CN107209185A - 用于早期诊断恙虫病的IgM、IgG抗体检测诊断试剂盒及此制造方法 - Google Patents
用于早期诊断恙虫病的IgM、IgG抗体检测诊断试剂盒及此制造方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及恙虫病诊断试剂盒及利用此的诊断方法，更具体地，利用由第一试剂盒及第二试剂盒构成，所述第一试剂盒及第二试剂盒分别包括混合抗原，所述混合抗原以恙虫病东方体吉列姆、卡普、卡托的56kDa的融合蛋白质cr56和恙虫病东方体江源的56kDa蛋白质kr56以5:3的体积比混合的恙虫病诊断试剂盒，可快速、准确的诊断恙虫病患者。
Description
技术领域
本发明涉及由第一试剂盒及第二试剂盒构成的恙虫病诊断试剂盒及恙虫病诊断方法。
背景技术
恙虫病是有关属于立克次体内丛林斑疹伤寒(Scrub typhus)群的恙虫病东方体(Orienta tsutsugamushi)，由螨幼虫传播的急性热性疾病。被螨幼虫咬之后约过10天(1～3周)之后，出现寒冷、发热、头痛，且发病1周前后，出现从身体开始扩散到四肢的皮疹。被螨幼虫咬的位置发生水泡，形成0.5至0.8cm大小的溃疡，且这由黑色痂被盖住叫做焦痂(eschar)。在一部分患者出现呼吸道症状，做胸部X线拍摄时，约在半数可看到肺浸润。严重时，侵犯中枢神经系统，出现失去意识或死亡的情况。恙虫病主要在包括日本、中国、马来西亚、泰国、越南等亚洲地区经常发生，主要在田野作业或露营等野外活动的人群中，频繁地发病。恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)的病原体，缘于因血管内皮细胞侵入的全身微血管炎。进入到血中的恙虫病东方体在血管内皮细胞增殖，破坏血管内皮细胞，或激发增殖引起微血栓和血管周围的炎症。因此，以病理组织学全身脏器的血管损伤为特征，由此发生皮肤烂死和皮疹、脑炎和丧失听力、心肌炎和心功能不全。不仅如此，也报告了由血管内凝血病的低纤维蛋白血症。根据在恙虫病东方体的各群(血清型)，病症状或流行病的局面，根据情况显示相异的差异。在相同群内的菌相互间，以血清学具有关联，但与其他群的菌，血清学交叉反应弱或没有。恙虫病东方体由一个种类被分类，但存在很多抗原结构不同的血清型，根据这些抗原的差异，被分类成吉列姆、卡普、卡托(Gilliam、Karp、Kato)等血清型。在韩国国内吉列姆、卡普之外，分类与之前告知的圆形菌珠，血清学反应局面不同的江源珠(Kanwon)和保宁珠(Boryong)。在决定如此的血清型多样性的恙虫病东方体的细胞膜蛋白抗原，存在种特异性抗原和血清型特异性抗原等。提纯恙虫病东方体，将抗原分析成聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹(immunoblotting)的结果，被视为存在70、60、54～56、46～47kDa的主要抗原(Takahashi K等，Microbiol.Immunol 29：475，1985)，但这些46～47kDa、54～56kDa及70kDa的蛋白子具有抗原性，70kDa和46～47kDa蛋白质被告知为菌珠特异抗原(Tamura A等，Microbiol.Immunol 26：321，1982)。通常，恙虫病被认识为临床症状较轻，由症状的临床诊断简单的疾病，但现实非典型临床症状的情况较多，所以，没有如全身淋巴腺肿胀或痂皮形成等的恙虫病特定意见时，很难诊断鉴定细螺旋体病、皮疹热及肾综合征性出血热等的急性热性疾病科。恙虫病的诊断法具有分离病原体，或由免疫荧光抗体法证明抗体的方法的精密诊断。但是，所述诊断法为了得到恙虫病东方体的抗原，要实施细胞培养，且被生产的抗原不仅很难长期保管，而且在检查中需要荧光显微镜，所以，只限在一部分检查室执行。因此，实际上位于在患者多发农村地区的一线医院，很难实施免疫荧光抗体法。
发明内容
技术课题
本发明的目的是提供利用恙虫病诊断试剂盒及利用此的诊断方法，更具体地，提供由第一试剂盒及第二试剂盒构成，所述第一试剂盒及第二试剂盒分别包括混合抗原，所述混合抗原以恙虫病东方体吉列姆、卡普、卡托的56kDa的融合蛋白质cr56和恙虫病东方体江源的56kDa蛋白质kr56以5:3的体积比混合的恙虫病诊断试剂盒及利用此的诊断方法。
但是，本发明所要解决的课题不限定于以上提及的课题，且没被提及的其他课题，可从以下的记载明确地理解给从业者。
