CN112574320A

CN112574320A - 一种犬布鲁氏菌病诊断用融合蛋白抗原

Info

Publication number: CN112574320A
Application number: CN202011593041.8A
Authority: CN
Inventors: 孙明军; 孙翔翔; 殷德辉; 刘蒙达; 樊晓旭; 田莉莉; 孙淑芳; 邵卫星; 范伟兴
Original assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Current assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2040-12-29
Also published as: CN112574320B

Abstract

本发明而提供一种布鲁菌病特异性融合蛋白抗原，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。本发明所提供的融合蛋白抗原包含了多个布鲁氏菌优势外膜抗原表位，具有好的伸展性、稳定性和生物活性。利用本发明融合蛋白建立的犬布鲁氏菌病ELISA抗体检测试剂盒具有高的敏感性和特异性。特异性交叉实验显示，融合蛋白与大肠杆菌O157血清、大肠杆菌H7血清、沙门氏菌O抗原多价血清、小肠耶尔森氏菌血清和单增李斯特菌血清与阴性血清的OD450比值均小于1.5，犬布鲁菌阳性血清与阴性血清的OD450比值大于5，表明本发明所提供的融合蛋白不与感染了其他细菌的血清发生交叉反应，从而保证了检测的准确性。

Description

一种犬布鲁氏菌病诊断用融合蛋白抗原

技术领域

本发明属于动物疫病检测技术领域，具体涉及一种犬布鲁氏菌病诊断用融合蛋白抗原。

背景技术

布鲁氏菌病(以下简称布病)是一种由布鲁氏菌引起的重要的人兽共患传染病,是国际动物卫生组织(OIE)规定必须通报的动物疫病，《中华人民共和国传染病防治法》规定其为乙类传染病，该病对我国养殖业、食品安全与人类健康构成重大威胁。目前布鲁氏菌属主要包括6个种，即羊种、牛种、猪种、绵羊附睾种、沙林鼠种和犬种布鲁氏杆菌。在我国主要流行羊种、牛种、猪种和犬种布鲁氏菌，均对人致病。人可通过接触患病动物的流产物、排泄物、乳、肉等经消化道和呼吸道感染。人布病的主要临床表现为波浪热、乏力、关节痛、神经痛、肝脾肿大、睾丸炎、流产等，还可引起脑膜炎、心内膜炎、脊柱炎等慢性病症，严重损伤身体，甚至丧失工作能力。

犬布鲁氏菌病是由犬种布鲁氏菌(B.canis)引起的传染病，感染的主要动物是各种犬类，但还可感染人，是人布鲁氏菌病的重要传染源之一。1966年，从美国比格犬中首次分离到犬种布鲁氏菌，证明该菌可引起与其他种(牛、羊、猪)布鲁氏菌类似的疾病：流产、不育和生殖功能减退。可通过结膜、口腔和阴道的粘膜感染犬，口腔的最小感染剂量约为10⁶个菌落形成单位(CFU)，而结膜最小感染剂量约为10⁴至10⁵个CFU，大部分感染是通过口鼻接触流产的胎儿及其分泌物而发生的，因为其中每毫升可能含有多达10¹⁰个细菌。同时，也可通过尿液或性交传播，这在犬养殖场中非常普遍。犬种布鲁氏菌感染宿主后，以游离细菌或在吞噬细胞内被运输到局部淋巴结，造成局部淋巴结肥大，淋巴和网状内皮增生以及炎症。如果细菌没有被免疫系统及时清除，它们就会通过血液和淋巴进行复制和传播，并在生殖器官、淋巴结和脾脏内持续增殖，导致生殖衰竭和非特异性、周期性发热。犬布鲁氏菌病在世界范围内呈地方流行，在美国东南部的农村地区和城市贫民窟，犬的血清阳性率较高，欧洲国家犬布病血清平均阳性率在3.7％，某些国家的阳性率可达11％。在非洲农村地区，犬布病阳性率较高，可达30％以上。亚洲国家的犬布病流行情况也比较严重，巴基斯坦的阳性率在10％左右，我国不同城市犬不病阳性率在0.5％至25％不等。犬布病的高感染率增加了人感染犬种布鲁氏菌的可能性，高风险人群包括兽医、动物饲养者、实验室工作人员等，处于妊娠期的妇女、儿童和免疫抑制病患者更加易感。在我国，近年来由犬种布鲁氏菌引发的人感染事件不断发生，而且随着宠物犬数量的不断增长，人面临的感染风险越来越大，对公共卫生安全和同一个健康理念造成极大挑战。

