KR101189191B1

KR101189191B1 - 용안육 추출물 또는 이를 포함하는 혼합 추출물을 함유하는 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101189191B1
Application number: KR1020100060181A
Authority: KR
Inventors: 양현옥; 배나영; 권학철; 정성권; 오명숙
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2010-06-24
Filing date: 2010-06-24
Publication date: 2012-10-09
Also published as: US9040102B2; JP5380420B2; KR20110140015A; US20110318435A1; JP2012006906A

Abstract

본 발명은 용안육 추출물, 또는 용안육이 포함된 혼합 추출물을 함유하는 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 용안육 추출물 또는 용안육이 포함된 혼합 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료 효과가 현저히 우수하며 특히 본 발명의 조성물은 도파민성 신경계에 선택적 작용을 하는 MPTP에 의한 신경 독성과 알파-시누클레인(alpha-synuclein) 단백질 응집에 의한 신경 독성으로부터 도파민 신경세포를 유의성 있게 보호함으로써 퇴행성 뇌신경질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

용안육 추출물 또는 이를 포함하는 혼합 추출물을 함유하는 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising longan arillus extract or mixed extracts comprising the same for neurodegenerative diseases}

본 발명은 용안육 추출물 또는 이를 포함하는 혼합 추출물을 함유하는 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

파킨슨병으로 대표되는 퇴행성 뇌신경질환은 뇌흑질치밀부의 도파민 신경세포의 사멸이 특징적이며 그 결과 선조체 내 신경전달물질인 도파민이 감소함으로써 신경전달체계 전체의 균형이 무너지고, 그 결과로서 파킨슨병의 대표적인 증상인 떨림증(tremor), 경직(rigidity), 운동완서(bradykinesia), 자세의 불안정(postural instability) 등의 증상이 나타난다.

　그러나 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌신경질환의 발병원인은 아직 정확히 밝혀져 있지 않으며 단지 유전적인 요인이나 외부로부터의 독성등에 의하여 도파민성 신경세포의 소실이 일어날수 있다는 가설이 있고 최근 일련의 연구에서는 뇌의 동맥경화증, 일산화탄소 중독, 약물, 부갑상선 기능 저하증 등에 의한 대사성, 외상성 뇌염 후유증 등이 관여된다고 알려져 있다.

　파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌신경질환에 대한 효과적인 치료법은 1970년대까지는 거의 없었으나 도파민의 전구물질인 엘도파를 사용하여 뇌 조직에서 감소되어 있는 도파민을 보충하거나, 도파민 수용체 작용제, 항콜린 약제, 엘데프릴(Eldepryl=depreyl) 등을 사용하는 치료법 등이 알려져 있다. 그러나 이들 약물들 대부분은 원인적인 치료가 아니라 증상을 조절하는 역할을 하는 것이며, 이러한 약물들의 장기 투여는 약물 부작용의 문제점을 야기하게 된다. 예를 들어, 항콜린 약제들은 자율신경계 이상이나 정신기능의 이상 등이 나타날 수 있어 고령의 환자들에게 지속적으로 투여하는 것에 한계가 있다. 또한, 엘도파 제제의 경우 장기간 동안의 복용에 따라 점차적으로 효과가 떨어지고, 몸이 뒤틀리고 손이나 발이 저절로 움직이는 이상운동이 생기는 등의 부작용이 발생하게 된다. 기타, 고주파를 이용한 신경자극술 즉, 고주파 파괴술 또는 심부 뇌자극술 등의 수술치료도 행해지고 있으나, 침습적인 수술을 필요로 하고 또한 많은 비용이 소요되는 문제가 있다.

따라서 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌신경질환의 치료에 있어서 임상증세를 호전시키기 위한 대증적 치료법의 개발도 중요하지만 파킨슨병의 직접적인 원인인 흑질내 도파민성 신경세포의 사멸을 방지하는 근본적인 치료방법의 개발도 시급히 요구되고 있다.

또한, 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌신경질환의 원인에 대한 최근 보고된 연구에 따르면 파킨슨병 환자의 뇌에서는 '알파-시누클레인(alpha-synuclein)'이라는 단백질이 비정상적으로 잘못 접힌 기형 상태로 발견된다. 이 알파-시누클레인이 세포에 쌓여서 신경세포를 파괴하는 현상은 파킨슨병의 특징 가운데 하나로 알려져 있다. 따라서 이러한 이상 단백질의 응집을 막거나 용해시키는 방법을 연구하는 것이 파킨슨병의 진행을 늦추거나 예방할 수 있는 새로운 치료법으로 주목을 받고 있다.(Ryu, J. 외 2인. Quality evolution and components of Euphoria longana. Kor. J. Pharmacogn. 33;191～193, 2002)

한편, Ubiquitin-proteasome system(UPS)은 인체 내에서 일어나는 대표적인 단백질 분해 메커니즘으로 많은 퇴행성 뇌신경질환 환자들은 이 기능이 저하되어 있어 변형된 단백질의 축적이 제어되지 못하는 것으로 알려져 있다(Olanow C.W, McNaught K.S. Ubiquitin-proteasome system and Parkinson's disease. Mov. Disord. 2006;21:1806-1823). UPS 외에 또 하나의 중요한 단백질 분해 기전에는 Autophagy-lysosomal pathway(ALP)가 있는데 이것이 최근 퇴행성 뇌신경질환 치료에 중요 타겟으로 연구되고 있다(Bandhyopadhyay U, Cuervo AM. Chaperone-mediated autophagy in aging and neurodegeneration: lessons from alpha-synuclein. Exp Gerontol. 2007;42:120-8). 즉 UPS의 기능에 이상이 생겨 리소좀의 분해 기능이 차단되면 자가 탐식작용(autophagy)이라는 또 다른 단백질 분해 경로가 활성을 나타내면서 일종의 보상 작용을 시도한다. 이 기작에서는 알파-시누클라인과 같은 이상 단백질을 분해하여 단백질이 뇌신경세포에 축적되어 세포손상을 일으키는 것을 방지한다 (Martinez-Vicente M. Cuervo A.M, Autophagy and neurodegeneration: when the cleaning crew goes on strike. Lancet Neurol. 2007;6:352-361., Ravikumar B, Duden R, Rubinsztein D.C. Aggregate-prone proteins with polyglutamine and polyalanine expansions are degraded by autophagy. Hum Mol Genet. 2002;11:1107-1117). 따라서 UPS 기능에 이상이 생긴 퇴행성 뇌신경질환 환자에게 ALP 즉 자가 탐식작용(autophagy) 통한 치료법의 개발이 중요하다.

한편 용안 나무는 무환자 나무과(Sapindaceae)에 속하는 식물이며 이 식물의 가종피를 용안육(龍眼肉, 생약명: longan arillus 또는 longanae arillus)이라고 한다. 동의보감에 따르면 용안육의 효능은 보익심비(補益心脾), 양혈안신(養血安神)이고, 주치병증은 건망실면(健忘失眠), 혈허위황(血虛萎黃), 기혈부족(氣血不足), 심계정충으로, 한방에서는 강장제, 진정제로서 건망증과 불면증에 주로 복용하는 것으로 알려져 있다.

그러나 상기 용안육이 퇴행성 뇌신경질환의 예방 및 치료에 효과가 있는지 여부에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.

본 발명자들은 퇴행성 뇌신경질환의 예방 및 치료에 효과가 있는 천연 물질에 관하여 연구하던 중, 용안육 및 이를 함유하는 혼합 추출물이 퇴행성 뇌신경질환의 예방 및 치료에 매우 효과적임을 밝혀 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 용안육 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 용안육 추출물을 함유하는 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 용안육 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 용안육 추출물을 함유하는 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서 '용안육'은 용안 나무의 가종피를 의미하며, 생약명이 longan arillus 또는 longanae arillus이다.

본 발명에서 '고본'은 미나리과에 속하는 약품식물로 생약명이 angelicae tenuissimae radix이며, 본 발명에서 상기 식물의 뿌리, 줄기 및 잎 부위를 추출하여 사용할 수 있으나 보다 바람직하게는 상기 식물의 뿌리를 사용할 수 있다.