技术方案
本发明的一个侧面是提供恙虫病诊断试剂盒，由第一试剂盒及第二试剂盒构成，所述第一试剂盒及第二试剂盒分别包括混合抗原，所述混合抗原以恙虫病东方体吉列姆、卡普、卡托的56kDa的融合蛋白质cr56和恙虫病东方体江源的56kDa蛋白质kr56以5:3的体积比混合。
根据一个实施例，所述第一试剂盒及第二试剂盒分别还可包括羊抗鸡IgY抗体。
根据一个实施例，所述第一试剂盒包括第一金共轭垫，包括抗人IgM共轭金及鸡IgY共轭金，且所述第二试剂盒可包括第二金共轭垫，包括抗人IgG共轭金及鸡IgY共轭金。
根据一个实施例，所述抗人IgM共轭金的浓度是OD1至1.5，且所述抗人IgG共轭金的浓度可以是OD2至4，并且所述鸡IgY共轭金的浓度是OD0.1至0.5。
根据一个实施例，所述混合抗原可包括0.4至0.8mg/ml。
根据一个实施例，所述第一试剂盒及第二试剂盒分别可包括前反应线领域，包括大肠菌抽取物1.5至3mg/ml。
本发明的第二侧面是提供用于诊断恙虫病提供信息的方法，其包括：使用权利要求1所述的恙虫病诊断试剂盒，同时检测患者的样品内恙虫病IgM及IgG抗体。
根据一个实施例，所述用于诊断恙虫病的信息可以是，以IFA测定的Ab效价(Abtiter)为IgM1:5至1:20及IgG1:50至1:100的，诊断恙虫病患者所需的信息。
技术效果
根据本发明，由第一试剂盒及第二试剂盒构成的恙虫病诊断试剂盒，可快速正确地诊断恙虫病，敏感度高且去除非特异反应，具有优秀的特异度，且一定地维持对照线的发色，可确保对评价结果的信赖度。
附图说明
图1是示出根据本发明的一个实施例的条形恙虫病诊断试剂盒。
图2是示出根据抗原浓度的试剂盒反应。
图3是示出根据混合抗原组成的试剂盒反应。
图4是示出根据对照线蛋白质的试剂盒反应。
图5是示出根据前反应线的大肠菌抽取物浓度的试剂盒反应。
具体实施方式
以下，参考附图对实施例进行详细地说明。示出在各图的相同参考符号表示相同的部件。
在以下说明的实施例中，可附加多样的变更。以下说明的实施例不限于实施形态，应该理解为，包括对这些的所有变更、均等物或者代替物。
在实施例中使用的用语，只是为了说明特定的实施例而被使用，而不是意图限定实施例。除了明确的指定意思以外，单数的表现包括复数的表现。在本说明书中，“包括”或者“具有”等用语是为了指定说明书上记载的特征、数字、步骤、动作、构成要素、组件或者这些组合的存在，并且要理解为，不是预先排除一个或者其以上的其他特征，或者数字、步骤、动作、构成要素、组件或者这些组合的存在或者附加可能性。
除了被定义为其他，包括技术或者科学用语，这里所使用的所有用语与实施例所属领域的技术人员一般的理解，具有相同的意思。一般使用的，如被定义在字典的用语被解释成与相关技术上下文具有相同的意思，并且除了在本申请中明确地定义以外，不能解释成理想的或者过度形式的意思。
还有，参考附图进行说明时，与图的符号无关，相同的构成要素赋予相同的参考符号，对此的重复说明给予省略。在说明实施例时，对相关公开技术的具体说明，被判断为模糊实施例的说明时，其详细地说明给予省略。
在本发明使用的用语‘诊断’意味着确认病理状态的存在后特征。此外，本发明在目的上的诊断是确认细螺旋体病。
在本发明使用的用语‘恙虫病’是指恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)的病原性引发的疾病。
本发明的一个侧面是提供恙虫病诊断试剂盒，由第一试剂盒及第二试剂盒构成，所述第一试剂盒及第二试剂盒分别包括混合抗原，所述混合抗原以恙虫病东方体吉列姆、卡普、卡托的56kDa的融合蛋白质cr56和恙虫病东方体江源的56kDa蛋白质kr56以5:3的体积比混合。
更具体地，构成本发明诊断试剂盒的第一试剂盒及第二试剂盒分别包括：(a)吸收样品的样品垫(sample pad)；(b)与样品内的人抗体结合的，金共轭垫(gold conjugationpad)；(c)包括恙虫病混合抗原的反应线(test line)和包括对照群蛋白质的对照线(control line)被处理的反应膜(或测试膜)；及(d)吸收剩余量样品的吸收垫(absorptionpad)。