与其他种类的布鲁氏菌(牛种、羊种和猪种)不同，犬布鲁氏菌外周膜脂多糖(LPS)中缺乏寡聚糖链(OPS)，而OPS是其他种类的布鲁氏菌的主要抗原表位，在其血清学检测中起着重要的作用。由于犬种布鲁氏菌缺乏OPS，极大限制了犬布鲁氏菌病检测技术的发展，我国目前商品化的产品较单一，仅有虎红平板凝集(RBT)试剂可用，它是以犬种布鲁氏菌的全菌作为抗原来检测血清中的抗体。全菌抗原的制备要涉及布鲁氏菌培养，人员感染的风险很大，而且需要在生物安全三级实验条件下操作，增加了制作成本。

发明内容

本发明为了解决现有技术的匮乏以及安全性低的缺点，而提供一种布鲁菌病特异性融合蛋白抗原，用于检测由犬种布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病。

本发明首先提供一种犬布鲁氏菌病诊断用融合蛋白抗原，其氨基酸序列如SEQ IDNo:1所示。

编码上述融合蛋白抗原的基因，其一种核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

本发明还提供一种用于表达上述融合蛋白的原核表达载体，所述的核表达载体中插入了用于编码述融合蛋白抗原的核酸片段；

作为实施例的一种具体记载，是在含有T7启动子的原核表达载体pET-28a中插入了编码上述融合蛋白抗原的基因。

本发明还提供一种重组菌株，是转入了上述的原核表达载体。

本发明另一个方面还提供一种犬布鲁菌病抗体ELISA试剂盒，它的诊断抗原为上述的布鲁氏菌病特异性融合蛋白；

本发明再一个方面还提供一种犬布鲁菌病免疫胶体金试纸条,它的诊断抗原为上述的布鲁氏菌病特异性融合蛋白。

本发明所提供的融合蛋白抗原包含了多个布鲁氏菌优势外膜抗原表位，具有好的伸展性、稳定性和生物活性。融合蛋白原核表达的密码子进行了优化，适用于在大肠杆菌BL21(DE3)的表达，并保持了融合蛋白的可溶性。临床样品检测结果表明，利用本发明融合蛋白建立的犬布鲁氏菌病ELISA抗体检测试剂盒具有高的敏感性和特异性，敏感性为92.5％，而特异性达到97.7％。特异性交叉实验显示，融合蛋白与大肠杆菌O157血清、大肠杆菌H7血清、沙门氏菌O抗原多价血清、小肠耶尔森氏菌血清和单增李斯特菌血清与阴性血清的OD₄₅₀比值均小于1.5，犬布鲁菌阳性血清与阴性血清的OD₄₅₀比值大于5，表明本发明所提供的融合蛋白不与感染了其他细菌的血清发生交叉反应，从而保证了检测的准确性。同时，本发明融合蛋白克服了传统的细菌培养安全性差、易对环境造成污染和感染人的缺点，用于犬布鲁氏菌病ELISA抗体检测试剂盒，还具有背景值低、重复性好、灵敏度高的优点，为犬布鲁菌病的快速、准确、特异诊断提供手段。

附图说明

图1：布鲁氏菌特异性融合蛋白亲疏水性分析图(数值越低表示亲水性越好)；

图2：纯化的融合蛋白SDS-PAGE鉴定结果图；

图3：犬布鲁氏菌病ELISA抗体检测试剂盒(融合蛋白)的ROC曲线图；

图4：ELISA抗体检测试剂盒与粗糙型虎红平板凝集试验比较图；

图5：免疫胶体金试纸条对犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清的鉴别检测结果图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：布鲁氏菌主要膜蛋白B细胞抗原多肽的预测和筛选

