KR101443023B1 - 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증억제용 조성물에 관한 것으로, 미성숙 잣구과 열수 추출물 또는 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 건강식품 조성물 및 약학적 조성물을 제공한다.

Description

미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증억제용 조성물{Composition for inhibition of inflammation comprising extract of un-ripening Pinus koraiensis Siebold et Zucc cone}

본 발명은 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증억제용 조성물, 좀더 상세하게는 미성숙 잣구과 열수 추출물 또는 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 건강식품 조성물 및 약학적 조성물에 관한 것이다.

최근 질병을 예방 혹은 치료할 수 있는 물질들이 자생식물체도 가지고 있다는 것이 보고되고 있으며(1-3), 삶을 건강하게 살려는 문화적 필요성에 따라 지구상의 다양한 자원으로부터 다양한 생리기능을 가진 물질을 탐색하려는 연구가 활발히 진행되고 있는데, 그 중에서도 특히 식물자원에 포함된 화합물에 많은 관심이 집중되고 있다(4-8).

잣나무(Pinus koraiensis Siebold et Zucc)는 소나무과에 속하는 상록교목으로 해발고도 1,000 m 이상에서 자라며 높이 30 m, 지름 1 m 정도까지 자라는 나무로 수피는 회갈색이고 ?은 조각이 떨어진다. 잎은 짧은 가지 끝에 3~5개씩 달리며, 뒷면에는 하얀 기공선이 있어 연한 초록색을 띠고, 가장자리에 잔 톱니가 있다.

우리나라에서 자생하는 잣나무의 대한 연구를 보면, Lee 등(9)은 잣나무 목부의 성분으로는 5-hydroxy-7-methoxyflavone, chrysin, pinocembrin, galangin, 3-hydroxy-5-methoxystilbene, pinosylvin 등의 물질이 함유된 것으로 보고하였다. Jung(10) 은 잣나무 구과 정유 추출물의 항산화효과 및 항균효과에 대한 연구에서 Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans등에 대해서 모두 99.9% 이상의 항균효과를 나타난다고 보고하였다.

Bae 등(11)은 잣나무 잎의 성분으로는 gallic acid, protocatechuic acid, vanillic acid, syringic acid, p-coumaric acid, scopoletin, (+)-catechin 등의 물질을 분리 동정하였고, Kim 등(12)은 잣나무 잎의 추출물에서 Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Pityrosporum ovale, Escherichia coli에 대한 ethyl acetate 분획의 Minimum Inhibitory Cencentrationi (MIC)는 각각 0.06%, 0.25%, 0.13%, 0.50%의 항균활성을 나타냈으며, kaempferol-3-O-glucoside (astragalin), kaempferol-3-O-arabinoside (juglanin) 물질을 분리 동정 하였다.

잣나무에는 영양물질 이외에 항균(13), 살충효과(14) 및 타감 작용을 하는 약리적인 성분들이 함유되어 있으며, 이러한 화학성분은 피부자극제, 소염제, 완화제 및 보향제로 이용되고 있다(15,16). 잣나무의 종자는 구과의 열매에서 수확하며 양질의 단백질과 지방산, 아미노산, 탄수화물, 그리고 비타민을 포함하고 있으며(17,18), 수피 추출물은 항암, 항노화, 노화방지, 돌연변이 억제 등의 효능을 갖는 등 경제적인 가치가 매우 높은 수종이다(19,21). 그럼에도 불구하고 농림부 통계에 의하면 2005년 현재 국내에서는 2,680톤의 잣이 생산되고 있으며, 잣은 수확 후 잣 알갱이만 식용으로 사용된다.

그 외의 부산물은 그대로 버려져 환경 오염원으로 방치 되고 있기 때문에 효과적인 재활용 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다(22). 잣 부산물에는 여러 생리활성 물질들이 함유되어 있어서 이를 재활용 한다면 환경 오염원의 배출량을 감소시키는 효과를 얻을 수 있으며, 폐기 자원의 재활용이라는 의미에서 가치가 높을 것으로 사료된다.

Lipopolysaccharide (LPS)는 그람 음성균의 외막 구성성분이며 옛날부터 발열물질로서 알려져 있다. 단구 세포 또는 macrophage는 미량의 LPS에 의해 활성화되고 다양한 사이토카인, 아라키돈산 대사산물, 활성산소, nitric oxide (NO) 등을 생산, 방출한다(23-27). 생체의 면역기구로서 제1선을 담당하는 macrophage는 골수에서 생산되는 탐식세포로서 체내에 들어온 이물질을 비특이적으로 탐식하고 소화하며, hydrogen peroxide (H₂O₂)나 NO와 같은 각종 세포독성물질을 분비하여 이종세포나 암세포를 파괴하는 면역세포이다(28).

또한 세균이나 이물질을 탐식 제거하는 과정에서 interleukin-1(IL-1), IL-6 그리고 tumor necrosis factor (TNF-α)와 같은 여러 가지 사이토카인과 phosphatase와 같은 효소를 분비하여 체내면역현상을 조절하여 염증반응, 조혈기구 등에도 관여하는 면역계의 주요 방어기구이다(29-32).

미성숙 잣나무의 종자는 구과의 열매에서 수확하며 양질의 단백질과 지방산, 아미노산, 탄수화물, 그리고 비타민을 포함하고 있으며, 수피 추출물은 항암, 항노화, 노화방지, 돌연변이 억제 등의 효능을 갖는 등 경제적인 가치가 매우 높은 수종이다.

그럼에도 불구하고, 농림부 통계에 의하면 2005년 현재 국내에서는 2,680톤의 잣이 생산되고 있으며, 잣은 수확 후 잣 알갱이만 식용으로 사용된다. 그 외의 부산물과 열매가 맺히지 않는 미성숙 잣구과는 그대로 버려져 환경 오염원으로 방치되고 있기 때문에, 효과적인 재활용 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.

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본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 연구를 지속적으로 수행하여, 국내에서 발생되어 수확되지 않고 방치되어 버려지는 농산 폐자원인 미성숙 잣구과(Pinus koraiensis Siebold et Zucc cone) 추출물이 염증억제 효과를 지님을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 미성숙 잣구과의 재활용 용도로서, 이의 추출물를 포함하는 염증억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증억제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 미성숙 잣구과 추출물에 식품학적으로 허용되는 부형제를 더 포함하는 기능성 건강식품인 염증억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 미성숙 잣구과 추출물에 약제학적으로 허용되는 부형제를 더 포함하는 약품인 염증억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증억제용 조성물은 히알루로니아제(HAase)를 저해함으로써 히알루론산(hyaluronic acid) 분자형태를 유지시키고, 염증관련 사이토카인의 발현을 억제함으로써 항염증 효과를 지닌다.