本发明的诊断试剂盒包括恙虫病混合抗原。在本发明可使用的恙虫病混合抗原是从恙虫病原因的恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)、吉列姆(Gilliam)、卡普(Karp)及卡托(Kato)由来的再组合抗原蛋白质及从江源(Kangwon)由来的抗原蛋白质混合的蛋白质。即，本发明的恙虫病混合抗原，是指将编码构成恙虫病东方体、吉列姆、卡普及卡托抗原决定体蛋白质的遗传基因，从串联连接再组合的遗传基因由来的遗传基因再组合蛋白质和从具有恙虫病东方体江源珠抗原活性的遗传基因由来的遗传基因再组合蛋白质混合的。具体地，在本发明中，根据恙虫病东方体的56kDa蛋白质具有抗原性，具有诊断价值的韩国公开专利第2002-0020281号等记载的事实，将编码标准血清型的吉列姆(Gilliam)、卡普(Karp)及卡托(Kato)珠的56kDa蛋白一部分切片的遗传基因，增幅成聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction；PCR)，且将增幅的DNA切片串联连接之后，克隆在蛋白质揭示用载体，在大肠菌内揭示，并分离提纯，可使用于诊断恙虫病诊断的融合蛋白质抗原，以单一工程同时生产、分离提纯。此外，在本发明为了提高恙虫病东方体、吉列姆、卡普及卡托外的恙虫病诊断的敏感度，将编码具有恙虫病东方体江源珠(Orientia tsutsugamushiKangwon)的抗原活性的56kDa蛋白质的遗传基因，增幅成聚合酶链反应，且将此增幅的DNA切片克隆在蛋白质揭示用载体，在大肠菌内揭示，并分离提纯，可与从所述恙虫病东方体吉列姆、卡普及卡托由来的56kDa蛋白遗传基因再组合蛋白质一起，用于诊断恙虫病。
本发明的诊断试剂盒包括将恙虫病东方体吉列姆、卡普及卡托再组合56kDa蛋白质及恙虫病东方体江源珠56kDa蛋白质，以5:3的体积比混合的恙虫病混合抗原。所述混合抗原可包括0.4至0.8mg/ml，优选地0.5至0.6mg/ml，更优选地0.533mg/ml。更具体地，所述恙虫病混合抗原可被点滴到试剂盒内反应线(test line)。
本发明的诊断试剂盒包括可与金-标志蛋白质结合的对照群蛋白质。例如，在本发明可使用的对照群蛋白质，可以是从羊抗鸡IgY多克隆抗体(Goat anti-chicken IgY)、兔抗羊IgG多克隆抗体、羊抗人IgG多克隆抗体、兔抗羊IgM多克隆抗体及羊抗人IgM多克隆抗体形成的群中，选择的至少任何一个，优选地，可以是羊抗鸡IgY抗体。使用羊抗鸡IgY抗体时，与反应线的反应程度无关，对照线一定的发色，具有可确保有关诊断试剂盒操作性信赖度的益点。所述对照群蛋白质可包括0.1mg/ml至2mg/ml的浓度，优选地1mg/ml浓度。
本发明的诊断试剂盒还可包括不揭示恙虫病抗原蛋白质，包括大肠菌抽取物的前反应线(pretest line)。所述前反应线将揭示在大肠菌的恙虫病东方体抗原蛋白质，用于诊断恙虫病的目的过程中，经包括在提纯的抗原蛋白质的大肠菌由来蛋白质，和包括在人血清中的大肠菌由来蛋白质的抗体，实际上为了排除不保有对恙虫病东方体抗原蛋白质的抗体，也可被误判为患者的可能性。此大肠菌抽取物可由1.5mg/ml至3mg/ml，优选地，2mg/ml的浓度包括在前反应线。
包括在本发明诊断试剂盒的反应膜，可包括规格大小(10x500mm)的硝基纤维素膜(MiliporeTM XA3J072100)等的适合物质。优选地，反应膜由所述前反应线、反应线及对照线的顺序被排列，这些前反应线、反应线及对照线以2.0至4.5mm的间隔，优选地，以2.5至3.0mm被排列。
包括在本发明诊断试剂盒的样品垫浸泡在包括0.2M sodum borate buffer(pH8.6)750ml、20％Tween 20 75ml、10％BSA 30ml、10％NaN3 1.5ml、D.W 630ml的溶液吸收之后，进行干燥被制造。
包括在本发明诊断试剂盒的金共轭垫，可包括适合的标志者，例如，可包括抗人IgM共轭金(Anti-human IgM conjugated gold)、抗人IgG共轭金(Anti-humanIgGconjugated gold)及鸡IgY共轭金(Chicken IgY conjugated gold)等。更具体地，构成本发明的诊断试剂盒的第一试剂盒包括含有抗人IgM共轭金及鸡IgY共轭金的第一金共轭垫，且第二试剂盒可包括含有抗人IgG共轭金及鸡IgY共轭金的第二金共轭垫。优选地，所述金共轭垫邻接的位于样品垫。