1、从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中获取布鲁氏菌主要外膜蛋白BP26、Omp2b、Omp16、Omp25和Omp31的氨基酸序列，采用Bepipred Linear EpitopePrediction、ABCpred prediction Server软件对外膜蛋白的B细胞抗原表位进行预测，选择α螺旋、β折叠少、亲水性和抗原性好的序列作为优势抗原表位(见表1)。

表1主要外膜蛋白B细胞抗原多肽预测信息表

2、利用NCBI网站蛋白序列比对功能，将上述预测的多肽与数据库中的蛋白序列进行比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，剔除与其他细菌的蛋白序列相似性(identity)达90％-100％的多肽。结果发现，多肽P2和P7与人苍白杆菌具有100％一致性，因此予以剔除。

3、预测多肽对犬布鲁氏菌阳性和阴性标准血清的鉴别能力验证。

将预测的抗原多肽分别偶联血蓝蛋白(KLH)作为抗原，采用间接ELISA法，用已知犬布鲁氏菌病阳和阴性血清对多肽进行筛选，具体步骤如下：

(1)抗原包被：抗原多肽和KLH偶联抗原以100μL/孔(5μg/mL)包被于酶标反应板中，4℃过夜；PBST洗板3次，每次3min，拍干。

(2)加入2％脱脂奶粉进行封闭，200μL/孔，37℃封闭2h，同上洗板；

(3)加入犬标准阳性和阴性血清(1:100稀释)(中国动物卫生与流行病学中心保存)，100μL/孔，37℃孵育1h，同上洗板；每个多肽做一孔重复。

(4)加入工作浓度的(1:8000稀释)HRP标记的重组链球菌蛋白G(rSPG)，100μL/孔，室温孵育1h，同上洗板；

(5)加入TMB底物显色液，100μL/孔，室温避光反应15min；

(6)加入终止液(2mol/L H₂SO₄)，50μL/孔；

(7)酶标仪读取OD₄₅₀值，P/N值越大表示对阳性和阴性血清的鉴别能力越强。

结果显示：多肽P5、P11、P12、P14、P16和P22的P/N值均小于2，而其它多肽的P/N值均大于2，P/N值的区间在2.621至9.718之间(见表2)。

表2：预测抗原多肽对犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清鉴别能力对比表

根据以上结果，选择多肽P1、P3、P4、P6、P8、P9、P10、P13、P15、P17、P18、P19、P20和P21进行串联，并在原核细胞内表达，作为犬布鲁氏菌病诊断用抗原。

实施例2布鲁氏菌特异性融合蛋白的设计及原核表达质粒的构建

将上述预测的抗原表位串联，各表位之间使用柔性多肽linker“GGGGS”相连接，最终形成含有366个氨基酸序列的蛋白，其序列如SEQ ID NO.1。利用在线软件对其可溶性进行分析(https://www.novopro.cn/tools/prot-sol.html)，预测的溶解度(归一化后)为0.659，表明该蛋白的溶解较高(>0.45代表溶解度溶解性可能比数据集的均值要高)。蛋白的疏水性分析表明，该蛋白的亲水性较好(图1)。较好的溶解性和亲水性表明该融合蛋白可作为理想的抗原用于抗体检测。

利用密码子优化工具(ExpOptimizer)对融合蛋白的氨基酸序列进行密码子优化，人工合成方法构建融合蛋白基因序列如SEP ID NO.2所示。将所构建的融合蛋白基因插入pET28a(+)载体中，选择插入的酶切位点为Nde I和Hind III。