또한, 본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증억제용 조성물은 폐기 자원의 재활용이라는 측면에서, 환경 오염원의 배출량을 감소시키는 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 다양한 추출용매가 미성숙 잣구과 추출물의 phenolic 화합물의 함량에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 2는 에탄올 농도가 미성숙 잣구과 추출물의 phenolic 화합물의 함량에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 3은 추출 시간에 따른 phenoic 화합물의 함량에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 4는 미성숙 잣구과 추출물의 항염증 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 Macrophage cell (Raw 264.7) 생존률측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 미성숙 잣구과 80% 에탄올 추출물의 Macrophage cell (Raw 264.7) 생존률 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 Nitric oxide 생성 저해 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 미성숙 잣구과 80% 에탄올 추출물의 Nitric oxide 생성 저해 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 inducible NO syntase (iNOS) 생성 억제 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 미성숙 잣구과 80% 에탄올 추출물의 inducible NO syntase (iNOS) 생성 억제 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 cyclooxygenase-2 (COX-2) 생성 억제 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8b는 미성숙 잣구과 80% 에탄올 추출물의 cyclooxygenase-2 (COX-2) 생성 억제 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 prostaglandin E₂ (PGE₂) 저해 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 9b는 미성숙 잣구과 80% 에탄올 추출물의 prostaglandin E₂ (PGE₂) 저해 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) 저해 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 10b는 미성숙 잣구과 80% 에탄올 추출물의 Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) 저해 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 Interleukin-6 (IL-6) 저해 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 11b는 미성숙 잣구과 80% 에탄올 추출물의 Interleukin-6 (IL-6) 저해 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 12a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 Interleukin-1β (IL-1β) 저해 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 12b는 미성숙 잣구과 80% 에탄올 추출물의 Interleukin-1β (IL-1β) 저해 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 "미성숙 잣구과"라 함은, 성숙된 잣구과(ripening Pinus koraiensis Siebold et Zucc cone)와 대비되는 것으로서, 잣나무의 구과(cone) 중 열매(해송자)가 맺히지 않는 것을 의미한다.

본 발명의 염증억제용 조성물에서, 상기 미성숙 잣구과 추출물은 상기 조성물 전체중량 대비 0.1~99.9 중량%일 수 있는데, 상기 미성숙 잣구과 추출물의 함량은 필요에 따라 적의 선택하여 변형할 수 있다.

본 발명의 염증억제용 조성물에서, 상기 미성숙 잣구과 추출물은 열수 추출물, C₁~C₄의 알코올 추출물 또는 아세톤 추출물, 바람직하게는 열수 추출물 또는 에탄올일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 열수 추출물의 경우, 미성숙 잣구과에 증류수를 중량 기준으로 5~15배 가하여, 80℃~90℃에서 1~5시간 동안 환류냉각 추출하거나, 통상의 중탕가열 방법으로 제조한 추출물을 9,000~15,000 rpm으로 5~15분간 원심분리한 후, 필터 여과지로 여과한 다음 농축하여 제조할 수 있다.

또한, 상기 알코올 추출물의 경우, 미성숙 잣구과에 중량 기준으로 5~15배 양의 C₁~C₄의 알코올, 바람직하게는 에탄올을 첨가하여 실온에서 9~36시간 동안 침지추출한 후 상등액과 침전물을 분리한 다음, 9,000~15,000 rpm으로 5~15분간 원심분리한 후, 필터 여과지로 여과한 다음 농축하여 제조할 수 있다.

본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 염증을 유발하는 사이토카인의 발현을 억제시켜 염증을 억제하는 기능을 한다.

본 발명자들은 국내에서 발생되어 수확되지 않고 방치되어 버려지는 농산폐자원인 미성숙 잣구과(Pinus koraiensis Siebold et Zucc cone) 추출물이 염증억제 효과를 지니고 있음을 확인하고, 유용성분을 효과적으로 추출하고자 최적 추출조건을 설정하고, 각 추출물의 염증 억제 효과를 마크로파지 셀 라인인 Raw cell을 이용하여 항염증 효과를 검정하기 위하여 세포내의 단백질의 변화를 웨스턴 블로팅을 통하여, NO, iNOS, COX-2 등의 억제 효과를 확인하고, 기능성 식품(functional foods) 소재 및 약품 소재로 활용하고자 하였다.

본 발명의 염증억제용 조성물은 식품학적으로 허용되는 부형제를 더 포함하는 기능성 건강식품일 수 있다.

본 발명의 염증억제용 조성물은 상기 미성숙 잣구과 추출물 이외에 식품학적으로 허용되는 부형제를 더 포함하도록 하여 산제, 과립제, 정제(tablet), 환(丸), 캡슐제(capsule), 현탁액, 에멀젼, 파스타제, 카타플라스마제 및 시럽 중에서 선택된 어느 하나의 경구형 제제의 형태로 제형화되어 식품학적 용도로 사용할 수 있는 염증억제용 조성물일 수 있수 있으나, 상기 제형은 특별히 제한되지 않는다.

상기에서 미성숙 잣구과 추출물 이외에 식품학적으로 허용되는 부형제를 포함하도록 하여 제형화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제의 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

상기 정제, 환제, 산제, 과립제 및/또는 캡슐제의 경구를 위한 고상 제제의 부형제로서 예를 들면 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴, 말토올리고당, 이소말토올리고당, 셀로올리고당, 프락토올리고당, 이눌로올리고당, 갈락토올리고당, 키토올리고당, 자일로올리고당, 트레할로스(trehalos), 솔비톨(sorbitol), 자일리톨(xylitol), 만니톨(mannitol), 만티톨(mantitol), 람니톨(rhamnitol), 이노시톨(Inositol), 에리스리톨(Erythritol), 파라티노스(paratinose), 쿠에르시톨(quercitol) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 염증억제용 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 더 포함하는 약품일 수 있다.

본 발명의 염증억제용 조성물은 상기 미성숙 잣구과 추출물 이외에 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하도록 하여 산제, 과립제, 정제(tablet), 환(丸), 캡슐제(capsule), 현탁액, 에멀젼, 분무제, 파스타제 및 시럽 중에서 선택된 어느 하나의 경구형 제제, 또는 주사제, 패취, 분무제, 연고제, 경고제 등과 같은 비경구형 제제의 형태로 제형화되어 약학적 용도로 사용할 수 있는 염증억제용 조성물일 수 있으나, 상기 제형은 특별히 제한되지 않는다.

