CN116593708A - 一种基于乳胶增强免疫比浊法测定cdt的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，提供了一种基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒及其制备方法，包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括缓冲液、促凝剂、防腐剂、表明活性剂；所述试剂2包括缓冲液、兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液、防腐剂、表面活性剂、稳定剂；本发明可以很好的检测人血CDT，且该试剂盒具有操作简便、检测速度快、特异性好、精密度高、检测结果不受操作影响等特点，且在价格方面也有很大的优势，可大规模使用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说是一种基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒及其制备方法。
背景技术
目前，嗜酒已成为一个全球性问题，可导致无法逆转的心理和生理损伤，也会造成家庭和社会问题，因此，正确判断饮酒状态在临床医学、法医学和司法等不同的领域都有着重要的作用。
近年来，学者们也越来越多地关注一些新的饮酒标志物，如乙醛蛋白复合物、脂肪酸乙酯、GGT等，其中糖缺失性转铁蛋白(carbohydrate-deficient transferrin，CDT)无疑是最受关注的一项新标志物。其自1978年被发现后，CDT迅速成为基础研究和临床研究的焦点，无数研究结果证明，CDT与饮酒状态具有紧密的相关性，是目前敏感性和特异性最佳的独立的标志物；
转铁蛋白主要由肝脏细胞合成，含有3部分结构域，即，一条由679个氨基酸组成的多肽和2条糖链，2条糖链结合位点分别位于肽链的413号位和611号位，可结合不同的糖链分子，转铁蛋白肽链的2个糖链结合位点分别可结合2支、3支或4支的糖链，每支糖链末端为一个带有负电荷的唾液酸分子；Stibler等首次报道了于嗜酒者脑脊液和血清中存在pI为5.7的转铁蛋白亚型，此类亚型含有的唾液酸较少，糖链的糖化程度较低，其含量增高多见于嗜酒者体内，并在禁酒一段时间后消失，半衰期约为14天，这些亚型包括无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白和双唾液酸转铁蛋白，目前将此类并成为CDT。
目前实验室用于检测人血CDT的常规方法包括电泳法、色谱法以及免疫法；其中，电泳法和色谱法都是根据CDT和非CDT亚型的pI的差异将CDT进行区分，但转铁蛋白结合不同数量的铁离子也会影响其pI，故在检测前，需要将血清样本进行铁饱和，然后再进行电泳法或色谱法检测。
1、电泳法
等电聚焦电泳法具有很高的分离度，在具有pH梯度的凝胶上根据不同亚型pI的不同将CDT进行分离，在免疫固定和染色步骤之后可见各类转铁蛋白亚型的条带，最后进行密度计量可得到CDT结果，但由于其是根据条带密度进行定量，故这种方法无法避免在准确性和精密度方面存在缺陷。
2、色谱法
在1986年Stibler首次建立了离子交换微柱层析联合免疫检测的方法用于CDT的检测，但其敏感性和分离性不及等电聚焦电泳法。
3、免疫法
免疫法也是由Stibler于1986年首次建立的，由于缺少CDT特异性抗体，免疫法需要通过离子交换微柱将CDT亚型从血清中分离，随后加入抗人转铁蛋白血清进行定量检测，这种将色谱法和免疫法联合的检测方法很快得到发展，并推出了多种商售试剂，但用于缺乏CDT的特异性抗体，此种方法的特异性还是依靠色谱层析的分离程度，而后者往往受检测环境、人员操作的影响，故准确性无法得到保证。
综上所述，目前现有的技术手段对于检测人血CDT均有一定的弊端，或准确性和精密度存在缺陷，或敏感性和分离性不够好，或容易受到检测环境和人员操作的影响，故发明一种操作简便、检测速度快、特异性好、精密度高、检测结果不受操作影响的检测手段势在必行。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒及其制备方法，以解决现有技术中检测人血CDT均有一定的弊端，或准确性和精密度存在缺陷，或敏感性和分离性不够好，或容易受到检测环境和人员操作的影响等问题，而该试剂盒具有操作简便、检测速度快、特异性好、精密度高、检测结果不受操作影响等特点，能很好地解决上述问题。
一种基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括缓冲液、促凝剂、防腐剂、表明活性剂；所述试剂2包括缓冲液、兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液、防腐剂、表面活性剂、稳定剂。
优选的，所述试剂1中的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为磷酸盐缓冲液；所述试剂1缓冲液浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；
所述试剂1中的促凝剂选自聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的任意一种或多种，优选为聚乙二醇6000；所述试剂1中的促凝剂浓度为1.0g/L-50g/L，优选为5.0g/L-30g/L，最优选为20g/L；