实施例3：布鲁氏菌融合蛋白的表达和纯化

将构建的含有融合蛋白序列(SEP ID NO.2)的pET28a(+)质粒热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌，涂LB平板(含30μg/mL卡那霉素)，37℃培养过夜。从平板上挑选单个菌落接种于LB液体培养基中(含30μg/mL卡那霉素)，37℃，200r/min过夜。然后，取过夜培养物菌液与新鲜配制的LB液体培养基(含30μg/mL卡那霉素)按1:100体积扩大培养，当菌液的OD₆₀₀达到0.6时，添加终浓度为0.3mmol/L的IPTG。经优化，诱导的最佳条件为25℃，150r/min诱导8h，此时融合蛋白在上清中的表达量最高。

将收集的菌体用提取缓冲液(50mmol/L Tris，300mmol/LNaCl，0.1％Trition X-100，pH＝8.0)重悬后，冰浴条件下超声破碎菌体，超声功率为400W，超声3s，暂停3s为一个循环，共处理15min。超声结束后，破碎的菌液经4℃，12000rpm，离心20min，取上清。

采用镍柱亲和层析方法对上清中的融合蛋白进行纯化，将收集的纯化蛋白液用超滤浓缩为1mg/ml，然后置于-80℃保存。将纯化后的融合蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，结果所示，所表达的融合蛋白分子量介于40KD-50KD左右，条带清晰且没有杂带(图2)。

实施例4融合蛋白对犬布鲁氏菌阳性和阴性血清的鉴别能力验证

采用间接ELISA法，用已知犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清对纯化后的融合蛋白进行检测，具体步骤如下：

(1)包被酶标反应板：将融合蛋白稀释成40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL的溶液，分别包被酶标板，4℃过夜。

(2)封闭：弃去包被液，PBST洗板3次，拍干，用2.5％脱脂奶粉进行封闭，200μL/孔，37℃，封闭1小时。

(3)弃去封闭液，PBST洗板3次，然后加入100μL犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清(1:100稀释)(中国动物卫生与流行病学中心保存)，100μL/孔,两孔重复，37℃，孵育1小时。

(4)加入工作浓度的HRP标记重组链球菌蛋白G(HRP-rSPG，1:8000稀释)，100μL/孔，室温孵育1小时，同上洗板。

(5)加入TMB底物显色液，100μL/孔，室温避光反应15min。

(6)加入终止液，50μL/孔。

(7)酶标仪读取OD₄₅₀值。

结果显示：0.125μg至4μg包被条件下，融合蛋白对犬布鲁氏菌阳性和阴性血清均具有良好的鉴别能力(P/N值均大于4)(见表3)。其中，在0.25μg包被条件下，融合蛋白显示最好的鉴别能力(P/N＝6.10)。

表3：融合蛋白对犬布鲁氏菌阳性和阴性血清鉴别能力表

实施例5:犬布鲁氏菌病ELISA抗体检测试剂盒(融合蛋白为抗原)的制备

(1)最佳抗原包被浓度和血清稀释度：融合蛋白分别作40.0μg/mL、20.0μg/mL、10.0μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL和1.25μg/mL稀释，取100μL包被于酶标反应板中，4℃过夜。犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清分别作1:50、1:100、1:200、1:400、1:800稀释，每个浓度设3个重复，酶标仪读取OD₄₅₀值后取平均值，选择P/N值最大者作为最佳抗原包被浓度和血清稀释度。

表4：最佳抗原包被浓度和血清稀释度表

由表4可知，P/N的最大值为6.620，所以融合蛋白最佳包被浓度为2.5μg/mL，血清的最佳稀释度为1:100。

(2)最佳抗原包被条件

分别在4℃过夜、37℃孵育2h和37℃孵育1h三种条件下包被融合蛋白抗原，同时设置犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清对照，各3复孔，酶标仪读取OD₄₅₀值后取平均值，选择P/N值最大者作为最佳抗原包被条件。

表5：最佳抗原包被条件的确定表

由表5可知，P/N值最大为6.573，因此4℃孵育过夜是最佳的抗原包被条件。

(3)最佳封闭液、封闭时间选择

分别选择0.5％BSA、1％BSA、2％脱脂奶粉和1％胎牛血清作为封闭液，选择37℃孵育1h和2h作为封闭时间，同时设置犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清对照，各3复孔，酶标仪读取OD₄₅₀值后取平均值，选择P/N值最大者作为最佳封闭液和封闭时间。