상기에서 미성숙 잣구과 추출물 이외에 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하도록 하여 제형화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제로서 예를 들면 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴, 솔비톨(sorbitol), 자일리톨(xylitol), 만니톨(mannitol), 만티톨(mantitol), 람니톨(rhamnitol), 이노시톨(Inositol), 에리스리톨(Erythritol), 파라티노스(paratinose), 쿠에르시톨(quercitol) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 현탁액, 유제, 동결건조 제제가 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 미성숙 잣구과 열수 추출물의 제조 (1)

경기도 가평지역의 잣나무에 자생하여 형성된 잣구과 중 열매가 맺히지 않은 미성숙 잣구과만을 수거하여 수세, 건조한 후 미성숙 잣구과 전체를 40 mesh 정도로 분쇄하여 분말로 4℃에서 보관한 시료 100g에, 중량 기준으로 10배 양의 증류수를 첨가하고, 85℃에서 3시간 동안 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리시켜 환류냉각 추출물을 수득하였다.

상기에서 수득한 환류냉각 추출물을 12,000rpm으로 10분간 원심분리한 후, 와트만(Whatman) No. 1 여과지로 여과한 다음, 상기 여액을 농축하고 동결건조시켜 미성숙 잣구과의 열수 추출물을 제조하였다.

<실시예 2> 미성숙 잣구과 열수 추출물의 제조 (2)

경기도 가평지역의 잣나무에 자생하여 형성된 잣구과 중 열매가 맺히지 않은 미성숙 잣구과만을 수거하여 수세, 건조한 후 미성숙 잣구과 전체를 40 mesh 정도로 분쇄하여 분말로 4℃에서 보관한 시료 100g에, 중량 기준으로 10배 양의 증류수를 첨가하고, 75℃에서 24시간 동안 중탕가열하여 중탕가열 추출물을 수득하였다.

상기에서 수득한 환류냉각 추출물을 12,000rpm으로 10분간 원심분리한 후, 와트만(Whatman) No. 1 여과지로 여과한 다음, 상기 여액을 농축하고 동결건조시켜 미성숙 잣구과의 열수 추출물을 제조하였다.

<실시예 3> 미성숙 잣구과 메탄올 추출물의 제조

경기도 가평지역의 잣나무에 자생하여 형성된 잣구과 중 열매가 맺히지 않은 미성숙 잣구과만을 수거하여 수세, 건조한 후 미성숙 잣구과 전체를 40 mesh 정도로 분쇄하여 분말로 4℃에서 보관한 시료 100g에, 중량 기준으로 10배 양의 50% (v/v) 메탄올을 첨가하고, 실온에서 24시간 동안 침지추출한 후, 상등액과 침전물을 분리시켜 침지추출 추출물을 수득하였다.

상기에서 수득한 침지추출 추출물을 12,000rpm으로 10분간 원심분리한 후, 와트만(Whatman) No. 1 여과지로 여과한 다음, 상기 여액을 농축하고 동결건조시켜 미성숙 잣구과의 메탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 4> 미성숙 잣구과 아세톤 추출물의 제조

경기도 가평지역의 잣나무에 자생하여 형성된 잣구과 중 열매가 맺히지 않은 미성숙 잣구과만을 수거하여 수세, 건조한 후 미성숙 잣구과 전체를 40 mesh 정도로 분쇄하여 분말로 4℃에서 보관한 시료 100g에, 중량 기준으로 10배 양의 아세톤을 첨가하고, 실온에서 24시간 동안 침지추출한 후, 상등액과 침전물을 분리시켜 침지추출 추출물을 수득하였다.

상기에서 수득한 침지추출 추출물을 12,000rpm으로 10분간 원심분리한 후, 와트만(Whatman) No. 1 여과지로 여과한 다음, 상기 여액을 농축하고 동결건조시켜 미성숙 잣구과의 아세톤 추출물을 제조하였다.

<실시예 5> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (1)

경기도 가평지역의 잣나무에 자생하여 형성된 잣구과 중 열매가 맺히지 않은 미성숙 잣구과만을 수거하여 수세, 건조한 후 미성숙 잣구과 전체를 40 mesh 정도로 분쇄하여 분말로 4℃에서 보관한 시료 100g에, 중량 기준으로 10배 양의 10% (v/v)에탄올을 첨가하고, 실온에서 24시간 동안 침지추출한 후, 상등액과 침전물을 분리시켜 침지추출 추출물을 수득하였다.

상기에서 수득한 침지추출 추출물을 12,000rpm으로 10분간 원심분리한 후, 와트만(Whatman) No. 1 여과지로 여과한 다음, 상기 여액을 농축하고 동결건조시켜 미성숙 잣구과의 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 6> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (2)

농도가 20%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 5와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 7> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (3)

농도가 30%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 5와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 8> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (4)

농도가 40%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 5와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 9> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (5)

농도가 50%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 5와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 10> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (6)

농도가 60%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 5와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 11> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (7)

농도가 70%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 12> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (8)

농도가 80%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 5와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 13> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (9)

농도가 90%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 5와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 14> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (10)

농도가 100%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 5와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 15> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (11)

추출시간을 3시간으로 한 것 이외에는 실시예 12와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 16> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (12)

추출시간을 6시간으로 한 것 이외에는 실시예 12와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 17> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (13)

추출시간을 9시간으로 한 것 이외에는 실시예 12와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 18> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (14)

추출시간을 12시간으로 한 것 이외에는 실시예 12와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 19> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (15)

추출시간을 15시간으로 한 것 이외에는 실시예 12와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 20> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (16)

추출시간을 18시간으로 한 것 이외에는 실시예 12와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 21> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (17)

추출시간을 21시간으로 한 것 이외에는 실시예 12와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 22> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (18)

추출시간을 27시간으로 한 것 이외에는 실시예 12와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 23> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (19)

추출시간을 30시간으로 한 것 이외에는 실시예 12와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 24> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (20)

추출시간을 33시간으로 한 것 이외에는 실시예 12와 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실험예>

1. 실험 재료

상기 실시예 1에서 제조한 미성숙 잣구과 열수 추출물 및 상기 실시예 3 내지 실시예 24에서 제조한 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 4℃로 유지되는 냉장실에 보관하면서 본 실험의 재료로 사용하였다.

2. 실험 방법

(1). 총 폴리페놀 함량측정

총 폴리페놀 화합물은 Folin-Denis 방법으로 측정하였으며, 시료 1 mL에 95% ethanol 1 mL와 증류수 5 mL를 첨가하고 1N Folin-ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, Na₂CO₃ 1 mL를 가한 후, 흡광도 725 nm에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.

(2). 미성숙 잣구과 추출물의 hyaluronidase 저해활성 측정

Hyaluronidase(HAase) 저해활성 측정은 sodium-hyaluronic acid(HA)로부터 형성된 N-acetylglucosamine을 glucoxazoline 유도체로 변형시킨 후, p-dimethylamino benzaldehyde (DMAB)로 발색시켜 흡광도를 측정하여 효소 활성을 측정하였다.

0.1M acetate buffer (pH 3.5)에 녹인 HAase (7,900U/mL) 0.05mL와 시료용액 0.1mL를 혼합하여 37℃에서 20분간 배양한 다음 12.5mM CaCl₂ 0.1mL를 가하고 혼합 후 다시 20분간 배양 하였다.

