KR102155218B1 - 생체물질의 분석 방법 - Google Patents

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전형진
김재호
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Abstract

유체 채널을 구비하는 센싱 기판을 이용한 생체물질 분석 방법이 개시된다. 생체물질 분석 방법은 목적 생체물질을 함유하는 검출 용액에 상기 목적 생체물질과 선택적으로 반응하는 제1 생체인지물질이 수식된 재귀반사 입자들을 혼합하는 단계; 중력 방향을 기준으로 바닥부가 덮개부의 하부에 위치하도록 센싱 기판을 배치하는 단계; 유체 채널에 재귀반사 입자들이 혼합된 상기 검출 용액을 주입한 후 제1 시간동안 유지시키는 단계; 센싱 기판을 회전시킨 후 제2 시간동안 유지시키는 단계; 바닥부를 통하여 유체 채널 내부에 광을 조사하는 단계; 및 재귀반사 입자들로부터 재귀반사된 광에 대한 이미지를 생성 및 분석하는 단계를 포함한다.

Description

생체물질의 분석 방법{METHOD OF ANALYSING BIOMATERIAL}
본 발명은 광학적인 방법을 이용하여 목적 생체물질을 정량적으로 분석할 수 있는 생체물질의 분석 방법에 관한 것이다.
면역 및 분자비콘을 비롯한 생물학적 분석목표를 가진 광학적 정량/정성분석을 수행하기 위해 산업계 및 학계에서 높은 빈도로 사용되어온 방법은 발광을 일으키는 신호표지자의 신호세기 감지를 통한 방법이 개발되어 사용되어왔다.
이러한 형태의 분석법은 고감도의 분석민감도를 충족하지만, 실험환경적 측면에서 정교한 광학장비를 갖춘 고가의 분석장비를 요구할 뿐만 아니라 타겟분자와 반응하지 않은 신호표지자를 제거하기 위한 세척과정을 필요로 한다. 하지만, 분석자가 수동적으로 세척용액을 주입하는 방식으로 상기 세척 과정이 진행되는데, 이러한 과정은 분석자의 숙련도에 따라 신호세기가 변동하게 되는 주요 원인이 된다.
본 발명의 목적은 생체물질과 미반응된 광학 표지자를 중력 침전의 방식으로 제거함으로써 분석자에게서 기인하는 오류를 최소화할 수 있는 생체물질의 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 실시예에 따른 생체물질 분석 방법은 목적 생체물질과 선택적으로 반응하는 제2 생체인지물질이 표면에 수식되고 투명한 바닥부, 상기 바닥부와 대향하고 검출 용액의 주입구가 형성된 덮개부 및 이들 사이에 배치되고 관통 개구를 구비하는 측벽부를 포함하고, 상기 바닥부, 상기 덮개부 및 상기 측벽부에 의해 형성된 유체 채널을 구비하는 센싱 기판을 이용하여 분석을 수행하고, 목적 생체물질을 함유하는 검출 용액에 상기 목적 생체물질과 선택적으로 반응하는 제1 생체인지물질이 수식된 재귀반사 입자들을 혼합하는 제1 단계; 중력 방향을 기준으로 상기 바닥부가 상기 덮개부의 하부에 위치하도록 센싱 기판을 배치하는 제2 단계; 상기 유체 채널에 상기 재귀반사 입자들이 혼합된 상기 검출 용액을 주입한 후 제1 시간동안 유지시키는 제3 단계; 중력 방향을 기준으로 상기 바닥부가 상기 덮개부의 상부에 위치하도록 상기 센싱 기판을 회전시킨 후 제2 시간동안 유지시키는 제4 단계; 상기 바닥부를 통하여 상기 유체 채널 내부에 광을 조사하는 제5 단계; 및 상기 재귀반사 입자들로부터 재귀반사된 광에 대한 이미지를 생성 및 분석하는 제6 단계를 포함한다.
일 실시예에 있어서, 상기 재귀반사 입자는 투명한 코어 입자, 상기 코어 입자의 일부를 피복하는 전반사 코팅층 및 상기 코어 입자의 노출면에 수식된 상기 제1 생체인지물질을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 생체인지물질은 상기 코어 입자의 노출면에만 선택적으로 수식되고, 상기 전반사 코팅층의 표면에는 알칸티올 화합물이 수식될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 유체 채널의 높이는 50 내지 1000 ㎛일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 단계에 있어서, 상기 재귀반사 입자들은 10 내지 1000 μg/mL의 농도로 상기 검출 용액에 혼합될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제3 단계 동안 중력에 의해 상기 재귀반사 입자들은 상기 유체 채널 내부에서 상기 바닥부 방향으로 침전되고, 상기 재귀반사 입자들에 결합된 목적 생체물질과 상기 바닥부에 수식된 상기 제2 생체인지물질 사이에 선택적 반응이 일어날 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제3 단계 동안 상기 바닥부에 고정되지 않은 미반응 재귀반사 입자들은 중력에 의해 상기 덮개부 방향으로 침강할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제4 단계에서 상기 센싱 기판은 회전 후 10분 이상의 시간동안 유지될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제6 단계는, 상기 재귀반사 입자들로부터 재귀반사되는 광에 대해 타임랩스(Time-lapse) 기법으로 제3 시간 동안 복수의 연속 촬영 이미지를 생성하는 단계; 상기 제3 시간 동안 변화가 없는 정적 픽셀들은 유지하고, 변화가 발생한 동적 픽셀들은 제거하는 방식으로 상기 이미지를 처리하는 단계; 및 상기 처리된 이미지로부터 재귀반사 입자들을 계수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 생체물질의 분석 방법에 따르면, 목적 생체물질과 미반응된 광학 표지자를 제거하는 과정을 중력에 의한 재귀반사 입자의 침전으로 대체하였으므로, 분석자에게서 기인하는 오류를 최소화할 수 있을 뿐만 아니라 간편한 방법으로 정확한 생체물질의 분석이 가능하다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서를 설명하기 위한 모식도이다.