表6：最佳封闭液和封闭时间的确定表

由表6可知，P/N值最大为5.945，因此2％脱脂奶粉为最佳封闭液，37℃孵育1h为最佳封闭条件。

(4)最佳血清反应时间

分别选择30min、60min、90min和120min作为待测血清的反应时间，同时设置犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清对照，每个血清反应时间均设置3个重复，酶标仪读取OD₄₅₀值后取平均值，选择P/N值最大者作为最佳血清反应时间。

表7：最佳血清反应时间的确定表

由表7可知，P/N值最大为6.636，此时待测血清的最佳反应时间为90min。

(5)最佳酶标抗体稀释度和反应时间

将酶标抗体HRP-rSPG(购自北京博尔西生物技术有限公司，浓度为1mg/mL)分别作1:5000、1:10000、1:15000和1:20000浓度稀释，同时设置犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清，每个浓度每种血清均设置3个重复，酶标仪读取OD₄₅₀值后取平均值。设置酶标抗体的反应时间为30min、60min、90min和120min，各3个重复，酶标仪读取OD₄₅₀值后取平均值，选择P/N值最大者作为最佳酶标抗体稀释度和反应时间。

表8：最佳酶标抗体稀释度的确定表

表9：最佳酶标抗体反应时间的确定表

由表8、表9可知，酶标抗体的最佳稀释度为1:5000，最佳反应时间为30min。

(6)最佳底物显色时间

分别选择5min、10min、15min和20min作为底物显色时间，同时设置犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清，每个底物显色时间每种血清均设置3个重复，酶标仪读取OD₄₅₀值后取平均值，选择P/N值最大者作为最佳底物显色时间。

表10：最佳底物显色时间的确定表

由表10可知，最佳底物显色时间为15min。

根据上述优化条件，对犬布鲁氏菌病ELISA抗体检测试剂盒的敏感性、特异性和重复性等进行评估：

(7)犬布鲁氏菌病ELISA抗体检测试剂盒的ROC曲线及临界值确定

53份犬布鲁氏菌阳性血清(中国动物卫生与流行病学中心保存)来自于经PCR病原学检测确认为布鲁氏菌感染的门诊动物，87份血清来自于济南某比格犬试验场，该场连续三年没有检出布鲁氏菌病，这些血清被确认为布鲁氏菌阴性血清。用上述条件优化的犬布鲁氏菌病ELISA抗体检测试剂盒对该批阳性和阴性血清进行检测，并获得各血清的OD值，然后运用SPSS软件，经ROC曲线分析，获得该ELISA检测方法的敏感性、特异性、曲线下面积(AUC)、约登指数(Yoden)等数据。结果显示(图3、表11)，95％置信区间，AUC为0.962，P＝0.000，说明该检测方法具有较高的灵敏度。

表11：曲线下面积结果表

临界值的确定：为了获得较好的特异性，选取约登指数(敏感性+特异性-1)最大值(0.845)所对应的OD值作为临界值,此时敏感性为92.5％，特异性为97.7％(见表12)

表12：检测方法不同临界值条件下的性能比较表

Cut-off值	敏感性	特异性	约登指数
				0.125	0.962	0.816	0.778
0.148	0.943	0.920	0.863
				0.186	0.925	0.977	0.902
0.240	0.868	0.989	0.856
				0.305	0.774	1.000	0.774

