JP5380420B2 - 龍眼肉抽出物またはこれを含む混合抽出物を含有する退行性脳神経疾患の予防用または治療用の組成物 - Google Patents
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Description
但し、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例に限定されるわけではない。
<1−1>龍眼肉抽出物の製造
龍眼肉(大田大学付属天安漢方病院)40gをきれいに洗浄して細かく切断した後、重量比率の4倍の水を加えて陶器薬湯器において95℃で4時間かけて1次抽出した後、ろ過して残った固形分に再び水を半分量追加して、前記と同一の条件で2次抽出した。
龍眼肉および藁本、龍眼肉および遠志、または龍眼肉、藁本および遠志を全て混合した混合抽出物を、多様な混合比率で構成して、前記実施例<1−1>と同一の方法で混合抽出物を製造した。前記薬材原料は全て大田大学付属天安漢方病院で購入した。
葛根12g、藁本8g、オウゴン4g、桔梗2g、ビャクシ4g、升麻4g、ライフクシ4g、遠志8g、石菖蒲12g、龍眼肉12gを購入(大田大学付属天安漢方病院)してそれぞれ準備し、これを前記実施例<1−1>と同一の方法で混合抽出物を製造した。
前記実施例1で製造された龍眼肉抽出物、混合抽出物(DG)および混合抽出物(MYH)が、細胞外部に処理したMPTP(1−methyl−4−phenyl−1,2,3,6−tetrahydropyridine)によって誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果を、次の方法で確認した。具体的には、ドーパミン性神経系に選択的に毒性を示す物質であるN−メチル−4−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン(N−methyl−4−phenyl−1,2,3,6−tetrahydropyridine、MPTP)を用いてSH−SY5Y細胞株に細胞毒性を誘導した後、細胞保護活性実験を行った。
前記実施例1の単一抽出物または混合抽出物を、10%牛胎児血清(fetal bovaine serum)および1%抗生剤を含むMEM培地(Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA)に、多様な濃度で希釈して使用した。
神経細胞モデルとして使用される細胞は、ヒト神経細胞種を起源とするSH−SY5Y細胞(寄託番号:ATCC CRL−2266)を選択した。前記細胞は10%牛胎児血清および1%抗生剤を含む前記実施例<2−1>のMEM培地で培養した。
本発明の龍眼肉抽出物と、混合抽出物(DG)、および混合抽出物(MYH)が、400μM MPTPで誘導した細胞毒性に対して、SH−SY5Y細胞の細胞活性度(cell viability)に及ぼす効果を測定するために、公知の細胞毒性測定(MTT Cell Proliferation assay)方法を使用した。
MTT分析のために培養されたSH−SY5Y細胞に実施例<1−1>で製造した龍眼肉抽出物を3.125、6.25、12.5、25μg/ml濃度で処理し、2時間後にMPTPを400μMの濃度で添加した後、5%のCO2、37℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群と、MPTPのみで処理した実験群も共に準備して実験に使用した。48時間後にMTT溶液を添加して1時間培養した後、ELISA機器を用いて吸光度を測定した。
MTT分析のために培養されたSH−SY5Y細胞に実施例<1−2>で製造した混合抽出物(DG)をそれぞれ25、50、100、200、300μg/mlの濃度で処理し、2時間後にMPTPを400μMの濃度で添加した後、5%のCO2、37℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群とMPTPのみで処理した実験群も共に準備して実験に使用した。48時間後にMTT溶液を添加して1時間培養した後、ELISA機器を利用して吸光度を測定した。
MTT分析のために培養されたSH−SY5Y細胞に実施例<1−2>で製造したそれぞれの混合抽出物をそれぞれ25μg/mlの濃度で処理し、2時間後にMPTPを400μMの濃度で添加した後、5%のCO2、37℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群と、MPTPのみで処理した実験群も共に準備して実験に使用した。48時間後にMTT溶液を添加して1時間培養した後、ELISA機器を利用して吸光度を測定した。