본 발명에서 '원지'는 원지과(Polygalaceae)에 속하는 약품식물로 생약명이 polygalae radix이며, 본 발명에서 상기 식물의 뿌리, 줄기 및 잎 부위를 추출하여 사용할 수 있으나 보다 바람직하게는 상기 식물의 뿌리를 사용할 수 있다.

본 발명에서 '갈근'은 칡(Pueraria lobata (Willd.) Ohwi)의 주피를 제거한 뿌리를 의미한다.

본 발명에서 '황금'은 학명이 Scutellariae Radix이며, 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과의 여러해살이풀로써, 본 발명에서 상기 식물의 뿌리, 줄기 및 잎 부위를 추출하여 사용할 수 있으나 보다 바람직하게는 상기 식물의 뿌리를 사용할 수 있다.

본 발명에서 '길경'은 학명이 Platycodi Radix로 초롱꽃과의 여러해살이풀로 여름에 흰색과 보라색으로 꽃이 핀다. 본 발명에서 상기 식물의 뿌리, 줄기 및 잎 부위를 추출하여 사용할 수 있으나 보다 바람직하게는 상기 식물의 뿌리를 사용할 수 있다.

본 발명에서 '승마'는 학명이 Cimicifugae Rhizoma로 미나리아재비과의 승마(Cimicifuga heracleifolia Komarov) 또는 동속 식물의 뿌리줄기로 만든 약재이다.

본 발명에서 '백지'는 산형과의 구릿대(Angelica dahurica Bentham et Hooker) 또는 그 변종의 뿌리를 말려 만든 약재로 학명이 Angelicae Dahuricae Radix이다.

본 발명에서 '내복자'는 십자화과의 무(Raphanus sativus L.) 또는　동속식물의 씨를 사용해 만든 약재로 학명이 Raphani Semen이다.

본 발명에서 '석창포'는 학명이 Acori Gramineri Rhizoma로 외떡잎식물 천남성목 천남성과의 여러해살이풀이다. 본 발명에서 상기 식물의 뿌리, 줄기 및 잎 부위를 추출하여 사용할 수 있으나 보다 바람직하게는 상기 식물의 뿌리줄기를 사용할 수 있다.

본 발명에서 '퇴행성 뇌신경질환'은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 축삭경화증(루게릭병) 및 다발성 경화증 일 수 있으며, 상기 근위축성 축산경화증은 루게릭병일 수 있으며, 가장 바람직하게는 파킨슨병일 수 있다.

본 발명에서 추출물은 열수 추출물 또는 유기용매 추출물일 수 있으며, 당업계에 공지된 식물 추출물 제조방법을 이용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올, 핵산, 염화메틸렌, 아세토니트릴 및 아세톤으로 이루어진 일종 이상의 유기용매 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명에서 추출물은 용안육, 바람직하게는 용안육에 고본 및 원지로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 혼합하거나 보다 더 바람직하게는 상기 혼합물에 갈근, 황금, 길경, 백지, 승마, 내복자 및 석창포로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 추가 혼합하고 이를 물 및 C1 내지 C4의 저급알코올로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 사용하여 1차 추출한 추출물이거나, 상기 1차 추출물을 물, 핵산, 염화메틸렌 및 C₁ 내지 C₄의 저급알코올로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 사용하여 추가적으로 추출한 2차 추출물일 수 있다. 보다 더 바람직하게는 상기 2차 추출물을 아세토니트릴, 메탄올, 아세톤 및 물로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 사용하여 추가적으로 추출한 3차 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실험예에서는 용안육 또는 이를 함유하는 혼합 추출물로 물을 가하여 제조된 열수 추출물을 사용한다.(<실시예 1> 참조)

본 발명의 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료 활성이 있는 유효성분은 용안육 단독 추출물 (YA) 일 수 있으나, 바람직하게는 용안육에 고본 및 원지로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상의 추출물이 추가적으로 함유된 혼합 추출물이거나, 또는 용안육에 고본 및 원지로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상의 추출물이 추가적으로 함유된 혼합 추출물에 갈근, 황금, 길경, 백지, 승마, 내복자 및 석창포로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상의 추출물이 더 추가적으로 함유된 추출물일 수 있다. 더욱 더 바람직하게는 용안육, 고본 및 원지의 혼합 추출물(DG), 가장 바람직하게는 용안육, 고본, 원지 갈근, 황금, 길경, 백지, 승마, 내복자 및 석창포의 혼합추출물(MYH)일 수 있다.

상기 추출물이 용안육 및 원지의 혼합 추출물인 경우 용안육 및 원지가 1:0.2 내지 1:10의 중량비로, 더 바람직하게는 1:0.4 내지 1:5의 중량비로, 보다 더 바람직하게는 1:0.8 내지 1:2.5의 중량비로 혼합되어 추출된 것이거나, 가장 바람직하게는 용안육 및 원지가 1:1의 중량비로 혼합되어 추출된 것일 수 있다.

상기 추출물이 용안육 및 고본의 혼합 추출물의 경우 용안육 및 고본이 1:0.1 내지 1:5의 중량비로, 더 바람직하게는 1:0.2 내지 1:2.5의 중량비로, 보다 더 바람직하게는 1:0.8 내지 1:1.25의 중량비로 혼합되어 추출된 것이거나, 가장 바람직하게는 용안육 및 원지가 1:1의 중량비로 혼합되어 추출된 것일 수 있다.

상기 추출물이 용안육, 원지 및 고본의 혼합 추출물인 경우 바람직하게는 용안육, 원지 및 고본이 1:0.1 내지 10:0.1 내지 10의 중량비로, 1:0.2 내지 5:0.2 내지 5의 중량비로, 보다 더 바람직하게는 1:0.4 내지 2.5:0.4 내지 2.5의 중량비로, 가장 바람직하게는 1:1:1의 중량비로 혼합(혼합추출물 DG로 표시함)되어 추출된 것일 수 있다.

상기 추출물이 용안육, 원지, 고본, 갈근, 황금, 길경, 백지, 승마, 내복자 및 석창포 추출물을 모두 포함하는 경우 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 용안육 15 내지 20 중량부, 고본 10 내지 15 중량부, 원지 10 내지 15 중량부, 갈근 15 내지 20 중량부, 황금 5 내지 10 중량부, 길경 1 내지 5 중량부, 백지 5 내지 10 중량부, 승마 5 내지 10 중량부, 내복자 5 내지 10 중량부 및 석창포 15 내지 20 중량부로 혼합되어 추출된 것일 수 있으며, 바람직하게는 용안육 15 내지 18 중량부, 고본 10 내지 13 중량부, 원지 10 내지 13 중량부, 갈근 15 내지 18 중량부, 황금 5 내지 8 중량부, 길경 1 내지 3 중량부, 백지 5 내지 8 중량부, 승마 5 내지 8 중량부, 내복자 5 내지 8 중량부 및 석창포 15 내지 18 중량부로 혼합되어 추출된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 용안육 16 내지 18 중량부, 고본 10 내지 12 중량부, 원지 10 내지 12 중량부, 갈근 16 내지 18 중량부, 황금 5 내지 7 중량부, 길경 2 내지 3 중량부, 백지 5 내지 7 중량부, 승마 5 내지 7 중량부, 내복자 5 내지 7 중량부 및 석창포 16 내지 18 중량부로 혼합되어 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 용안육 추출물, 용안육이 포함된 혼합추출물의 뇌세포 사멸에 미치는 효과를 분석한 결과, MPTP(<실시예 2> 참조)로 뇌세포 사멸을 유도하고 상기 추출물들을 투여한 결과, 상기 추출물들은 뇌세포 사멸을 효과적으로 억제할 수 있는 활성이 있어 뇌세포 보호 효과가 있음을 알 수 있다.

