CN103884682A - 表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物芯片领域，具体涉及一种表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用。所述生物芯片是通过在固相载体固定蝇毒磷-卵清蛋白耦联物作为生物探针，利用金膜产生表面等离子体共振响应，利用自组装单分子层技术在金膜表面修饰巯基，芯片活化后在生物芯片上固定探针得到的；该生物芯片的应用包括利用表面等离子体共振生物芯片直接法检测蝇毒磷单克隆抗体的应用和利用表面等离子体共振生物芯片通过抑制法检测蝇毒磷的应用。直接检测法可进行抗体的筛选，研究免疫反应动力学；竞争抑制法可检测蝇毒磷小分子的浓度，检测限低于25μg/L。该生物芯片具有快速、实时、能现场检测的特点，灵敏度高而成本低，不污染环境。

Description

表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物芯片领域，具体涉及一种表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用。

背景技术

二十世纪九十年代，人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)和分子生物学相关学科的发展为生物芯片、基因芯片技术的出现和发展提供了有利条件。生物芯片（biochip）是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程固着于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。蛋白质芯片(protein chip)是将蛋白质或抗原等一些非核酸生命物质固定在微型载体上获得，芯片上的探针构成为蛋白质或芯片作用对象为蛋白质者统称为蛋白质芯片。

尽管生物芯片技术已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但仍然存在着许多问题，例如技术成本昂贵、操作复杂、重复性差、分析范围较狭窄、通常需要放射性元素标记或者荧光标记等。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等方面。荧光法是目前使用最多的标记方法，灵敏度不高，需要避光，用于检测结果的激光扫描仪价格昂贵。同位素标记法需要同位素和放射自显影，使用不便，操作复杂，耗时，有严重的污染。

有机磷农药（organophosphorus pesticide,OPPs）是一类含有不同取代基团的磷酸酯，通过对乙酰胆碱酯酶的抑制作用起到杀虫效果，在创造巨大经济效益的同时，对环境造成了不可忽视的污染。中国是世界上施用农药量最大的国家之一，其中有机磷类农药用量接近农药用量的70%。有机磷农药会在果蔬等农产品中残留，严重威胁人类健康，对人类及动物具有神经毒性作用，会引起神经功能紊乱、震颤、精神错乱、语言失常甚至死亡等中毒症状，有机磷农药引起的中毒事件时有发生，并且人类通过饮食摄入还会将残留农药蓄积于体内，从而给人体造成慢性伤害。因此食品中有机磷农药残留问题一直受到人们关注，很多有机磷农药已被禁止或限制使用，一些国家及国际组织对食品中有机含磷农药的残留严格规定了限量，中国规定蝇毒磷在蔬菜和水果中的残留量低于0.05mg/kg，欧盟制定有机磷农药的最大残留限量（MRL）是0.1mg/kg。欧洲、日本等国家和地区不断修改进口水果、蔬菜中有机磷农药残留量的限制规定，因此有关农产品中有机磷农药残留检测方法的研究十分迫切且必要。

蝇毒磷是常用的有机磷农药，传统的蝇毒磷检测方法以色谱技术为主，如低压气相色谱-质谱联用技术、高效液相色谱法、薄层色谱法，另外还有波谱法和酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)等，这些方法灵敏度高，但是样品前处理过程繁琐，仪器贵重，操作复杂，成本高，不利于大批量样品的快速检测和现场检测，因此，开发简单、快速、灵敏和廉价的农药检测方法是一个亟待解决的问题。

表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）是一种基于麦克斯韦电磁波理论的物理光学现象，它产生于具有复介电常数这一特性的金属表面。表面等离子体共振技术（SPR）利用P偏振光在玻璃与金属薄膜界面处发生全内反射时进入金属薄膜内的隐失波（倏逝波）,引发金属中的自由电子产生表面等离子体,当隐失波的波矢与表面等离子体的波矢相匹配时，二者将发生共振,入射光的能量被表面等离子体吸收,反射光强急剧下降，发生SPR现象，这时对应的入射角度称为谐振角或者共振角。如果将探针或配体固定于传感器芯片表面，含待分析物的样品流经传感器表面，若流过生物芯片表面的样品中含有与之结合的物质，它们之间发生的相互作用将导致芯片表面的介质折射率发生改变，引起SPR共振角发生改变。通过检测SPR信号改变检测分子间的相互作用的特异性、浓度、动力学、亲合性、协同作用、相互作用模式等。在生物分子相互作用分析过程中，靶物质可以天然存在于分析物中，在自然条件下进行分析，保证了所得结果的真实性。因此，SPR生物传感器具有实时、免标记、操作简单、可定量检测生物分子、检测两种或多种分子间结合的优点。目前，SPR技术已广泛应用于食品检测、药物筛选、疾病诊断等领域。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种表面等离子体共振生物芯片，该生物芯片以蝇毒磷-卵清蛋白耦联物（H₁₁-OVA）作为探针。