도 2 및 도 3은 도 1에 도시된 센싱 기판 및 재귀반사 입자를 각각 설명하기 위한 단면도들이다.
도 4는 제1 생체인지물질을 재귀반사 입자 중 노출된 코어 입자 표면에 선택적으로 수식하는 방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 PMMA로 형성된 센싱 기판의 바닥부에 제2 생체인지물질을 고정하기 위한 표면처리 공정의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 생체물질의 정량 분석 방법을 설명하기 위한 순서도이다.
도 7은 센싱 기판의 회전에 따른 재귀반사 입자들의 침강을 설명하기 위한 도면이다.
도 8은 센싱 기판의 반전 후 시간에 따른 재귀반사 입자의 개수의 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따라 CK-MB 검출용액들을 분석한 결과를 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서를 설명하기 위한 모식도이고, 도 2 및 도 3은 도 1에 도시된 센싱 기판 및 재귀반사 입자를 각각 설명하기 위한 단면도들이다.
도 1 내지 도 3을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서(100)는 재귀반사 입자들(110), 센싱 기판(120), 이미지 분석장치(130) 및 광원(140)을 포함할 수 있다.
상기 재귀반사 입자(120)는 목적 생체물질과 선택적으로 반응할 수 있고, 입사광을 광원(140) 방향으로 재귀반사할 수 있다.
일 실시예로, 상기 재귀반사 입자(120)는 투명한 코어 입자(111), 상기 코어 입자(111)의 일부를 피복하는 전반사 코팅층(112) 및 상기 코어 입자(111)의 노출면에 직접 또는 간접적으로 결합된 제1 생체인지물질(113)을 포함할 수 있다.
상기 코어 입자(111)는 구형의 형상을 가질 수 있다. 본 발명에 있어서 ‘구형’이라 함은 중심으로부터 표면의 모든 지점까지의 반지름들이 동일한 완벽한 구형뿐만 아니라 최대 반지름과 최소 반지름의 차이가 약 10% 이하인 실질적인 구형체도 포함하는 것으로 정의된다. 상기 코어 입자(111)는 상기 목적 생체물질(미도시)과의 결합 특성, 상기 광원으로부터 조사되는 광의 파장과의 관계, 상기 검출 용액 내에서의 침강 특성 등을 고려하여, 약 600nm 이상 5㎛ 이하, 예를 들면, 약 700nm 이상 900nm 이하의 평균 직경을 가질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자(111)는 입사광을 투과시킬 수 있는 투명 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 코어 입자(111)는 투명 산화물이나 투명 고분자 물질 등으로 형성될 수 있다. 상기 투명 산화물은, 예를 들면, 실리카(silica), 글라스(glass) 등을 포함할 수 있고, 상기 투명 고분자 물질은, 예를 들면, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate)) 등을 포함할 수 있다.
상기 전반사 코팅층(112)은 상기 코어 입자(111)의 표면 중 일부를 피복하도록 형성되고, 상기 코어 입자(111) 내부를 진행하는 광의 적어도 일부를 전반사시켜 상기 광원(140)의 방향으로 재귀반사되는 광량을 증가시킬 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 전반사 코팅층(112)은 상기 코어 입자(111)의 표면 중 약 30% 이상 70% 이하의 면적을 피복하도록 상기 코어 입자(111)의 표면 상에 형성될 수 있다. 상기 전반사 코팅층(112)이 상기 코어 입자(111) 표면의 30% 미만을 피복하는 경우, 상기 코어 입자(111) 내부에 입사된 광 중 재귀반사되지 않고 누설되는 광량이 많아 상기 바이오 센서(100)의 감도가 저하되는 문제점이 발생할 수 있고, 상기 전반사 코팅층(112)이 상기 코어 입자(111) 표면을 70% 초과하여 피복하는 경우에는, 상기 코어 입자(111) 내부로 입사되는 광량이 감소하여 상기 바이오 센서(100)의 감도가 저하되는 문제점이 발생할 수 있다. 일 실시예로, 상기 전반사 코팅층(112)은 상기 코어 입자(111) 표면의 약 40% 이상 60% 이하를 피복하도록 상기 코어 입자(111)의 표면 상에 형성될 수 있다.