包括在本发明使用的在金共轭垫的标志者，可包括0.1至6，优选地，0.1至3浓度的光密度(optical density；在OD，530nm测定)。所述标志者的量过量时，要分析的恙虫病抗体在较低领域，也被揭示为非特征信号，可导致伪阳性结果。例如，抗人IgM共轭金可包括由OD1至1.5，优选地，OD1.25的浓度，且抗人IgG共轭金可包括由OD2至4，优选地，OD3的浓度，并且鸡IgG共轭金可包括由OD0.1至0.5，优选地，OD0.3的浓度。吸收垫位于膜的反面末端，经毛细管现象吸收根据膜移动的生物样品，如血清、血浆等。
本发明的诊断试剂盒以从一个样品垫分支的第一试剂盒及第二试剂盒。例如，第一试剂盒可以是用于检测对恙虫病抗原蛋白质的人IgM抗体，第二试剂盒可以是用于检测对恙虫病抗原蛋白质的人IgG抗体，且这些顺序可换。根据本发明的一个实施例，第一试剂盒包括含有抗人IgM共轭金和鸡IgY共轭金的第一金共轭垫及含有羊抗鸡IgY抗体的对照线，第二试剂盒可包括含有抗人IgG共轭金和鸡IgY共轭金的第二金共轭垫及羊抗鸡IgY抗体的对照线。根据本发明的一个实施例，所述第一试剂盒和第二试剂盒可由并列排列，但本发明不限定于此，第一试剂盒和第二试剂盒以反方向相互串联布置或多方向排列。本发明的诊断试剂盒为了确保个别的安全性，可由围绕测试条的外壳被包装。此诊断试剂盒以无诊断活性的损失，可长时间(至少18个月以上)保管在室温。
构成本发明的恙虫病诊断试剂盒的第一试剂盒及第二试剂盒，分别包括样品垫、金共轭垫、反应膜及吸收垫。样品垫叠在金共轭垫上，形成第一重叠部分，金共轭垫叠在膜上，形成第二重叠部分。此外，膜和吸收垫形成第三重叠部分。生物学样品点滴到样品垫时，经毛细管现象生物学样品通过金共轭垫。形成金-标志的金粒子，优选是20至55nm的直径大小，更优选地具有20至40nm直径大小，作用为染料值指示器(indicator dye)。根据通过所述金共轭垫，生物学样品内的抗体与金标记的标志者结合，形成复合体，所述复合体随着膜移动。
在本发明使用的用语生物学样品是指疑似恙虫病的，包括人的哺乳动物的血清、血浆等。生物学样品点滴到本发明的诊断试剂盒的样品垫之前，可稀释使用或不稀释使用。在生物学样品具有恙虫病抗体时，根据通过包括本发明的所述诊断试剂盒内恙虫病混合抗原的反应线，所述抗体与恙虫病混合抗原结合，可使肉眼识别在膜上的反应线发生色变化。即，由抗原-抗体复合体的形成，经所述金复合体的燃料值指示器(indicator dye)沉淀的同时，显示可检测的红紫色带，由此显示在生物学样品内存在恙虫病抗体的阳性反应。但是，在生物学样品没有恙虫病抗体时，不与本发明的恙虫病混合抗原结合，在膜上的反应线不发生任何变化。
本发明的第二个侧面是提供用于诊断恙虫病信息，使用恙虫病诊断试剂盒，同时检测患者的样品内恙虫病IgM及IgG抗体。
通常，为了诊断疑似恙虫病的患者是否感染恙虫病东方体，要确认人体内恙虫病东方体的存在与否，但现在的恙虫病诊断方法主要利用免疫荧光抗体法。但是，此方法具有敏感度和特异度高，鉴别并测定IgM和IgG，在一定程度上可区分初期感染和再感染的优点，但需要培养菌体，所以需要细胞培养设施，且方法复杂只能由专家来执行，具有消耗大量的时间和维持费用等问题。与此相反，本发明的诊断方法利用由抗原-抗体反应的免疫层析法，所以，在十分钟内外的快时间内，可方便正确地诊断恙虫病，比起现有诊断方法具有优秀的效能。
利用本发明的恙虫病诊断试剂盒，检测恙虫病抗体的方法如下。首先，将要检测的生物学样品，点滴到所述诊断试剂盒样品吸收部位的样品垫时，生物学样品由毛细管现象，达到金共轭垫使样品内的抗体与金共轭垫内的标志者，例如，抗人IgM共轭金(Anti-humanIgM conjugated gold)、抗人IgG共轭金(Anti-human IgGconjugated gold)及鸡IgY共轭金(Chicken IgY conjugated gold)等，形成胶体。生物学样品不固定在所述金共轭垫，且继续移动达到恙虫病混合抗原固定的反应线(test line)。被恙虫病感染的患者的生物学样品，与所述恙虫病混合抗原发生抗原-抗体反应，即结合在患者金共轭垫内的特征标志者的恙虫病抗体，结合在固定于反应线的恙虫病混合抗体，形成红紫色带，可由肉眼观察。并且，与生物学样品内抗体不反应的剩余金共轭垫内的标志者，达到对照线与对照群蛋白质反应，形成红紫色带，显示检测的适当性。如此，本发明的诊断试剂盒利用由抗原-抗体反应的免疫层析法，是不需特别的设备可由肉眼确认检测结果的方法。