MTT分析のために培養されたSH−SY5Y細胞に実施例<1−3>で製造した龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物を含む組成物(MYH)をそれぞれ6.25、12.5、25、50μg/mlの濃度で処理し、2時間後にMPTPを400μMの濃度で添加した後、5%のCO2、37℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群と、MPTPのみで処理した実験群も共に準備して実験に使用した。48時間後にMTT溶液を添加して1時間培養した後、ELISA機器を利用して吸光度を測定した。
NGF(nerve groth factor)を利用して神経細胞に分化させたPC12細胞株で自食作用誘導活性を示すマーカーであるLC3 2蛋白質の発現を確認するために、ウエスタンブロッティング(western−blotting)実験を下記の通り行った。
前記実施例1の混合抽出物(I)または混合抽出物(II)を10%牛胎児血清(Fetal bovaine serum)および1%抗生剤を含むDMEM培地(HyClone Laboratories, Hyclone Rd., Logan UT, 米国)に多様な濃度で希釈して使用した。
神経細胞モデルとして使用される細胞は、白ネズミの褐色細胞種を起源とするPC12細胞(NGFにより分化,RCB0009,RIKEN BRC 細胞バンク,茨城県つくば市, 日本)を選択した。
前記細胞は10%牛胎児血清および1%抗生剤を含むDMEM培地で培養し、実験に使用する前にNGFを利用して神経細胞に分化させた。
前記実施例1で製造された龍眼肉抽出物または混合抽出物が自食作用を誘導する効果を確認するために、ウエスタンブロッティングアッセイを利用して自食作用発現マーカーであるLC3 1からLC3 2への転換比率を測定した。
培養されたPC12細胞に実施例<1−1>で製造した龍眼肉抽出物をそれぞれ25μg/ml、50μg/ml、100μg/mlの濃度で処理し、5%のCO2、37℃の条件で24時間培養した後、捕集して2500rpmで5分間遠心分離後、FBS(pH7.2)で2回洗浄した。得られた細胞は、ミトコンドリア溶解緩衝液(50mM Tris pH7.4、150mM NaCl、2mM EDTA、2mM EGTA、0.2%TritonX−100、0.3% NP−40、100μM PMSF、10μg/ml ロイペプチン、2μg/ml アプロチニン)と4℃で20分間反応させて蛋白質を分離した後、13,200rpmで20分間遠心分離して得られた上清液を、ブラッドフォード法(Bradford's method)(Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)によって蛋白質を定量した。
培養されたPC12細胞に実施例<1−1>で製造した龍眼肉抽出物をそれぞれ100μg/ml濃度で処理し、実施例<1−2>で製造した混合抽出物(DG)を300μg/ml処理して、5%のCO2、37℃の条件で24時間培養した後、実施例<3−3−1>と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、GapDH蛋白質は同量確認のために測定した。以降、LC3 1からLC3 2への転換比率を確認した実験結果を、図2bに示した。
培養されたPC12細胞に実施例<1−2>で製造した混合抽出物(DG)を多様な濃度(75、150、300、600μg/ml)で処理し、5%のCO2、37℃の条件で24時間培養した後、実施例<3−3−1>と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、GapDH蛋白質は同量確認のために測定した。以降、LC3 1からLC3 2への転換比率を確認した実験結果を、図2cに示した。
前記培養されたPC12細胞に実施例<1−2>で製造した混合抽出物(DG)300μg/mlを処理し、5%のCO2、37℃の条件で多様な時間(6、12、24、48h)の間培養した後、実施例<3−3−1>と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、GapDH蛋白質は同量確認のために測定した。以降、LC3 1からLC3 2への転換比率を確認した実験結果を、図2dに示した。
本発明の混合抽出物(DG)のautophagy誘導効果をより確実に検証するために、自食作用阻害剤を利用した実験を進行した。本実験に使用された3−Methyladenine(3MA)は、特異的な自食作用阻害剤であり、細胞に自食作用を誘発する薬品と共に処理した時、薬品によって誘発される自食作用の効果を抑制することによって、薬品の自食作用誘導効果を検証する実験に主に使用する試薬である(Seglen P.O, Gordon P.B.(1982). 3−Methyladenine:specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America,79;1889〜1892,1982.)
