CN110716058A - 一种超敏c反应蛋白检测用芯片 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物检测芯片制备技术与CRP检测技术领域，具体涉及一种超敏C反应蛋白检测用芯片。该芯片制备时包括：基片羧基化处理、进样进行芯片制备等步骤。本申请中，发明人以特定的现有生物分子相互作用分析仪为例，通过对于相关制备体系优化，制备获得了特定用于检测超敏C反应蛋白用检测芯片。初步实验验证结果表明，所制备检测芯片灵敏度、准确度较高，可以用于实际临床检验应用；同时由于基于SPR技术所制备检测用芯片具有制备成本低、使用方便等优点，因而使得本申请具有较好的推广应用价值。
Description
技术领域
本申请属于生物检测芯片制备技术与CRP检测技术领域，具体涉及一种超敏C反应蛋白检测用芯片。
背景技术
反应蛋白（C-reactive protein，CRP）由肝细胞合成，在胎儿期产生，非母体胎盘传递。其产生机理是：当机体受感染或组织受损伤时巨噬细胞和其他白细胞等被激活，产生白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子TNF-a等细胞因子及其他介导物，这些细胞因子和介导物到达肝脏，刺激肝细胞和上皮细胞合成CRP。而超敏CRP与普通CRP是同一种蛋白，只是其浓度较低，测定方法更灵敏，因此临床检测中主要以超敏CRP来作为检测指标。一般而言，临床检测应用中，当超敏CRP的浓度小于1 μg/ml、1~3 μg/ml、大于3μg/ml时，可分别用来预测低、中、高心血管疾病类风险。再配合其他临床症状，可作为冠状动脉疾病或急性冠脉综合征复发的预警指标。因此，超敏CRP的检测在临床疾病判定中具有十分重要的作用。
现有技术中，针对超敏CRP虽有多种检测方式，但普遍存在检测时间较长缺陷，例如：酶联免疫法大约30-120 min，乳胶免疫比浊法约15-30 min，酶促化学发光法约15-60min。加上现有检测方法也存在一些检测成本较高、操作较为复杂等缺陷，因此，从临床应用角度而言，极有必要进一步缩短检测的人力和物力成本。
表面等离子共振技术，简称SPR，是从20世纪90年代发展起来的一种新技术，其应用SPR原理检测生物传感芯片（biosensor chip）上配位体与分析物之间的相互作用情况，广泛应用于各个领域。与传统检测方法相比，SPR技术具有无需标记、对表面特性和物质变化敏感，实时、快速和易于实现自动化等特点，已被广泛应用于生命科学、临床诊断、药物筛选、食品安全、环境监测等领域，检测对象包括蛋白、核酸、激素、毒素、农药、细胞、微生物等。由于利用SPR技术具有检测速度较快（一般在2~5min）优点，因此如能利用SPR技术开发一种超敏C反应蛋白检测用芯片，可为临床中相关超敏C反应蛋白检测奠定良好技术基础。
发明内容
本申请目的在于提供一种超敏C反应蛋白（CRP，C-反应蛋白）检测用芯片，从而为相关疾病和医疗诊断奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种超敏C反应蛋白检测用芯片，具体通过如下步骤制备获得：
（一）基片羧基化处理
以镀金玻璃片作为芯片制备用基片，进行羧基化处理，具体而言：
首先，将镀金玻璃片在乙醇中超声清洗5min，再用去离子水冲洗干净，吹干后备用（一般用氮气吹干）；所述镀金玻璃片，玻璃片厚度一般为0.3-0.5 mm，金膜镀层厚度一般为50nm左右；
其次，将上述清洗并吹干后镀金玻璃片浸泡于浓度不小于0.1mM的十一巯基烷酸溶液中（乙醇配置），室温条件下浸泡不小于10小时，浸泡结束后，依次用乙醇和去离子水冲洗干净，最后吹干备用（一般用氮气吹干）；
（二）芯片制备
