CN108452033A - 含有混合中药材提取物的骨疾病的预防及治疗用组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含有混合中药材提取物的骨疾病的预防及治疗用组合物,包含当归(Angelicagigas)、白芍(Paeoniae Radix Alba)、白术(Atractylodes macrocephala Koidzumi)、茯苓(Wolfiporia extensa)及桔梗(铃当花(Platycodongrandiflorum A.DC.)的根)提取物,包含由栀子(Gardeniae Fructus)、甘草(Glycyrrhiza uralensis,Licorice)、干姜(Zingiberis Siccatum Rhizoma)及薄荷(Mentha arvensis var.piperascens)组成的组中的一种以上的提取物的组合物呈现在体内安全,增加骨头的重量和长度,增加骨密度的效果,尤其,在以最优含量包含桔梗的组合物的情况下,显著增加成骨细胞的碱性磷酸酶活性,并显著抑制破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性,因而可有效地适用于包含骨质疏松症的多种骨疾病治疗剂改善。
Description
技术领域
本发明涉及含有当归(Angelicagigas)、白芍(Paeoniae Radix Alba)、白术(Atractylodes macrocephala Koidzumi)、茯苓(Wolfiporia extensa)、栀子(GardeniaeFructus)、甘草(Glycyrrhiza uralensis,Licorice)、桔梗(铃当花(Platycodongrandiflorum A.DC.)的根)、干姜(Zingiberis Siccatum Rhizoma)及薄荷(Mentha arvensis var.piperascens)混合提取物作为有效成分的骨疾病的预防或治疗用组合物。
背景技术
构成我们的身体的骨组织为了保持骨量(bone mass)及骨骼的稳态(skeletalhomeostasis)不断地发生吸收和形成的动态组织。在破坏和新生骨头中成骨细胞和破骨细胞起到作用,来源于造血干细胞的破骨细胞通过破坏或再吸收(resorption)过程去除老骨头,并通过向血流放出钙来参与保持身体功能,在骨细胞中生成的成骨细胞通过制成新骨头来重建骨骼。在正常成人中,在骨吸收量与骨形成量之间一直保持均衡,并通过产生整体的骨质减少或骨质增加来以骨骼的异常呈现成骨细胞与破骨细胞活性之间的不均衡。
青少年时期,骨形成比骨破坏更活跃,到成年骨形成和骨破坏得到均衡,并产生骨重构,但是到老年期骨破坏比骨形成更活跃,从而成为生病的原因。如上所述,若得不到骨吸收量与骨形成量之间的均衡,则产生骨疾病,如类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、骨质疏松症(osteoporosis)、成骨细胞的活动过活跃而导致骨密度变高的骨硬化病(osteopetrosis)及被称为变形性骨炎的佩吉特氏病(Paget's disease)、骨软化症(osteomalacia)、骨质减少症(osteopenia)、骨萎缩(bone atrophy)、骨关节炎(osteoarthritis)等。
具体地,骨质疏松症(osteoporosis)使骨组织的石灰减少,从而骨头的密质骨变薄,由此使骨髄腔变宽,并随着症状的进展,骨骼变得虚弱,所以在小的冲击下也容易骨折。众所周知,骨量可根据遗传因素,营养摄入,激素变化,运动及生活习惯的差异等多种因素受到影响,作为骨质疏松症的原因有老龄、运动不足、低体重、吸烟、低钙饮食、闭经、卵巢切除。另一方面,虽然存在个人差异,黑人与白人相比,骨吸收水平(bone resorption level)低,从而骨量跟高,大致骨量在14-18岁时最高,老后每年下降约减少1%。尤其,在女性的情况下,在30岁以后开始持续进行骨质减少,到闭经期,因激素变化急剧进行骨质减少。即,到闭经期雌激素浓度急剧减少,在上述情况下,如基于白细胞介素-7(IL-7,interleukin-7)大量生成B淋巴细胞(B-lymphocyte),从而前B细胞(pre-B cell)蓄积于骨髓(bonemarrow),由此增加白细胞介素-6(IL-6)的量,从而使破骨细胞的活性增加,因而最终减少骨量。如上所述,骨质疏松症在程度上有差异,但是在老年层,尤其对闭经期以后的女性是无法避免的症状,在发达国家随着人口老龄化对骨质疏松症及其治疗剂的关心逐渐增加。并且,在全世界上与骨疾病治疗相关形成有约1300亿美元的市场,预计以后还增加,因此世界各研究机关和制药公司对骨疾病治疗剂的开发投资得多。