일 실시예로, 상기 코어 입자(111) 내부를 진행하는 광의 적어도 일부를 전반사시켜 상기 광원(140)의 방향으로 재귀반사되는 광량을 증가시키기 위해, 상기 전반사 코팅층(112)은 상기 코어 입자(111)보다 굴절률이 작은 물질로 형성될 수 있다. 일 예로, 상기 코어 입자(111)는 적어도 360nm 내지 820 nm의 가시광선 파장 영역에서 약 1.4 이상의 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있고, 상기 전반사 코팅층(112)은 상기 코어 입자 (121)보다 작은 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있다. 구체적으로, 상기 코어 입자(111)가 가시광선 영역에서 약 1.4 이상의 굴절률을 갖는 투명 산화물 또는 투명 고분자 물질로 형성된 경우, 상기 전반사 코팅층(112)은 그보다 작은 굴절률을 갖는 금속 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 전반사 코팅층(112)은 532nm 파장의 광에 대해 약 0.22의 굴절률을 갖는 금(Au), 약 0.15의 굴절률을 갖는 은(Ag), 약 1.0의 굴절률을 갖는 알루미늄(Al), 약 0.4의 굴절률을 갖는 구리(Cu), 약 1.2의 굴절률을 갖는 아연(Zn) 등으로부터 선택된 하나 이상의 금속으로 형성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 광 투과에 의한 광 누설을 방지하고 상기 재귀반사 입자(120)의 상기 검출 용액 내에서의 분산성을 향상시키기 위하여, 상기 전반사 코팅층(112)은 약 10 내지 500nm의 두께를 가질 수 있다. 상기 전반사 코팅층(112)의 두께가 10nm 미만인 경우, 상기 코어 입자(111) 내부에 입사된 광 중 일부가 상기 전반사 유도층(112)을 투과하여 누설되는 문제점이 발생할 수 있고, 상기 전반사 코팅층(112)의 두께가 500nm를 초과하는 경우, 상기 광학 표지부(110)의 중량이 커져 액체 내에서의 상기 광학 표지부(110)의 분산성이 저하되는 문제점이 발생할 수 있다.
상기 제1 생체인지물질(113)은 목적 생체물질과 선택적으로 결합할 수 있는 물질로 형성될 수 있다. 상기 제1 생체인지물질(113)은 검출하고자 하는 목적 생체물질에 따라 변경될 수 있고, 단백질, 핵산, 리간드 등으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 생체물질이 항원 물질인 경우, 상기 제1 생체인지물질(113)은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 또는 압타머(Aptamer) 물질일 수 있고, 상기 목적 생체물질이 유전자 물질인 경우, 상기 제1 생체인지물질(113)은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 DNA(deoxyribonucleic acid), RNA(ribonucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 등과 같은 핵산 물질일 수 있으며, 상기 목적 생체물질이 세포신호 물질인 경우, 상기 제1 생체인지물질(113)은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 물질일 수 있다.
상기 제1 생체인지물질(113)은 상기 전반사 코팅층(112)으로부터 노출된 상기 코어 입자(111)의 표면에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 일 실시예로, 상기 제1 생체인지물질(113)은 상기 코어 입자(111)의 노출 표면에만 선택적으로 수식될 수 있고, 상기 전반사 코팅층(112)의 표면에는 수식되지 않을 수 있다. 예를 들면, 상기 재귀반사 입자를 제조하는 과정에서, 상기 전반사 코팅층(112)의 표면에 먼저 6-mercapto-1-hexanol, 2-mercaptoethanol, 3-mercapto-1-propanol, 4-mercapto-1-butanol, 6-mercapto-1-hexanol, thiol-PEG 등의 생체인지물질 수식 방해 물질을 먼저 수식한 후 고농도의 상기 생체인지물질 함유 용액에 상기 재귀반사 입자를 첨가함으로써 상기 생체인지물질을 상기 코어 입자(111)의 노출 표면에만 수식할 수 있다. 이와 같이, 상기 코어 입자(111)의 노출 표면에만 상기 제1 생체인지물질(113)을 선택적으로 수식하는 경우, 하기에서 설명되는 바와 같이 상기 코어 입자(111)의 노출 표면을 상기 이미지 분석장치(130) 방향으로 배향시킬 수 있으므로, 보다 강한 재귀반사 신호를 유도할 수 있고, 그 결과 상기 바이오 센서(100)의 감도를 향상시킬 수 있다.
상기 센싱 기판(120)은 상기 목적 생체물질 및 이와 결합한 상기 재귀반사 입자(110)를 함유하는 검출 용액을 수용하는 밀폐된 유체 채널(20)을 구비할 수 있고, 상기 유채 채널(20)의 일면에는 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 제2 생체인지물질(124)이 수식될 수 있다.
일 실시예로, 상기 센싱 기판(120)은 바닥부(121), 덮개부(122) 및 측벽부(123) 및 제2 생체인지물질(124)을 포함할 수 있다.
상기 바닥부(121)는 투명한 고분자 재질로 형성되고, 상기 유체 채널(20)의 바닥면을 형성할 수 있다. 일 실시예로, 상기 바닥부(121)는 PMMA(Poly(methyl methacrylate)), PC(polycarbonate), PS(polystyrene) 등의 투명 고분자 물질로 형성될 수 있다.