기질로서 0.1M acetate buffer (pH 3.5)에 녹인 HA (12 mg/mL)를 첨가하여 다시 40분간 배양하여 0.4N potassiumtetraborate 0.1 mL 및 0.4N NaOH 용액을 0.1mL 반응 혼합물에 첨가하여 3분 동안 수욕상에서 가열한 후 완전히 냉각시켰다. 냉각시킨 반응물에 발색제로 DMAB 시약 3mL을 가하여 37℃에서 20분간 배양한 다음 585nm에서 흡광도를 측정하여 하기의 수학식 1에 의해 저해활성을 산출하였다.

(3). 미성숙 잣구과 추출물의 cell line 항염증 효능 검정

(3-1). 미성숙 잣구과 추출물의 nitric oxide 측정

NO의 농도는 배양액 내의 nitrite농도를 Griess Reagent System 25를 이용하여 측정하였다. RAW 264.7세포에 추출물을 전처리하고 1시간 후 100ng/mL의 LPS를 처리하여 18시간 배양하였다.

배양액 50μL와 같은 양의 Griess Reagent를 넣어주고 10분간 상온에서 반응시킨 후, ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다(3). Sodium nitrite의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO 농도를 결정하였다.

(3-2). 외부자극으로부터의 세포내 색소침착 및 염증관련 단백질 발현 양상 측정

iNOS, COX-2, p-IkB, NFkB, MITF, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase 단백질의 양을 측정하였다(3). 각 cell line을 이용하여 culture dish에 배양한 뒤 sample 처리를 한 다음 24시간 후에 PBS로 세척한 후 원심분리 하여 세포를 수집하고, RIPA buffer를 사용하여 cell lysate를 제조하였다.

세포 lysate에 함유된 단백질의 양은 Bradford 법으로 측정하였다. 단백질 20 μg을 10% polyacrylamide를 함유한 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF membrane으로 electroblot 120 V에서 1시간을 실시하였다.

이어 PVDF membrane을 5% skim milk에서 1시간 방치한 뒤 primary antibody에서 4℃에서 overnight하여 주었다. 다시 TBST로 세번 세척한 뒤 secondary antibody를 상온에서 1시간 반응시킨 뒤 TBST로 세번 세척하고 ECL kit (Amersham-Pharmacia)와 반응시켜 X-ray film에 노출 시켰다. X-ray film에 현상되어진 밴드를 Biorad geldoc을 이용하여 정량화하였다.

(3-3). 미성숙 잣구과 추출물의 PEG₂ 생성량 측정

세포 배양액 내의 PGE₂ 양을 측정하기 위해 commercial competitive enzyme immuno assay kit를 R&D systems (Minneapolis,MN)에서 구입하여 실험하였다. 세포에 추출물을 전처리 하고 100ng/mL의 LPS를 처리하였다.

18시간 후 세포 배양액을 얻어 PGE₂ 측정에 사용하였다. 배양액을 goatanti-mouse로 coating된 96-well plate에 각각 100μL씩 loading하고, 여기에 primary antibody solution 50μL와 PGE₂ conjugate 50μL씩 첨가하여 4℃에서 overnight 시켰다.

Washing buffer로 4회 세척하고 substratesolution을 200μL씩 처리하여 5~20분간 반응시킨 후, 50μL의 stop solution을 처리한 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

(3-4). Cytokine assay (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8)

배양된 세포에서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8을 측정하였다. 즉 anti-human TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 capture 단클론 항체를 96 well plate에 각각 2 μg/mL로 코팅하고 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다.

코팅 후 비특이성 반응을 막기 위해서 10% FBS를 함유한 PBS (phosphate buffered saline)로 구성된 blocking solution을 첨가하여 37℃에서 2시간 반응하였다. 다시 0.05% tween 20을 함유한 PBS인 washing buffer로 4회씩 세척한 후, 표준이 되는 재조합 단백질 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8을 적절한 농도로 계대 희석하여 준비하고, 배양 상등액을 희석하여 각 well에 100μL씩 넣어 37℃에서 2시간 반응시켰다.

다시 washing buffer로 4회씩 세척한 후 biotinylated anti-human TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8을 blocking solution을 이용하여 300 ng/mL의 농도로 희석한 후 각 well에 100μL씩 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

다시 washing buffer로 4회 세척한 후 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate enzyme을 2.5μg/mL 농도로 각 well에 처리한 다음, 37℃에서 30분간 반응한 후 4회 세척하였다.

기질액을 각 well에 50μL씩 가하여 20분간 발색을 유도한 다음 2N 황산을 이용하여 반응을 멈추고 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8의 단백질 양을 측정하였다.

(3-5). 외부자극으로부터의 세포내 단백질 발현 양상 측정

Ras, pERK, FGF, MMP-3, p38, c-fos, TNF-α, 4-hydroxynonenal modified protein 단백질의 양을 측정하였다. 각 cell line을 이용하여 culture dish에 배양한 뒤 sample 처리를 한 다음 24시간 후에 PBS로 세척한 후 원심분리 하여 세포를 수집하고, RIPA buffer를 사용하여 cell lysate를 제조하였다.

세포 lysate에 함유된 단백질의 양은 Bradford 법으로 측정하였다. 단백질 20 μg을 10% polyacrylamide를 함유한 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF membrane으로 electroblot 120 V에서 1시간을 실시하였다.

이어 PVDF membrane을 5% skim milk에서 1시간 방치한 뒤 primary antibody에서 4℃에서 overnight하여 주었다. 다시 TBST로 세번 세척한 뒤 secondary antibody를 상온에서 1시간 반응시킨 다음, TBST로 세번 세척하고 ECL kit (Amersham-Pharmacia)와 반응시켜 X-ray film에 노출 시켰다. X-ray film에 현상되어진 밴드를 Biorad geldoc을 이용하여 정량화하였다.

3. 연구 결과

(1). 미성숙 잣(Pinus koraiensis Siebold et Zucc)구과로부터 phenol성 물질의 최적 추출 조건

(1-1). 다양한 추출용매가 미성숙 잣구과 추출물의 phenolic 화합물의 함량에 미치는 영향

식물에 존재하는 많은 phytochemical 중 폴리페놀 화합물이나 플라보노이드류는 여러 가지 식물에 널리 분포되어 있으며, 천연 항산화제로써 작용할 수 있다는 여러 연구들이 행해져 왔다.

Phenolic compounds은 식물계에 널리 분포하고 있다. 이는 식물체의 2차 대사산물로서 여러 가지 다양한 구조와 분자량을 가지고 있어 이화학적 성질 및 생리적 활성도 매우 다르게 나타난다. 특히 이들은 phenolic hydroxyl기를 가지고 있기 때문에 거대분자로 분류되는 단백질, 효소단백질 등과 결합하는 성질이 있어 항산화, 항균활성 등과 같은 여러 생리 기능을 가진다고 보고되어 있다.