本发明的诊断试剂盒包括前反应线(pretest line)，去除实际上不保有对恙虫病东方体抗原蛋白质的抗体，也被误判为保有的可能性，提高恙虫病诊断的准确性。
根据本发明的一个实施例，使用本发明的恙虫病诊断试剂盒，确认诊断结果所需的时间约是5至10分钟，是15分钟以内。诊断结果可用于诊断患者的恙虫病感染状态。例如，如果是从感染恙虫病的染患者收集的生物学样品时，本发明的诊断试剂盒对恙虫病抗体显示阳性反应，可诊断为恙虫病，如果是从没有被感染恙虫病患者收集的生物学样品时，本发明的诊断试剂盒显示阴性反应，可诊断为不是恙虫病。更具体地，本发明对阳性反应结果是除了对照线外，包括恙虫病混合抗原的反应线发色的情况，对恙虫病的阴性反应结果是，只有对照线发色的情况。
以下，由以下实施例对啊本发明进行更具体地说明。但是，这只是为了便于理解本发明，本发明的范围不限定于这些实施例。
实施例1.抗原蛋白质揭示及分离
1-1嵌合再组合56kDa cr56的蛋白质揭示
包括恙虫病东方体吉列姆、卡普、卡托(Orientia tsutsugamushi Gilliam，Karp，Kato)主要抗原部位的嵌合再组合蛋白质cr56，与韩国专利公开第2002-0020281号的实施例记载的方法，相同的方法体现及分离提纯。
即，在小白鼠L-929细胞培养并收获恙虫病东方体的吉列姆、卡普、卡托之后，进行提纯。将提纯的菌株酶分解后，由苯酚提取和乙醇沉淀，提纯DNA。此外，将恙虫病东方体56kDa蛋白遗传基因的序列表作为根据，选择吉列姆、卡普、卡托血清间氨基酸序列显示30％以上相同性的蛋白部位，在吉列姆、卡普、卡托株分别制作一对寡核苷酸引子。由这些各个引子对，将在所述提取的恙虫病东方体DNA作为主行，实施PCR反应增幅吉列姆、卡普及卡托的DNA切片。提纯PCR产物使连接在pTYB12载体的相应限制酶切断部位，进行克隆。首先，在pTYB12载体导入吉列姆的DNA切片，制作载体pTG3，在pTG3导入卡普的DNA切片制作载体pTGP1之后，在pTGP1导入卡托的DNA切片制作pTGP2。此外，从载体pTGPT2切断吉列姆、卡普及卡托的DNA切片的串联连接体，导入到pET22b(+)载体制作载体pETb7。由制作的体现载体形质转换大肠菌，培养形质转换的大肠菌，诱导融合蛋白质体现。确认电泳及蛋白质印迹之后，分离提纯体现的融合蛋白抗原。
1-2再组合江源56kDa蛋白kr56的揭示
参考系统发育分析(Phylogenic analysis)结果(FEMA Microbiology Letters，1999,180:163-169)，考虑可大致分类成全世界原始型(prototype)的卡普(Karp)、吉列姆(Gilliam)、卡托(Kato)和涟川(Yonchon)(与Kangwon最相似)时，利用这些四种菌株为抗原，被视为最适合。卡普(Karp)、吉列姆(Gilliam)及卡托(Kato)由cr56示出。此外，涟川(Yonchon)由类似江源(Kangwon)的kr56示出。在此，发明者将江源56kDa再组合蛋白质kr56，作为嵌合再组合蛋白cr56的辅助抗原使用。
(1)江源(Kangwon)56kDa蛋白质(protein)kr56揭示的概要
被告知为江源(Kangwon)87-61的主要抗原域(major antigenic domain)的部分氨基酸84(250bp)到445(1,335bp)，使包括Nco I和Sal I认知部位进行变更，制作一对引子(表1)，执行PCR反应。将PCR产物和体现载体pET30a，由Nco I和Sal I限制酶进行处理切断后，对这些进行结扎。将此质粒在大肠菌株BL21形质转换后，提取蛋白。
【表1】
*质粒pET30a体现His-Tagged融合蛋白质。
(2)遗传基因的克隆及揭示
将由聚合酶连锁反应增幅的DNA(amino acid 84(250bp)到445(1,335bp)的362a.a.(总共1,086bp))，在1.2％琼脂糖凝胶电泳之后，使用QIAGEN gel elution kit(QIAGEN Inc.,USA)进行回收。在紫外线透照仪(transilluminator)上，将切除适合预计大小增幅的带，移到微管。添加琼脂糖凝胶体积3倍的NaI溶液之后，在60℃放置5分钟完全地融化凝胶。其中，添加玻璃奶(glass milk)搅拌10秒。将此在常温以17,000g(Hanil，AI.5S-24,12,000rpm)圆心分离1分钟之后，去除上层液。将微管在常温放置5分钟并干燥后，添加洗脱缓冲液(elution buffer)搅拌之后，以17,000x g(12,000rpm)进行圆心分离，将上层液移至新的微管。这样提纯的PCR产物和pET30a载体，完全切断成限制酶Nco I和Sal I之后，利用Geneclean kit II相同的方法回收。混合切断的载体100ng和切断的PCR产物100ng，在此混合10倍浓度的连接酶缓冲液(250mM Tris-HCl pH 7.8，100mM MgCl2，20mMDTT，4mM ATP)和连接酶，在4℃反应18小时。