所述试剂1中的防腐剂选自Proclin300、叠氮钠、硫柳汞中的任意一种，优选为叠氮钠；所述试剂1防腐剂浓度为0.1g/L-5.0g/L，优选为0.5g/L-2.0g/L，最优选为1.0g/L；
所述试剂1中的表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲拉通X-100中的任意一种或多种，优选为吐温20；所述试剂1表面活性剂浓度为5mmol/L-100mmo/L，优选为10mmo/L-30mmo/L，最优选为20mmo/L。
优选的，所述试剂2中的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为磷酸盐缓冲液；所述试剂2中的缓冲液浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；
所述试剂2中的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液中CDT抗体的浓度为10.0mg/L-1000mg/L，优选为100mg/L-500mg/L，最优选为300mg/L；
所述试剂2中的防腐剂选自Proclin300、叠氮钠、硫柳汞中的任意一种，优选为叠氮钠；所述试剂2中的防腐剂浓度为0.1g/L-5.0g/L，优选为0.5g/L-2.0g/L，最优选为1.0g/L；
所述试剂2中的表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲拉通X-100中的任意一种或多种，优选为吐温20，所述试剂2中的表面活性剂浓度为5mmol/L-100mmo/L，优选为10mmo/L-30mmo/L，最优选为20mmo/L；
所述试剂2中的稳定剂选自甘油、蔗糖、甘露醇、海藻糖、EDTA-Na2中的任意一种或多种，优选为EDTA-Na2；所述试剂2中的稳定剂浓度为5mmol/L-100mmo/L，优选为10mmo/L-30mmo/L，最优选为20mmo/L。
优选的，所述试剂1和试剂2的pH均为5.0-9.0，优选为6.0-8.0，最优选为7.0。
一种基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1、配置试剂1
按照试剂1的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，混合均匀后，定容，过滤，制得试剂1；
2、配置试剂2
S1、清洗：首先取不同粒径的胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；然后离心，去上清，沉淀用活化缓冲液超声重悬；
S2、活化：重悬后的胶乳微球悬液中加入活化剂活化，活化结束后，再次离心，沉淀用偶联缓冲液超声重悬；
S3、偶联：取兔抗人CDT抗体加入到活化好的胶乳微球悬液中，室温反应2小时，制得偶联好的乳胶微球；
S4、封闭：向上述活化好的胶乳微球悬液中加入封闭剂进行封闭，封闭结束后，离心，沉淀用胶乳保存缓冲液超声重悬，即制得所需的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液；
S5、按照试剂2的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，混合均匀后，定容，制得试剂2。
优选的，所述步骤S1中的胶乳微球的粒径大小为：80nm、95nm、107nm、123nm、141nm，优选为：95nm、107nm、123nm，最优选为：107nm；
所述步骤S1中的活化缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为MES缓冲液；所述活化缓冲液的浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；所述活化缓冲液的pH为4.0-8.0，优选为5.0-7.0，最优选为6.0；
所述步骤S2中的活化剂采用EDC/NHS；用量为胶乳固含的0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10.0％，优选为胶乳固含的0.5％、1.0％、2.0％；最优选为胶乳固含的1.0％；
所述步骤S2中的偶联缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为磷酸盐缓冲液；所述偶联缓冲液的浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；所述偶联缓冲液的pH为5.0-9.0，优选为6.0-8.0，最优选为7.0；
所述步骤S3中的兔抗人CDT抗体的用量为10.0mg/L-1000mg/L，优选为100mg/L-500mg/L，最优选为300mg/L；
所述步骤S4中的封闭剂采用BSA；用量优选于反应体积的0.5％、1.0％、2.0％，最优选为反应体积的1.0％；
所述步骤S4中的保存缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为磷酸盐缓冲液；所述保存缓冲液的浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；所述保存缓冲液的pH为5.0-9.0，优选为6.0-8.0，最优选为7.0。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明特异性强，是一种专门针对CDT的检测系统；操作简单，标本无需进行铁饱和预处理，也不用先进行离子交换层析再检测；自动化程度较高，不易受检测环境和人员操作的影响；同时也不受转铁蛋白突变亚型的干扰，从而将CDT的检测技术提升到了一个全新的台阶。