本发明的另一目的在于提供上述表面等离子体共振生物芯片的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述表面等离子体共振生物芯片的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种表面等离子体共振生物芯片的制备方法，包含如下步骤：

（1）在玻璃基底上沉积厚度为45～55nm的金膜作为表面等离子体共振生物芯片的固相载体；

（2）在培养皿中注入含有HS(CH₂)₁₀COOH（巯基十一酸）和HS(CH₂)₆OH（巯基己酸）的乙醇溶液，对金膜表面进行化学修饰；然后通入PBS缓冲液清洗，洗掉未结合物质；氮气吹干；

（3）将上述固相载体固定在SPR检测仪上；

（4）流通池中通入PBS缓冲液清洗，待基线稳定后加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）的混合液活化芯片；然后通入PBS缓冲液清洗；

（5）在生物芯片表面固定蝇毒磷-卵清蛋白耦联物（H₁₁-OVA）；记录表面等离子体共振共振角的变化，监测生物探针固定的过程，SPR响应值有大幅升高，则探针固定效果较好,当共振角不再升高时，探针固定过程结束；然后注入PBS缓冲液清洗；

（6）加入乙醇胺（Eth）溶液封闭灭活剩余的酯键；然后通入PBS缓冲液清洗；得到表面等离子体共振生物芯片。

步骤（1）中所述的玻璃基底优选直径为20mm、厚度为1mm的圆形玻璃片；所述的金膜的厚度优选为50nm；

步骤（2）中所述的HS(CH₂)₁₀COOH的终浓度为0.1～10mM，优选为0.1mM；所述的HS(CH₂)₆OH的终浓度为0.1～100mM，优选为0.9mM；

步骤（2）中所述的化学修饰的条件为37℃温浴，避光反应0.5～6h，优选为2h；

步骤（2）所述的氮气吹干的温度为40～60℃，优选为50℃；

步骤（4）中所述的N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为0.05mol/L，所述的N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）碳二亚胺的终浓度为0.05mol/L；

步骤（4）中所述的活化芯片的时间为10～60min，优选为15min；

步骤（5）中所述的蝇毒磷-卵清蛋白耦联物（H₁₁-OVA）的浓度优选为83mg/L；所述的固定的时间为10～90min，优选为30min；其中，H₁₁为根据蝇毒磷结构设计的半抗原，H₁₁的结构式如式1所示：

式1；

步骤（6）中所述的乙醇胺溶液的浓度为1mol/L，pH值为8.5；所述的封闭灭活的时间为3～10min，优选为6min；

步骤（2）、（4）、（5）和（6）中所述的PBS缓冲液清洗的次数优选为2次，清洗的时间优选为2min；

所述的PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH₂PO₄、终浓度为2mmol/L的Na₂HPO₄、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4；

一种表面等离子体共振生物芯片，通过上述制备方法得到；

上述表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，包括利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测蝇毒磷单克隆抗体的应用、利用表面等离子体共振生物芯片通过抑制法检测蝇毒磷小分子的应用和利用表面等离子体共振生物芯片通过连续抑制法检测蝇毒磷小分子的应用；

所述的利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测蝇毒磷单克隆抗体，包含如下步骤：

（一）建立标准曲线：

已知浓度的蝇毒磷单克隆抗体用PBS缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液分别注入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；

（二）未知样品的检测：

将未知样品注入微流通池与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得未知样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤（一）得到的回归标准曲线，计算出未知样品中蝇毒磷单克隆抗体的浓度；

（三）下一样品检测：

步骤（二）中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗1～5次，每次清洗的时间是1～5min；再通入SDS-HCl溶液清洗1～3次，每次清洗时间是1～3min，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液1～5次，每次清洗的时间是1～3min；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。

步骤（一）中所述的蝇毒磷单克隆抗体标准溶液的优选浓度范围为0.01mg/L～100mg/L；

步骤（一）所述的标准溶液的检测量优选为100μL；所述的免疫反应的反应时间为3～10min，优选反应时间为5～6min；所述的表面等离子体共振扫描范围为0.5～4°，优选为1～2°；

步骤（二）中所述的未知样品的检测量优选为100μL；所述的免疫反应的反应时间为3～10min，优选反应时间为5～6min；所述的表面等离子体共振扫描范围为0.5～4°，优选为1～2°；

步骤（三）中所述的SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01mol/L；

步骤（三）中所述的PBS缓冲液清洗次数优选为2次，清洗的时间优选为2min；所述的SDS-HCl溶液清洗次数优选为1次，清洗的时间优选为1～3min；

所述的PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH₂PO₄、终浓度为2mmol/L的Na₂HPO₄、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4；