또한 본 발명의 일실시예에서는 용안육 추출물, 용안육이 포함된 혼합추출물이 파킨슨병의 원인으로 알려진 알파-시누클레인(alpha-synuclein) 단백질의 분해를 촉진하는 자가탐식작용 (autophagy)을 유도하는 효과가 매우 우수함을 알 수 있다. (<실시예 3> 참조)

　또한 본 발명의 일실시예에서는 (in vivo 실험) MPTP로 마우스에 파킨슨병을 유발시킨 후, 행동실험(Pole test, Rota-rod test) 및 도파민 세포(dopaminergic neuron) 보호 활성 실험을 수행한 결과, 용안육 추출물, 용안육이 포함된 혼합추출물을 투여한 경우 MPTP에 의해 야기되는 운동기능 퇴화를 복원시키며(<실시예 4> 참조), 또한 선조체(striatum)와 흑질(substantia nigra)에서 우수한 도파민 세포(dopaminergic neuron)의 보호활성을 나타냄을 알 수 있다.(<실시예 4> 참조) 나아가 tyrosine hydrolase에 대한 조직 면역 염색 방법(TH-IHC)과 avidin-biotin peroxidase를 이용한 면역 염색 방법 (TH-IR)에 의해서도 MPTP에 의해 유발되는 뇌세포 사멸을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.(<실시예 4> 참조)

　　따라서 본 발명의 약학적 조성물이 용안육 단독 추출물이나, 바람직하게는 용안육에 고본 및 원지로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상의 추출물이 추가적으로 함유된 혼합 추출물, 보다 바람직하게는 상기 혼합 추출물에 갈근, 황금, 길경, 백지, 승마, 내복자 및 석창포로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상의 추출물이 추가적으로 함유된 혼합 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료 효과가 현저히 우수하다.

보다 구체적으로 본 발명의 약학적 조성물이 도파민성 신경계에 선택적 작용을 하는 MPTP에 의한 신경 독성과 알파-시누클레인(alpha-synuclein) 단백질 응집에 의한 신경 독성으로부터 도파민 신경세포를 유의성 있게 보호함으로써 퇴행성 뇌신경질환을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물 내의 유효성분으로서의 상기 추출물의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 '고형분 중량'은 추출물 중 용매 성분을 제거하고 남은 성분의 중량을 말한다.

　본 발명의 약학적 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

　본 발명의 약학적 조성물은 상기 추출물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 원지, 고본 및 용안육 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 경피제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

　본 발명의 약학적 조성물은 사람에게 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행(standard phamaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강내 또는 혀밑 투여될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제 (예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔(witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유(apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물) 와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.5 내지 50 ㎎/kg, 바람직하게는 1 내지 30 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생할 수 있으므로, 상기 범위로 하는 것이 바람직하다.

　상기에서 환자는 사람을 포함하는 포유동물을 말하며 바람직하게는 퇴행성 뇌신경질환, 보다 바람직하게는 파킨슨병으로 진단된 사람을 말한다.

한편 본 발명의 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물은 용안육 단독 추출물, 바람직하게는 용안육에 고본 및 원지로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상의 추출물이 추가적으로 함유된 혼합 추출물, 보다 바람직하게는 상기 혼합 추출물에 갈근, 황금, 길경, 백지, 승마, 내복자 및 석창포로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상의 추출물이 추가적으로 함유된 혼합 추출물을 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 조성물의 제조방법 및 퇴행성 뇌신경질환을 예방하고 증상을 개선할 수 있는 활성에 대해서는 앞서 기술한 것과 같다.

　본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강 식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

　예를 들면, 건강 식품으로는 상기 용안육 추출물 또는 혼합추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 상기 용안육 추출물 또는 혼합추출물과 퇴행성 뇌신경질환 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

　또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 상기 용안육 추출물 또는 혼합추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.

　또한, 상기 용안육 추출물 또는 혼합추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

　본 발명의 식품 조성물 중 상기 용안육 추출물 또는 혼합추출물의 바람직한 함유량으로는 식품 100g당 약 0.001g 내지 20g이다. 바람직하게는, 본 발명에서의 상기 용안육 추출물 또는 혼합추출물은 특히, 퇴행성 뇌신경질환 개선 효과가 있는 것으로 알려진 활성 성분과 함께 혼합하여 건강 식품의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 용안육 추출물 또는 이를 함유하는 혼합 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료 효과가 현저히 우수하며 특히 본 발명의 조성물은 도파민성 신경계에 선택적 작용을 하는 MPTP에 의한 신경 독성과 알파-시누클레인(alpha-synuclein) 단백질 응집에 의한 신경 독성으로부터 도파민 신경세포를 유의성 있게 보호함으로써 퇴행성 뇌신경질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1a는 용안육 추출물이 농도 증가에 따라 MPTP로 유발된 뇌세포 사멸에 미치는 효과를 측정한 결과이다 (YA:용안육).
도 1b는 용안육 추출물에 고본 및 원지추출물이 혼합된 혼합 추출물(DG)이 농도 증가에 따라 MPTP로 유발된 뇌세포 사멸에 미치는 효과를 측정한 결과이다.
도 1c는 용안육과 고본의 혼합 혹은 용안육과 원지의 혼합 추출물과 용안육, 고본 및 원지 혼합 추출물이 다양한 혼합 비율에 따라 MPTP로 유발되는 뇌세포 사멸에 미치는 효과를 측정한 결과이다 (YA 또는 Y: 용안육, WJ 또는 W:원지, GB 또는 G: 고본, Y1W1: 용안육과 원지가 1:1의 중량비로 혼합된 경우).
도 1d는 혼합 추출물(MYH)이 농도 증가에 따라 MPTP로 유발된 뇌세포 사멸에 미치는 효과를 측정한 결과이다.
도 2a는 용안육 추출물(YA)의 농도의 증가에 따른 자가 탐식작용(autophagy) 유도 활성을 나타낸 실험결과이다.
도 2b는 용안육 추출물(YA)과 혼합 추출물(DG)의 자가 탐식작용(autophagy) 유도 활성을 비교한 실험결과이다.
도 2c는 혼합 추출물(DG)의 농도의 증가에 따른 자가 탐식작용(autophagy) 유도 활성을 나타낸 실험결과이다.
도 2d는 혼합 추출물(DG)의 시간 경과에 따른 자가 탐식작용(autophagy) 유도 활성을 나타낸 실험결과이다.
도 2e는 autophagy inhibitor를 이용한 혼합 추출물(DG)의 autophagy 유도 효과를 검증한 실험결과이다.
도 2f는 혼합 추출물(MYH)의 농도의 증가에 따른 자가 탐식작용(autophagy) 유도 활성을 나타낸 실험결과이다.
도 2g는 혼합 추출물(MYH)의 시간 경과에 따른 자가 탐식작용(autophagy) 유도 활성을 나타낸 실험결과이다.
도 2h는 autophagy inhibitor를 이용한 혼합 추출물(MYH)의 autophagy 유도 효과를 검증한 실험결과이다.
도 3a는 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson's disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스에 대한 혼합 추출물(DG)의 행동시험(pole test) T-turn 결과(%)를 나타낸 그래프이다. (각 수치는 평균±표준편차를 의미하며, **는 대조군에 비하여 p <0.01 인 경우, #는 p <0.05인 경우, ##는 p <0.01인 경우를 의미함)
도 3b는 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson's disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스에 대한 혼합 추출물(DG)의 행동시험(pole test) T-LA 결과(%)를 나타낸 그래프이다. (각 수치는 평균±표준편차를 의미하며, **는 대조군에 비하여 p <0.01 인 경우, #는 p <0.05인 경우, ##는 p <0.01인 경우를 의미함)
도 3c는 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson's disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스에 대한 혼합 추출물(DG)의 행동시험(Rota-rod test) 결과(%)를 나타낸 그래프이다. (각 수치는 평균±표준편차를 의미하며, ***는 대조군에 비하여 p <0.001 인 경우, #는 MPTP만을 처리한 군에 비하여 p <0.05인 경우를 의미함)
도 3d는 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson's disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스에서 흑질(substantia nigra)의 도파민 양성 세포 (tyrosine hydroxylase positive cell) 감소에 대한 혼합 추출물(DG)의 억제활성을 측정한 결과(%)를 나타낸 그래프와 DG의 억제활성 효과를 보여주는 사진이다(X100). (Scale bar는 100 μm이고, 각 수치는 평균±표준편차를 의미하며, ***는 대조군에 비하여 p <0.001인 경우, ###는 MPTP만을 처리한 군에 비하여 p <0.001인경우를 의미함)
도 3e는 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson's disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스에서 선조체(striatum)의 광학밀도(optical density) 감소에 대한 혼합 추출물(DG)의 억제활성을 측정한 결과(%)를 나타낸 그래프와 혼합 추출물(DG)의 억제활성 효과를 보여주는 사진이다. (X40) (Scale bar는 200 μm이고 각 수치는 평균±표준편차를 의미하며, ***는 대조군에 비하여 p <0.001인 경우, #는 MPTP만을 처리한 군에 비하여 p <0.05인 경우를 의미함)
도 3f는 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson's disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스에서 흑질(substantia nigra)의 도파민 양성 세포 (tyrosine hydroxylase positive cell) 감소에 대한 혼합 추출물(MYH)의 억제활성을 측정한 결과(%)를 나타낸 그래프와 MYH의 억제활성 효과를 보여주는 사진이다 (X40) (Scale bar는 100 μm이고 각 수치는 평균±표준편차를 의미하며, ***는 대조군에 비하여 p <0.001인 경우, #는 MPTP만을 처리한 군에 비하여 p <0.001인 경우를 의미함)
도 3g는 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson's disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스에서 선조체(striatum)의 광학밀도(optical density) 감소에 대한 혼합 추출물(MYH)의 억제활성을 측정한 결과(%)를 나타낸 그래프와 MYH의 억제활성 효과를 보여주는 사진이다 (X100) (Scale bar는 200 μm이고 각 수치는 평균±표준편차를 의미하며, ***는 대조군에 비하여 p <0.001인 경우, #는 MPTP만을 처리한 군에 비하여 p <0.05인 경우를 의미함)
도 4a은 혼합 추출물(DG)가 세포 활성도에 미치는 효과를 측정한 결과이다.
도 4b은 혼합 추출물(MYH)가 세포 활성도에 미치는 효과를 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