图说明
图1为本发明的试剂盒制备方法示意图；
图2为本发明的试剂2配置流程图；
图3为本发明的CDT试剂盒拟合曲线-实施例1示意图；
图4为本发明的CDT试剂盒拟合曲线-实施例4示意图；
图5为本发明的CDT试剂盒拟合曲线-实施例5示意图。
具体实施方式
下面结合图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
如图1和图2所示：一种基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括缓冲液、促凝剂、防腐剂、表明活性剂；所述试剂2包括缓冲液、兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液、防腐剂、表面活性剂、稳定剂；
所述试剂1中的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为磷酸盐缓冲液；所述试剂1缓冲液浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；
所述试剂1中的促凝剂选自聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的任意一种或多种，优选为聚乙二醇6000；所述试剂1中的促凝剂浓度为1.0g/L-50g/L，优选为5.0g/L-30g/L，最优选为20g/L；
所述试剂1中的防腐剂选自Proclin300、叠氮钠、硫柳汞中的任意一种，优选为叠氮钠；所述试剂1防腐剂浓度为0.1g/L-5.0g/L，优选为0.5g/L-2.0g/L，最优选为1.0g/L；
所述试剂1中的表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲拉通X-100中的任意一种或多种，优选为吐温20；所述试剂1表面活性剂浓度为5mmol/L-100mmo/L，优选为10mmo/L-30mmo/L，最优选为20mmo/L；
所述试剂2中的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为磷酸盐缓冲液；所述试剂2中的缓冲液浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；
所述试剂2中的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液中CDT抗体的浓度为10.0mg/L-1000mg/L，优选为100mg/L-500mg/L，最优选为300mg/L；
所述试剂2中的防腐剂选自Proclin300、叠氮钠、硫柳汞中的任意一种，优选为叠氮钠；所述试剂2中的防腐剂浓度为0.1g/L-5.0g/L，优选为0.5g/L-2.0g/L，最优选为1.0g/L；
所述试剂2中的表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲拉通X-100中的任意一种或多种，优选为吐温20，所述试剂2中的表面活性剂浓度为5mmol/L-100mmo/L，优选为10mmo/L-30mmo/L，最优选为20mmo/L；
所述试剂2中的稳定剂选自甘油、蔗糖、甘露醇、海藻糖、EDTA-Na2中的任意一种或多种，优选为EDTA-Na2；所述试剂2中的稳定剂浓度为5mmol/L-100mmo/L，优选为10mmo/L-30mmo/L，最优选为20mmo/L；
所述试剂1和试剂2的pH均为5.0-9.0，优选为6.0-8.0，最优选为7.0。
一种基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1、配置试剂1
按照试剂1的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，然后将其混合均匀后，最后通过定容和过滤，制得试剂1；
2、配置试剂2
S1、清洗：首先取不同粒径的胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；然后离心，去上清，沉淀用活化缓冲液超声重悬；
所述步骤S1中的胶乳微球的粒径大小为：80nm、95nm、107nm、123nm、141nm，优选为：95nm、107nm、123nm，最优选为：107nm；
所述步骤S1中的活化缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为MES缓冲液；所述活化缓冲液的浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；所述活化缓冲液的pH为4.0-8.0，优选为5.0-7.0，最优选为6.0。
S2、活化：重悬后的胶乳微球悬液中加入活化剂活化，活化结束后，再次离心，沉淀用偶联缓冲液超声重悬；
所述步骤S2中的活化剂采用EDC/NHS；用量为胶乳固含的0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10.0％，优选为胶乳固含的0.5％、1.0％、2.0％；最优选为胶乳固含的1.0％；