(8)与粗糙型虎红平板凝集试验(rough-RBT)方法的对比

收集的53份犬布鲁氏菌病阳性血清和87份阴性血清，用传统的粗糙型虎红平板凝集试验进行检测,并与本发明所建立的ELISA抗体检测方法进行对比，以0.186作为cut-off值进行判定。结果：53份阳性血清中，经ELISA诊断为阳性的血清为50份，符合率为94.34％。87份阴性血清中，有85份诊断为阴性，符合率为92.98％，总符合率为97.70％。从53份阳性血清中，粗糙型虎红平板凝集试验仅检测出10个阳性血清，总符合率为18.87％，说明该方法的敏感性较差。但是该方法识别出了所有的阴性血清，表明其特异性好，见图4。因此，针对犬布鲁氏菌病抗体检测而言，利用本发明所建立的ELISA抗体检测试剂盒具有出色的敏感性，同时保持了很高的特异性，远优于传统的粗糙型虎红平板凝集试验。

(9)特异性交叉实验

从天津生物芯片技术有限责任公司购买兔源大肠杆菌O157血清(IM-EH003-44)、大肠杆菌H7血清(IM-EH001-7)、沙门氏菌O抗原多价血清(IM-SA004-8)、小肠耶尔森氏菌血清(IM-YE016-6)和单增李斯特菌血清(IM-LM012-1)，用融合蛋白制备的ELISA抗体检测试剂盒进行检测。结果显示：大肠杆菌O157血清、大肠杆菌H7血清、沙门氏菌O抗原多价血清、小肠耶尔森氏菌血清和单增李斯特菌血清与阴性血清的OD₄₅₀比值均小于1.5(0.978～1.296)，犬布鲁菌阳性血清与阴性血清的OD₄₅₀比值大于5，表明本发明所提供的融合蛋白不与感染了其他细菌的血清发生交叉反应，检测的特异性较高，保证了检测的准确性(表13)。

表13：融合蛋白与其他细菌病的血清学交叉反应检测结果

(8)重复性实验

用同一批次的融合蛋白包被同一块酶标反应板，检测8份犬布鲁菌病阳性血清的OD₄₅₀值，每份血清设置4个重复，检测其批内变异系数。用不同批次的融合蛋白包被酶标反应板，检测8份布鲁菌病阳性血清的OD₄₅₀值，每份血清设置4个重复，检测其批间变异系数。

表14：犬布鲁菌病ELISA抗体检测试剂盒重复性实验结果表

结果如表14所示，批内变异系数在1.52％～7.49％之间，批间变异系数在3.44％～7.26％之间，均小于10％，表明建立的犬布鲁菌ELISA抗体检测试剂盒的重复性良好。

实施例5:犬布鲁氏菌病免疫胶体金检测试纸条的制备

由于免疫胶体金技术具有快速、操作简单、灵敏度高等优点,已被广泛应用于疫病快速诊断。本发明所述的融合蛋白完全适用于免疫胶体金技术，可用于犬布鲁氏菌病血清学检测，其制备过程简述如下：

(1)胶体金的制备：采用柠檬酸钠还原法制备粒径大小为30nm的胶体金,0.01％的氯化金溶液100mL加热沸腾后,迅速加入1％柠檬酸三钠溶液1.4mL,待溶液由灰色变黑,再逐渐变为酒红色后,继续煮沸3min，然后自然冷却。在日光下观察，胶体金溶液颜色鲜亮透明、分散性和均匀性良好。

(2)胶体金标记抗体：首先确定最佳的pH值，向4个离心管里加入0.9mL上述胶体金溶液，分别加入0.1mL pH为7.5、8.0、8.5、9.0的Tris-HC1缓冲溶液，混匀后加入5μL 100μg/mL兔抗犬IgG多克隆抗体(bs-0303R)。振荡均匀后，静置10min，观察胶体金是否团聚，选择标记抗体的最佳pH,而最佳的pH为8.5。确定最佳抗体标记量，在8.5的pH条件下，向含有1mL胶体金缓冲溶液的离心管中分别加入2、4、6、8、12μL多克隆抗体，每毫升胶体金缓冲溶液中加入4μL抗体时，所获得的胶体金兔抗犬IgG多克隆抗体复合物最稳定，没有出现团聚现象。因而，pH 8.5条件下，每毫升胶体金缓冲溶液加入4μL抗体是最佳的标记条件。取100mL胶体金溶液，在最适的pH缓冲溶液里，加入合适体积的兔抗犬多克隆抗体，混匀后，静置30min，然后加入1％BSA溶液，封闭20min，离心后用10mL抗体稀释液(含1％BSA、5％蔗糖的PBS溶液)重悬沉淀。将制备好的胶体金溶液均匀涂在金标垫上,37℃干燥2h备用。