以现有杭州纽蓝科技有限公司生产销售的生物分子相互作用分析仪NeoSPR-M100（该仪器基于表面等离子共振技术研发，主要用于生物分子的相互作用分析；其原理为：当芯片表面发生生物分子结合时，芯片的折射率会发生改变，从而导致表面等离子体共振角改变，共振角的改变以共振像素形式得以实时记录；因而该仪器能实时分析芯片表面的生物分子变化情况，从而能用于相关生物分子的定量分析）为例，将步骤（一）中羧基化处理后基片插入仪器的芯片插口后，具体制备过程为：
（1）将仪器的进样口1和进样口2相连，进样口3与进样口4相连，出样口2与出样口3相连，将出样口4与注射泵相连；
（2）从出样口1进样，设定注射泵的抽取速度大于5 μl/min；
（3）从进样口进PBST（磷酸盐吐温（1%吐温-20）缓冲液，pH=7.4）样本，进样时间不小于10 min；
（4）将浓度为0.4 M EDC（N-(3-二甲基氨丙基)-N’-乙基碳二亚胺）和浓度为0.1M NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）等比例混合后，将混合液从出样口1进样，进样时间不小于5min，进样速度不小于5 μl/min，进样完成后进0.5-3 μl空气；
（5）将浓度不小于0.1μg/ml的CRP 抗体溶液（CRP抗体溶液pH=4.0-6.0，）从出样口1进样，进样时间不小于3 min，进样完成后进0.5-3 μl空气；
（6）将浓度为1 M的乙醇胺溶液（以超纯水配置）从出样口1进样，进样时间不小于7min，进样完成后进0.5-3 μl空气；随后进10 mM的PBST缓冲液，最后依次用乙醇和去离子水冲洗干净，干燥后（一般用氮气吹干）即为超敏C反应蛋白检测用芯片。
利用所述超敏C反应蛋白检测用芯片的CRP检测方法，同样以申请人自有的NeoSPR-M100仪器为例，具体检测步骤如下：
（1）分别将出样口1、出样口2、出样口3、出样口4与注射泵相连；
（2）分别从进样口1、进样口2、进样口3、进样口4进样，控制注射泵的抽取速度为20μl/min；进样顺序为：
不小于30 s PBST溶液→不小于1min待检CRP样品溶液→1min PBST溶液→1min 浓度为50 mM NaOH溶液→不小于30s PBST溶液；
（3）结果记录与判定：整个CRP检测过程中记录每个步骤的共振像素值，以待检CRP样品溶液的像素值与第一次进PBST溶液的像素值差值为响应信号，最终计算和判定待检待检CRP样品溶液中CRP含量或浓度数据。
本申请中，发明人以特定的现有生物分子相互作用分析仪为例，通过对于相关制备体系优化，制备获得了特定用于检测超敏C反应蛋白用检测芯片。初步实验验证结果表明，所制备检测芯片灵敏度、准确度较高，可以用于实际临床检验应用；同时由于基于SPR技术所制备检测用芯片具有制备成本低、使用方便等优点，因而使得本申请具有较好的推广应用价值。
附图说明
图1为NeoSPR-M100设备进样口、出样口示意图；
图2 为芯片制备过程中部分像素差值记录结果；
图3为 CRP检测过程中部分像素响应值；
图4为对待检样品CRP检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请做进一步的解释说明。介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分实验材料情况简要说明如下。
实验材料：
镀金玻璃片，苏州原位芯片科技有限公司产品；
CRP 抗体溶液（浓度7.9mg/ml；纯度>90%）、CRP样品（浓度2.4mg/ml；纯度>95%），均为武汉华美生物工程有限公司产品。
实施例
本申请所提供的超敏C反应蛋白检测用芯片，具体制备过程如下。
（一）基片羧基化处理
以镀金玻璃片作为芯片制备用基片，进行羧基化处理，具体而言：
首先，将镀金玻璃片在乙醇中超声清洗5min，再用去离子水冲洗干净，氮气吹干后备用；所述镀金玻璃片，玻璃片厚度为0.5 mm，金膜镀层平均厚度为50nm；