在生物芯片表面固定蝇毒磷-卵清蛋白耦联物（H₁₁-OVA），直接检测蝇毒磷单克隆抗体，可进行抗体筛选和研究免疫反应动力学。同一个芯片至少可连续检测50个样品，一个样品检测完，通入PBS缓冲液，然后通入SDS-HCl溶液，使抗原-抗体结合物解离，再通入PBS缓冲液SPR响应值降回基线，可继续检测下一个样品。

所述的利用表面等离子体共振生物芯片通过抑制法检测蝇毒磷小分子，包含如下步骤：

（Ⅰ）建立标准曲线：

蝇毒磷标准品用PBS缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，不同浓度的蝇毒磷标准溶液分别与定量蝇毒磷单克隆抗体溶液混合，静置，得到各个标准溶液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液；以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液分别注入表面等离子体共振仪的微流通池，与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子体共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；

（Ⅱ）未知样品的检测：

将未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体混合，静置，得到未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液，将上述混合溶液注入微流通池进行免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得待测样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤（Ⅰ）得到的回归标准曲线，计算出未知样品中蝇毒磷小分子的浓度；

（Ⅲ）下一样品的检测：

步骤（Ⅱ）中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗1～3次，每次清洗的时间是1～5min；再通入SDS-HCl溶液清洗1～3次，每次清洗时间是1～3min，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液1～5次，每次清洗的时间是1～3min；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。

步骤（Ⅰ）中所述定量蝇毒磷单克隆抗体在混合溶液中终浓度为10mg/L；

步骤（Ⅰ）中所述的蝇毒磷标准品分子量为362.78；

步骤（Ⅰ）中所述的标准溶液的浓度范围为0.1～10000μg/L；

步骤（Ⅰ）中所述的静置时间为1～15min，优选时间为8min；

步骤（Ⅰ）中所述的蝇毒磷标准品与蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液的检测量优选为100μL；所述的免疫反应的反应时间为1～10min；优选反应时间为6min；所述的表面等离子体共振扫描范围为0.5～4°，优选为1～2°；

步骤（Ⅱ）中所述的定量蝇毒磷单克隆抗体在混合溶液中终浓度为10mg/L；所述的静置时间为1～15min，优选时间为8min；

步骤（Ⅱ）中所述的未知样品提取液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液检测量为100μL；所述的免疫反应的反应时间为1～10min，优选反应时间为6min；所述的表面等离子体共振扫描范围为0.5～4°，优选为1～2°；

步骤（Ⅲ）中所述的SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01mol/L；

步骤（Ⅲ）中所述的PBS缓冲液清洗次数优选为2次，每次清洗的时间优选为2min；所述的SDS-HCl溶液清洗次数优选为1次，每次清洗的时间优选为1～3min；

所述的PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH₂PO₄,终浓度为2mmol/L的Na₂HPO₄、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4；

所述的利用表面等离子体共振生物芯片通过连续抑制法检测蝇毒磷小分子，包含如下步骤：

①建立标准曲线：

蝇毒磷标准品用PBS缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，不同浓度的蝇毒磷标准溶液分别与定量蝇毒磷单克隆抗体溶液混合，静置，得到各个标准溶液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液；以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液分别注入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子体共振动力学曲线；以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；

②未知样品的检测：

将未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体混合，静置，得到未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液，将上述混合溶液注入微流通池进行免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得待测样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤①得到的回归标准曲线，计算出未知样品中蝇毒磷小分子的浓度；

③下一样品的检测：

步骤②中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗1～3次，每次清洗的时间是1～5min；继续检测下一个样品。

步骤①中所述的定量蝇毒磷单克隆抗体在混合溶液中终浓度为10mg/L；

步骤①中所述的蝇毒磷标准品分子量为362.78；

步骤①中所述的标准溶液的浓度范围为0.1～10000μg/L；

步骤①中所述的静置时间为1～15min，优选时间为8min；

步骤①中所述的蝇毒磷标准品与蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液的检测量优选为100μL；所述的免疫反应的反应时间为1～10min；优选反应时间为6min；所述的表面等离子体共振扫描范围为0.5～4°，优选为1～2°；

步骤②中所述的定量蝇毒磷单克隆抗体在混合溶液中终浓度为10mg/L；所述的静置时间为1～15min，优选时间为8min；

步骤②中所述的未知样品提取液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液检测量优选为100μL；所述的免疫反应的反应时间为1～10min，优选反应时间为6min；所述的表面等离子体共振扫描范围为0.5～4°，优选为1～2°；

所述的PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH₂PO₄、终浓度为2mmol/L的Na₂HPO₄、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4；