所述步骤S2中的偶联缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为磷酸盐缓冲液；所述偶联缓冲液的浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；所述偶联缓冲液的pH为5.0-9.0，优选为6.0-8.0，最优选为7.0。
S3、偶联：取兔抗人CDT抗体加入到活化好的胶乳微球悬液中，室温反应2小时，制得偶联好的乳胶微球；
所述步骤S3中的兔抗人CDT抗体的用量为10.0mg/L-1000mg/L，优选为100mg/L-500mg/L，最优选为300mg/L。
S4、封闭：向上述活化好的胶乳微球悬液中加入封闭剂进行封闭，封闭结束后，离心，沉淀用胶乳保存缓冲液超声重悬，即制得所需的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液；
所述步骤S4中的封闭剂采用BSA；用量优选于反应体积的0.5％、1.0％、2.0％，最优选为反应体积的1.0％；
所述步骤S4中的保存缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为磷酸盐缓冲液；所述保存缓冲液的浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；所述保存缓冲液的pH为5.0-9.0，优选为6.0-8.0，最优选为7.0。
S5、按照试剂2的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，然后将其混合均匀后，然后定容，制得试剂2。
如图3、图4、图5所示：本发明以独特技术将抗人糖缺失性转铁蛋白(CDT)抗体定向锚定在胶乳微球表面，样本中的糖缺失性转铁蛋白(CDT)与试剂中的相应抗体在液相中结合，形成抗原抗体复合物，产生浊度变化，胶乳试剂可以特异的增大该浊度变化，增大试剂的灵敏度，该浊度变化的高低与样本中糖缺失性转铁蛋白的含量成正比。测定该浊度，与校准品比较，即能得出样本中糖缺失性转铁蛋白的含量。
综上，本方法相较于传统的检测方法，其优势在于：特异性强，是一种专门针对CDT的检测系统；操作简单，标本无需进行铁饱和预处理，也不用先进行离子交换层析再检测；自动化程度较高，不易受检测环境和人员操作的影响；同时也不受转铁蛋白突变亚型的干扰，从而将CDT的检测技术提升到了一个全新的台阶。
本发明试剂盒使用方法：
1、按照上文所述实施方案任一项所述的组分及含量配制本发明的试剂盒。
2、按照如下参数在全自动生化仪上测定样本反应前后的吸光度差值。
表1 CDT测定基本参数表
3、根据吸光度变化差值，并与校准品比较，即可计算出样本中CDT的含量。
实施例1
本实施例是一种基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒及其制备方法，包括试剂1和试剂2。
其中试剂1的成分及相应含量为：浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液；浓度为20g/L的聚乙二醇6000；浓度为1.0g/L的叠氮钠；浓度为20mmo/L的吐温20；pH值为7.0；
其中试剂2的成分及相应含量为：浓度100mmol/L的磷酸盐缓冲液；浓度为300mg/L的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液；浓度为1.0g/L的叠氮钠；浓度为20mmo/L的吐温20；浓度为20mmo/L的EDTA-Na2；pH值为7.0。
其制备方法包括以下步骤：
1、配制试剂1：
按照试剂1的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，混合均匀后，定容，过滤，制得试剂1；
2、配制试剂2：
2.1、清洗：取不同粒径的胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；离心，去上清，沉淀用活化缓冲液超声重悬；
2.2、活化：重悬后的胶乳微球悬液中加入活化剂活化，活化结束后，再次离心，沉淀用偶联缓冲液超声重悬；
2.3、偶联：取兔抗人CDT抗体加入到活化好的胶乳微球悬液中，室温反应2小时，制得偶联好的乳胶微球；
2.4、封闭：向上述活化好的胶乳微球悬液中加入封闭剂进行封闭，封闭结束后，离心，沉淀用胶乳保存缓冲液超声重悬，即制得所需的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液。
2.5、按照试剂2的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，混合均匀后，定容，制得试剂2。
其中：胶乳微球的粒径大小为80nm；活化缓冲液为浓度100mmol/L的pH6.0的MES缓冲液；活化剂采用EDC/NHS；用量为胶乳固含的1.0％；偶联缓冲液为浓度100mmol/L的pH7.0的磷酸盐缓冲液；兔抗人CDT抗体的用量为300mg/L；封闭剂采用BSA；用量为反应体积的1.0％；保存缓冲液为浓度100mmol/L的pH7.0的磷酸盐缓冲液。
实施例2
本实施例是一种基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒及其制备方法，包括试剂1和试剂2。