其次，将上述清洗并吹干后镀金玻璃片浸泡于浓度0.1mM的十一巯基烷酸溶液中（乙醇配置），室温条件下浸泡10小时，浸泡结束后，依次用乙醇和去离子水冲洗干净，最后氮气吹干即为羧基化后基片。
（二）芯片制备
以现有的杭州纽蓝科技有限公司的NeoSPR-M100生物分子相互作用分析仪为例，具体制备过程说明如下。
将羧基化基片插入仪器的芯片插口后：
（1）将仪器的进样口1和进样口2相连，进样口3与进样口4相连，出样口2与出样口3相连，将出样口4与注射泵相连（进样口、出样口顺序如图1所示）；
（2）从出样口1进样，设定注射泵的抽取速度大于5 μl/min；
（3）从进样口1进PBST（含1%质量份数吐温-20的磷酸盐吐温缓冲液，pH=7.4）样本，进样时间10 min；
（4）将浓度为0.4 M EDC（N-(3-二甲基氨丙基)-N’-乙基碳二亚胺）和浓度为0.1M NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）等体积比例混合后，将混合液从出样口1进样，进样时间5min，进样速度5 μl/min，进样完成后进3 μl空气；
（5）将浓度100μg/ml的CRP 抗体溶液从出样口1进样，进样时间3 min，进样完成后进3μl空气；
（6）将浓度为1 M的乙醇胺溶液（以超纯水配置）从出样口1进样，进样时间7min，进样完成后进3 μl空气；随后进10 mM的PBST缓冲液，最后依次用乙醇和去离子水冲洗干净，氮气吹干后即为超敏C反应蛋白检测用芯片。
步骤（二）的芯片制备过程中，记录每个步骤的像素值，以两次进PBST样本之间的像素差值为偶联量，进而判断检测芯片的制备效果。部分记录结果如图2所示。从图中可以看出，通过这种记录和测量，可以较为准确的判定芯片制备效果。
需要说明的是，上述芯片制备过程中的基片羧基化处理过程中，由于羧基化处理时，羧基化效果与十一巯基烷酸溶液浓度具有直接联系，因此发明人对十一巯基烷酸溶液的浓度进行了优化实验。
具体而言，以实际制备后芯片的像素值记录结果为评价标准，发明人对不同十一巯基烷酸溶液的浓度对像素值影响做了记录，具体芯片制备过程参考如上，仅调整部分参数如下：
步骤（一）中，十一巯基烷酸溶液的浓度分别设置为0.1、1、10、20mM以对基片进行羧基化处理；
步骤（二）的步骤（5）中，CRP抗体的浓度为100μg/ml（pH=6.0）。
不同十一巯基烷酸溶液浓度所制备芯片的像素值具体结果如下：
0.1mM十一巯基烷酸羧基化芯片的偶联量为56.23像素；
1mM十一巯基烷酸羧基化芯片的偶联量为100.52像素；
10mM十一巯基烷酸羧基化芯片的偶联量为212.89像素；
20mM十一巯基烷酸羧基化芯片的偶联量为219.54像素。
从上述结果可以看出，综合制备成分和制备效果而言，十一巯基烷酸浓度优选10mM较为适宜。
另一方面，芯片制备过程中，基于实验经验总结，由于CRP抗体溶液的pH与最终像素值也直接关联，发明人对CRP抗体溶液的pH进行了优化确定。
具体而言，以实际制备后芯片的像素值记录结果为评价标准，发明人对不同pH条件下的CRP抗体溶液所制备芯片像素值影响做了记录，具体芯片制备过程参考如上，仅调整部分参数如下：
步骤（一）中，十一巯基烷酸溶液的浓度设置为10mM以对基片进行羧基化处理；
步骤（二）的步骤（5）中，CRP抗体的浓度为100μg/ml，pH分别调整为4.4、5.0、5.4、6.0、7.0。
不同pH条件下CRP抗体溶液所制备芯片的像素值具体结果如下：
pH为4.4的偶联量为148.96像素；
pH为5.0的偶联量为209.56像素；
pH为5.5的偶联量为234.21像素；
pH为6.0的偶联量为212.89像素；
pH为7.0的偶联量为2.14像素。