(3)感应细胞(competent cell)制作及形质转换
将在LB培养基培养18小时的大肠菌BL21，在LB培养基稀释100倍，在600nm光密度为0.3为止再培养。在冰里放置30分钟后，扔掉培养基上层液，添加0.1M Cacl2为培养基的1/2体积，漂游大肠菌。在冰里放置1小时，在2,000g(4,100rpm)圆心分离10分钟后，由培养的培养基1/10体积的0.1M Cacl2漂浮，将此用于形质转换。
(4)形质转换
在所述(3)混合制作的结扎产物和感应细胞(competent cell)，放置在冰里之后，在42℃给予热冲击1分30秒。添加LB培养基之后，在37℃培养1小时。将培养液接种在LB琼脂平板培养基之后，在37℃进行培养。
(5)形质转换大肠菌的质粒(plasmid)DNA分离
将形质转换的大肠菌单菌落，接种在含有卡纳毒素(Kanamycin)的LB培养基，在37℃进行振荡培养。质粒DNA抽取利用了AccuPrep质粒提取试剂盒(AccuPrep PlasmidExtraction kit)。在常温以750g(2,500rpm)圆心分离培养液10分钟之后，只回收细胞沉淀物。其中，添加再悬浮缓冲液(resuspenstion buffer)之后，搅拌并添加裂解缓冲液(lysisbuffer)，在常温放置5分钟。添加中和缓冲液(Neutralization buffer)在常温放置之后，以17,000xg(12,000rpm)圆心分离，将上层液移至绑定列管(binding column tube)。将此在常温以17,000xg(12,000rpm)圆心分离之后，去除提取液。其中，分柱80％乙醇并圆心分离之后，只将列绑定移至新的管。其中，分柱洗脱缓冲液(Elution buffer)在常温放置之后圆心分离，将上层液移至新的微管。
(6)蛋白质的揭示及分离
在本培养基接种种子培养工程的培养液。所述接种在37℃进行，且接种后以220rpm搅拌1小时45分钟。O.D值显示0.5至0.6时，接种IPTG0.5mM培养3个小时。之后，在4℃以3,000rpm圆心分离30分钟，在药丸放入1x结合缓冲液(binding Buffer)(6M Urea、500mMNaCl、20mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM Imidazole)使用超声波仪(Sonicator)，破坏(pulse：10sec on，20sec off，time：6min X2回(中间一次inverting)，Amp.：45％)细胞。Kr56在4℃以14,000rpm圆心分离15分钟(rotor 7in autoclaved ultra centrifuge bottle)之后，上层液冷藏保管，药丸以1X结合缓冲液(Binding buffer)(以1L Erlenmeyer flask培养液为基准50ml)再悬浊。在冰(Ice)放置1小时(放置30分钟后，inverting)之后，在4℃以14,000rpm圆心分离(rotor 7in autoclaved ultra centrifuge bottle)30分钟之后，获得上层液。上层液以1X结合缓冲液(Binding buffer)(6M urea)稀释2倍之后，过滤(0.45μmsyringe filter)在4℃进行保管。
(7)蛋白质提纯
使Hisbind树脂载体(Novagen)在管柱成2ml的填充后，使用蒸馏水和1X电荷缓冲液(charge buffer)、1X结合缓冲液(binding buffer)准备管柱。将抗原蛋白通过管柱之后，由1X洗涤缓冲液(washing buffer)进行清洗。通过1x洗脱(Elution)缓冲液(6M Urea，500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，500mM Imidazole)，每1ml的回收蛋白质。各个分割内的蛋白质浓度，利用BCA蛋白检测法(BCA protein assay)定量，以AmiconUltra30K浓缩之后，利用BCA蛋白检测法(BCA protein assay)定量。