용안육 추출물 및 용안육이 함유된 혼합 추출물의 제조

<1-1> 용안육 추출물 제조

용안육(대전대학교 부속 천안한방병원) 40 g을 깨끗이 세척하고 잘게 절단한 후 중량비율의 4배의 물을 가하여 옹기 약탕기에서 95℃에서 4시간 동안 1차 추출한 후, 여과하고 남은 고형분에 다시 물을 절반량 추가하여 상기와 동일한 조건에 따라 2차 추출하였다.

상기 두 가지 추출액을 모아서 여과하여 고형분을 제거한 후, 3200 rpm 에서 20분간 원심 분리한 후 상청액을 수집하였다. 다시 상청액을 2.0 um 마이크로 필터를 사용하여 필터링한 액체만을 수집하여 사용하였다.

<1-2> 용안육 , 고본 및 원지의 다양한 혼합비에 따른 혼합 추출물의 제조

용안육 및 고본 혹은 용안육 및 원지의 혼합 추출물과 용안육, 고본 및 원지를 모두 혼합한 혼합 추출물을 다양한 혼합 비율로 구성하여 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 혼합 추출물을 제조하였다. 상기 약재 원료는 모두 대전대학교 부속 천안한방병원에서 구입하였다.

특히 용안육, 고본 및 원지를 1:1:1의 비율로 혼합한 경우를 혼합 추출물 DG로 명명하였다.

2종 혼합 추출물		3종 혼합 추출물
명칭	혼합비율	명칭	혼합비율
Y1W1	용안육 30g : 원지 30g	Y1W2G1	용안육 15g : 원지 30g : 고본 15g
Y1G1	용안육 30g : 고본 30g	Y1W1G2	용안육 15g : 원지 15 : 고본 30g
Y1W2	용안육 20g: 원지 40g	Y1W2G2	용안육 12g : 원지 24g : 고본 24g
Y1G2	용안육 20g : 고본 40g	Y1W1G1 (DG)	용안육 20g : 원지 20g : 고본 20g
Y2W1	용안육 40g : 원지 20g	Y2W1G1	용안육 30g : 원지 15g : 고본 15g
Y2G1	용안육 40g : 고본 20g	Y2W2G1	용안육 24g : 원지 24g : 고본 12g
		Y2W1G2	용안육 24g : 원지 12g : 고본 24g

<1-3> 용안육 , 갈근 , 고본, 황금, 길경 , 백지, 승마, 내복자 , 원지 및 석창포의 혼합 추출물( MYH )의 제조

　갈근 12g, 고본 8g, 황금 4g, 길경 2g, 백지 4g, 승마 4g, 내복자 4g, 원지 8g, 석창포 12g, 용안육 12g을 구입(대전대학교 부속 천안한방병원)하여 각각 준비하고 이를 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 혼합 추출물을 제조하였다.

천연약재	생약명	중량(g) 및 조성비율(%)
용안육	Longan Arillus(= Longanae Arillus )	12 g (17.14 중량%)
고본	Angelicae Tenuissimae Radix	8 g (11.43 중량%)
원지	Polygalae Radix	8 g (11.43 중량%)
갈근	Puerariae Radix	12 g (17.14 중량%)
황금	Scutellariae Radix	4 g (5.71 중량%)
길경	Platycodi Radix	2 g (2.86 중량%)
승마	Cimicifugae Rhizoma	4 g (5.71 중량%)
백지	Angelicae Dahuricae Radix	4 g (5.71 중량%)
내복자	Raphani Semen	4 g (5.71 중량%)
석창포	Acori Gramineri Rhizoma	12 g (17.14 중량%)
합계		70 g

< 실시예 2>

본 발명의 혼합 추출물이 MPTP 에 의해 유발되는 뇌세포 사멸에 미치는 효과

상기 <실시예 1>에서 제조된 용안육 추출물과 혼합 추출물(DG) 및 혼합 추출물(MYH)이 세포 외부에 처리한 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)에 의해 유발되는 뇌세포 사멸에 미치는 효과를 다음과 같이 확인하였다. 구체적으로 도파민성 신경계에 선택적으로 독성을 나타내는 물질인 N-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘(N-methyl-4-phenyl -1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)을 이용하여 SH-SY5Y 세포주에 세포독성을 유도한 후 세포보호 활성 실험을 수행하였다.

<2-1> 추출물이 함유된 배지

상기　<실시예 1>의 단일 추출물 또는 혼합 추출물을 10% 우태아혈청 (fetal ovaine serum) 및 1% 항생제를 함유하는 MEM 배지 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA)에 다양한 농도로 희석하여 사용하였다.

<2-2> 세포 배양

신경세포 모델로 사용될 세포는 인간 신경 세포종에서 기원한 SH-SY5Y 세포(기탁번호: ATCC CRL-2266)를 선택하였다. 상기 세포는 10% 우태아혈청(fetal bovaine serum) 및 1% 항생제를 함유하는 상기 <실시예 2-1>의 MEM 배지에서 배양하였다.

<2-3> 세포독성실험 MTT 분석

본 발명의 용안육 추출물과 혼합 추출물(DG) 및 혼합 추출물(MYH)이 400 μM MPTP로 유도한 세포 독성에 대하여 SH-SY5Y 세포의 세포활성도(cell viability)에 미치는 효과를 측정하기 위하여 공지된 세포독성 측정 (MTT Cell Proliferation assay) 방법을 사용하였다.

<2-3-1> 용안육 추출물이 농도 증가에 따라 MPTP 로 유발되는 뇌세포 사멸에 미치는 효과

MTT 분석을 위해 배양된 SH-SY5Y 세포에 <실시예 1-1>에서 제조한 용안육 추출물을 3.125, 6.25, 12.5, 25 ㎍/㎖ 농도로 처리하고, 2시간 후에 MPTP를 400 μM 의 농도로 첨가한 후, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 이때 배지만 처리한 대조군과 MPTP만 처리한 실험군도 함께 준비하여 실험에 사용하였다. 48시간 후에 MTT 용액을 첨가하여 1시간 동안 배양한 후, ELISA 기기를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

상기와 같이 MTT 환원 정도를 측정함으로써 각 군의 세포활성도(cell viability)를 얻어 그 결과를 도 1a에 나타내었다.