其中试剂1的成分及相应含量为：浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液；浓度为5.0g/L的聚乙二醇6000；浓度为1.0g/L的叠氮钠；浓度为20mmo/L的吐温20；pH值为7.0；
其中试剂2的成分及相应含量为：浓度100mmol/L的磷酸盐缓冲液；浓度为300mg/L的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液；浓度为1.0g/L的叠氮钠；浓度为20mmo/L的吐温20；浓度为20mmo/L的EDTA-Na2；pH值为7.0。
其制备方法包括以下步骤：
1、配制试剂1：
按照试剂1的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，混合均匀后，定容，过滤，制得试剂1；
2、配制试剂2：
2.1、清洗：取不同粒径的胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；离心，去上清，沉淀用活化缓冲液超声重悬；
2.2、活化：重悬后的胶乳微球悬液中加入活化剂活化，活化结束后，再次离心，沉淀用偶联缓冲液超声重悬；
2.3、偶联：取兔抗人CDT抗体加入到活化好的胶乳微球悬液中，室温反应2小时，制得偶联好的乳胶微球；
2.4、封闭：向上述活化好的胶乳微球悬液中加入封闭剂进行封闭，封闭结束后，离心，沉淀用胶乳保存缓冲液超声重悬，即制得所需的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液。
2.5、按照试剂2的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，混合均匀后，定容，制得试剂2。
其中：胶乳微球的粒径大小为107nm；活化缓冲液为浓度100mmol/L的pH6.0的MES缓冲液；活化剂采用EDC/NHS；用量为胶乳固含的1.0％；偶联缓冲液为浓度100mmol/L的pH7.0的磷酸盐缓冲液；兔抗人CDT抗体的用量为300mg/L；封闭剂采用BSA；用量为反应体积的1.0％；保存缓冲液为浓度100mmol/L的pH7.0的磷酸盐缓冲液。
实施例3
本实施例是一种基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒及其制备方法，包括试剂1和试剂2。
其中试剂1的成分及相应含量为：浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液；浓度为20g/L的聚乙二醇6000；浓度为1.0g/L的叠氮钠；浓度为20mmo/L的吐温20；pH值为7.0；
其中试剂2的成分及相应含量为：浓度100mmol/L的磷酸盐缓冲液；浓度为100mg/L的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液；浓度为1.0g/L的叠氮钠；浓度为20mmo/L的吐温20；浓度为20mmo/L的EDTA-Na2；pH值为7.0。
其制备方法包括以下步骤：
1、配制试剂1：
按照试剂1的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，混合均匀后，定容，过滤，制得试剂1；
2、配制试剂2：
2.1、清洗：取不同粒径的胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；离心，去上清，沉淀用活化缓冲液超声重悬；
2.2、活化：重悬后的胶乳微球悬液中加入活化剂活化，活化结束后，再次离心，沉淀用偶联缓冲液超声重悬；
2.3、偶联：取兔抗人CDT抗体加入到活化好的胶乳微球悬液中，室温反应2小时，制得偶联好的乳胶微球；
2.4、封闭：向上述活化好的胶乳微球悬液中加入封闭剂进行封闭，封闭结束后，离心，沉淀用胶乳保存缓冲液超声重悬，即制得所需的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液。
2.5、按照试剂2的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，混合均匀后，定容，制得试剂2。
其中：胶乳微球的粒径大小为107nm；活化缓冲液为浓度100mmol/L的pH6.0的MES缓冲液；活化剂采用EDC/NHS；用量为胶乳固含的1.0％；偶联缓冲液为浓度100mmol/L的pH7.0的磷酸盐缓冲液；兔抗人CDT抗体的用量为100mg/L；封闭剂采用BSA；用量为反应体积的1.0％；保存缓冲液为浓度100mmol/L的pH7.0的磷酸盐缓冲液。
实施例4
本实施例是一种基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒及其制备方法，包括试剂1和试剂2。
其中试剂1的成分及相应含量为：浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液；浓度为20g/L的聚乙二醇6000；浓度为1.0g/L的叠氮钠；浓度为20mmo/L的吐温20；pH值为7.0；
其中试剂2的成分及相应含量为：浓度100mmol/L的磷酸盐缓冲液；浓度为300mg/L的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液；浓度为1.0g/L的叠氮钠；浓度为20mmo/L的吐温20；浓度为20mmo/L的EDTA-Na2；pH值为7.0。