경기도 지방에서 주로 재배되는 잣나무로부터 미성숙 잣구과를 수확하여 사용하여, 시료의 유효성분을 보다 효율적으로 추출할 방안을 확립하기 위하여, 인체에 유해하지 않은 용매로 물과 에탄올을 선택하여 용매 종류별, 추출시간별, 용매 농도별로 용출되는 생리활성성분을 phenolic 화합물을 주 target으로 하여 함량을 측정한 결과, 도 1에서와 같이 메탄올 추출에서 7.3±0.4 mg/g으로 가장 높은 phenolic compound의 함량을 나타내었고, 아세톤, 에탄올, 물 순으로 5.1, 4.1 3.7 mg/g의 함량을 각각 나타내었다.

이는 물 추출물보다 유기용매에서 미성숙 잣구과의 phenolic compounds가 높은 용해도를 가진다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 인체에 직접 사용하기 위해서 추출용매로서 유기용매의 사용은 지향되어야 하는 바, 본 발명에서는 식품에서 허용되고 있는 물과 에탄올 추출물 만으로 추출물을 제조하기로 하였다.

(1-2). 에탄올 농도가 미성숙 잣구과 추출물의 phenolic 화합물의 함량에 미치는 영향

미성숙 잣구과 추출물의 추출 최적조건을 확립시키기 위하여 다양한 농도의 ethanol을 용매로 사용하여 잣구과의 phenolic compounds를 추출하였다.

그 결과 도 2에서와 같이 80% ethanol 추출에서 4.7±0.1 mg/g의 함량으로 가장 높은 phenolic compounds의 함량을 보였다.

(1-3). 추출 시간에 따른 phenoic 화합물의 함량에 미치는 영향

미성숙 잣구과 추출물을 식품 및 화장품산업에 이용가능성을 알아보고자 물과 인체에 유해하지 않으며 산업적으로 이용도가 높은 ethanol을 사용하여 phenol성 물질의 용해도를 30시간 동안 3시간 간격으로 추출한 후, 추출시간에 따른 phenolics 용출의 영향을 측정하였다.

그 결과 도 3에서와 같이 열수 추출물과 에탄올 추출물 모두 12시간 동안 용출량이 급증하는 것을 알 수 있었으며, 그 이후 용출량의 변화량이 거의 없는 것을 확인할 수 있었다.

이상의 결과에 따라, 미성숙 잣구과의 생리 기능성을 알아보기 위하여 80% 에탄올과 물을 추출용매로 하여 12시간 추출한 후, 실험 시료로서 사용하기로 하였다.

상기의 최적 조건에서 추출한 미성숙 잣구과 추출물의 phenolics 함량은 표 1에서와 같이 물 추출물이 3.7±0.9 mg/mL이었고, 80% 에탄올 추출물에서 4.9±0.8 mg/mL의 함량을 나타내었다.

시료	페놀성 물질의 함량(mg/g)
	열수 추출물	80% 에탄올 추출물
미성숙 잣구과	3.7±0.9	4.9±0.8

(1-4). 미성숙 잣구과 추출물의 항염증 활성 측정

히아루론산(hyaluronic acid, HA)은 고분자 다당으로 진피층의 섬유아세포에서 산출되어, 표피, 진피에 주요한 세포외 matrix로 glucuronic acid와 glucosamine이 연결된 점액성 moucopolysaccharide이다. HA는 염증형성의 중요인자인 macrophage의 phagocytic ability를 저해하는 한편, HA 분해산물과 저분자 HA는 상처 치유과정에서 inflammation, fibrosism, collagen deposition을 증가시키며, 고분자 HA의 분해효소인 hyaluronidase (HAase)의 저해에 의해 HA의 고분자 형태를 유지하게 함으로서 항염증 효과를 기대할 수 있다.

미성숙 잣구과 추출물을 이용하여 HAase 저해 활성을 측정한 결과 도 4에서와 같이, phenolic compound를 100~200 μg/mL의 농도로 첨가하였을 때, 물 추출물에서 16.2%, 에탄올 추출물에서 26.2%의 HAase 저해효과가 확인되어, 저농도의 phenolics에서는 효과가 없으나 ,일정한 농도 이상의 phenolic의 첨가에 의해 HAase 억제효과가 발현되는 것으로 확인되었다.

또한, phenolics의 첨가 농도가 높아지면서 억제 활성이 증가하는 경향이 나타나, 농도 의존적으로 억제효과가 증가하는 것으로 판단되었다.

(2). 미성숙 잣구과 추출물의 cell line 항염증 효과 측정

최근 고령화와 식생활의 변화에 따라 급성염증질환과 류마티스관절염, 대상포진, 비염과 같은 만성염증질환이 증가하는 추세이다. 만성 염증과 암 또는 다른 질병과의 상관 관계가 보고되면서, 식이 섭취 변화(dietary intervention)를 이용하여 염증 반응을 감소시킴으로써, 질병의 위험을 줄이려는 노력이 진행되고 있다.

염증 반응은 외부로부터 물리적, 화학적 자극이나 세균 감염에 대한 생체조직의 방어 반응의 하나이며, 손상된 조직을 수복하거나 재생하려는 기전이다. 체내에서 염증 반응이 일어나면 대식세포와 같은 염증 세포들은 nitric oxide (NO), prostagladin E₂ (PGE₂), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β)등 염증매개 물질을 분비한다.

특히, 대식세포에서 cytokines, tumor necrosis factor (TNF-α), lipopolysaccharide (LPS)와 같은 자극에 의해 염증 반응의 전사인자인 nuclear factor-kB (NF-kB)를 활성화시키며, 그 결과 inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2)를 발현시켜 과량의 nitric oxide (NO)와 PGE₂를 생성하여 염증을 일으킨다.

지금까지 개발된 합성 항염증제는 크게 스테로이드(히드로코르티손, 프레드니솔론, 베타메타손)와 비스테로이드(아스피린, 인도메타신, 이부프로펜)로 나눌 수가 있으며, 이들은 대부분 위장, 신장 및 심장질환 등의 부작용을 나타내어, 현재보다 안전하고 효과 있는 천연물유래 항염증 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

(2-1). Macrophage cell (Raw 264.7)의 생존률 확인

MTT assay를 이용하여 Raw 264.7 세포에서 미성숙 잣구과 물 추출물과 80% ethanol 추출물의 세포독성을 확인 한 결과, 도 5에서와 같다.