도 1a에 기재된 바와 같이, 400 μM MPTP 처리군의 세포활성도는 대조군 대비 62.75%로 세포독성이 유발되었으며 이 독성에 대하여 용안육 추출물 3.125㎍/㎖ 처리군에서 세포활성도가 123%, 6.25㎍/㎖ 처리군에서는 세포활성도가 138%까지 상승하였으며 이후에도 세포 보호활성을 나타내었다.

상기 결과를 통하여 본 발명의 용안육 추출물은 외부 처리된 MPTP에 의해 유발되는 뇌세포 사멸을 농도의존적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

<2-3-2> 혼합 추출물( DG )가 농도 증가에 따라 MPTP 로 유발되는 뇌세포 사멸에 미치는 효과

MTT 분석을 위해 배양된 SH-SY5Y 세포에 <실시예 1-2>에서 제조한 혼합 추출물(DG)을 각각 25, 50, 100, 200, 300 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, 2시간 후에 MPTP를 400 μM 의 농도로 첨가한 후, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 이때 배지만 처리한 대조군과 MPTP만 처리한 실험군도 함께 준비하여 실험에 사용하였다. 48시간 후에 MTT 용액을 첨가하여 1시간 동안 배양한 후, ELISA 기기를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

상기와 같이 MTT 환원 정도를 측정함으로써 각 군의 세포활성도(cell viability)를 얻어 그 결과를 도 1b에 나타내었다.

도 1b에 기재된 바와 같이, 400 μM MPTP 처리군의 세포활성도는 대조군 대비 62.13%로 세포독성이 유발되었으며 이 독성에 대하여 혼합 추출물(DG) 25㎍/㎖ 처리군에서 세포활성도가 110%까지 상승하였으며 이후에도 농도의존적으로 세포 보호활성을 나타내었다.

상기 결과를 통하여 본 발명의 혼합 추출물(DG)은 외부 처리된 MPTP에 의해 유발되는 뇌세포 사멸을 농도의존적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

<2-3-3> 다양한 혼합비율에 따른 혼합 추출물들이 MPTP 로 유발되는 뇌세포 사멸에 미치는 효과 비교

MTT 분석을 위해 배양된 SH-SY5Y 세포에 <실시예 1-2>에서 제조한 각각의 혼합 추출물을 각각 25 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, 2시간 후에 MPTP를 400 μM 의 농도로 첨가한 후, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 이때 배지만 처리한 대조군과 MPTP만 처리한 실험군도 함께 준비하여 실험에 사용하였다. 48시간 후에 MTT 용액을 첨가하여 1시간 동안 배양한 후, ELISA 기기를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

상기와 같이 MTT 환원 정도를 측정함으로써 각 군의 세포활성도(cell viability)를 얻어 그 결과를 도 1c에 나타내었다.

도 1c에 기재된 바와 같이, 400 μM MPTP 처리군의 세포활성도는 대조군 대비 70.21%로 세포독성이 유발되었으며 이 독성에 대하여 두 가지 약재로 구성된 혼합 추출물 처리군의 세포활성도는 65 내지 75% 사이의 세포보호활성이 있음이 확인되었다. 특히 용안육 및 원지가 함유된 혼합 추출물의 경우 1:1~2, 보다 바람직하게는 1:1의 중량비로 혼합하여 제조된 경우 매우 효과적인 세포보호활성이 있음을 알 수 있다. 또한 용안육 및 고본이 함유된 혼합 추출물의 경우 1:0.5~1, 보다 바람직하게는 1:1의 중량비로 혼합하여 제조된 경우 매우 효과적인 세포보호활성이 있음을 알 수 있다.

한편, 용안육, 원지 및 고본의 세 가지 약재로 구성된 혼합 추출물 처리군의 세포활성도는 80 내지 110% 사이로 세포보호활성이 증가함을 알 수 있다. 특히 용안육, 고본, 원지를 1:0.5~2:0.5~2의 중량비로 혼합한 경우, 보다 바람직하게는 1:1:1의 중량비로 혼합하는 경우 세포보호활성이 보다 우수함을 알 수 있다.

<2-3-4> 용안육 , 고본 및 원지의 혼합 추출물을 함유하는 조성물( MYH )가 농도 증가에 따라 MPTP 로 유발되는 뇌세포 사멸에 미치는 효과

MTT 분석을 위해 배양된 SH-SY5Y 세포에 <실시예 1-3>에서 제조한 용안육, 고본 및 원지의 혼합 추출물을 함유하는 조성물(MYH)을 각각 6.25, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, 2시간 후에 MPTP를 400 μM 의 농도로 첨가한 후, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 이때 배지만 처리한 대조군과 MPTP만 처리한 실험군도 함께 준비하여 실험에 사용하였다. 48시간 후에 MTT 용액을 첨가하여 1시간 동안 배양한 후, ELISA 기기를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

상기와 같이 MTT 환원 정도를 측정함으로써 각 군의 세포활성도(cell viability)를 얻어 그 결과를 도 1d에 나타내었다.

도 1d에 기재된 바와 같이, 400 μM MPTP 처리군의 세포활성도는 대조군 대비 64.74%로 세포독성이 유발되었으며 이 독성에 대하여 혼합 추출물(MYH) 를 처리한 경우, 6.25 ㎍/㎖에서는 85.86%의 세포 보호 활성을 나타내었고, 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖농도에서는 배지만 처리한 대조군과 비교했을 때 모두 완벽히 세포 보호 활성을 나타내는 것을 관찰할 수 있었다.

상기 결과를 통하여 본 발명의 용안육, 고본 및 원지의 혼합 추출물을 함유하는 조성물(MYH)은 외부 처리된 MPTP에 의해 유발되는 뇌세포 사멸을 농도의존적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

< 실시예 3>

본 발명의 용안육 추출물 또는 혼합 추출물이 뇌신경 세포에서 자가 탐식작용( autophagy )을 유도하는 효과

NGF (nerve groth factor)를 이용하여 신경세포로 분화시킨 PC12 세포주에서 autophagy 유도 활성을 나타내는 마커인 LC3 2 단백질의 발현을 확인하기 위하여 western-blotting 실험을 하기와 같이 수행하였다.

<3-1> 추출물이 함유된 배지

상기　<실시예 1>의 혼합 추출물(I) 또는 혼합 추출물(Ⅱ)을 10% 우태아혈청 (Fetal bovaine serum) 및 1% 항생제를 함유하는 DMEM 배지(HyClone Laboratories, Hyclone Rd., Logan UT, 미국)에 다양한 농도로 희석하여 사용하였다.

<3-2> 세포배양

신경세포 모델로 사용될 세포는 흰쥐 갈색 세포종에서 기원한 PC12 세포 (differentiated by NGF, RCB0009, RIKEN BRC Cell Bank, Tsukuba, Ibaraki, 일본)를 선택하였다.

상기 세포는 10% 우태아혈청 (fetal bovaine serum) 및 1% 항생제를 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였으며, 실험에 사용하기 전 NGF (nerve growth factor)를 이용하여 신경세포로 분화시켰다.

<3-3> 자가 탐식작용 ( autophagy ) 유도 활성 확인

상기 <실시예 1>에서 제조된 용안육 추출물 또는 혼합 추출물이 autophagy를 유도하는 효과를 확인하기 위하여 western-blotting assay를 이용하여 autophagy 발현 마커인 LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율을 측정하였다.

<3-3-1> 용안육 추출물의 농도 증가에 따른 자가탐식작용 ( autophagy ) 유도 활성

배양된 PC12 세포에 <실시예 1-1>에서 제조한 용안육 추출물을 각각 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 5% CO2, 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후, 포집하여 2500 rpm에서 5분간 원심분리하여 FBS (pH 7.2)로 2회 세척하였다. 얻어진 세포는 mitochondrial lysis buffer (50mM Tris pH 7.4, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 2mM EGTA, 0.2% Triton X-100, 0.3% NP-40, 100μM PMSF, 10μg/ml leupeptin, 2μg/ml aprotinin)과 4℃에서 20분간 반응시켜 단백질을 분리한 후, 13,200rpm에서 20분간 원심분리하여 얻은 상청액을 Bradford's method (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에 따라서 단백질을 정량하였다.