상기 덮개부(122)는 상기 바닥부와 이격된 상태에서 대향하도록 배치되고, 상기 유체 채널(20)의 상부면을 형성할 수 있으며, 상기 유채 채널(20) 내부로 상기 검출 용액을 주입할 수 있는 주입구(미도시)를 구비할 수 있다. 상기 덮개부(122)는 상기 바닥부(121)와 동일한 재질로 형성될 수도 있고, 이와 다른 재질로 형성될 수도 있다. 일 실시예로, 상기 덮개부(122)는 PDMS(polydimethylsiloxane), PS(polystyrene), PMMA(Poly(methyl methacrylate)), COC(Cyclic olefin copolymer), COP(cyclic olefin polymers) 등으로 형성될 수 있다.
상기 측벽부(123)는 상기 유체 채널(20)에 대응되는 관통 개구를 구비하고, 상기 바닥부(121) 및 상기 덮개부(122) 사이에 배치되어 상기 유체 채널(20)의 측면을 형성할 수 있다. 상기 측벽부(123)는 상기 바닥부(121)와 동일한 재질로 일체로 형성될 수도 있고, 이와 달리 상기 바닥부(121)와 다른 재질로 형성될 수도 있다.
상기 유체 채널(20)의 높이(H)는 상기 검출 용액 내에서의 상기 재귀반사 입자의 침강 길이와 연관되므로, 상기 유체 채널(20)의 높이는 약 50 내지 1000 ㎛일 수 있다.
상기 제2 생체인지물질(124)은 상기 유체 채널의 바닥면에 대응하는 상기 바닥부(121)의 표면에 수식될 수 있다. 상기 제2 생체인지물질(124)은 목적 생체물질과 선택적으로 결합할 수 있는 물질로 형성될 수 있다. 상기 제2 생체인지물질(124)은 상기 재귀반사 입자(110)의 제1 생체인지물질(113)과 동일한 물질일 수도 있고, 이와 다른 물질일 수도 있다. 상기 제2 생체인지물질(124)은 검출하고자 하는 목적 생체물질에 따라 변경될 수 있고, 단백질, 핵산, 리간드 등으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 생체물질이 항원 물질인 경우, 상기 제2 생체인지물질(124)은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 또는 압타머(Aptamer) 물질일 수 있고, 상기 목적 생체물질이 유전자 물질인 경우, 상기 제2 생체인지물질(124)은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 DNA(deoxyribonucleic acid), RNA(ribonucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 등과 같은 핵산 물질일 수 있으며, 상기 목적 생체물질이 세포신호 물질인 경우, 상기 제2 생체인지물질(124)은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 물질일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 센싱 기판(120)의 유체 채널(20)에 상기 재귀반사 입자들(110)과 미리 혼합된 상기 검출 용액을 주입할 수 있다. 예를 들면, 상기 검출 용액에 상기 재귀반사 입자들(110)을 첨가하여 상기 검출 용액 내의 목적 생체물질과 상기 재귀반사 입자들(110)을 미리 반응시킨 후 이를 상기 센싱 기판(120)의 유체 채널(20)에 주입할 수 있다.
이어서, 상기 검출 용액을 상기 유체 채널(20)에 주입한 후 제1 시간 동안 유지하여, 상기 재귀반사 입자(110)와 반응한 목적 생체물질을 상기 센싱 기판(120)의 제2 생체인지물질(124)와 선택적으로 반응시킬 수 있다. 예를 들면, 중력 방향을 기준으로 상기 바닥부(121)가 상기 덮개부(122)의 하부에 위치하도록 상기 센싱 기판(120)을 배치한 상태에서 상기 검출 용액을 상기 유체 채널(20)에 주입한 후 제1 시간 동안 유지하는 경우, 상기 재귀반사 입자(110)는 중력에 의해 상기 바닥부(121)로 침강하게 되고, 상기 재귀반사 입자(110)와 미리 결합된 목적 생체물질은 상기 바닥부(121)에 수식된 제2 생체인지물질(124)과 선택적으로 반응하게 된다.
이어서, 상기 바닥부(121)가 상기 덮개부(122)의 상부에 위치하도록 상기 센싱 기판(120)을 회전시킨 후 제2 시간 동안 유지하여 상기 제2 생체인지물질(124)과 미반응한 재귀반사 입자들(110)을 상기 덮개부(122) 방향으로 침강시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 센싱 기판(120)을 회전시킨 후 제2 시간 동안 유지하는 경우, 상기 재귀반사 입자들(110) 중 상기 목적 생체물질을 통해 상기 제2 생체인지물질(124)에 결합된 재귀반사 입자들(110)은 상기 바닥부(121)에 인접한 위치에 계속 유지될 것이나, 상기 제2 생체인지물질(124)과 반응하지 않은 미반응 재귀반사 입자들(110)은 중력에 의해 상기 덮개부(122) 방향으로 침강될 것이다.