미성숙 잣구과 물 추출물과 80% ethanol 추출물을 농도별로(5, 10, 25, 50 μg/mL) 처리한 결과 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었으나, 미성숙 잣구과 80% ethanol 추출물 50 μg/mL 처리군에서 60% 정도 감소시켜 세포 독성이 어느 정도 있는 것으로 확인되어, 미성숙 잣구과 물 추출물과 80% ethanol 추출물은 25 μg/mL 이하의 농도에서는 세포독성이 낮아 세포의 생존률에 영향을 주지 않는다는 사실을 알 수 있었다.

이상의 결과로부터, nitric oxide, cytokine 및 western blot은 80% 이상의 생존률을 가지는 25 μg/mL 이하의 농도에서 실험을 진행하였다.

(2-2). 미성숙 잣구과 추출물의 Nitric oxide 생성 저해

LPS (엔도톡신)는 그람 음성균의 외막 구성성분이며 옛날부터 발열물질로서 알려져 있다. 단구 세포 또는 마크로파지는 미량의 LPS에 의해 활성화되고 다양한 사이토카인, 아라키돈산 대사산물, 활성산소, NO등을 생산, 방출하고 LPS의 다채로운 생리반응이 발현된다.

NO는 free radical 중의 하나로서, 매우 불안정한 분자이며, 산소나 superoxide에 의하여 NO₂, N₂O₃, N₂O₄, nitrite (NO₂-) 및 nitrate (NO₃-)와 같은 안정한 nitrogen oxide로 바꾸어진다. NO는 L-arginine으로부터 nitric oxide synthase (NOS)에 의해 만들어지며, NOS는 항상성 유지에 필요한 NO를 생성하는 endothelial NOS (eNOS) 및 neuronal NOS (nNOS)와 염증성 인자 등에 의해 유도되는 inducible NOS (iNOS)로 분류할 수 있다.

체내 염증과정에서는 과량의 Nitric oxide(NO) 및 Prostaglandin E2(PGE2)등의 염증인자가 유도형 NO synthase(iNOS) 및 cycloxygenase(COX)-2에 의해 형성된다. 이 중 NO는 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관 확장 등의 다양한 생리기능을 가지고 있다. NO 자체는 반감기자 6~10초 정도로 매우 짧으며, 이러한 NO를 형성하는 nitric oxide syntase(NOS)는 물리 화학적 성상에 따라 type Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 등 3종류의 동종 효소로 나누어진다.

Type Ⅰ(neuronal NOS, nNOS)과 type Ⅲ(endothelial, eNOS)는 세포속에 계속적으로 존재하기 때문에 구성 NOS(constitutive NOS)로 분류하며, 상대적으로 일부 세포에서 LPS, cytokides 및 박테리아 독소 같은 특수한 자극제들에 노출되는 경우에만 발현되는 type Ⅲ인 유도형 NOS(iNOS)로 나누어진다.

이러한 NOS들은 L-argine을 L-citrulline으로 전환시키면서 NO를 형성한다. 이들 NOS는 iNOS에 의한 발현성이 절대적으로 많으며, 이는 병리적으로 중요한 작용을 한다. 일반적으로 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 병리학적인 원인에 의한 과도한 NO의 형성은 염증을 유발시키게 되며, 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발한다.

NO는 NO 합성효소에 의해 L-arginine으로부터 생성되는 무기 유리체로 면역반응, 세포독성, 신경전달계 및 혈관 이완 등 여러 생물학적인 과정에 관여하며, 농도에 따라 세포기능유지에 중요한 작용을 하기도 하고 세포독성을 일으키기도 한다.

Raw 264.7 세포에 LPS를 처리한 후 미성숙 잣구과 물 추출물과 80% ethanol 추출물을 농도별 (5, 10, 25 μg/mL)로 처리한 결과, NO 생성량 변화는 도 6에서와 같다.

LPS 처리 후 NO 생성량은 정상세포에 비하여 약 4배 이상 증가되었다. 미성숙 잣구과 물 추출물과 80% ethanol 추출물은 농도가 증가함에 따라 NO 생성량이 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었지만, 특히 미성숙 잣구과 80% ethanol 추출물 25 μg/mL 처리군에서는 LPS을 처리한 군과 비교 했을 때, 40% 이상의 NO 생성 저해를 일으키는 것을 확인할 수 있었다.

이상의 결과로부터, 미성숙 잣구과 80% ethanol 추출물은 물 추출물과 NO 생성 억제능이 비슷한 것으로 나타났다. 따라서 미성숙 잣구과 추출물은 저농도에서 NO 저해 효과를 나타내어 이로 인하여 Nitric oxide와 상호 작용을 가진 전사인자들의 발현 측정 여부와 LPS로 유도되어진 대식세포주인 Raw264.7 세포에서의 면역 기능과 염증반응의 효과를 기대할 수 있어 항염증 소재로서의 사용이 가능할 것으로 판단되었다.

(2-3). Western blot을 통한 단백질의 발현

(2-3-1). 잣구과 추출물의 inducible NO syntase (iNOS) 생성 억제

Nitric oxide (NO)는 혈관 확장, 평활근 수축, 신경신호 전달, 혈소판 응집 억제, 면역조절 등과 같은 다양한 생물학적 기능을 조절하는 생체 내에 널리 분포하는 유리 라디칼로서 항암, 항균 작용뿐만 아니라 다양한 염증성 질환의 발병에도 관여한다.

그러나, 과도하게 NO가 생성되면 염증 반응의 항진, 과도한 혈관 확장에 의한 패혈성 유발, 상처 치유의 억제, 전신성 홍반성 루프스의 병인에 관여하며 면역기능의 저하 및 세포고사를 유발한다.

NO의 생성에는 NO syntase (NOS)라는 효소가 작용한다. NOS에는 constitutive NOS (cNOS)와 inducible NOS (iNOS) 두 종류가 있다. 특히, 자극에 유도된 iNOS인 경우 오랜 기간 동안 다량의 NO를 생성하게 되고, 생성된 NO는 guanylyl cyclase의 활성과 동시에 주위 조직에 세포독성을 나타내는 것이 특징이다. 즉 LPS로 유도되어진 RAW 264.7 cell에서 iNOS의 protein level의 감소에 의해 항염증 효과를 기대할 수 있으며, 또한 세포와 같은 macrophage 또한 monocyte에서 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6)와 같은 proinflammatory cytokine을 증가시키는 요인 중 하나인 COX-2의 protein level을 측정함으로써 항염증 효과를 기대할 수 있다.

iNOS는 세포내에 존재하지 않으나 일단 자극에 의해 유도가 되면 NO를 생성하며 생성된 NO는 혈관확장, 세포독성, 조직손상과 같은 작용을 하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다. Nitric oxide 생성 억제에 대한 실험 결과를 토대로 미성숙 잣구과 물 추출물과 50% ethanol 추출물의 효과가 iNOS의 발현억제에 기인한 것인지 알아보기 위하여, western blot을 실행하였다.