동량의 세포파쇄액은 SDS loading buffer와 혼합하여 99℃에서 5분간 가열한 후에 15% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)를 시행하였다. 단백질은 분자량에 기초하여 분리하기 위하여 단일 15% SDS-polyacrylamide gel을 사용하였다. 각 gel 당 150V로 전기영동 한 단백질은 semi-dry 방법으로 실온에서 15의 전하를 1시간 동안 걸어주어 nitrocellulose membrane상으로 이동시켜다. nitrocellulose membrane은 blocking buffer (5% skim milk in Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20) 와 상온에서 30분 동안 반응하여 비특이적인 항체 결합을 예방하였다. LC3, GapDH 에 대한 항체 (Cell Signaling Technology Inc. <Beverly, Massachusetts, U.S.A.> 에서 구입)는 0.1% Tween-20이 포함된 5% skim milk/Tris-buffered saline 에 1:1000으로 희석하여 4℃에서 overnight 동안 반응시킨 후, 이차항체(anti-rabbit IgG conjugated horse-radish peroxidase, Cell Signaling Technology Inc. <Beverly, Massachusetts, U.S.A.> 에서 구입) 를 1:2000 의 비율로 희석하여 1시간 동안 반응하였다. nitrocellulose membrane은 TBS로 3회 세척 후 ECL kit를 사용하여 ECL필름에 현상하였다. 이때 배지만 처리한 대조군도 함께 준비하여 실험에 사용하였으며, GapDH 단백질은 동량확인을 위하여 측정하였다. 이후 실험 결과는 LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율을 확인하여 도 2a에 나타내었다.

도 2a에 기재된 바와 같이, 용안육 추출물을 처리한 경우 100 ㎍/㎖ 처리군에서 LC3 2/LC3 1의 비율이 대조군에 비하여 증가하는 경향을 확인하여 용안육추출물이 LC3 2 단백질의 발현을 유도함을 알 수 있다.

<3-3-2> 본 발명의 용안육 추출물과 혼합 추출물( DG )의 자가탐식작용 ( autophagy ) 유도 활성 비교

배양된 PC12 세포에 <실시예 1-1>에서 제조한 용안육 추출물을 각각 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하고, <실시예 1-2>에서 제조한 혼합 추출물(DG)을 300 ㎍/㎖ 처리하여 5% CO₂, 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후, <실시예 3-3-1>과 같은 방법으로 실험하였다. 이때 배지만 처리한 대조군도 함께 준비하여 실험에 사용하였으며, GapDH 단백질은 동량확인을 위하여 측정하였다. 이후 실험 결과는 LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율을 확인하여 도 2b에 나타내었다.

도 2b에 나타낸 바와 같이, 용안육 추추물 100 ㎍/㎖ 처리군에서 LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율이 1.73으로 증가한 것에 비하여 혼합 추출물 DG 300 ㎍/㎖ 처리군에서는 매우 뚜렷한 LC3 2 단백질 발현이 나타났으며, LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율이 14.10인 것으로 확인하였다.

이상의 결과에서, 용안육 추출물뿐만 아니라 용안육, 고본 및 원지를 혼합한 추출물에서 autophagy 유도효과가 매우 우수함을 알 수 있다.

<3-3-3> 혼합 추출물( DG )의 농도 증가에 따른 자가 탐식작용 ( autophagy ) 유도 활성

배양된 PC12 세포에 <실시예 1-2>에서 제조한 혼합 추출물(DG)을 다양한 농도(75, 150, 300, 600 ㎍/㎖)로 처리하고 5% CO₂, 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후, <실시예 3-3-1>과 같은 방법으로 실험하였다. 이때 배지만 처리한 대조군도 함께 준비하여 실험에 사용하였으며, GapDH 단백질은 동량확인을 위하여 측정하였다. 이후 실험 결과는 LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율을 확인하여 도 2c에 나타내었다.

도 2c에 나타난 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물(DG)은 농도가 증가함에 따라 autophagy 유도 효과를 나타내는 마커인 LC3 2 단백질의 발현, 혹은 LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율이 증가함을 확인함으로써 본 발명의 혼합 추출물은 농도가 증가함에 따라 autophagy를 유도하는 효과를 증가시킴을　알 수 있다.

<3-3-4> 혼합 추출물( DG )의 시간 경과에 따른 자가 탐식작용 ( autophagy ) 유도 활성

상기 배양된 PC12 세포에 <실시예 1-2>에서 제조한 혼합 추출물(DG) 300 ㎍/㎖를 처리하고 5% CO2, 37℃의 조건에서 다양한 시간 (6, 12, 24, 48 h) 동안 배양한 후, <실시예 3-3-1>과 같은 방법으로 실험하였다. 이때 배지만 처리한 대조군도 함께 준비하여 실험에 사용하였으며, GapDH 단백질은 동량확인을 위하여 측정하였다. 이후 실험 결과는 LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율을 확인하여 도 2d에 나타내었다.

도 2d에 기재한 바와 같이, 본 발명의 혼합추출물(DG)은 시간이 경과함에 따라 autophagy 유도 효과를 나타내는 마커인 LC3 2 단백질의 발현, 혹은 LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율이 대조군에 비해 증가하였는데, 특히 12 시간이 경과한 시점에서 LC3 2/LC3 1 전환비율이 가장 크게 증가하였다.

<3-3-5> autophagy inhibitor 를 이용한 혼합 추출물( DG )의 autophagy 유도 효과 검증

　본 발명의 혼합 추출물(DG)의 autophagy 유도 효과를 더욱 확실히 검증하기 위하여 autophagy inhibitor를 이용한 실험을 진행하였다. 본 실험에 사용된 3-Methyladenine(3MA)은 specific autophagy inhibitor로, 세포에 autophagy을 유발하는 약물과 함께 처리하였을 때 약물에 의해 유발되는 autophagy의 효과를 억제함으로써, 약물의 autophagy 유도 효과를 검증하는 실험에 주로 사용하는 시약이다(Seglen P.O, Gordon P.B. (1982). 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, 79; 1889-1892, 1982.)

배양된 PC12 세포에 혼합 추출물(DG) 300 ㎍/㎖만 처리한 실험군과 혼합 추출물(DG) 300 ㎍/㎖과 3MA 10 mM을 혼합 처리한 실험군을 5% CO₂, 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후, <실시예 3-3-1>과 같은 방법으로 실험하였다. 이때 배지만 처리한 대조군도 함께 준비하여 실험에 사용하였으며, GapDH 단백질은 동량확인을 위하여 측정하였다. 이후 실험 결과는 LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율을 확인하여 도 2e에 나타내었다.

도 2e에 기재한 바와 같이, 혼합 추출물(DG)만 처리한 실험군에서 관찰된 LC3 2 단백질의 발현이 혼합 추출물(DG)과 3MA를 혼합 투여한 실험군에서는 대조군 수준으로 감소하여 본 발명의 혼합 추출물(DG)은 자체적으로 autophagy를 유발하는 효과가 있음을 검증하였다.

<3-3-6> 혼합 추출물( MYH )의 농도 증가에 따른 자가 탐식작용 ( autophagy ) 유도 활성

배양된 PC12 세포에 <실시예 1-3>에서 제조한 혼합 추출물(MYH)을 다양한 농도(100, 400, 800, 1200 ㎍/㎖)로 처리하고 5% CO₂, 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후, <실시예 3-3-1>과 같은 방법으로 실험하였다. 이때 배지만 처리한 대조군도 함께 준비하여 실험에 사용하였으며, GapDH 단백질은 동량확인을 위하여 측정하였다. 이후 실험 결과는 LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율을 확인하여 도 2f에 나타내었다.

도 2f에 나타난 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물(MYH)은 농도가 증가함에 따라 autophagy 유도 효과를 나타내는 마커인 LC3 2 단백질의 발현, 혹은 LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율이 증가함을 확인함으로써 본 발명의 혼합 추출물(MYH)은 농도가 증가함에 따라 autophagy를 유도하는 효과를 증가시킴을　알 수 있다.