包括在本发明恙虫病混合抗原的恙虫病东方体江源56kDa蛋白质的具体氨基酸序列，可参考公开在注册专利第10-0796772号的氨基酸序列。
实施例2.根据抗原浓度的试剂盒的反应(判断伪阳性与否)
根据所述实施例1制作的本发明混合抗原，分别以0.6mg/ml、0.9mg/ml、1.2mg/ml及1.5mg/ml浓度准备。各准备4个包括各个浓度抗原的试剂盒。利用诊断恙虫病标准诊断试验法一种的免疫荧光抗体法，评价患者的样品之后，准备阴性血清1个(DK13)和阳性血清3个(90-202、00-350、89-129)，将此分别适用在具有不同抗原浓度的诊断试剂盒，测定反应。
图2是示出根据抗原浓度的试剂盒反应。
以下表2是示出根据抗原浓度的试剂盒反应。
【表2】
如表2及图2示出，在抗原浓度为0.9、1.2、1.5mg/ml的诊断试剂盒显示伪阳性，但在抗原浓度为0.6mg/ml的诊断试剂盒没有显示伪阳性。
实施例3.根据混合抗原组成的试剂盒反应
将根据所述实施例1制作的本发明的混合抗原以0.6mg/ml准备，现有的混合抗原以相同的浓度准备。现有的混合抗原是将cr56、kr56及r21蛋白质分别以5:2:1比率混合的。制作包括本发明混合抗原的诊断试剂盒，和包括现有混合抗原的诊断试剂盒，测定对阴性血清和阳性血清的反应度。作为对照群，各个阴性血清和阳性血清，测定了根据IFA的Ab效价。
图3是示出根据混合抗原组成的试剂盒反应。
以下表3是示出根据混合抗原组成的试剂盒反应。
【表3】
如表3及图3示出，混合抗原不包括r21且增加kr56比率时，提高了对抗体的反应敏感度。
实施例4.根据对照线的蛋白质的试剂盒反应
准备了本发明的诊断试剂盒，其根据所述实施例1制作的本发明的混合抗原0.6mg/ml及以点滴在对照线的蛋白质，包括羊抗鸡IgY1.0mg/ml。其他条件都相同地包括，但准备了点滴在对照线的蛋白质为抗蛋白A的诊断试剂盒。利用诊断恙虫病的标准诊断试验法的免疫荧光抗体法，评价患者的样品之后，将阴性血清和阳性血清适用在各个诊断试剂盒，测定反应。
图4是示出根据对照线蛋白质的试剂盒反应。
以下表4是示出根据对照线蛋白质的试剂盒反应。
【表4】
如表4及图4示出，将抗蛋白A用于对照线的蛋白质时，对照线具有发色差异，但将羊抗鸡IgY用于对照线的蛋白质时，对照线的发色没有差异，维持一定的水准。
实施例5.包括在提纯抗原中的大肠菌由来蛋白质和人血清中抗体的反应去除研究
利用His-bind亲和色层分离提纯抗原，但不可完全地去除大肠菌由来蛋白质。因此，判断由提纯完全地去除这些大肠菌由来蛋白质比较困难，只培养不体现恙虫病抗原蛋白质的大肠菌宿主细胞，制作提取液后，以前反应线(pretestline)滴定到反应线前部分，去除包括在人血清中的大肠菌由来蛋白质和产生抗原-抗体反应的抗体。
实施例6.根据前反应线的大肠菌抽取物浓度的试剂盒反应
准备了根据所述实施例1制作的本发明混合抗原0.6mg/ml及由滴定在对照线的蛋白质包括羊抗鸡IgY1.0mg/ml的本发明诊断试剂盒。本发明的诊断试剂盒内大肠菌抽取物，分别以0.5mg/ml、1mg/ml或2mg/ml滴定在前反应线。准备阴性血清适用在各个诊断试剂盒，测定反应。
图5是示出根据前反应线的大肠菌抽取物浓度的试剂盒反应。
以下表5是示出根据前反应线的大肠菌抽取物浓度的试剂盒反应。
【表5】
如表5及图5示出，前反应线的大肠菌抽取物的浓度为0.5mg/ml及1mg/ml时，显示伪阳性，但前反应线的大肠菌抽取物的浓度为2mg/ml时，没有显示伪阳性。
实施例6.条形诊断剂样品的制作