NO 생성 억제기작에 관한 iNOS 단백질의 관련성을 조사하기 위하여, immunoblot analysis를 이용하여 western blot으로 세포질 내에서의 iNOS 단백질의 발현량을 측정하기 위하여, LPS에 의해 활성화된 Raw 264.7 세포에 미성숙 잣구과 물 추출물과 80% ethanol 추출물을 농도별 (5, 10, 25 μg/mL)로 처리한 결과, 도 7에서와 같이 25 μg/mL 처리군에서 NO 생성과 관계있는 iNOS의 단백질 발현은 LPS 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의성 있게 저해 효과를 나타냄을 확인할 수 있었으며, β-actin의 band density 비율에 따라 미성숙 잣구과 80% ethanol 추출물에서 50% 이상의 저해율을 나타내었다.

Western blot으로 분석한 결과, 미성숙 잣구과 ethanol 추출물이 LPS에 의해 유도된 iNOS 단백질을 저해하는 것으로 보아, iNOS의 전사를 저해하며 염증반응 억제를 매개하는 것을 확인할 수 있었다.

(2-3-2). 미성숙 잣구과 추출물의 cyclooxygenase-2 (COX-2) 생성 억제

Pro-oxidant나 pro-inflammatory stimuli (i.e. TPA, LPS, TNF-α, ROI, etc)에 의해 MEKK-1, NFκB의 활성화를 경유하여 생성되는 Cyclooxygenase-2 (COX-2)는 prostaglandin synthesis를 증가시켜 염증반응에 있어서 중추적 역할을 한다

또, monocyte에서 COX-2의 발현은 proinflammatory agent인 IL-1β, TNF-α와 phosphatidic acid, fibroblast growth factor 등에 의해서 증식하고 glucocorticioid와 IL-4, IL-13에 의해 발현 억제가 유도된다. 즉, COX-2의 protein level의 감소는 세포와 같은 macrophage의 monocyte에서 tumor necrosis factor-alpha (TNF-a), IL-6와 같은 pro-inflammatory cytokine을 감소시킴으로 인해 항염증 효과를 기대할 수 있다. 그러므로 COX-2에 선택적인 inhibitor의 개발은 염증의 치료 target molecule이 되고 있다.

Cyclooxygenase (COX)에는 Cyclooxygenase-1 (COX-1)과 Cyclooxygenase-2 (COX-2) 두 종류가 있는데 COX-1은 거의 모든 조직에 발현되어 있고, prostagradin을 생산하여 혈소판형성, 신장의 혈액 흐름을 조절하거나 위장의 세포를 보호하는 등의 정상적인 생체기능을 조절한다. 반면, COX-2는 염증 반응에서 발현되는 유도성 효소이며, 통증과 발열을 유발하는 PGE₂와 같은 염증 매개물질들을 생성한다.

Prostaglandin E₂ 생성 효소인 COX-2의 생성에 대한 미성숙 잣구과 물 추출물과 80% ethanol 추출물의 영향을 확인하기 위하여 western blot을 실행한 결과, 도 8에서와 같이 미성숙 잣구과 ethanol 추출물에서 prostagladin E₂ 생성과 관계있는 COX-2의 단백질 발현도 농도 의존적으로 유의성 있게 억제되어 iNOS 단백질 발현과 같은 양상을 나타내었다.

β-actin의 band density 비율에 따라 25 μg/mL 처리군에서 미성숙 잣구과 80% ethanol 추출물이 약 60%의 저해율을 나타내었다. Positive control로 사용된 pyrrolidine dithio carbamate (PDTC)와 비교하면 25 μM/mL의 농도에서는 PDTC에 비하여 매우 우수한 COX-2의 단백질 발현 억제 효과를 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과는 앞의 iNOS 단백질의 발현 억제현상과 같은 유형을 나타내는 결과로서, 염증반응에서 미성숙 잣구과 추출물이 COX-2 단백질 발현 양을 감소시켜 PGE₂ 생성을 억제함으로써, LPS로 유도되어진 대식세포주인 Raw264.7 세포에서의 높은 염증반응 억제의 효과를 기대할 수 있었다.

(2-3-3). 미성숙 잣구과 추출물의 prostaglandin E₂ (PGE₂) 저해 활성

Prostaglandin은 국소적으로 활성화되는 물질로서 arachidonic acid로부터 cyclooxygenase (COX)의 작용에 의해 합성되어 진다. PGE₂는 염증반응을 유도하는 중요한 인자로 염증반응에 동반되어지는 홍반, 부종 및 통증을 유발한다.

따라서, Raw 264.7 세포에서 LPS에 의해서 생성된 PGE₂ 형성을 억제하는지 알아보기 위하여, 미성숙 잣구과 물 추출물과 80% ethanol 추출물을 농도별 (5, 10, 25 μg/mL)로 처리하여 측정한 결과, 도 9에서와 같다.

LPS 대조군에 비해 추출물 첨가군에서 농도 의존적으로 저해 효과를 나타내며, 물추출물보다 ethanol 추출물군에서 유의성 있는 억제효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 25 μg/mL 처리군에서 미성숙 잣구과 물 추출물과 80% ethanol 추출물에서 각각 15%와 약 60%의 저해율을 나타내어 항염증 효과가 우수함을 알 수 있었다.

이러한 결과로 보아, 미성숙 잣구과 ethanol 추출물이 저농도에서 PGE₂ 생성을 저해시켜 염증생성을 조절하는 것으로 판단되었다.

(2-3-4). 미성숙 잣구과 추출물의 cytokine 저해 활성

(가). 잣구과 추출물의 Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) 저해 활성

Macrophage와 mast cell에서 분비되는 TNF-α는 LPS반응의 주요 매개체로서 내제 면역에 있어 중요한 역할을 한다. 따라서, Raw 264.7 세포에서 LPS에 의해서 생성된 TNF-α 형성을 억제하는지 알아보기 위하여 미성숙 잣구과 물 추출물과 80% ethanol 추출물을 농도별(5, 10, 25 μg/mL)로 처리하여 측정한 결과, 도 10에서와 같이 LPS 대조군에 비해 첨가되는 미성숙 잣구과 추출물에 농도 의존적으로 유의성 있게 저해 효과를 나타냄을 확인할 수 있었으며, 25 μg/mL 처리군에서 미성숙 잣구과 물 추출물과 80% ethanol 추출물에서 각각 20%와 45%의 저해율을 나타내었다.

이러한 결과는 미성숙 잣구과 추출물이 저 농도에서도 TNF-α 생성의 억제를 유발시켜 염증생성을 조절하는 것으로 확인되어, 앞의 iNOS와 COX-2 단백질의 발현 억제현상과 같은 유형을 나타내는 결과로 LPS로 유도되어진 대식세포주인 Raw264.7 세포에서의 높은 염증반응 억제의 효과를 기대할 수 있었다.