<3-3-7> 혼합 추출물( MYH )의 시간 경과에 따른 자가 탐식작용 ( autophagy ) 유도 활성

배양된 PC12 세포에 <실시예 1-3>에서 제조한 혼합 추출물(MYH) 400 ㎍/㎖를 처리하고 5% CO2, 37℃의 조건에서 다양한 시간 (6, 12, 24 h) 동안 배양한 후, <실시예 3-3-1>과 같은 방법으로 실험하였다. 이때 배지만 처리한 대조군도 함께 준비하여 실험에 사용하였으며, GapDH 단백질은 동량확인을 위하여 측정하였다. 이후 실험 결과는 LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율을 확인하여 도 2g에 나타내었다.

도 2g에 기재한 바와 같이, 본 발명의 혼합추출물(MYH)은 시간이 경과함에 따라 autophagy 유도 효과를 나타내는 마커인 LC3 2 단백질의 발현, 혹은 LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율이 대조군에 비해 증가시킴을 확인하였다.

<3-3-8> autophagy inhibitor 를 이용한 혼합 추출물( MYH )의 autophagy 유도 효과 검증

　본 발명의 혼합 추출물(MYH)의 autophagy 유도 효과를 더욱 확실히 검증하기 위하여 autophagy inhibitor를 이용한 실험을 진행하였다. 배양된 PC12 세포에 혼합 추출물(MYH) 400 ㎍/㎖만 처리한 실험군과 혼합 추출물(MYH) 400 ㎍/㎖과 3MA 10 mM을 혼합 처리한 실험군을 5% CO₂, 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후, <실시예 3-3-1>과 같은 방법으로 실험하였다. 이때 배지만 처리한 대조군도 함께 준비하여 실험에 사용하였으며, GapDH 단백질은 동량확인을 위하여 측정하였다. 이후 실험 결과는 LC3 1에서 LC3 2로의 전환비율을 확인하여 도 2h에 나타내었다.

도 2h에 기재한 바와 같이, 혼합 추출물(MYH)만 처리한 실험군에서 관찰된 LC3 2 단백질의 발현이 혼합 추출물(MYH)과 3MA를 혼합 투여한 실험군에서는 대조군 수준으로 감소하여 본 발명의 혼합 추출물(MYH)은 자체적으로 autophagy를 유발하는 효과가 있음을 검증하였다.

< 실시예 4>

MPTP 투여에 의한 파킨슨병 동물모델에서, 본 발명의 혼합 추출물이 행동장애 및 뇌세포 사멸에 미치는 효과

<4-1> 본 실험에 사용된 혼합 추출물

상기　<실시예 1-2>의 혼합 추출물(DG)와 <실시예 1-3>의 혼합 추출물 (MYH)을 생리 식염수에 다양한 농도로 희석하여 사용하였다.

<4-2> 실험 동물 처치

<4-2-1> 혼합 추출물( DG )로 실험 동물 처치

마우스를 각 군당 9마리씩 4군으로 나누었다. 제 1군(대조군) 및 제 2군(MPTP군)은 생리 식염수를 마우스 체중 kg당 5 ml로 6일간 1일 1회 경구 투여하였고, 제 3군(혼합 추출물 50 mg/kg 투여군)과 제 4군(혼합 추출물 100 mg/kg 투여군)은 생리 식염수에 용해시킨 각각의 혼합 추출물을 6일 동안 1일 1회 경구 투여하였다. 약물 투여 3일째 되는 날 마지막 투여 2시간 후 제 1군(대조군)은 생리식염수를 마우스 체중 kg당 5 ml로 1일 4회(급성, Acute) 2시간 간격으로 복강 투여하였으며, 제 2군, 제 3군 및 제 4군은 MPTP 20 mg/kg 체중의 농도로 생리식염수에 용해시켜 1일 4회(급성, Acute) 2시간 간격으로 복강투여 하였다.

<4-2-2> 혼합 추출물( MYH )로 실험 동물 처치

마우스를 각 군당 7마리씩 3군으로 나누었다. 제 1군(대조군) 및 제 2군(MPTP군)은 제 3군(혼합추출물(MYH) 100mg/kg 투여군)은 생리 식염수에 용해시킨 혼합추출물(MYH)를 3일 동안 1일 1회 경구 투여하였고, 제 1군(대조군) 및 제 2군(MPTP군)은 같은 생리 식염수양을 경구 투여하였다. 약물 투여 3일째 되는 날 제 2군과 제 3군에 MPTP를 20 mg/kg 체중의 농도로 생리식염수에 용해시켜 1일 4회(급성, acute) 2시간 간격 복강 투여하였다. MPTP 투여 7일 후, 마취를 통해 마우스를 죽인 후, 뇌조직을 4% paraformaldehyde(PFA)로 고정하여 -80℃에 보관하였다.

<4-3> 혼합 추출물( DG )의 행동장애 개선 효과

<4-3-1> 행동 시험 ; 폴 테스트 ( pole test )

상기 MPTP 투여 종료 다음 날, 높이 50cm, 지름 1cm의 막대에서 폴 테스트(pole test)를 수행하였다. 막대 위에 C57BL/6 마우스의 머리가 위로 향하게 놓고, 마우스가 꼭대기를 180° 도는 시간과 돌아서 네 다리가 땅에 닿을 때까지 내려오는 시간을 측정하였다. 각 마우스를 3회씩 연습시킨 후 7번 본 실험을 행하였으며, 그 결과를 도 3a 또는 도 3b에 나타내었다.

도 3a 또는 도 3b에 나타낸 바와 같이, MPTP군은 대조군 대비 %로 분석 시 T-turn과 T-LA 시간이 각각 260.21%, 151.82%로 MPTP에 의한 행동장애가 유발되었고, 이에 대하여 제3군 (혼합 추출물 50 mg/kg 투여군) 에서는 T-turn과 T-LA 시간이 각각 133.10%, 110.51%로 나타났으며, 제4군 (혼합 추출물 100 mg/kg 투여군) 에서는 T-turn과 T-LA 시간이 각각 143.05%, 121.85%로 나타나 유의성이 확인되었으며, T-turn과 T-LA 시간 모두 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다.

<4-3-2>　행동시험; 로타로드 테스트 ( Rota - rod test )

본 발명의 혼합 추출물 투여가 끝난 1일 후 (MPTP 투여 후 5일), 가속모드(Accelerator)에서 8 rpm으로 설정된 로타로드 장치 (Rotarod B1001, B.S Technolab INC., Korea)의 플라스틱 봉(지름1 인치)에 마우스를 올려놓고 5분씩 트레이닝(Training)을 수행하였다. 24시간 후, 가속모드에서 16 rpm으로 설정하여 본 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 3c에 나타내었다.

도 3c에 기재된 바와 같이, MPTP군은 대조군 대비 %로 분석 시 마우스가 떨어지는 시간 (Latency time)은 21.69%로 감소하여 MPTP에 의한 행동장애가 유발되었으며, 이에 대하여 제 3군 (혼합 추출물 50 mg/kg 투여군)에서는 53.24%로 나타났으며, 제 4군 (혼합 추출물 100 mg/kg 투여군)에서는 77.89%로 측정되어 Latency time이 유의하게 증가하였음을 확인하였다.

상기 행동시험 결과, 본 발명의 혼합 추출물(DG)은 MPTP에 의한 행동장애에 대한 유효한 개선효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

<4-4> 혼합 추출물( DG )의 도파민 세포의 보호 활성 평가

상기 폴 테스트와 로타로드 테스트가 완료된(MPTP 투여 후 7일) 각 군의 마우스를 치사시킨 후, 뇌 조직[흑질(substantia nigra) 및 선조체(striatum)]을 분리하였다. 분리된 뇌 조직을 과산화수소로 탈수한 후 1차 항체인 Tyrosine hydroxylase (TH, millipore, rabbit origin 1:2000, Chemicon International Inc. <Temecula, CA, USA>에서 구입) 을 하룻밤 반응시킨 후 2차 항체로 biotinylated anti-rabbit (goat origin, Vector Laboratories <Burlingame, CA, USA>에서 구입) 을 사용하고, ABC 반응 (ABC kit, Vector Laboratories <Burlingame, CA, USA>에서 구입) 을 거쳐 Diaminobenzidine을 이용하여 발색시켰다. 도파민 세포 보호효과는 흑질에서 TH 양성 세포 숫자를 세어 분석하였고, 선조체에서 광학밀도(optical density)를 측정하여 평가하였으며 그 결과를 도 3d 및 도 3e에 나타내었다.