其制备方法包括以下步骤：
1、配制试剂1：
按照试剂1的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，混合均匀后，定容，过滤，制得试剂1；
2、配制试剂2：
2.1、清洗：取不同粒径的胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；离心，去上清，沉淀用活化缓冲液超声重悬；
2.2、活化：重悬后的胶乳微球悬液中加入活化剂活化，活化结束后，再次离心，沉淀用偶联缓冲液超声重悬；
2.3、偶联：取兔抗人CDT抗体加入到活化好的胶乳微球悬液中，室温反应2小时，制得偶联好的乳胶微球；
2.4、封闭：向上述活化好的胶乳微球悬液中加入封闭剂进行封闭，封闭结束后，离心，沉淀用胶乳保存缓冲液超声重悬，即制得所需的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液。
2.5、按照试剂2的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，混合均匀后，定容，制得试剂2。
其中：胶乳微球的粒径大小为107nm；活化缓冲液为浓度100mmol/L的pH6.0的MES缓冲液；活化剂采用EDC/NHS；用量为胶乳固含的1.0％；偶联缓冲液为浓度100mmol/L的pH7.0的磷酸盐缓冲液；兔抗人CDT抗体的用量为300mg/L；封闭剂采用BSA；用量为反应体积的1.0％；保存缓冲液为浓度100mmol/L的pH7.0的磷酸盐缓冲液。
实施例5
本实施例是一种基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒及其制备方法，包括试剂1和试剂2。
其中试剂1的成分及相应含量为：浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液；浓度为20g/L的聚乙二醇6000；浓度为1.0g/L的叠氮钠；浓度为20mmo/L的吐温20；pH值为7.0；
其中试剂2的成分及相应含量为：浓度100mmol/L的磷酸盐缓冲液；浓度为300mg/L的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液；浓度为1.0g/L的叠氮钠；浓度为20mmo/L的吐温20；浓度为20mmo/L的EDTA-Na2；pH值为7.0。
其制备方法包括以下步骤：
1、配制试剂1：
按照试剂1的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，混合均匀后，定容，过滤，制得试剂1；
2、配制试剂2：
2.1、清洗：取不同粒径的胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；离心，去上清，沉淀用活化缓冲液超声重悬；
2.2、活化：重悬后的胶乳微球悬液中加入活化剂活化，活化结束后，再次离心，沉淀用偶联缓冲液超声重悬；
2.3、偶联：取兔抗人CDT抗体加入到活化好的胶乳微球悬液中，室温反应2小时，制得偶联好的乳胶微球；
2.4、封闭：向上述活化好的胶乳微球悬液中加入封闭剂进行封闭，封闭结束后，离心，沉淀用胶乳保存缓冲液超声重悬，即制得所需的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液。
2.5、按照试剂2的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，混合均匀后，定容，制得试剂2。
其中：胶乳微球的粒径大小为141nm；活化缓冲液为浓度100mmol/L的pH6.0的MES缓冲液；活化剂采用EDC/NHS；用量为胶乳固含的1.0％；偶联缓冲液为浓度100mmol/L的pH7.0的磷酸盐缓冲液；兔抗人CDT抗体的用量为300mg/L；封闭剂采用BSA；用量为反应体积的1.0％；保存缓冲液为浓度100mmol/L的pH7.0的磷酸盐缓冲液。
实施例6
本实施例用于评价上述实施例配制的基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒的性能：
(1)、准确度验证
选用德国西门子医学诊断产品有限公司的CDT质控品，分别用上述实施例制备的试剂(盒)进行测试，重复检测3次，取测试结果均值，并计算相对偏差，要求相对偏差不超过±15％，结果见表2-1、表2-2。
表2-1不同实施例准确度测试结果1(mg/L)
表2-2不同实施例准确度测试结果2(mg/L)
(2)、重复性验证
在重复性条件下，用浓度在20mg/L-200mg/L的样品来测试试剂(盒)，重复测试至少10次(n≥10)，分别计算测量值的平均值和标准差，并计算变异系数(CV)，要求CV≤10％，结果见表3-1、表3-2。
表3-1不同实施例低值样本重复性测试结果(mg/L)
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | |
| 1 | 32.7 | 37.1 | 33.7 | 35.2 | 34.9 |
| 2 | 36.1 | 37.5 | 36.1 | 33.9 | 36.4 |
| 3 | 35.4 | 36.9 | 35.2 | 35.6 | 34.5 |