상기 광원(140)은 상기 제2 시간 동안 유지된 후 상기 센싱 기판(120)의 바닥부(121) 상부에서 상기 유채 채널(20) 내부로 광을 조사할 수 있다. 상기 광원(130)은 다양한 파장의 혼합 광을 조사하거나 특정 파장의 단색 광을 조사할 수 있다. 예를 들면, 상기 광원(140)은 백색광을 조사할 수 있다.
상기 광원(140)이 상기 투명한 바닥부(121)를 통해 상기 유체 채널(20) 내부로 광을 조사하는 경우, 상기 목적 생체물질을 통해 상기 제2 생체인지물질(124)에 결합된 재귀반사 입자들(110)은 입사광을 재귀반사시킬 수 있다. 이 경우, 상기 목적 생체물질과 선택적으로 반응하는 제1 생체인지물질(113)이 상기 재귀반사 입자(110) 중 코어 입자(111)의 노출 표면에 수식되어 있으므로, 목적 생체물질을 통해 상기 제2 생체인지물질(124)에 결합된 재귀반사 입자들(110)은 상기 코어 입자(111)의 노출 표면이 상기 센싱 기판(120)의 바닥부(121)를 향하도록 배향될 수 있고, 그 결과, 상기 광원(140)으로부터 광이 조사된 경우, 상기 재귀반사 입자들(110)은 보다 강한 재귀반사 신호를 생성할 수 있다.
상기 이미지 분석장치(130)는 상기 유체 채널 내부의 재귀반사 입자들(110)로부터 재귀반사되는 광을 수용하여 이에 대한 이미지를 생성하고, 상기 이미지를 분석하여 상기 검출 용액 내의 상기 목적 생체물질의 농도에 대한 정보를 생성할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 이미지 분석장치(130)는 상기 재귀반사된 광 신호를 이미지화하는 화상 생성부, 상기 화상 생성부에서 생성된 이미지를 처리하는 화상 처리부 및 상기 이미지 처리부에 의해 처리된 이미지를 분석하는 화상 분석부를 포함할 수 있다.
상기 화상 생성부는 타임랩스(Time-lapse) 기법으로 기 설정된 시간 동안 복수의 연속 촬영 이미지를 생성할 수 있다. 예를 들면, 상기 화상 생성부는 약 1 내지 2초 사이에 약 4장 이상의 연속촬영을 수행한 후 이의 이미지를 생성할 수 있다.
상기 화상 처리부는 상기 복수의 연속 촬영 이미지를 분석한 후 상기 기설정된 시간 동안 변화가 없는 정적 픽셀들은 유지하고, 변화가 발생한 동적 픽셀들은 제거하는 방식으로 이미지를 처리할 수 있다. 이와 같이 이미지를 처리하는 경우, 미반응 재귀반사 입자들로부터 재귀반사된 광에 의한 오류를 최소화할 수 있다.
상기 화상 분석부는 상기 화상 처리부에 의해 처리된 이미지를 분석하여 상기 목적 생체물질의 농도 등과 같은 정량 정보를 생성할 수 있다. 예를 들면, 상기 화상 분석부는 상기 이미지로부터 재귀반사 입자들의 수를 산출함으로써 상기 목적 생체물질의 정량 정보를 생성할 수 있다.
도 4는 제1 생체인지물질을 재귀반사 입자 중 노출된 코어 입자 표면에 선택적으로 수식하는 방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다.
도 4를 참조하면, 기판 상에 고밀도로 배열된 단층 코어 입자들을 형성한 후 이온빔 증착 방법을 이용하여 상기 코어 입자의 반구면 상에 전반사 코팅층을 형성할 수 있다.
이어서, 상기 전반사 코팅층의 표면에 스페이서(spacer) 역할을 할 수 있는 알칸티올(alkanethiol) 화합물을 수식하여 부동태화를 실시한 후 입자들을 상기 기판으로부터 분리할 수 있다. 예를 들면, 상기 알칸티올(alkanethiol) 화합물로는 6-mercapto-1-hexanol, 2-mercaptoethanol, 3-mercapto-1-propanol, 4-mercapto-1-butanol, 6-mercapto-1-hexanol, thiol-PEG 등의 화합물이 적용될 수 있다.
이어서, 제1 생체인지물질이 고농도로 함유된 용액에 상기 알칸티올(alkanethiol) 화합물로 전반사 코팅층이 부동태화된 입자들을 혼합하여 상기 제1 생체인지물질을 상기 코어 입자의 노출된 표면에 흡착시킬 수 있다.
이어서, 재귀반사 입자의 비특이적 결합을 최소화하기 위해, 선택적으로 상기 전반사 유도층의 미수식 영역에 BSA(Bovine Serum Albumin)를 코팅할 수 있다.
도 5는 PMMA로 형성된 센싱 기판의 바닥부에 제2 생체인지물질을 고정하기 위한 표면처리 공정의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다.
도 5를 참조하면, PMMA 기판에 상압 플라즈마 처리르 수행하여 상기 PMMA 기판 상에 카르복실기(carboxyl group)를 도입할 수 있다.
이어서, 아미노리시스(aminolysis) 반응을 통해 실란화 처리(silanization)를 반복 수행할 수 있고, 이 때, 아민기(amine group)가 표면에 노출되도록 유도할 수 있다.