SPR检测蝇毒磷免疫反应得到的曲线为对数增长曲线，先快后慢，逐渐趋于平缓，最后免疫反应达到饱和。蝇毒磷免疫反应速度较慢，在起始阶段（5min内）免疫反应的响应值与时间近似呈线性关系，通常5min以后反应速度才趋于平缓，15min后才会达到平衡，并且当生物芯片表面固定的生物探针较多，待测样品的浓度不高时，起始阶段探针与待测物的结合数量少，只占芯片表面探针的小部分，对后面加入的样品中待测物与芯片探针的结合影响很小。解离速度与抗体本身的性质、温度以及缓冲液成分有关。蝇毒磷免疫反应完成后，通入PBS缓冲液使抗原-抗体结合物解离，解离速度很慢。现场实际检测中，如果减少单个样品的检测时间，可以对更多组别的样品进行连续检测。连续抑制法检测蝇毒磷小分子省略酸或碱洗脱的步骤，简化了实验步骤，减少了芯片再生过程，降低测量成本，有利于推广到大量样品的现场检测。

本发明的原理：在固相载体（镀金膜的玻璃片）固定蝇毒磷-卵清蛋白耦联物（H₁₁-OVA）作为生物探针，利用金膜产生表面等离子体共振（SPR）响应，利用自组装单分子层技术在金膜表面修饰巯基，经活化后芯片可以固定探针，样品注入微流通池，与探针发生免疫反应，由P偏振光检测生物芯片探针与样品的反应（图1）。当检测样品中有与探针匹配的物质时，共振角发生变化，SPR检测仪记录检测结果，获得检测样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合回归标准曲线，分析实验结果。蝇毒磷的分子量较小（362.78），不适于直接检测。如果生物芯片表面固定蝇毒磷单克隆抗体作为探针，蝇毒磷能与抗体结合，但对芯片表面附近的折射率影响小，SPR共振峰的变化小，直接检测效果不好。为了检测蝇毒磷痕量小分子物质，本发明提出抑制免疫型生物芯片法。芯片表面固定H₁₁-OVA作为探针，蝇毒磷小分子与定量的蝇毒磷单克隆抗体混合后注入流通池，蝇毒磷小分子和芯片表面的H₁₁-OVA都可以与蝇毒磷单克隆抗体结合，是竞争的关系，蝇毒磷小分子抑制了蝇毒磷单克隆抗体与芯片表面的探针H₁₁-OVA结合，样品中蝇毒磷的浓度与响应值的变化成反比。如果样品中蝇毒磷浓度小，则更多的蝇毒磷单克隆抗体与芯片表面探针结合，SPR响应值即共振角的变化更大。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明不需要对样品标记，对环境无污染。

（2）本发明只需单一抗体，样品处理简单且用量少，简化了操作步骤，缩短了检测时间，降低了成本。

（3）本发明采用H₁₁-OVA作为探针，应用SPR技术进行信号检测，不需要昂贵的检测仪器，降低了芯片的使用成本及实验条件。

（4）本发明可以用便携式SPR检测仪实现样品的现场快速检测，可以广泛应用于普通实验室，有望在超市、市场、工厂等需要食品质量实时监控的场所，实现大量样品的现场快速检测。

本发明可实现生物芯片技术的快速、实时、能现场检测的特点，可迅速给出定量结果、灵敏度高而成本低，不污染环境。直接检测法检测蝇毒磷单克隆抗体可研究抗原-抗体亲和力及动力学反应过程，适用于基础研究和抗体的筛选等。抑制检测法可检测蝇毒磷小分子，灵敏度高，符合中国和欧洲水果、蔬菜中农药残留的标准，可用于食品检测、药物筛选、疾病诊断等领域，将会产生较好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1是本发明的表面等离子体共振生物芯片系统模式图。

图2是实施例2中表面等离子体共振生物芯片检测2mg/L蝇毒磷单克隆抗体的共振角变化图。

图3是实施例2中部分蝇毒磷单克隆抗体标准溶液的共振曲线图。

图4是实施例3中各个蝇毒磷标准溶液的共振角变化图。1为PBS形成的基线；2是芯片表面活化；3是活化后PBS清洗；4是生物芯片表面探针（H₁₁-OVA）的固定；5是PBS缓冲液清洗；6是乙醇胺封闭；7是PBS清洗；8、10、12、14、16、18、20、22所示，分别为检测蝇毒磷分子浓度为5000μg/L、3000μg/L、1000μg/L、500μg/L、300μg/L、100μg/L、50μg/L和0μg/L的样品的动力学曲线；标识9、11、13、15、17、19、21、23所示为SDS-HCl溶液洗脱。