综合上述结果可以看出，pH显然应在酸性条件下进行制备，结合抗体偶联量和活性情况，优选情况下不应超过6.0。
进一步地，芯片制备过程中，由于CRP抗体溶液浓度与最终像素值也直接关联，因此发明人对CRP抗体溶液的浓度进行了优化确定。
具体而言，以实际制备后芯片的像素值记录结果为评价标准，发明人对不同CRP浓度条件下的CRP抗体溶液所制备芯片像素值影响做了记录，具体芯片制备过程参考如上，仅调整部分参数如下：
步骤（一）中，十一巯基烷酸溶液的浓度设置为10mM以对基片进行羧基化处理；
步骤（二）的步骤（5）中，CRP抗体的浓度为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml，pH为6.0
不同的CRP抗体浓度条件下制备芯片的像素值如下：
CRP浓度为12.5μg/ml的偶联量为72.905像素
CRP浓度为25μg/ml的偶联量为143.604像素
CRP浓度为50μg/ml的偶联量为205.68像素
CRP浓度为100μg/ml的偶联量为212.89像素
CRP浓度为200μg/ml的偶联量为233.77像素
从上述结果看出，综合制备成本和制备效果而言，芯片制备过程中CRP抗体浓度优选50μg/ml。
（三）CRP检测
按上述制备过程，调节步骤（一）中的十一巯基烷酸溶液的浓度为10mM，步骤（二）的步骤（5）中CRP抗体的浓度为50μg/ml，pH=6.0，制备具体芯片以进行CRP检测应用实验。
需要说明的是，以PBST将购买的CRP样品溶液稀释至100 μg/ml作为母液后，将待检CRP样品溶液进一步稀释制备成不同实验组别：
50 μg/ml CRP溶液、25 μg/ml CRP溶液、12.5 μg/ml CRP溶液、6.25 μg/ml CRP溶液、3.13μg/ml CRP溶液、1.56 μg/ml CRP溶液、0.78 μg/ml CRP溶液、0.39 μg/ml CRP溶液、0.19μg/ml CRP溶液。
同样以申请人自有的NeoSPR-M100仪器为例，具体检测步骤如下：
（1）分别将出样口1、出样口2、出样口3、出样口4与注射泵相连；
（2）分别从进样口1、进样口2、进样口3、进样口4进样，控制注射泵的抽取速度为20μl/min；进样顺序为：
先进30 s PBST溶液得到基线像素值；
然后进2min待测CRP样品溶液得到CRP的实时像素值（将某一时刻的CRP实时响应值与基线像素值的差值作为该时刻的响应信号）；
再后进1min PBST溶液；
再后进1min 浓度为50 mM NaOH溶液以使芯片再生，再生完成后进30s PBST溶液，以使芯片回到进样前原始状态，从而便于下一次进样检测应用。
（3）结果记录与判定：整个CRP检测过程中记录每个步骤的共振像素值，以待检CRP样品溶液的像素值与第一次进PBST溶液的像素值差值为响应信号，最终计算和判定待检待检CRP样品溶液中CRP含量或浓度数据。
部分检测结果如图3所示，从中可以看出，不同进样时间、进样情况下均能较好测得不同响应值，从而便于对检测结果进行准确判定。
检测过程中，为对所制备检测用芯片灵敏度和准确度进行评价，对不同浓度CRP(0.19、0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50μg/ml)待检CRP样品溶液进样检测，取进样（待检CPR样品溶液）60s的数据进行响应信号分析。
结果如图4所示。可以看出，利用该芯片检测CRP样品时：检测上限高于50μg/ml，检测下限为0.19μg/ml，甚至可以更低；而在0.19-12.5μg/ml之间，线性相关系数为0.999。这一结果表明，一方面该芯片可以使用较宽范围的CRP浓度检测用，且检测准确度较高；另一方面检测灵敏度较高（检测下限越低，灵敏度越高）。