| 4 | 38.3 | 34.9 | 36.5 | 34.2 | 33.7 |
| 5 | 35.6 | 34.5 | 34.6 | 35.5 | 36.3 |
| 6 | 32.5 | 35.2 | 33.5 | 35.3 | 35.2 |
| 7 | 35.4 | 32.5 | 37.2 | 36.1 | 36.1 |
| 8 | 36.8 | 33.7 | 38.1 | 33.6 | 33.9 |
| 9 | 38.2 | 38.1 | 31.6 | 36.1 | 35.6 |
| 10 | 31.4 | 34.0 | 35.0 | 35.4 | 34.8 |
| 平均值 | 35.24 | 35.44 | 35.15 | 35.09 | 35.14 |
| 标准差 | 2.36 | 1.86 | 1.93 | 0.88 | 0.96 |
| 变异系数 | 6.70％ | 5.25％ | 5.48％ | 2.52％ | 2.73％ |
表3-2不同实施例高值样本重复性测试结果(mg/L)
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | |
| 1 | 153.5 | 158.7 | 155.4 | 160.4 | 148.7 |
| 2 | 158.0 | 162.7 | 161.3 | 157.2 | 152.5 |
| 3 | 165.4 | 165.2 | 166.7 | 161.6 | 151.6 |
| 4 | 157.4 | 155.6 | 161.3 | 158.3 | 146.4 |
| 5 | 163.2 | 155.7 | 163.9 | 162.4 | 147.3 |
| 6 | 165.2 | 163.7 | 155.9 | 162.6 | 144.5 |
| 7 | 159.7 | 163.1 | 156.4 | 158.5 | 152.5 |
| 8 | 168.3 | 165.2 | 157.8 | 157.6 | 150.7 |
| 9 | 157.8 | 154.8 | 166.3 | 162.3 | 151.3 |
| 10 | 164.1 | 158.6 | 161.7 | 161.5 | 148.4 |
| 平均值 | 161.26 | 160.33 | 160.67 | 160.24 | 149.39 |
| 标准差 | 4.65 | 4.11 | 4.18 | 2.13 | 2.75 |
| 变异系数 | 2.88％ | 2.56％ | 2.60％ | 1.33％ | 1.84％ |
(3)、常规样本相关性验证
采用德国西门子医学诊断产品有限公司的CDT测定试剂盒和上述实施例配制的基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒分别测定覆盖整个测量范围的20份新鲜血清样本中CDT的值，结果见表4；以德国西门子医学诊断产品有限公司的CDT测定试剂盒测定的样本结果为横坐标，以上述实施例配制的基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒测定的样本结果为纵坐标绘制散点图，进行相关性分析，要求R2≥0.990；结果见表4。
表4不同实施例常规样本相关性验证结果(mg/L)
总结：通过上述实施例1-实施例5以及实施例6的数据分析不难看出，本发明的多数实施例都是能满足其性能要求的，无论是在重复性、精密度，还是在常规样本的测量方面，都不会存在太明显的差异，这为发明投入生产提供了很大的便利，但综合考虑，还是建议以最优选方案为投入生产时的首选。
本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (6)
1.一种基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒，其特征在于：包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括缓冲液、促凝剂、防腐剂、表明活性剂；所述试剂2包括缓冲液、兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液、防腐剂、表面活性剂、稳定剂。
2.如权利要求1所述基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒，其特征在于：所述试剂1中的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为磷酸盐缓冲液；所述试剂1中的缓冲液浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；
所述试剂1中的促凝剂选自聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的任意一种或多种，优选为聚乙二醇6000；所述试剂1中的促凝剂浓度为1.0g/L-50g/L，优选为5.0g/L-30g/L，最优选为20g/L；
所述试剂1中的防腐剂选自Proclin300、叠氮钠、硫柳汞中的任意一种，优选为叠氮钠；所述试剂1中的防腐剂浓度为0.1g/L-5.0g/L，优选为0.5g/L-2.0g/L，最优选为1.0g/L；
所述试剂1中的表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲拉通X-100中的任意一种或多种，优选为吐温20；所述试剂1中的表面活性剂浓度为5mmol/L-100mmo/L，优选为10mmo/L-30mmo/L，最优选为20mmo/L。