图5是实施例3中部分蝇毒磷标准溶液的表面等离子共振动力学曲线。

图6是实施例3获得的回归标准曲线。

图7是实施例4的共振角变化图。阶段1是PBS缓冲液形成的基线，2是通入EDC/NHS，使生物芯片活化，3是活化后PBS清洗，4是探针（H₁₁-OVA）固定，5是PBS清洗，6是乙醇胺封闭，7是封闭后PBS清洗。抑制法连续检测5个样品，蝇毒磷单克隆抗体工作浓度为10mg/L，蝇毒磷小分子浓度分别为500μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、0μg/L，抗体与蝇毒磷小分子混合，静置5min，然后依次通入生物芯片表面，阶段8、9、10、11、12记录了5个样品的动态检测曲线，每个样品检测完仅用PBS清洗。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

蝇毒磷标准品（0.02g/mL）购买于农业部环境保护科研监测所；

蝇毒磷-卵清蛋白耦联物（H₁₁-OVA）和未纯化的蝇毒磷单克隆抗体（5mg/mL）根据参考文献（Xu Z L,Shen Y D,Zheng W X,et al.Broad-specificityimmunoassay for O,O-diethyl organophosphorus pesticides:application of molecularmodeling to improve assay sensitivity and study antibody recognition[J].Analyticalchemistry,2010,82(22):9314-9321.）制备得到；其中H₁₁的结构式如式1所示：

N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）、乙醇胺（Eth）、十二烷基硫酸钠（SDS）、HS(CH₂)₁₀COOH（巯基十一酸）和HS(CH₂)₆OH（巯基己酸）购于美国Sigma公司；其它试剂购于北京化学试剂公司；PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH₂PO₄、终浓度为2mmol/L的Na₂HPO₄、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4；SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01m_ol/L。

实施例1表面等离子体共振生物芯片的制备

（1）以直径为20mm、厚度为1mm的圆形玻璃片作为基底，在玻璃基底上沉积厚度为50nm的金膜作为表面等离子体共振生物芯片的固相载体；

（2）培养皿中注入含有终浓度为0.1mM的HS(CH₂)₁₀COOH（巯基十一酸）和0.9mM HS(CH₂)₆OH（巯基己酸）的乙醇溶液4mL，37℃温浴，避光，对金膜表面进行化学修饰2h；然后通入PBS缓冲液充分清洗2次，每次2min，洗掉未结合物质；50℃氮气吹干；

（3）将上述固相载体固定在SPR检测仪上；

（4）流通池中通入PBS缓冲液清洗2次，每次2min，待基线稳定后加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）的混合液150μL，活化芯片15min；然后通入PBS缓冲液清洗2次，每次清洗2min；其中，混合液中，N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为0.05mol/L、N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）碳二亚胺的终浓度为0.05mol/L；

（5）蝇毒磷-卵清蛋白耦联物（H₁₁-OVA）（5mg/mL）稀释60倍，取100μL通入生物芯片表面，固定生物探针，固定时间为30min；记录表面等离子体共振共振角的变化，监测生物探针固定的过程,当共振角不再升高时，探针固定过程结束；然后通入PBS缓冲液清洗2次，每次2min；

（6）加入1mol/L的乙醇胺溶液（pH=8.5）150μL，封闭灭活剩余的酯键6min；然后通入PBS缓冲液清洗2次，每次2min。

实施例2利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测蝇毒磷单克隆抗体

（1）建立标准曲线：

用PBS缓冲液配置成不同浓度的蝇毒磷单克隆抗体标准溶液：浓度分别为0μg/L、100μg/L、500μg/L、1mg/L、2mg/L；以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液分别取100μL依次注入表面等离子共振仪的微流通池，与实施例1制备得到的表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，反应时间设定为6min；对生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，扫描范围为1～2°；记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液发生免疫反应的表面等离子体共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；其中图2为表面等离子体共振生物芯片检测2mg/L蝇毒磷单克隆抗体的共振角变化图，图3为部分蝇毒磷单克隆抗体标准溶液的共振曲线图；

（2）未知样品的检测：

将100μL的未知样品通入微流通池与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，反应时间设定为6min；对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，扫描范围为1～2°；记录SPR共振角的变化，获得未知样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤（1）得到的回归标准曲线，计算出未知样品中蝇毒磷单克隆抗体的浓度；

（3）下一样品检测：

一个样品检测结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗2次，每次清洗2min；再通入SDS-HCl溶液处理1～3次，使抗原-抗体结合物解离，每次处理1～3min；然后通入PBS缓冲液2次，每次清洗2min；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。