当前,作为用作骨质疏松症治疗剂的物质有雌激素(estrogen)、雄性合成类固醇(androgenic anabolic steroid)、钙制剂、磷酸盐、氟制剂、依普黄酮(Ipriflavone)、维生素D3等。并且,1995年美国默克公司作为骨质疏松症治疗剂开发氨基二膦酸盐(aminobisphosphonate),1997年,美国礼来公司(Lilly Co.)作为骨质疏松症治疗剂开发以选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator、SERM)起到作用的雷洛昔芬(raloxifene)。
另一方面,作为现有技术,作为与包含生药材提取物的骨质疏松症的预防及治疗用组合物相关的专利,在韩国公开专利第2005-0072625号中公开熟地黄、杜仲、牛膝、当归、枸杞子、肉桂、续断、甘草、山楂、菟丝子、桑枝、白茯苓、人参、鹿茸、龟板珠子、砂仁等的骨质疏松症的改善及预防用组合物。在大韩韩方妇人科学志21卷2008年号1期中公开了因加味逍遥散卵巢切除诱发的对白鼠的骨质疏松症产生的影响。只是,公开于上述文献的混合组合物无法呈现显著的骨质疏松症治疗效果,因此,当前急需开发对人体无毒性的利用天然物的骨质疏松症治疗效果高的组合物。
对此,本发明人为了以对人体无毒性的天然物为对象开发显著的骨疾病治疗剂努力的结果表明当归、白芍、白术、茯苓、栀子、甘草、桔梗、干姜及薄荷的混合生药材提取物在摘除卵巢的白鼠模型中使骨密度(Bone mineral density)显著增加,在以最优含量包含桔梗的组合物的情况下,显著增加成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性,并显著抑制破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性,因而可用作包含骨质疏松症的多种骨疾病治疗剂,从而完成了本发明。
现有技术文献
专利文献:
韩国公开专利第2005-0072625号
日本公开专利JP 09094452
韩国公开专利1999-0085303
非专利文献:
朴灿柱(Chan Soo Park)、孙英柱(Young Joo Sohn)大韩韩方妇人科学志21卷2008年1期
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发明内容
现有骨质疏松症治疗剂大部分作为雌激素类的物质,在长期服用雌激素类的物质的情况下,呈现副作用如癌症、胆结石、血栓症等。但是骨质疏松症不能仅通过药物的短期服用治疗,药物的长期服用是必须的。因此,需要在长期服用药物时也没有如上所述的副作用,并具有可代替雌激素的程度的优秀的药效的新物质。因此,本发明的目的在于,提供包含骨质疏松症的骨疾病的预防及治疗用药学组合物或健康食品,利用在长期服用的情况下,也无副作用,并可发挥卓越的效果的生药提取物。
为了实现上述目的,本发明提供组合物的用途,用作骨疾病的预防及治疗用药学组合物,包含当归、白芍、白术、茯苓及桔梗(铃当花的根)提取物,还含有栀子、甘草、干姜及薄荷组成的组中的一种以上的提取物。
并且,本发明提供用作骨疾病的预防及改善用健康食品的上述组合物的用途。
包含本发明的包含当归、白芍、白术、茯苓(Wolfiporia extensa)及桔梗(铃当花的根)提取物,并含有选自由栀子、甘草、干姜及薄荷组成的组中的一种以上的提取物的组合物呈现对体内安全,并增加骨头的重量和长度,并增加骨密度的效果,尤其,在以最优含量包含桔梗的组合物的情况下,显著增加成骨细胞的碱性磷酸酶活性,并显著抑制成骨细胞的碱性磷酸酶活性,因而可有用地使用于包含骨质疏松症的骨疾病的治疗。
附图说明
图1为确认本发明组合物对破骨细胞肌动蛋白环(actin ring)形成产生的效果的图。
具体实施方式
以下,对本发明进行详细说明。