이어서, 상기 아민기와 제2 생체인지물질과 반응하는 크로스링커(cross-linker) 화합물을 이용하여 상기 제2 생체인지물질을 상기 PMMA 기판 표면에 고정시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 제2 생체인지물질이 항체 물질인 경우, 상기 크로스링커(cross-linker) 화합물로는 Glutaraldehyde, succinimidyl ester 계열의 화합물이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 크로스링커(cross-linker) 화합물로는 BS3(bis(sulfosuccinimidyl)suberate) 화합물을 사용할 수 있다.
이하 도 1 내지 도 5를 참조하여 설명한 바이오 센서(100)를 이용한 목적 생체물질의 정량 분석 방법에 대해 상술한다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 생체물질의 정량 분석 방법을 설명하기 위한 순서도이고, 도 7은 센싱 기판의 회전에 따른 재귀반사 입자들의 침강을 설명하기 위한 도면이다.
도 1 내지 도 5와 함께 도 6 및 도 7을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 생체물질 정량 분석 방법은, 목적 생체물질을 함유하는 검출 용액에 상기 목적 생체물질과 선택적으로 반응하는 제1 생체인지물질(113)이 수식된 재귀반사 입자들(110)을 혼합하는 제1 단계(S110); 중력 방향을 기준으로 상기 목적 생체물질과 선택적으로 반응하는 제2 생체인지물질(124)이 수식된 바닥부(121)가 상기 덮개부(122)의 하부에 위치하도록 상기 센싱 기판(120)을 배치하는 제2 단계(S120); 상기 센싱 기판(120)의 유체 채널(20)에 상기 재귀반사 입자들(110)이 혼합된 상기 검출 용액을 주입한 후 제1 시간동안 유지시키는 제3 단계(S130); 중력 방향을 기준으로 상기 바닥부(121)가 상기 덮개부(122)의 상부에 위치하도록 상기 센싱 기판(120)을 회전시킨 후 제2 시간동안 유지시키는 제4 단계(S140); 상기 바닥부(121)를 통하여 상기 유체 채널(20) 내부에 광을 조사하는 제5 단계(S150); 및 상기 재귀반사 입자들로부터 재귀반사된 광에 대한 이미지를 생성 및 분석하는 제6 단계(S160)를 포함할 수 있다.
상기 제1 단계(S110)에 있어서, 상기 목적 생체물질을 함유하는 검출 용액에 상기 재귀반사 입자들(110)을 혼합하여 상기 재귀반사 입자들(110)의 제1 생체인지물질(113)과 상기 목적 생체물질을 반응시킬 수 있다. 이 경우, 모든 목적 생체물질이 재귀반사 입자들(110)과 반응할 수 있도록, 충분한 수량의 재귀반사 입자들을 상기 검출 용액에 혼합할 수 있다.
상기 제2 단계(S120) 및 제3 단계(S130)에 있어서, 중력 방향을 기준으로 상기 제2 생체인지물질(124)이 수식된 바닥부(121)가 상기 덮개부(122)의 하부에 위치하도록 상기 센싱 기판(120)을 배치한 상태에서 상기 재귀반사 입자들(110) 및 이들과 반응한 목적 생체물질을 함유한 검출용액을 상기 덮개부에 형성된 검출 용액 주입구(미도시)를 통해 상기 유체 채널 내부에 주입하는 경우, 중력에 의해 상기 재귀반사 입자들(110)은 아래 방향, 즉, 상기 센싱 기판(120)의 바닥부(121) 방향으로 침강되고, 그 결과 상기 바닥부(121)에 수식된 제2 생체인지물질과 상기 재귀반사 입자들(110)에 결합된 목적 생체물질 사이에 선택적 반응이 일어난다. 즉, 상기 목적 생체물질과 반응한 재귀반사 입자들(110)은 상기 목적 생체물질을 통해 상기 바닥부(121)에 고정되고, 상기 목적 생체물질과 반응하지 않은 재귀반사 입자들(110)은 상기 바닥부(121)에 고정되지 않는다.
상기 제4 단계(S140)에 있어서, 중력 방향을 기준으로 상기 바닥부(121)가 상기 덮개부(122)의 상부에 위치하도록 상기 센싱 기판(120)을 회전시킨 후 제2 시간동안 유지시키는 경우, 상기 바닥부(121)에 고정된 재귀반사 입자들(110)은 상대적으로 고정된 위치에 유지되나, 상기 바닥부(121)에 고정되지 않은 미반응 재귀반사 입자들(110)은 중력에 의해 아래 방향, 즉, 상기 덮개부(122) 방향으로 침강하게 된다.
상기 제5 단계(S150) 및 제6 단계(S160)에 있어서, 상기 바닥부(121)를 통하여 상기 유체 채널(20) 내부에 광을 조사하는 경우, 상기 바닥부(121)에 고정된 재귀반사 입자들은 광이 입사되는 상기 바닥부(121)와 인접한 위치에서 고정되어 입사광을 강하게 재귀반사할 수 있으나, 상기 바닥부(121)에 고정되지 않은 미반응 재귀반사 입자들은 아래로 침강되어 부유 상태에서 입사광을 약하게 재귀반사할 수 있다.