(3)胶体金检测试纸条的组装：将融合蛋白稀释成0.3mg/mL的溶液，然后用喷膜仪在硝酸纤维素膜的T线位置上按1.2μL/cm进行划线；将羊抗兔IgG多克隆抗体(20ug/mL)用喷膜仪在硝酸纤维素膜的C线位置上划线。包被完成后，将硝酸纤维素膜置37℃干燥4h。按照试纸条常规组装方式，依次按顺序将吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫从上到下组装到PVC底板上,并用自动切条机将其切割成4mm宽的试纸条,放入装有干燥剂的密封袋里,于4℃避光保存。

(3)胶体金检测试纸条的验证：取确认的犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清(中国动物卫生与流行病学中心保存)各5μL滴到检测卡的加样孔中，然后滴加200μL PBS溶液，静置10-20分钟。质控线(C线)位置出现肉眼明显可见的线时，再观察T线位置的显色情况。结果显示，犬阳性血清在T线位置出现明显的紫红色反应线，而阴性血清在T线位置没有出现肉眼可见的线，说明使用本发明融合蛋白建立的犬布鲁氏菌免疫胶体金检测试纸条具有很好的区分犬布病阳性和阴性血清的能力(图5)。

综上，利用本发明制备所得的融合蛋白所建立的ELISA试剂盒可用来检测犬布鲁氏菌病血清抗体，具有特异性强、重复性好、灵敏度高的优点，可用于人和动物的布鲁氏菌病诊断。本发明对布鲁氏菌病检测是摈弃了传统的用细菌来制备抗原的方法，使得抗原的安全性、易得性更高。除了用于建立犬布鲁氏菌病ELISA检测方法和免疫胶体金方法外，该融合蛋白用于其他检测方法的目的如荧光偏振检测技术(FPA)和基因芯片技术等，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种犬布鲁氏菌病诊断用融合蛋白抗原

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Phe Ala Gln Glu Asn Gln Met Thr Thr Gln Pro Ala Arg Ile

1 5 10 15

Ala Val Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Ile Tyr Val Tyr Pro Asp Asp

20 25 30

Lys Asn Asn Leu Lys Glu Pro Thr Ile Thr Gly Tyr Gly Gly Gly Gly

35 40 45

Ser Gly Val Asn Gln Gly Gly Asp Leu Asn Leu Val Asn Asp Asn Pro

50 55 60

Ser Ala Val Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Pro Asp Asn

65 70 75 80

Ser Val Pro Ile Ala Ala Gly Glu Asn Ser Tyr Asn Val Ser Val Asn

85 90 95

Val Val Phe Glu Gly Gly Gly Gly Ser Asn Asn Ser Gly Val Asp Gly

100 105 110

Lys Tyr Gly Asn Glu Thr Ser Ser Gly Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Asp Val Lys Gly Gly Asp Asp Val Tyr Ser Gly Thr Asp Arg Asn Gly

130 135 140

Trp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Thr Val Thr Pro Glu Val Ser Tyr

145 150 155 160

Thr Lys Phe Gly Gly Glu Trp Lys Asn Thr Val Ala Glu Asp Asn Ala

165 170 175

Trp Gly Gly Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Ala Lys Leu Glu Asn

180 185 190

Arg Thr Asn Gly Gly Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ile Lys

195 200 205

Asn Ser Leu Arg Ile Gly Gly Glu Glu Ser Ser Lys Ser Lys Thr Gln

210 215 220

Thr Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Gly Lys Lys Asn Phe Gly Leu