本发明提供组合物的用途,用作骨疾病的预防及治疗用药学组合物,包含当归、白芍、白术、茯苓及桔梗(铃当花的根)提取物,还含有栀子、甘草、干姜及薄荷组成的组中的一种以上的提取物。
优选地,上述组合物包含当归、白芍、白术、茯苓、栀子、甘草及桔梗提取物,还含有干姜或薄荷提取物,更优选地,含有当归、白芍、白术、茯苓、栀子、甘草、桔梗、干姜及薄荷提取物。
优选地,在上述组合物中,相对于100重量份的总组合物,包含5重量份至15重量份的桔梗提取物,更优选地,包含8重量份至13重量份的桔梗提取物。
并且,优选地,上述组合物包含10重量份至20重量份的当归提取物、10重量份至20重量份的白芍提取物、10重量份至20重量份的白术提取物、10重量份至20重量份的茯苓提取物及5重量份至15重量份的桔梗提取物,还含有选自由5重量份至15重量份的栀子提取物、5重量份至15重量份的甘草提取物、1重量份至10重量份的干姜提取物及1重量份至10重量份的薄荷提取物组成的组中的一种以上的提取物,最优选地,包含10重量份至20重量份的当归提取物、10重量份至20重量份的白芍提取物、10重量份至20重量份的白术提取物、10重量份至20重量份的茯苓提取物、5重量份至15重量份的桔梗提取物、5重量份至15重量份的栀子提取物、5重量份至15重量份的甘草提取物、1重量份至10重量份的干姜提取物及1重量份至10重量份的薄荷提取物。
在含有5重量份以下或15重量份以上的桔梗提取物的情况下,与桔梗独立提取物或不添加桔梗的混合生药材提取物相比骨疾病治疗效果减少,因而,在骨疾病治疗中,为了呈现显著上升的效果,优选地,相对于100重量份的总组合物,包含5重量份至15重量份的桔梗提取物。
优选地,上述生药材提取物可通过包括以下步骤的制备方法制备,但并不限定于此。
步骤1),通过在当归、白芍、白术、茯苓、栀子、甘草、桔梗、干姜及薄荷混合物中加入提取溶剂来提取;步骤2),对步骤1)的提取物进行冷却后,过滤的步骤;以及步骤3),对过滤的提取物进行减压浓缩后干燥的步骤。
优选地,在上述方法中,作为步骤1)的提取溶剂将水、C1至C2低级醇或它们的混合物作为溶剂提取,优选地,上述低级醇为乙醇或甲醇,但并与限定于此。优选地,在干燥的混合生药材中,添加0.1倍至10倍的上述提取溶剂,更优选地添加0.3倍至5倍,但并不限定于此。优选地,提取温度为20℃至70℃,但并不限定于此。并且,提起时间可以为12至48小时,但并不限定于此。在上述方法中,步骤3)的减压浓缩可以为利用真空减压浓缩器或真空旋转蒸发器,但并不限定于此。并且,干燥可以为减压干燥、真空干燥、沸腾干燥、喷雾干燥或冷冻干燥,但并不限定于此。
上述混合提取物可混合生药材后提取,也可以混合分别提取的提取物来使用,但并不限定于此。
并且,上述骨疾病是指因不能得到骨吸收量与骨形成量之间的均衡而产生的多种疾病,优选地,可以为选自由类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、退行性关节炎(degenerative arthritis)、骨质疏松症(osteoporosis)、骨硬化病(osteopetrosis)、佩吉特氏病(Paget's disease)、骨软化症(osteomalacia)、骨质减少症(osteopenia)、骨萎缩(bone atrophy)、外伤性骨折及骨关节炎(osteoarthritis)组成的组中的一种,但并不限定于此。
在本发明的具体实施例中,本发明人为了确认当归、白芍、白术、茯苓、栀子、甘草、桔梗、干姜及薄荷混合提取物的质疏松症预防及治疗效果,本发明人通过在诱发骨质疏松症的正常小鼠(假手术(Sham)组)、卵巢切除小鼠组、按用量别摄取本发明的生药材提取物的小鼠组中,测定动物的体重变化(参照表2)、体重增加量、饮食摄入量及饮食效率(参照表3)及长期重量(参照表4),来确认了本发明的生药材混合物的体内稳定性。
并且,本发明人测定股骨重量及长度(参照表5)、骨密度(骨密度)(参照表6)、血液的生化指标(参照表7)及血液的钙和磷含量(表8),其结果,确认了生药材混合物的骨质疏松症改善效果。
并且,本发明人确认了当摄取本发明的生药材混合物时,血液中的胆固醇指数与正常组相比增加。但是,确认了这是与阳性对照组相比是良好的水平。
