにより試料中の
物質の検出を行う熱レンズ顕微鏡を用いた分析方法であ
って、暗視野照明により検出光の散乱光のみを抽出する
ことを特徴とする暗視野熱レンズ顕微鏡分析方法を提供
する。

【０００９】また、この出願の発明は、第２には、励起
光と検出光の周波数を異なるものとし、色収差のあるレ
ンズを暗視野コンデンサーとして用いることにより暗視
野照明し、試料中における励起光および検出光の焦点位
置が一致しないようにする暗視野熱レンズ顕微鏡分析方
法をも提供する。そして、この出願の発明は、第３に
は、光学顕微鏡としての接眼レンズと対物レンズ並びに
試料ステージを備えた前記第１の方法のための装置であ
って、励起光と検出光の光源と、暗視野照明装置と、試
料透過光の集光装置とを有し、励起光と検出光とは接眼
レンズに入射されて対物レンズより試料ステージ上の試
料に放射され、暗視野照明装置によって暗視野照明さ
れ、試料透過光は集光装置により集光されて透過光のう
ちの検出光の散乱光のみから分析が行われることを特徴
とする暗視野熱レンズ顕微鏡装置を提供する。さらにま
た、この出願の発明は、第４には、励起光と検出光の周
波数を異なるものとした前記第３の装置であって、色収
差のあるレンズを暗視野コンデンサーとして暗視野照明
装置を構成している暗視野熱レンズ顕微鏡装置を提供す
る。

【００１０】

【発明の実施の形態】この出願の発明は、上記のとおり
の特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態につ
いてさらに詳しく説明する。なによりもこの出願の発明
では、暗視野照明による光学顕微鏡系であって、しかも
熱レンズ顕微鏡であることを特徴としている。

【００１１】ここで、光学顕微鏡、あるいは光学顕微鏡
系との規定は、接眼レンズと対物レンズとのレンズ構成
を有しているもの、あるいは、さらにはこれに加えて、
対物レンズに対向する試料ステージを有しているものを
意味している。そして、この発明の装置は、前記のとお
り、光学顕微鏡としての接眼レンズと対物レンズ並びに
試料ステージを備えた装置であって、励起光と検出光の
光源と、暗視野照明装置と、試料透過光の集光装置とを
有し、励起光と検出光とは接眼レンズに入射されて対物
レンズより試料ステージ上の試料に放射され、暗視野照
明装置によって暗視野照明され、試料透過光は集光装置
により集光されて透過光のうちの検出散乱光のみから分
析が行われることを特徴としている。

【００１２】図１は、この出願の発明に係る暗視野熱レ
ンズ顕微鏡の構成例を示す概略図である。この出願の発
明の暗視野熱レンズ顕微鏡において、励起光（Ａ）は励
起光源（１）から出力される。励起光源（１）から出力
された励起光（Ａ）は、チョッパ（２）により変調され
る。検出光源（３）から出力された検出光（Ｂ）は、ダ
イクロックミラー（４）により、変調後の励起光（Ａ）
と同軸で合成される。励起光（Ａ）と検出光（Ｂ）から
なる合成光（Ｃ）は、反射ミラー（５）によって反射さ
れ、接眼レンズ（６）から光学顕微鏡（７）内部へ入射
される。励起光源（１）および検出光源（３）には、例
えば、アルゴンレーザー光源やヘリウムネオンレーザー
光源といった各種レーザー光源が適宜選択され用いられ
る。

【００１３】光学顕微鏡（７）内部に入射された合成光
（Ｃ）は、暗視野コンデンサー（８）より出力され、ス
テージ（９）に設置された試料（１０）に照射される。
ステージ（９）は水平方向、垂直方向に移動することが
可能であり、水平方向に移動することにより、２次元走
査分析が可能である。試料内部においては、合成光
（Ｃ）を構成する励起光（Ａ）の一部の成分が光熱変換
し熱レンズが形成され、熱レンズを通過した検出光
（Ｂ）は拡散し、光熱変換に関わらなかった励起光
（Ａ）とともに試料中を透過する。原理的には励起光
（Ａ）も熱レンズの影響を受けるが、検出光（Ｂ）に比
べてわずかである。検出光（Ｂ）は熱レンズにより散乱
し、散乱光（Ｄ）が検出光（Ｂ）の焦点の直下方向へ集
中的に照射される。この出願の発明の暗視野熱レンズ顕
微鏡は、この散乱光（Ｄ）の光量を、検出光（Ｂ）の焦
点の直下方向に設置されたフォトダイオード（１１）に
より測定することにより、分析がなされるものである。
試料（１０）に対して暗視野照明がなされたため、試料
（１０）を透過した後の励起光（Ａ）と検出光（Ｂ）か
らなる合成光（Ｃ）は、フォトダイオード（１１）に入
射されず、検出光（Ｂ）の散乱光（Ｄ）のみを検出する
ことが可能となる。試料（１０）とフォトダイオードの
間には、更に測定の精度向上のため、フィルター（１
２）を設置することが好ましい。