配置不同浓度的蝇毒磷单克隆抗体标准溶液，样品浓度分别为：200μg/L、400μg/L、800μg/L，记为其真实值；同时利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测上述蝇毒磷单克隆抗体标准溶液中蝇毒磷单克隆抗体的含量：通过SPR检测仪测定的数据结合步骤（1）得到的回归标准曲线，计算出样品中蝇毒磷单克隆抗体浓度的检测值；检测值与真实值进行对比，如表1所示。检测值与真实值的绝对偏差均较小，其相对偏差亦均较小，说明SPR生物芯片检测系统具有良好的检测能力，实验方法可行。

表1利用表面等离子体共振生物芯片直接法检测蝇毒磷单克隆抗体结果分析

随着免疫反应的进行，生物芯片表面抗原-抗体结合物增多，SPR响应值增大。随样品中蝇毒磷单克隆抗体浓度升高，免疫反应速度增快，SPR共振角增大，共振曲线右移。检测每个样品时，免疫反应先快后慢，逐步趋于饱和。

实施例3利用表面等离子体共振生物芯片通过抑制法检测蝇毒磷

（1）建立标准曲线：

蝇毒磷标准品溶液与蝇毒磷单克隆抗体溶液混合并静置8min，在混合溶液中蝇毒磷单克隆抗体采用固定的工作浓度：10mg/L；蝇毒磷标准品的终浓度分别为0μg/L、50μg/L、100μg/L、300μg/L、500μg/L、1000μg/L、3000μg/L和5000μg/L；以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液与抗体溶液的混合溶液分别取100μL注入表面等离子共振仪的微流通池，与实施例1制备得到的表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，反应时间为6min；对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，扫描范围为1～2°；记录免疫反应过程中SPR共振角的变化（图4），获得各个蝇毒磷标准溶液的表面等离子共振动力学曲线（图5），以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线（图6）；

（2）未知样品的检测：

将未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体混合并静置8min，在混合溶液中蝇毒磷单克隆抗体采用固定的工作浓度：10mg/L；得到未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液，将100μL上述混合溶液注入微流通池进行免疫反应，反应时间设定为6min；对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，扫描范围为1～2°；记录SPR共振角的变化，获得待测样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤（1）得到的回归标准曲线，计算出未知样品中蝇毒磷小分子的浓度；

（3）下一样品的检测

一个样品检测结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗2次，每次清洗2min；再通入SDS-HCl溶液处理1～3次，使抗原-抗体结合物解离，每次处理1～3min；然后通入PBS缓冲液2次，每次清洗的时间是2min；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。

配置不同浓度的蝇毒磷标准溶液，样品浓度分别为：200μg/L、400μg/L、800μg/L、1600μg/L，记为其真实值；同时利用表面等离子体共振生物芯片通过抑制法检测上述蝇毒磷标准溶液中蝇毒磷的含量：通过SPR检测仪测定的数据结合步骤（1）得到的回归标准曲线，计算出样品中蝇毒磷小分子浓度的检测值；检测值与真实值进行对比，如表2所示。检测值与真实值的绝对偏差均较小，其相对偏差亦均较小，说明SPR生物芯片检测系统具有良好的检测能力，实验方法可行。

表2利用表面等离子体共振生物芯片通过抑制法检测蝇毒磷结果分析

抑制法检测蝇毒磷小分子的标准曲线近似呈倒“S”型，对每一个浓度进行反复测试（3次）的标准偏差小于5%，检出限为25μg/L，符合中国和欧盟关于农药残留的标准。由未知浓度的待测样品SPR响应值，查询标准曲线，可得出样品中蝇毒磷的浓度，可用于食品质量监控和现场实时检测。

当样品中蝇毒磷浓度大时，可与芯片表面探针结合的蝇毒磷单克隆抗体数量少，免疫反应速度慢，SPR响应值低，蝇毒磷小分子浓度与SPR响应值成反比。经测定每个生物芯片至少可连续检测50组样品，超过50组样品SPR响应值明显下降，说明生物芯片表面固定的探针受损。这时芯片表面通入SDS-HCl溶液可实现芯片再生，重新自组装并固定生物探针。

实施例4利用表面等离子体共振生物芯片通过连续抑制法检测蝇毒磷

（1）建立标准曲线：

蝇毒磷标准品溶液与蝇毒磷单克隆抗体溶液混合并静置8min，在混合溶液中蝇毒磷单克隆抗体采用固定的工作浓度：10mg/L；蝇毒磷标准品的终浓度分别为500μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、0μg/L；以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液与抗体溶液的混合溶液分别取100μL注入表面等离子共振仪的微流通池，与实施例1制备得到的表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，反应时间为6min；对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，扫描范围为1～2°；记录免疫反应过程中SPR共振角的变化（图7），获得各个蝇毒磷标准溶液的表面等离子共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；