도 3d에서, MPTP군은 대조군 대비 %로 분석 시 흑질에서 TH 양성세포 수가 30.82%로 MPTP에 의한 세포손상이 유도되었으며, 이에 반해 혼합추출물 50 mg/kg 투여군에서는 52.75%, 100 mg/kg 투여군에서는 89.19%로 증가하여 MPTP로 유도한 세포독성에 대하여 보호 효과를 보였으며, 특히 100 mg/kg 투여군에서 TH 양성세포 수가 통계학적으로 유의하게 증가하였다.

한편, 도 3e에서, MPTP군은 대조군 대비 % 분석 시 선조체에서의 광학밀도가 26.30%로 MPTP에 의한 도파민 세포 손상이 유도되었으며, 이에 반해 혼합 추출물 50mg/kg 투여군에서는 36.31%, 100 mg/kg 투여군에서는 43.42%로 증가하여 도파민 세포의 보호 효과가 확인되었고, 특히 100 mg/kg 투여군에서 광학밀도가 통계학적으로 유의하게 증가하였다.

이상의 결과에서, 본 발명의 혼합 추출물(DG)은 흑질(substantia nigra) 및 선조체(striatum)에서 농도 의존적으로 우수한 도파민 세포의 보호활성을 나타냄을 확인할 수 있다.

<4-5> 용안육 , 고본 및 원지의 혼합 추출물을 함유하는 조성물( MYH )의 도파민 세포의 보호 활성 평가

상기 <실시예 4-2-2>에서 준비된 뇌 조직을 <실시예 4-4>의 실험방법을 이용해 처치한 후, 도파민 세포 보호효과 평가를 위해 흑질에서 TH 양성 세포 숫자를 세어 분석하였고, 선조체에서 광학밀도(optical density)를 측정하여 그 결과를 도 3f 및 도 3g에 나타내었다.

도 3f에서, MPTP군은 대조군 대비 %로 분석 시 흑질에서 TH 양성세포 수가 36.7%로 MPTP에 의한 세포손상이 유도되었으며, 이에 반해 혼합추출물(MYH) 100 mg/kg 투여군에서는 53.04%로 증가하여 MPTP로 유도한 세포독성에 대하여 보호 효과를 보였다.

한편, 도 3g에서, MPTP군은 대조군 대비 % 분석 시 선조체에서의 광학밀도가 37.79%로 MPTP에 의한 도파민 세포 손상이 유도되었으며, 이에 반해 혼합 추출물(MYH) 100 mg/kg 투여군에서는 53.10%로 증가하여 도파민 세포의 보호 효과가 확인되었다.

이상의 결과에서, 용안육, 고본 및 원지의 혼합 추출물을 함유하는 조성물(MYH)은 흑질(substantia nigra) 및 선조체(striatum)에서 농도 의존적으로 우수한 도파민 세포의 보호활성을 나타냄을 확인할 수 있다.

< 시험예 1>

본 발명의 혼합 추출물이 뇌세포 사멸에 미치는 효과

<1-1> 혼합 추출물( DG )의 뇌세포 사멸에 미치는 효과

본 발명의 혼합 추출물(DG)이 SH-SY5Y 세포의 세포활성도(cell viability)에 미치는 효과를 측정하기 위하여 공지된 세포독성 측정(MTT Cell Proliferation assay) 방법을 사용하였다.

　MTT 분석을 위해 배양된 SH-SY5Y 세포에 <실시예 1-2>에서 제조한 혼합 추출물(DG)을 다양한 농도(25, 50, 100, 200, 300 ㎍/㎖)로 처리하고 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 이때 배지만 처리한 대조군도 함께 준비하여 실험에 사용하였다. 24시간 후에 MTT 용액을 첨가하여 1시간 동안 배양한 후, ELISA 기기를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

　상기와 같이 MTT 환원 정도를 측정함으로써 각 군의 세포활성도(cell viability)를 얻고 그 결과를 도 4a에 나타내었다.　

도 4a에 기재된 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물을 다량 복용한다 할지라도 세포독성이 없으므로 본 발명의 혼합 추출물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물의 유효한 성분으로 안전하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

　한편, ICR mouse(5주령)을 이용한 단회 투여 급성 독성 실험 결과, 본 발명의 혼합 추출물(DG)은 2g/kg/10ml (경구투여)의 농도까지 독성을 보이지 않았다(결과 미기재).

<1-2> 혼합 추출물( MYH )의 뇌세포 사멸에 미치는 효과

　MTT 분석을 위해 배양된 SH-SY5Y 세포에 <실시예 1-3>에서 제조한 혼합 추출물(MYH)을 다양한 농도(6.25, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖)로 처리하고 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 이때 배지만 처리한 대조군도 함께 준비하여 실험에 사용하였다. 24시간 후에 MTT 용액을 첨가하여 1시간 동안 배양한 후, ELISA 기기를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

　상기와 같이 MTT 환원 정도를 측정함으로써 각 군의 세포활성도(cell viability)를 얻고 그 결과를 도 4b에 나타내었다.　

도 4b에 기재된 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물을 다량 복용한다 할지라도 세포독성이 없으므로 본 발명의 혼합 추출물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물의 유효한 성분으로 안전하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

Claims

용안육 추출물을 유효성분으로 함유하는,
알츠하이머병 및 파킨슨병으로 이루어진 군에서 선택된 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 고본 및 원지로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상의 추출물이 추가적으로 함유된 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제2항에 있어서, 갈근, 황금, 길경, 백지, 승마, 내복자 및 석창포로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상의 추출물이 추가적으로 함유된 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 추출물은 용안육 및 원지가 1:0.2 내지 1:10의 중량비로 혼합되어 추출된 것인 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 추출물은 용안육 및 고본이 1:0.1 내지 1:5의 중량비로 혼합되어 추출된 것인 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 추출물은 용안육, 원지 및 고본이 1: 0.1 내지 10: 0.1내지 10의 중량비로 혼합되어 추출된 것인 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 추출물은 용안육 15 내지 20 중량부, 고본 10 내지 15 중량부, 원지 10 내지 15 중량부, 갈근 15 내지 20 중량부, 황금 5 내지 10 중량부, 길경 1 내지 5 중량부, 백지 5 내지 10 중량부, 승마 5 내지 10 중량부, 내복자 5 내지 10 중량부 및 석창포 15 내지 20 중량부로 혼합되어 추출된 것인 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올, 핵산, 염화메틸렌, 아세토니트릴 및 아세톤으로 이루어진 일종 이상의 유기용매 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 사용하여 추출된 것인 약학적 조성물.
삭제
용안육 추출물을 유효성분으로 함유하는,
알츠하이머병 및 파킨슨병으로 이루어진 군에서 선택된 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제10항에 있어서, 고본 및 원지로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상의 추출물이 추가적으로 함유된 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제11항에 있어서, 갈근, 황금, 길경, 백지, 승마, 내복자 및 석창포로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상의 추출물이 추가적으로 함유된 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제11항에 있어서, 상기 추출물은 용안육 및 원지가 1: 0.2 내지 10의 중량비로 혼합되어 추출된 것인 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제11항에 있어서, 상기 추출물은 용안육 및 고본이 1: 0.1 내지 5의 중량비로 혼합되어 추출된 것인 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제11항에 있어서, 상기 추출물은 용안육, 원지 및 고본이 1: 0.1 내지 10: 0.1내지 10의 중량비로 혼합되어 추출된 것인 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제12항에 있어서, 상기 추출물은 용안육 15 내지 20 중량부, 고본 10 내지 15 중량부, 원지 10 내지 15 중량부, 갈근 15 내지 20 중량부, 황금 5 내지 10 중량부, 길경 1 내지 5 중량부, 백지 5 내지 10 중량부, 승마 5 내지 10 중량부, 내복자 5 내지 10 중량부 및 석창포 15 내지 20 중량부로 혼합되어 추출된 것인 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올, 핵산, 염화메틸렌, 아세토니트릴 및 아세톤으로 이루어진 일종 이상의 유기용매 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 사용하여 추출된 것인 식품 조성물.
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