确认从大肠菌揭示的，对恙虫病抗原cr56、kr56蛋白质的恙虫病诊断剂的效能，利用运动自动化(Kinematic automation)(M1600)公司的散发器(dispenser_管理编号IMM-E-P-005)的仪器，制作诊断用测试条样品。测试条的结构如第3示出，由硝化纤维膜、样品垫、吸收垫、金结合垫(玻璃纤维)构成。硝化纤维膜使用在密理博公司制作的，但为了防止膜容易被损伤，在一侧粘贴了透明的塑料。在硝化纤维膜喷射3种蛋白质。1种是存在于患者血清中的，用于检测对恙虫病抗体，将在大肠菌体现的cr56、kr56蛋白抗原适当量混合的蛋白质的反应线(test line)，其他1种是用于判断发色系统的正常反应与否的对照线(control line)。另外其他1种是包括在人血清中，产生大肠菌由来的蛋白质和抗原-抗体反应的，用于去除抗体没有体现恙虫病抗原蛋白质的大肠菌培养提取液的前反应线(pretest line)。使用散发器将适当量的蛋白质喷射在前反应线、反应线、对照线之后，在25℃进行干燥。在玻璃纤维的5％海藻糖稀释适当量胶体金共轭，吸收之后在25℃干燥24小时。样品垫和吸收垫分别以所需的长度切断之后，使样品垫可重新很好地吸收血清或血浆，浸泡在将二联囊体20在0.1M sodium borate buffer成为0.5％的溶液吸收之后，在常温直到干燥为止完全地干燥。之后，在硝化纤维膜下侧，粘贴喷射胶体金共轭的金结合垫(玻璃纤维)，在其下再次粘贴样品垫。在硝化纤维膜上侧粘贴吸收垫。最终诊断剂条的大小以宽4mm，高60mm的进行切断。在本发明，将两个带放在一个塑料，可使同时诊断的进行制作。由此，对制作的诊断剂样品使用患者血清和正常人血清，执行效能试验结果，证实了快速、准确、方便的恙虫病诊断剂的效能。此外，以其他急性热性疾病(肾综合征性出血热、皮疹热、细螺旋体病)患者血清，交叉实验的结果，确认没有发生反应。
实施例7.诊断试剂盒的性能试验
为了测定本发明的恙虫病诊断试剂盒的敏感度和特异度的比较，与其他公司(S公司)的恙虫病诊断试剂盒进行了比较试验。利用诊断恙虫病标准诊断试验法的免疫荧光抗体法(IFA)，准备被评价的阳性检测体60个和阴性检测体100个。使用本发明的恙虫病诊断试剂盒的方法如下。
1)由微量移液管取3的血清、血浆，或6的全血，使吸收在检测体注入部底部样品垫进行注入，立即将检测稀释液7滴滴定到检测注入部。
2)等待在对照线(C)区域出现红色条为止。开始检测之后，在15分钟内判读结果，且15分以后重新显示的红色条，不包括在结果判定。
其他公司的恙虫病诊断试剂盒，根据相应诊断试剂盒附上的说明书被使用。
试验诊断试剂盒性能的结果，本发明的恙虫病诊断试剂盒的敏感度为99％，特异度为100％的被评价，相反，S公司的敏感度为83％，特异度为100％的被评价，显示本发明的恙虫病诊断试剂盒的敏感度更高。
综上所述，实施例虽然由限定的实施例和图被说明，但是本领域的技术人员可从上述的说明多样地修正及变更。例如，由说明的技术与说明的方法和其他顺序被执行，和/或由说明的系统、结构、装置、回路等，构成要素与说民的方法和其他形态被键合或者组合，或者由其他构成要素或者均等物对置或者置换，也可达到适当的结果。
所以，其他具体体现、其他实施例及与专利请求范围均等的，也属于后述的专利请求范围的范围。
Claims (8)
1.一种恙虫病诊断试剂盒，由第一试剂盒及第二试剂盒构成，所述第一试剂盒及第二试剂盒分别包括混合抗原，所述混合抗原以恙虫病东方体吉列姆、卡普、卡托的56kDa的融合蛋白质cr56和恙虫病东方体江源的56kDa蛋白质kr56以5:3的体积比混合。
2.根据权利要求1所述的恙虫病诊断试剂盒，其特征为，所述第一试剂盒及第二试剂盒分别还包括羊抗鸡IgY抗体。
3.根据权利要求1所述的恙虫病诊断试剂盒，其特征为，所述第一试剂盒包括第一金共轭垫，包括抗人IgM共轭金及鸡IgY共轭金，且
所述第二试剂盒包括第二金共轭垫，包括抗人IgG共轭金及鸡IgY共轭金。
4.根据权利要求3所述的恙虫病诊断试剂盒，其特征为，所述抗人IgM共轭金的浓度是OD1至1.5，且
所述抗人IgG共轭金的浓度是OD2至4，并且
所述鸡IgY共轭金的浓度是OD0.1至0.5。
5.根据权利要求1所述的恙虫病诊断试剂盒，其特征为，所述混合抗原包括0.4至0.8mg/ml。
6.根据权利要求1所述的恙虫病诊断试剂盒，其特征为，所述第一试剂盒及第二试剂盒分别包括前反应线领域，包括大肠菌抽取物1.5至3mg/ml。
7.一种用于诊断恙虫病提供信息的方法，其包括：
使用权利要求1所述的恙虫病诊断试剂盒，同时检测患者的样品内恙虫病IgM及IgG抗体。
8.根据权利要求7所述的用于诊断恙虫病提供信息的方法，其特征为，所述用于诊断恙虫病的信息是，以IFA测定的Ab效价为IgM1:5至1:20及IgG1:50至1:100的，诊断恙虫病患者所需的信息。
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