（2）未知样品的检测：

将未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体混合并静置8min，在混合溶液中蝇毒磷单克隆抗体采用固定的工作浓度：10mg/L；得到未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液，将100μL上述混合溶液注入微流通池进行免疫反应，反应时间设定为6min；对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，扫描范围为1～2°；记录SPR共振角的变化，获得待测样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤（1）得到的回归标准曲线，计算出未知样品中蝇毒磷小分子的浓度；

（3）下一样品的检测：

步骤（2）中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗1～3次，每次清洗的时间是1～5min；继续检测下一个样品。

配置不同浓度的蝇毒磷标准溶液，样品浓度分别为160μg/L、80μg/L、40μg/L，记为其真实值；同时利用表面等离子体共振生物芯片通过连续抑制法检测上述蝇毒磷标准溶液中蝇毒磷的含量；通过SPR检测仪测定的数据结合步骤（1）得到的回归标准曲线，计算出样品中蝇毒磷小分子浓度的检测值；检测值与真实值进行对比，如表3所示。检测值与真实值的绝对偏差均较小，其相对偏差亦均较小，说明SPR生物芯片检测系统具有良好的检测能力，实验方法可行。现场实际检测中，如果减少单个样品的检测时间，可以对更多组别的样品进行连续检测。该方法省略酸或碱洗脱的步骤，减少了实验步骤，简化了芯片再生过程，降低测量成本，有利于推广到大量样品的现场检测。

表3利用表面等离子体共振生物芯片通过连续抑制法检测蝇毒磷结果分析

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种表面等离子体共振生物芯片的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）在玻璃基底上沉积厚度为45～55nm的金膜作为表面等离子体共振生物芯片的固相载体；

（2）在培养皿中注入含有HS(CH₂)₁₀COOH和HS(CH₂)₆OH的乙醇溶液，对金膜表面进行化学修饰；然后通入PBS缓冲液清洗，洗掉未结合物质；氮气吹干；

（3）将上述固相载体固定在SPR检测仪上；

（4）流通池中通入PBS缓冲液清洗，待基线稳定后加入N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）碳二亚胺的混合液活化芯片；然后通入PBS缓冲液清洗；

（5）在生物芯片表面固定蝇毒磷-卵清蛋白耦联物，记录表面等离子体共振共振角的变化，监测生物探针固定的过程，当共振角不再升高时，探针固定过程结束；然后注入PBS缓冲液清洗；

（6）加入乙醇胺溶液封闭灭活剩余的酯键；然后通入PBS缓冲液清洗；得到表面等离子体共振生物芯片。

2.根据权利要求1所述的一种表面等离子体共振生物芯片的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的玻璃基底为直径为20mm、厚度为1mm的圆形玻璃片；所述的金膜的厚度为50nm；

步骤（2）中所述的HS(CH₂)₁₀COOH的终浓度为0.1mM；所述的HS(CH₂)₆OH的终浓度为0.9mM；

步骤（2）中所述的化学修饰的条件为37℃温浴，避光反应2h；

步骤（2）所述的氮气吹干的温度为50℃；

步骤（4）中所述的N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为0.05mol/L，所述的N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）碳二亚胺的终浓度为0.05mol/L；

步骤（4）中所述的活化芯片的时间为15min；

步骤（5）中所述的蝇毒磷-卵清蛋白耦联物的浓度为83mg/L；所述的固定的时间为30min；

步骤（6）中所述的乙醇胺溶液的浓度为1mol/L，pH值为8.5；所述的封闭灭活的时间为6min；

步骤（2）、（4）、（5）和（6）中所述的PBS缓冲液清洗的次数为2次，清洗的时间为2min；

所述的PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH₂PO₄、终浓度为2mmol/L的Na₂HPO₄、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4。

3.一种表面等离子体共振生物芯片，其特征在于采用权利要求1或2所述方法制备得到。

4.权利要求3所述的一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用。

5.根据权利要求4所述的一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于：包括利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测蝇毒磷单克隆抗体的应用、利用表面等离子体共振生物芯片通过抑制法检测蝇毒磷小分子的应用和利用表面等离子体共振生物芯片通过连续抑制法检测蝇毒磷小分子的应用。

6.根据权利要求5所述的一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于：所述的利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测蝇毒磷单克隆抗体，包含如下步骤：

（一）建立标准曲线：

已知浓度的蝇毒磷单克隆抗体用PBS缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液分别注入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；

（二）未知样品的检测：

将未知样品注入微流通池与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得未知样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤（一）得到的回归标准曲线，计算出未知样品中蝇毒磷单克隆抗体的浓度；

（三）下一样品检测：

步骤（二）中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗1～5次，每次清洗的时间是1～5min；再通入SDS-HCl溶液清洗1～3次，每次清洗时间是1～3min，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液1～5次，每次清洗的时间是1～3min；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。