培養されたPC12細胞に実施例<1−3>で製造した混合抽出物(MYH)を多様な濃度(100、400、800、1200μg/ml)で処理し、5%のCO2、37℃の条件で24時間培養した後、実施例<3−3−1>と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、GapDH蛋白質は同量確認のために測定した。以降、実験結果はLC3 1からLC3 2への転換比率を確認したものを、図2fに示した。
培養されたPC12細胞に実施例<1−3>で製造した混合抽出物(MYH)400μg/mlを処理し、5%のCO2、37℃の条件で多様な時間(6、12、24h)培養した後、実施例<3−3−1>と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、GapDH蛋白質は同量確認のために測定した。以降、実験結果はLC3 1からLC3 2への転換比率を確認して、図2gに示した。
本発明の混合抽出物(MYH)の自食作用誘導効果をより確実に検証するために、自食作用阻害剤を利用した実験を進行した。培養されたPC12細胞に混合抽出物(MYH)400μg/mlのみで処理した実験群と混合抽出物(MYH)400μg/mlと3MA10mMを混合処理した実験群を5%のCO2、37℃の条件で24時間培養した後、実施例<3−3−1>と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、GapDH蛋白質は同量確認のために測定した。以降、LC3 1からLC3 2への転換比率を確認した実験結果を、図2hに示した。
<4−1>本実験に使用された混合抽出物
前記実施例<1−2>の混合抽出物(DG)と実施例<1−3>の混合抽出物(MYH)を生理食塩水に多様な濃度で希釈して使用した。
<4−2−1>混合抽出物(DG)による実験動物の処置
マウスを各群当り9匹ずつ4群に分けた。第1群(対照群)および第2群(MPTP群)は生理食塩水をマウス体重kg当り5mlで6日間1日1回経口投与し、第3群(混合抽出物50mg/kg投与群)および第4群(混合抽出物100mg/kg投与群)は生理食塩水に溶解させたそれぞれの混合抽出物を6日間1日1回経口投与した。薬品投与3日目となる日に最後の投与をした2時間後、第1群(対照群)は生理食塩水をマウス体重kg当り5mlで1日4回(急性、Acute)2時間間隔で腹腔投与し、第2群、第3群および第4群は、MPTP20mg/kg体重の濃度で生理食塩水に溶解させて1日4回(急性、Acute)2時間間隔で腹腔投与した。
マウスを各群当り7匹ずつ3群に分けた。第1群(対照群)および第2群(MPTP群)は第3群(混合抽出物(MYH)100mg/kg投与群)は生理食塩水に溶解させた混合抽出物(MYH)を3日間1日1回経口投与し、第1群(対照群)および第2群(MPTP群)は同一の生理食塩水量を経口投与した。薬品投与3日目となる日に第2群と第3群にMPTPを20mg/kg体重の濃度で生理食塩水に溶解させて1日4回(急性、acute)2時間間隔で腹腔投与した。MPTP投与7日後、麻酔を通じてマウスを殺した後、脳組織を4%のパラホルムアルデヒド(paraformaldehyde:PFA)で固定して−80℃で保管した。
<4−3−1>行動試験;ポールテスト(pole test)
前記MPTP投与終了の翌日、高さ50cm、直径1cmの棒でポールテストを行った。棒の上にC57BL/6マウスの頭が上を向くように置き、マウスが頂上を180°度回転する時間(T‐回転)と、回転して4本足が床につくまで降りてくる時間(T−LA)を測定した。各マウスを3回ずつ練習させた後、7回本実験を行い、その結果を図3aまたは図3bに示した。
本発明の混合抽出物の投与が終わった1日後(MPTP投与後5日)、加速モード(Accelerator)で8rpmに設定されたロタロッド装置(Rota rod B1001、B.S Technolab INC., Korea)のプラスチック棒(直径1インチ)にマウスを乗せて、5分ずつトレーニングを行った。24時間後、加速モードで16rpmに設定して本実験を行い、その結果を図3cに示した。