225 230 235 240

Asn Asp Leu Asp Thr Arg Gly Ser Phe Lys Thr Asn Asp Ile Arg Gly

245 250 255

Gly Gly Gly Ser Val Ser Glu Pro Ser Ala Pro Thr Ala Ala Pro Val

260 265 270

Asp Thr Phe Ser Trp Thr Gly Gly Tyr Ile Gly Ile Asn Ala Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser Gly Lys Phe Lys His Pro Phe Ser Ser Phe Asp Lys Glu

290 295 300

Asp Asn Glu Gln Val Ser Gly Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly

305 310 315 320

Pro Ile Ser Ala Gly Ala Ser Gly Leu Glu Gly Lys Ala Glu Gly Gly

325 330 335

Gly Gly Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu His Thr Trp Ser Asp Lys

340 345 350

Thr Lys Ala Gly Trp Thr Leu Gly Ala Gly Ala Glu Tyr Ala

355 360 365

<210> 2

<211> 1098

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcattcg ctcaagaaaa ccaaatgact acgcaaccgg cacgtattgc agttggtggt 60

ggtggcagcc aaccgatcta cgtgtatccg gatgataaaa acaacctgaa agaaccaacc 120

atcaccggtt acggtggtgg tggttccggt gttaaccaag gtggtgacct gaacctggtt 180

aacgacaacc cttctgcagt tatcaatggt ggtggtggtt ctgcggcggc acctgataac 240

tccgttccga tcgcagcggg tgaaaactcc tacaacgtat ccgtcaacgt ggtttttgaa 300

ggtggcggtg gctccaacaa ctctggtgtt gacggtaagt atggtaacga gacttcttct 360

ggtactgtcg gtggcggtgg cagcgatgtg aaaggtggtg acgacgttta ttctggtact 420

gatcgtaacg gttgggacaa aggcggtggt ggttctactg taacgccgga agtttcttac 480

accaaatttg gcggcgaatg gaaaaatacg gtagcagaag ataacgcgtg gggtggtatt 540

ggtggcggtg gttccggtcg tgctaaactg gagaaccgta ctaacggtgg tacttctggt 600

ggtggcggtt ctggcggcat caaaaactct ctgcgtatcg gcggcgaaga atccagcaaa 660

agcaaaaccc agaccggtgg tggtggctcc accgattacg gtaaaaaaaa ttttggtctg 720

aacgatctgg atacccgtgg ttcctttaaa accaacgata tccgcggtgg tggcggttcc 780

gtgtctgaac caagcgcacc tactgcggct ccggttgaca ccttttcctg gactggcggc 840

tacatcggta ttaacgctgg tggtggcggc agcggtaagt tcaagcatcc gttcagctcc 900

ttcgataaag aagataacga acaggtttct ggttctctgg gtggtggtgg ctctaccggc 960

ccaatttccg caggtgcgtc cggtctggaa ggcaaagctg aaggcggtgg tggttctggt 1020

gatgatgcat ccgcactgca cacctggagc gataagacta aagcaggttg gactctgggt 1080

gcgggtgctg aatacgca 1098

Claims

1.一种犬布鲁氏菌病诊断用融合蛋白抗原，其特征在于，所述的融合蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ ID No:1。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因用于编码权利要求1所述的融合蛋白抗原。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID No:2。

4.一种原核表达载体，其特征在于，所述的原核表达载体插入了用于编码权利要求1所述的融合蛋白抗原的核酸片段。

5.如权利要求4所述的原核表达载体，其特征在于，所述的原核表达载体是在含有T7启动子的原核表达载体中插入了权利要求2所述的基因片段。

6.一种重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株中转入了权利要求4所述的原核表达载体。

7.权利要求1所述的融合蛋白抗原在制备用于检测犬布鲁菌病的分子检测制品中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的分子检测制品为ELISA检测试剂盒或胶体金试纸条。

9.一种犬布鲁菌病抗体ELISA试剂盒，其特征在于，所述的ELISA试剂盒的诊断抗原为权利要求1所述的融合蛋白抗原。

10.一种犬布鲁菌病免疫胶体金试纸条,其特征在于，所述的胶体金试纸条的诊断抗原为权利要求1所述的融合蛋白抗原。