(나). 미성숙 잣구과 추출물의 Interleukin-6 (IL-6) 저해 활성

Raw 264.7 세포에서 LPS에 의해서 생성된 IL-6 형성을 억제하는지 알아보기 위하여 미성숙 잣구과 물 추출물과 80% ethanol 추출물을 농도별 (5, 10, 25 μg/mL)로 처리하여 측정한 결과, 도 11에서와 같이, LPS 대조군에 비해 5 μg/mL의 매우 낮은 농도에서는 억제효과를 나타내지 않지만, 10~25 μg/mL 정도의 비교적 낮은 농도의 처리구에서 농도 의존적으로 유의성 있게 저해 효과를 나타냄을 확인할 수 있었으며, 25 μg/mL 처리군에서 미성숙 잣구과 물 추출물과 80% ethanol 추출물에서 각각 15%와 25% 저해율을 나타내어 미성숙 잣구과 ethanol 추출물의 염증 억제 효과가 더 우수한 것을 알 수 있었다.

(다) 미성숙 잣구과 추출물의 Interleukin-1β (IL-1β) 저해 활성

IL-1β는 monocyte, macrophage, B-cell, dendritic cell, endothelial cell, neutrophil과 hepatocyte에서 분비되며, TNF-α, IL-2, IL-6와 함께 proinflammatory cytokine으로서 여러 면역학적 작용들과 연관이 있다. 특히, IL-1β는 T-cell의 activation, B-cell의 maturation, NK cell의 activity를 활성화 한다.

따라서, Raw 264.7 세포에서 LPS에 의해서 생성된 IL-1β 형성을 억제하는지 알아보기 위하여, 미성숙 잣구과 물 추출물과 80% ethanol 추출물을 농도별 (5, 10, 25 μg/mL)로 처리하여 측정한 결과, 도 12에서와 같이 미성숙 잣구과 물 추출물은 억제 효과가 높지 않았고, ethanol 추출물은 LPS 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의성 있게 저해 효과를 나타냄을 확인할 수 있었으며, 25 μg/mL 처리군에서 미성숙 잣구과 80% ethanol 추출물에서 30% 정도의 저해율을 나타내었다.

이러한 저해 양상으로 볼 때, 첨가되는 미성숙 잣구과 추출물의 농도를 높인다면 더 우수한 항염증 효과도 기대할 수 있을 것이라 판단되었다.

이상의 결과로 PGE_{2 ,} TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성억제는 농도가 높아짐에 따라, 농도 의존적으로 대조군에 비하여 강한 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었으며, 미성숙 잣구과 80% 에탄올 추출물이 물 추출물보다 사이토카인 생성 억제능이 더 뛰어난 것으로 나타났다.

<제제예 1> 식품 조성물의 제조 (1)

상기 실시예 1에서 얻은 미성숙 잣구과의 열수 추출물 5중량％ 및 식품학적으로 사용하는 부형제로서, 옥수수 전분 70중량％, 락토오스(lactose) 10중량％, 수크로오스(sucrose) 10중량％, 솔비톨 5중량％를 혼합한 다음, 산제화하여 산제 제형의 미성숙 잣구과의 열수 추출물을 포함하는 염증저해용 기능성 건강식품 조성물을 제조하였다.

<제제예 2> 식품 조성물의 제조 (2)

상기 실시예 18에서 얻은 미성숙 잣구과의 80% 에탄올 추출물 5중량％ 및 식품학적으로 사용하는 부형제로서, 옥수수 전분 70중량％, 락토오스(lactose) 10중량％, 수크로오스(sucrose) 10중량％, 솔비톨 5중량％를 혼합한 다음, 과립화하여 과립 제형의 미성숙 잣구과의 에탄올 추출물을 포함하는 염증저해용 기능성 건강식품 조성물을 제조하였다.

<제제예 3> 식품 조성물의 제조 (3)

상기 실시예 18에서 얻은 미성숙 잣구과의 80% 에탄올 추출물 10중량％ 및 약품학적으로 사용하는 부형제로서 옥수수 전분 65중량％, 락토오스(lactose) 10중량％, 수크로오스(sucrose) 10중량％, 젤라틴 5중량％를 혼합한 다음, 연질 캡슐제로 캡슐화하여 캡슐제 제형의 미성숙 잣구과의 에탄올 추출물을 포함하는 염증저해용 기능성 건강식품 조성물을 제조하였다.

<제제예 4> 약학적 조성물의 제조 (1)

상기 실시예 1에서 얻은 미성숙 잣구과의 열수 추출물 5중량％ 및 약제학적으로 사용하는 부형제로서, 옥수수 전분 70중량％, 칼슘카보네이트(calcium carbonate) 5중량％, 락토오스(lactose) 10중량％, 수크로오스(sucrose) 10중량％를 혼합한 다음 과립화하여 과립제 제형의 염증저해용 약학적 조성물을 제조하였다.

<제제예 5> 약학적 조성물의 제조 (2)

상기 실시예 18에서 얻은 미성숙 잣구과의 80% 에탄올 추출물 5중량％ 및 약제학적으로 사용하는 부형제로서, 옥수수 전분 50중량％, 칼슘카보네이트(calcium carbonate) 5중량％, 락토오스(lactose) 10중량％, 수크로오스(sucrose) 10중량％, 마그네슘 스테아레이트 2.5중량％, 탈크 2.5중량％를 혼합한 다음, 정제기로 정제하여 정제 제형의 염증저해용 약학적 조성물을 제조하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예, 실험예 및 적용예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증억제용 조성물은 히알루로니아제(HAase)를 저해함으로써 히알루론산(hyaluronic acid) 분자형태를 유지시키고, 염증관련 사이토카인의 발현을 억제함으로써 항염증 효과를 지니기 때문에, 식품산업 뿐만 아니라, 제약산업 분야에 유용하게 적용될 수 있다.

또한, 본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증억제용 조성물은 폐기 자원의 재활용이라는 측면에서, 환경 오염원의 배출량을 감소시키는 효과를 제공할 수 있다.

Claims (9)

1. 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증억제용 조성물로서, 상기 조성물이 비경구용 제형인 것을 특징으로 하는 염증억제용 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 더 포함하는 약품인 것을 특징으로 하는 염증억제용 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 미성숙 잣구과 추출물은 상기 조성물 전체중량 대비 0.1~99.9 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 염증억제용 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 미성숙 잣구과 추출물은 열수 추출물, C₁~C₄의 알코올 추출물 또는 아세톤 추출물인 것을 특징으로 하는 염증억제용 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 미성숙 잣구과 추출물은 열수 추출물 또는 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 염증억제용 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 염증억제는 염증을 유발하는 사이토카인의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증억제용 조성물.
8. 삭제
9. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 외용 패치, 분무제 및 연고제로부터 선택되는 제형으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 염증억제용 조성물.

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