前記ポールテストとロタロッドテストが完了した(MPTP投与後7日)各群のマウスを致死させた後、脳組織(黒質および線条体)を分離した。分離された脳組織を過酸化水素で脱水した後、1次抗体であるチロシンヒドロキシラーゼ(Tyrosine hydroxylase)(TH, millipore, rabbit origin 1:2000, Chemicon International Inc. <Temecula, CA, USA>で購入)を一晩反応させた後、2次抗体でビオチン化抗ウサギ抗体(ヤギ由来, Vector Laboratories <Burlingame, CA, USA>で購入)を使用し、ABC反応(ABC kit, Vector Laboratories <Burlingame, CA, USA>で購入)を経て、ジアミノベンジジン(Diaminobenzidine)を利用して発色させた。ドーパミン細胞保護効果は黒質におけるTH陽性細胞の数を数えて分析し、線条体における光学密度を測定して評価し、その結果を図3dおよび図3eに示した。
前記実施例<4−2−2>で準備された脳組織を実施例<4−4>の実験方法を利用して処置した後、ドーパミン細胞保護効果の評価のために黒質におけるTH陽性細胞の数を数えて分析し、線条体における光学密度を測定して、その結果を図3fおよび図3gに示した。
本発明の混合抽出物が脳細胞死滅に及ぼす効果
<1−1>混合抽出物(DG)の脳細胞死滅に及ぼす効果
本発明の混合抽出物(DG)がSH−SY5Y細胞の細胞活性度に及ぼす効果を測定するために、公知の細胞毒性測定(MTT Cell Proliferation assay)方法を使用した。
MTT分析のために培養されたSH−SY5Y細胞に実施例<1−3>で製造した混合抽出物(MYH)を多様な濃度(6.25、12.5、25、50μg/ml)で処理し、5%のCO2、37℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用した。24時間後にMTT溶液を添加して1時間培養した後、ELISA機器を利用して吸光度を測定した。
Claims (9)
- 龍眼肉、遠志および藁本の混合抽出物を有効成分として含む、退行性脳神経疾患の予防用または治療用の薬学的組成物。
- 前記抽出物は、龍眼肉、遠志および藁本を1:0.5〜2:0.5〜2の重量比で混合して抽出されたものである、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択される一種以上の抽出物を追加的に含む、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記抽出物は、龍眼肉および遠志を1:0.2〜1:10の重量比で混合して抽出されたものである、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記抽出物は、龍眼肉および藁本を1:0.1〜1:5の重量比で混合して抽出されたものである、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記抽出物は、龍眼肉、遠志および藁本を1:0.1〜10:0.1〜10の重量比で混合して抽出されたものである、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記抽出物は、龍眼肉を15〜20重量部、藁本を10〜15重量部、遠志を10〜15重量部、葛根を15〜20重量部、オウゴンを5〜10重量部、桔梗を1〜5重量部、ビャクシを5〜10重量部、升麻を5〜10重量部、ライフクシを5〜10重量部、および石菖蒲を15〜20重量部で混合して抽出されたものである、請求項3に記載の薬学的組成物。
- 前記抽出物は、水、C1〜C4の低級アルコール、ヘキサン、塩化メチレン、アセトニトリルおよびアセトンからなる一種以上の溶媒およびこれらの混合溶媒からなる群より選択される一種以上を使用して抽出されたものである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記退行性脳神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症および多発性硬化症からなる群より選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
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