또한, 상기 제1 생체인지물질(113)이 상기 재귀반사 입자(110) 중 코어 입자(111)의 노출 표면에만 수식되어 있으므로, 상기 바닥부(121)에 고정된 재귀반사 입자들(110)은 상기 코어 입자(111)의 노출 표면이 상기 센싱 기판(120)의 바닥부(121)를 향하도록 배향되나, 상기 바닥부(121)에 고정되지 않은 미반응 재귀반사 입자들(110)은 부유 상태이므로 배향 방향이 불규칙적이고 시간의 경과에 따라 배향 방향이 변경될 수 있다.
이와 같이, 상기 바닥부(121)에 고정되지 않은 미반응 재귀반사 입자들로부터의 재귀반사 광에 의한 분석 오류를 최소화하기 위해, 상기 제6 단계(S160)에서는 타임랩스(Time-lapse) 기법으로 기 설정된 시간 동안 복수의 연속 촬영 이미지를 생성한 후 상기 기설정된 시간 동안 변화가 없는 정적 픽셀들은 유지하고, 변화가 발생한 동적 픽셀들은 제거하는 방식으로 이미지를 처리하고, 상기 처리된 이미지를 기초로 상기 바닥부(121)에 고정된 재귀반사 입자들의 수를 산출함으로써, 상기 목적 생체물질의 농도 등과 같은 정량 정보를 생성할 수 있다.
본 발명의 바이오 센서 및 이를 이용한 생체물질의 분석 방법에 따르면, 목적 생체물질과 미반응된 광학 표지자를 제거하는 과정을 중력에 의한 재귀반사 입자의 침전으로 대체하였으므로, 분석자에게서 기인하는 오류를 최소화할 수 있을 뿐만 아니라 간편한 방법으로 정확한 생체물질의 분석이 가능하다.
이하 본 발명의 실시예에 대해 상술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 일부 실시 형태에 불과한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재귀반사 입자들의 침전 특성 분석
500μm의 높이를 갖고, 바닥부에 제2 생체인지물질이 수식된 유체 채널을 구비하는 센싱 기판을 준비하였다. 그리고, 동일한 농도의 생체물질을 함유하는 검출 용액들에 재귀반사 입자들을 50, 75, 100 μg/mL의 농도로 혼합하여 3가지 검출 용액을 준비하였다.
상기 3가지 검출 용액 각각을 상기 유체 채널 내부에 주입하여 1차적으로 약 30분 동안 침전시킨 후 상기 센싱 기판을 반전시켰고, 상기 센싱 기판의 반전 후 1시간 동안 시간에 따른 재귀반사 입자의 개수의 변화를 측정하였다.
도 8은 센싱 기판의 반전 후 시간에 따른 재귀반사 입자의 개수의 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8을 참조하면, 모든 샘플들에서, 센싱 기판의 반전 이후 초기 5 내지 10분 동안에는 재귀반사 입자들의 수량이 급격히 변화하나 이후에는 측정되는 재귀반사 입자들의 수량의 변화가 미세한 것으로 나타났다. 따라서, 상기 재귀반사 입자들의 2차 침전을 유도하기 위한 시간으로는 약 5 내지 10분 이상 설정되는 것이 바람직할 것이다.
한편, 50 ㎍/mL 농도의 재귀반사 입자 용액에서 가장 많은 분리수율 변화가 측정되었다. 따라서, 검출 용액에 주입되는 재귀반사 입자의 농도는 약 40 내지 60 ㎍/mL인 것이 바람직할 것으로 판단된다.
CK-MB 마커에 대한 정량분석
0, 0.1, 1, 10, 100, 1000 ng/mL 농도의 인간혈청 CK-MB 검출 용액에 detection 항체가 수식된 재귀반사 입자들을 50 ㎍/mL 농도로 첨가하여 재귀반사 입자들과 CK-MB를 반응시켰다.
이어서, capture 항체가 고정화된 PMMA 센서기판에 상기 반응 후의 검출 용액을 주입한 후 일정시간 유지하여 상기 capture 항체와 CK-MB를 반응시켰다.
이어서, 상기 센싱기판을 반전시킨 후 약 10 내지 15 분 동안 유지시켰고, 이어서 상기 유체 채널 내부로 광을 조사한 후 재귀반사되는 광을 타임랩스 촬영 기법을 통해 이미지를 수득하였고, ImageJ S/W를 이용하여 지정된 면적위에 존재하는 재귀반사 입자들을 계수하였다.
도 9는 CK-MB 검출용액들에 대한 분석결과를 나타낸다.
도 9를 참조하면, 인간혈청 시료에서 측정된 CK-MB의 계산된 검출한계(Limit of detection, LOD)는 0.664 ng/mL이었고, 변동계수(Coefficient of variability, CV) 최대값은 6.82%이었다.