由于实际应用过程中，该芯片为可重复检测应用芯片，因此，对于其重复性需要进行评价。为此，以5μg/ml的待检CRP检测溶液为例，对同一芯片进行了重复性检测（参考前述步骤说明进行芯片重生恢复即可）。
对每次（共17次）进样60s后响应值记录如下：14.183、14.05、14.263、13.629、14.249、13.308、14.453、14.324、13.939、14.359、14.278、14.191、14.234、14.205、13.88、14.064、14.434（像素值）。统计表明，其CV仅为2%。这一结果表明，芯片重生后检测结果仍是较为稳定的，因此是可以重复再生应用的。
Claims (9)
1.一种超敏C反应蛋白检测用芯片，其特征在于，该芯片具体通过如下步骤制备获得：
（一）基片羧基化处理
以镀金玻璃片作为芯片制备用基片，进行羧基化处理；
（二）芯片制备
将步骤（一）中羧基化处理后基片插入芯片制备仪器的后，具体制备过程为：
（1）将芯片制备仪器的进样口、出样口分别进行连接，并将出样口与注射泵相连；
（2）设定注射泵的抽取速度大于5 μl/min；
（3）从进样口进PBST样本，进样时间不小于10 min；
（4）将EDC和NHS混合液进样，进样时间不小于5min，进样速度不小于5 μl/min，进样完成后进空气；
（5）将浓度不小于0.1μg/ml的CRP 抗体溶液进样，进样时间不小于3 min，进样完成后进空气；
（6）将乙醇胺溶液进样，进样时间不小于7min，进样完成后进；随后进PBST缓冲液，冲洗干净、干燥后即为超敏C反应蛋白检测用芯片。
2.如权利要求1所述超敏C反应蛋白检测用芯片，其特征在于，步骤（一）中，所述羧基化处理方式具体为：
首先，将镀金玻璃片在乙醇中清洗干净，吹干后备用；
其次，将上述清洗并吹干后镀金玻璃片浸泡于浓度不小于0.1mM的十一巯基烷酸溶液中，浸泡不小于10小时，浸泡结束后，冲洗干净、吹干。
3.如权利要求2所述超敏C反应蛋白检测用芯片，其特征在于，十一巯基烷酸浓度为10mM。
4.如权利要求1所述超敏C反应蛋白检测用芯片，其特征在于，步骤（一）中，所述镀金玻璃片，玻璃片厚度为0.3-0.5 mm，金膜镀层厚度为50nm。
5.如权利要求1所述超敏C反应蛋白检测用芯片，其特征在于，步骤（二）中，所述芯片制备仪器为杭州纽蓝科技有限公司的生物分子相互作用分析仪NeoSPR-M100。
6.如权利要求1所述超敏C反应蛋白检测用芯片，其特征在于，步骤（二）中，步骤（4）的EDC浓度为0.4 M，NHS浓度为0.1M，EDC和NHS混合液为等比例混合液。
7.如权利要求1所述超敏C反应蛋白检测用芯片，其特征在于，步骤（二）中，步骤（5）中，CRP抗体溶液pH=4.0-6.0。
8.如权利要求1所述超敏C反应蛋白检测用芯片，其特征在于，步骤（二）中，步骤（5）中，CRP抗体浓度为50μg/ml。
9.利用权利要求1所述超敏C反应蛋白检测用芯片的CRP检测方法，其特征在于，利用杭州纽蓝科技有限公司的生物分子相互作用分析仪NeoSPR-M100，具体检测步骤如下：
（1）分别将出样口1、出样口2、出样口3、出样口4与注射泵相连；
（2）分别从进样口1、进样口2、进样口3、进样口4进样，控制注射泵的抽取速度为20μl/min；进样顺序为：
不小于30 s PBST溶液→不小于1min待检CRP样品溶液→1min PBST溶液→1min 浓度为50 mM NaOH溶液→不小于30s PBST溶液；
（3）结果记录与判定：整个CRP检测过程中记录每个步骤的共振像素值，以待检CRP样品溶液的像素值与第一次进PBST溶液的像素值差值为响应信号，最终计算和判定待检待检CRP样品溶液中CRP含量或浓度数据。
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