【００１４】フォトダイオード（１１）に入射した散乱
光（Ｄ）は電気信号に変換され、プリアンプ（１３）に
よって増幅されロックインアンプ（１４）に入力され、
チョッパ（２）を制御するチョッパ制御装置（１５）か
らのリファレンス信号と併せて計測される。ロックイン
アンプ（１４）から出力される計測結果を示す信号は、
コンピュータ（１６）に入力され、試料（１０）の分析
がなされる。

【００１５】この出願の発明に係る暗視野熱レンズ顕微
鏡における暗視野コンデンサーは、例えば図２に示すよ
うに、コンデンサケース（２１）内部に固定されるコン
デンサレンズ（２２）、曲面を持つ反射板（２３）（２
４）、コンデンサレンズ（２２）に接して固定されるリ
ングスリット（２５）からなる。顕微鏡に入射された励
起光（Ａ）と検出光（Ｂ）で構成される合成光（Ｃ）
は、コンデンサケース（２１）の開口部より入射され、
リングスリット（２５）を通過することにより円環状の
光束となり、反射板（２３）により外向きに反射した
後、反射板（２４）により内向きに進行方向を変えてコ
ンデンサレンズ（２２）に入射されるため、試料（２
６）を通過する合成光（Ｃ）はフォトダイオード（２
７）に直接入射しない。コンデンサレンズ（２２）は色
収差を有するため、励起光（Ａ）と検出光（Ｂ）の試料
（２６）内部における焦点位置は一致せず、その結果、
励起光（Ａ）により熱レンズ効果が生じる。前述の通
り、熱レンズ効果により検出光（Ｂ）は散乱し、その散
乱光（Ｄ）は、検出光（Ｂ）の焦点の直下方向へ集中的
に照射され、フォトダイオード（２７）により光量に応
じた電気信号に変換される。

【００１６】そして、この発明では、熱レンズ顕微鏡分
析を行うために、対物レンズより試料（１０）中へ入射
される励起光（Ａ）と検出光（Ｂ）の焦点位置が一致し
ないようにするのが望ましい。そのための光学調整法と
しては、たとえば励起光（Ａ）と検出光（Ｂ）の周波数
を異なるものとし、色収差のあるレンズを暗視野コンデ
ンサーとし、これを対物レンズとして用いる方法があ
る。また、ビームエキスパンダーを用いて、励起光
（Ａ）または検出光（Ｂ）のいずれに角度を持たせて光
学顕微鏡（７）の接眼レンズ（６）へ入射する方法も考
えられる。後者の方法については、原理的には励起光
（Ａ）と検出光（Ｂ）のどちらに対してビームエキスパ
ンダーを用いてもよいが、ビームエキスパンダーを構成
する光学素子による機械的な振動の発生と、より精度の
高い分析のためには検出光（Ｂ）は安定した状態である
ことが望ましいことを考慮すると、励起光（Ａ）に対し
てビームエキスパンダー（２０）を適用することが好ま
しい。

【００１７】たとえばこの出願の発明に係る熱レンズ顕
微鏡の空間分解能を、銀薄膜を蒸着したガラス基板を用
い、励起光源として、アルゴンレーザー光源を、また、
検出光源として、ヘリウムネオンレーザー光源を用い、
励起光と検出光の焦点位置が一致しないように色収差の
あるレンズを対物レンズとしてのこの発明の暗視野コン
デンサーとして用いて評価した。

【００１８】銀薄膜が蒸着されたガラス基板を１方向へ
走査し、透過光の強度を電圧として測定した結果、この
装置の空間分解能が約１．０μｍであることが確認され
た。このことから、空間分解能は、検出光のスポット径
に等しく、この出願の発明に係る熱レンズ顕微鏡超微量
分析は、微粒子の検出に優れた能力を持つことがわか
る。