7.根据权利要求6所述的一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于：

步骤（一）中所述的蝇毒磷单克隆抗体标准溶液的浓度范围为0.01mg/L～100mg/L；

步骤（一）所述的标准溶液的检测量为100μL；所述的免疫反应的反应时间为5～6min；所述的表面等离子体共振扫描范围为1～2°；

步骤（二）中所述的未知样品的检测量为100μL；所述的免疫反应的反应时间为5～6min；所述的表面等离子体共振扫描范围为1～2°；

步骤（三）中所述的SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01mol/L；

步骤（三）中所述的PBS缓冲液清洗次数为2次，每次清洗的时间为2min；所述的SDS-HCl溶液清洗次数为1次，清洗的时间为1～3min；

所述的PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH₂PO₄、终浓度为2mmol/L的Na₂HPO₄、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4。

8.根据权利要求5所述的一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于：所述的利用表面等离子体共振生物芯片通过抑制法检测蝇毒磷小分子，包含如下步骤：

（Ⅰ）建立标准曲线：

蝇毒磷标准品用PBS缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，不同浓度的蝇毒磷标准溶液分别与定量蝇毒磷单克隆抗体溶液混合，静置，得到各个标准溶液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液；以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液分别注入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子体共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；

（Ⅱ）未知样品的检测：

将未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体混合，静置，得到未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液，将上述混合溶液注入微流通池进行免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得待测样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤（Ⅰ）得到的回归标准曲线，计算出未知样品中蝇毒磷小分子的浓度；

（Ⅲ）下一样品的检测：

步骤（Ⅱ）中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗1～3次，每次清洗的时间是1～5min；再通入SDS-HCl溶液清洗1～3次，每次清洗时间是1～3min，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液1～5次，每次清洗的时间是1～3min；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。

9.根据权利要求8所述的一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于：

步骤（Ⅰ）中所述定量蝇毒磷单克隆抗体在混合溶液中终浓度为10mg/L；

步骤（Ⅰ）中所述的蝇毒磷标准品分子量为362.78；

步骤（Ⅰ）中所述的标准溶液的浓度范围为0.1～10000μg/L；

步骤（Ⅰ）中所述的静置时间为8min；

步骤（Ⅰ）中所述的蝇毒磷标准品与蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液的检测量为100μL；所述的免疫反应的反应时间为6min；所述的表面等离子体共振扫描范围为1～2°；

步骤（Ⅱ）中所述的定量蝇毒磷单克隆抗体在混合溶液中终浓度为10mg/L；所述的静置时间为8min；

步骤（Ⅱ）中所述的未知样品提取液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液检测量为100μL；所述的免疫反应的反应时间为6min；所述的表面等离子体共振扫描范围为1～2°；

步骤（Ⅲ）中所述的SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01mol/L；

步骤（Ⅲ）中所述的PBS缓冲液清洗次数为2次，每次清洗的时间为2min；所述的SDS-HCl溶液清洗次数为1次，清洗的时间为1～3min；

所述的PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH₂PO₄,终浓度为2mmol/L的Na₂HPO₄、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4。

10.根据权利要求5所述的一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于：所述的利用表面等离子体共振生物芯片通过连续抑制法检测蝇毒磷小分子，包含如下步骤：

①建立标准曲线：

蝇毒磷标准品用PBS缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，不同浓度的蝇毒磷标准溶液分别与定量蝇毒磷单克隆抗体溶液混合，静置，得到各个标准溶液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液；以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液分别注入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子体共振动力学曲线；以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；

②未知样品的检测：

将未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体混合，静置，得到未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液，将上述混合溶液注入微流通池进行免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得待测样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤①得到的回归标准曲线，计算出未知样品中蝇毒磷小分子的浓度；

③下一样品的检测：

步骤②中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗1～3次，每次清洗的时间是1～5min；继续检测下一个样品；

步骤①中所述的定量蝇毒磷单克隆抗体在混合溶液中终浓度为10mg/L；

步骤①中所述的蝇毒磷小分子分子量为362.78；

步骤①中所述的标准溶液的浓度范围为0.1～10000μg/L；

步骤①中所述的静置时间为8min；

步骤①中所述的蝇毒磷标准品与蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液的检测量为100μL；所述的免疫反应的反应时间为6min；所述的表面等离子体共振扫描范围为1～2°；

步骤②中所述的定量蝇毒磷单克隆抗体在混合溶液中终浓度为10mg/L；所述的静置时间为8min；

步骤②中所述的未知样品提取液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液检测量为100μL；所述的免疫反应的反应时间为6min；所述的表面等离子体共振扫描范围为1～2°；

所述的PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH₂PO₄、终浓度为2mmol/L的Na₂HPO₄、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4。

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