3.如权利要求1所述基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒，其特征在于：所述试剂2中的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为磷酸盐缓冲液；所述试剂2中的缓冲液浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；
所述试剂2中的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液中CDT抗体的浓度为10.0mg/L-1000mg/L，优选为100mg/L-500mg/L，最优选为300mg/L；
所述试剂2中的防腐剂选自Proclin300、叠氮钠、硫柳汞中的任意一种，优选为叠氮钠；所述试剂2中的防腐剂浓度为0.1g/L-5.0g/L，优选为0.5g/L-2.0g/L，最优选为1.0g/L；
所述试剂2中的表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲拉通X-100中的任意一种或多种，优选为吐温20，所述试剂2中的表面活性剂浓度为5mmol/L-100mmo/L，优选为10mmo/L-30mmo/L，最优选为20mmo/L；
所述试剂2中的稳定剂选自甘油、蔗糖、甘露醇、海藻糖、EDTA-Na2中的任意一种或多种，优选为EDTA-Na2；所述试剂2中的稳定剂浓度为5mmol/L-100mmo/L，优选为10mmo/L-30mmo/L，最优选为20mmo/L。
4.如权利要求1所述基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒，其特征在于：所述试剂1和试剂2的pH均为5.0-9.0，优选为6.0-8.0，最优选为7.0。
5.如权利要求1～4中任一项所述基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1、配置试剂1
按照试剂1的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，混合均匀后，定容，过滤，制得试剂1；
2、配置试剂2
S1、清洗：首先取不同粒径的胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；然后离心，去上清，沉淀用活化缓冲液超声重悬；
S2、活化：重悬后的胶乳微球悬液中加入活化剂活化，活化结束后，再次离心，沉淀用偶联缓冲液超声重悬；
S3、偶联：取兔抗人CDT抗体加入到活化好的胶乳微球悬液中，室温反应2小时，制得偶联好的乳胶微球；
S4、封闭：向上述活化好的胶乳微球悬液中加入封闭剂进行封闭，封闭结束后，离心，沉淀用胶乳保存缓冲液超声重悬，即制得所需的兔抗人CDT抗体致敏的乳胶颗粒悬液；
S5、按照试剂2的配方，准确称量各组分物质于同一容器中，混合均匀后，定容，制得试剂2。
6.如权利要求5所述基于乳胶增强免疫比浊法测定CDT的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的胶乳微球的粒径大小为：80nm、95nm、107nm、123nm、141nm，优选为：95nm、107nm、123nm，最优选为：107nm；
所述步骤S1中的活化缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为MES缓冲液；所述活化缓冲液的浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；所述活化缓冲液的pH为4.0-8.0，优选为5.0-7.0，最优选为6.0；
所述步骤S2中的活化剂采用EDC/NHS；用量为胶乳固含的0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10.0％，优选为胶乳固含的0.5％、1.0％、2.0％；最优选为胶乳固含的1.0％；
所述步骤S2中的偶联缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为磷酸盐缓冲液；所述偶联缓冲液的浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；所述偶联缓冲液的pH为5.0-9.0，优选为6.0-8.0，最优选为7.0；
所述步骤S3中的兔抗人CDT抗体的用量为10.0mg/L-1000mg/L，优选为100mg/L-500mg/L，最优选为300mg/L；
所述步骤S4中的封闭剂采用BSA；用量优选于反应体积的0.5％、1.0％、2.0％，最优选为反应体积的1.0％；
所述步骤S4中的保存缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的任意一种，优先为磷酸盐缓冲液；所述保存缓冲液的浓度为5mmol/L-200mmol/L，优选为50mmol/L-150mmol/L，最优选为100mmol/L；所述保存缓冲液的pH为5.0-9.0，优选为6.0-8.0，最优选为7.0。
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