이상의 결과로부터, 본 발명에 따라 생체물질을 정량분석하는 경우 현저하게 낮은 변동계수를 정확한 분석을 수행할 수 있음을 확인할 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
100: 바이오 센서 110: 재귀반사 입자
120: 센싱 기판 130: 이미지 분석장치
140: 광원

Claims (9)

  1. 목적 생체물질과 선택적으로 반응하는 제2 생체인지물질이 표면에 수식되고 투명한 바닥부, 상기 바닥부와 대향하고 검출 용액의 주입구가 형성된 덮개부 및 이들 사이에 배치되고 관통 개구를 구비하는 측벽부를 포함하고, 상기 바닥부, 상기 덮개부 및 상기 측벽부에 의해 형성된 유체 채널을 구비하는 센싱 기판을 이용한 생체물질 분석 방법에 있어서,
    목적 생체물질을 함유하는 검출 용액에 상기 목적 생체물질과 선택적으로 반응하는 제1 생체인지물질이 수식된 재귀반사 입자들을 혼합하는 제1 단계;
    중력 방향을 기준으로 상기 바닥부가 상기 덮개부의 하부에 위치하도록 센싱 기판을 배치하는 제2 단계;
    상기 유체 채널에 상기 재귀반사 입자들이 혼합된 상기 검출 용액을 주입한 후 제1 시간동안 유지시키는 제3 단계;
    중력 방향을 기준으로 상기 바닥부가 상기 덮개부의 상부에 위치하도록 상기 센싱 기판을 회전시킨 후 제2 시간동안 유지시키는 제4 단계;
    상기 바닥부를 통하여 상기 유체 채널 내부에 광을 조사하는 제5 단계; 및
    상기 재귀반사 입자들로부터 재귀반사된 광에 대한 이미지를 생성 및 분석하는 제6 단계를 포함하고,
    상기 재귀반사 입자는 투명한 코어 입자, 상기 코어 입자의 일부를 피복하는 전반사 코팅층 및 상기 코어 입자의 노출면에 수식된 상기 제1 생체인지물질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체물질 분석 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 생체인지물질은 상기 코어 입자의 노출면에만 선택적으로 수식되고,
    상기 전반사 코팅층의 표면에는 티올계 화합물이 수식된 것을 특징으로 하는, 생체물질 분석 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 유체 채널의 높이는 50 내지 1000 ㎛인 것을 특징으로 하는, 생체물질 분석 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1 단계에 있어서, 상기 재귀반사 입자들은 10 내지 1000 μg/mL의 농도로 상기 검출 용액에 혼합되는 것을 특징으로 하는, 생체물질 분석 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제3 단계 동안 중력에 의해 상기 재귀반사 입자들은 상기 유체 채널 내부에서 상기 바닥부 방향으로 침전되고,
    상기 재귀반사 입자들에 결합된 목적 생체물질과 상기 바닥부에 수식된 상기 제2 생체인지물질 사이에 선택적 반응이 일어나는 것을 특징으로 하는, 생체물질 분석 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제3 단계 동안 상기 바닥부에 고정되지 않은 미반응 재귀반사 입자들은 중력에 의해 상기 덮개부 방향으로 침강하는 것을 특징으로 하는, 생체물질 분석 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제4 단계에서 상기 센싱 기판은 회전 후 10분 이상의 시간동안 유지되는 것을 특징으로 하는, 생체물질 분석 방법.
  9. 목적 생체물질과 선택적으로 반응하는 제2 생체인지물질이 표면에 수식되고 투명한 바닥부, 상기 바닥부와 대향하고 검출 용액의 주입구가 형성된 덮개부 및 이들 사이에 배치되고 관통 개구를 구비하는 측벽부를 포함하고, 상기 바닥부, 상기 덮개부 및 상기 측벽부에 의해 형성된 유체 채널을 구비하는 센싱 기판을 이용한 생체물질 분석 방법에 있어서,
    목적 생체물질을 함유하는 검출 용액에 상기 목적 생체물질과 선택적으로 반응하는 제1 생체인지물질이 수식된 재귀반사 입자들을 혼합하는 제1 단계;
    중력 방향을 기준으로 상기 바닥부가 상기 덮개부의 하부에 위치하도록 센싱 기판을 배치하는 제2 단계;
    상기 유체 채널에 상기 재귀반사 입자들이 혼합된 상기 검출 용액을 주입한 후 제1 시간동안 유지시키는 제3 단계;
    중력 방향을 기준으로 상기 바닥부가 상기 덮개부의 상부에 위치하도록 상기 센싱 기판을 회전시킨 후 제2 시간동안 유지시키는 제4 단계;
    상기 바닥부를 통하여 상기 유체 채널 내부에 광을 조사하는 제5 단계; 및
    상기 재귀반사 입자들로부터 재귀반사된 광에 대한 이미지를 생성 및 분석하는 제6 단계를 포함하고,
    상기 제6 단계는,
    상기 재귀반사 입자들로부터 재귀반사되는 광에 대해 타임랩스(Time-lapse) 기법으로 제3 시간 동안 복수의 연속 촬영 이미지를 생성하는 단계;
    상기 제3 시간 동안 변화가 없는 정적 픽셀들은 유지하고, 변화가 발생한 동적 픽셀들은 제거하는 방식으로 상기 이미지를 처리하는 단계; 및
    상기 처리된 이미지로부터 재귀반사 입자들을 계수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체물질 분석 방법.
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