【００１９】さらに、この出願の発明に係る熱レンズ顕
微鏡分析を、小型ゲルを用いた短距離電気泳動によるＤ
ＮＡの高空間分解検出に適用した。得られたＤＮＡ試料
のバンド幅は１００μｍであり、これは従来の大きさの
ゲルを用いた場合の約１／１０の幅である。分離に要し
た泳動距離は１６ｍｍ、時間は１５分であり、これは従
来の大きさのゲルを用いた場合の１０倍以上速い。分離
された各試料バンドは、肉眼では約１５００ｂｐまでし
か検出できないが、この出願の発明に係る熱レンズ顕微
鏡超微量分析により２４００ｂｐまでの検出が可能であ
った。

【００２０】以上より、この出願の発明に係る熱レンズ
顕微鏡超微量分析は、優れた空間分解能を有しており、
また、この空間分解能を利用した小型試料の測定も可能
となり、測定時間の短縮に貢献することがわかった。

【００２１】

【発明の効果】この出願の発明により、空間分解能や定
量分析能力に優れ、かつ、生体細胞や組織などのｉｎ−
ｖｉｔｒｏ、ｉｎ−ｖｉｖｏ測定が可能である超微量分
析顕微鏡が実現する。さらに、高い空間分解能や定量分
析能力を応用することにより、試料を小型化し、分析時
間を大幅に短縮することや試料量を低減することも可能
となる。

【００２２】また、光熱変換分工法の利点や特徴を有す
ることから、熱拡散率や比熱などの熱物性物理量の分布
測定や超高速時間分解測定などにも応用可能であると考
えられる。以上より、この出願の発明に係る暗視野熱レ
ンズ顕微鏡は、今後の材料開発や物理化学研究、生体工
学研究などに対して極めて有効な手段と考えられ、特
に、生体工学の分野においては、これまで不可能であっ
た液相微小空間での単一クラスターの個別計測などが実
現されるものと期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】この出願の発明に係る熱レンズ顕微鏡超微量分
析装置の構成例を示す概略図である。

【図２】この出願の発明に係る暗視野熱レンズ顕微鏡を
構成する暗視野コンデンサーの概略図である。

【符号の説明】

Ａ励起光Ｂ検出光Ｃ合成光Ｄ散乱光１励起光源２チョッパ３検出光源４ダイクロックミラー５反射ミラー６接眼レンズ７光学顕微鏡８暗視野コンデンサー９ステージ１０試料１１フォトダイオード１２フィルター１３プリアンプ１４ロックインアンプ１５チョッパ制御装置１６コンピュータ２１コンデンサケース２２コンデンサレンズ２３反射板２４反射板２５リングスリット２６試料２７フォトダイオード

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者火原彰秀東京都北区昭和町１−11−12 リバティハウスＡ201 Ｆターム(参考） 2G040 AA02 AB07 BA24 BA27 CA02 CA12 CA23 EA06 EA11 EB02 2H052 AA09 AC04 AC05 AC06 AC14 AC17 AC18 AC27 AC29 AC34 AF06

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】光学顕微鏡において、励起光を入射し、
励起光が試料中に照射されることにより形成される熱レ
ンズに検出光を入射し、熱レンズによる試料透過後の検
出光の拡散を測定することにより試料中の物質の検出を
行う熱レンズ顕微鏡を用いた分析方法であって、暗視野
照明により検出光の散乱光のみを抽出することを特徴と
する暗視野熱レンズ顕微鏡分析方法。
【請求項２】励起光と検出光の周波数を異なるものと
し、色収差のあるレンズを暗視野コンデンサーとして用
いることにより暗視野照明し、試料中における励起光お
よび検出光の焦点位置が一致しないようにする請求項１
記載の暗視野熱レンズ顕微鏡分析方法。
【請求項３】光学顕微鏡としての接眼レンズと対物レ
ンズ並びに試料ステージを備えた請求項１の方法のため
の装置であって、励起光と検出光の光源と、暗視野照明
装置と、試料透過光の集光装置とを有し、励起光と検出
光とは接眼レンズに入射されて対物レンズより試料ステ
ージ上の試料に放射され、暗視野照明装置によって暗視
野照明され、試料透過光は集光装置により集光されて透
過光のうちの検出光の散乱光のみから分析が行われるこ
とを特徴とする暗視野熱レンズ顕微鏡分析装置。
【請求項４】励起光と検出光の周波数を異なるものと
した請求項４の装置であって、色収差のあるレンズを暗
視野コンデンサーとして暗視野照明装置を構成している
暗視野熱レンズ顕微鏡分析装置。