并且,本发明人为了确认骨疾病治疗用混合生药材提取物的最优配合比,制备以多种浓度添加桔梗提取物的混合生药材提取物后,确认碱性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶活性,结果作为包含本发明的桔梗的混合生药材提取物的TM-3与无添加桔梗的混合生药材提取物、桔梗独立提取物相比,呈现显著地效果,尤其,还与以多种浓度添加桔梗的TM-2及TM-4相比,呈现显著地效果,确认了具有显著的骨疾病治疗效果的组合物为TM-3(参照表9至表12)。
并且,确认了对在本发明中确立的具有最优配合比的混合生药材提取物的成骨细胞及破骨细胞活性产生的效果,结果显著增加成骨细胞的胶原蛋白(collagen)含量、矿化(mineralization)沉积及骨钙素(OCN)的生成,并抑制破骨细胞的肌动蛋白环的形成(参照表13至表15及图1)。
因此,本发明的混合生药材提取物在体内呈现稳定地效果,并且有效增加股骨的重量、长度生长、骨密度及血液内钙合磷含量,并有效增加成骨细胞的碱性磷酸酶活性,显著抑制破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性,因而可有效地适用于包含骨质疏松症多种骨疾病治疗。
本发明的组合物以药剂学上有效的量服用。在本发明中“药剂学上有效的量”是指以可适用于医学治疗的合理的受益或风险比率对治疗疾病充分地量,有效容量水平可根据患者的疾病的种类、重症度、药物的活性、对药物的敏感性、服用时间、服用途径、排出比率、治疗时间、包含同时使用的药物的要素及其他在医药领域只能怪众所周知的要素。本发明的组合物能够以个别治疗剂的方式服用或与其他治疗剂并用服用,可与现有的治疗剂依次或同时服用,可以单一服用或多重服用。重要的是均考虑上述要素来服用无副作用以最小的量可取得最大效果的量,这是可通过本发明所属领域的技术人员容易确定。
具体地,本发明的组合物的有效量可根据患者的年龄、性别、体重不同,通常,每1kg体重服用0.1mg至100mg,优选地,每天或隔天可服用0.2mg至17mg,或1天一次至3次分开服用。但是可根据服用途径、肥胖的重症度、性别、体重、年龄等增减,因而上述服用量并不是以任何方法限定本发明的范围。
上述混合生药材提取物在临床服用时,可口服或非口服给药,并且能够以普通医药品制剂的形态使用。即,本发明的混合生药材提取物在实际临床服用时能够以口服及非口服的各种剂型服用,在制剂化的情况下,通过使用通常使用的稀释剂,如填充剂、增量剂、结合剂、润湿剂、崩解剂及表面活性剂等或赋形剂来调配。作为用于口服服用的固体制剂包含片剂、丸剂、散剂、颗粒剂及胶囊剂等,这种固体制剂通过在混合生药材提取物中混合至少一种的赋形剂来调配,例如,通过混合淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖及明胶等调配。并且,除了简单的赋形剂之外还使用润滑剂如硬脂酸镁滑石等。用于口服给药的液体制剂可包含悬浮剂、内溶液剂,乳剂、糖浆剂等,除了作为通常用使用的稀释剂的水、液体石蜡之外,还可包含多种赋形剂,例如润湿剂,甜味剂、芳香剂及保鲜剂等。作为用于非口服药的制剂包括无菌水溶液、非水性溶剂,悬浮剂,乳剂,冷冻干燥制剂及坐剂。可使用非水性溶剂和悬浮溶剂,如用丙二醇,聚乙二醇;植物油,如橄榄油等;以及可注射酯,如油酸乙酯等。作为坐剂的基剂,可以使用半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、月桂醇、甘油及明胶等。例如,给药单位可包含个别给药量的1倍、2倍、3倍或4倍或可包含1/2倍、1/3倍或1/4倍。优选地,个别给药量含有一次服用有效药物的量,这是通常相当于1天服用量的1/2倍、1/3倍或1/4倍。混合生药材提取物的有效用量为10mg/kg至1000mg/kg,优选地,为30mg/kg至3000mg/kg,1天可服用1~6次。
并且,本发明提供组合物的用途,用作骨疾病的预防及改善用健康食品,包含当归、白芍、白术、茯苓及桔梗(铃当花的根)的提取物,还包含选自由栀子、甘草、干姜及薄荷组成的组中的一种以上的提取物。
上述用作健康食品的组合物的结构与用于骨疾病的预防及治疗用药学组合物的组合物相同,因而援引用于骨疾病的预防及治疗用药学组合物的内容,以下仅对健康食品的特有的结构进行说明。
并不特别局限上述食品的种类。作为可添加上述食品的例有肉类、香肠、面包、巧克力、糖类、快餐类、饼干类、比萨、方便面、其他面类、口香糖类、冰淇淋类的乳制品、各种汤、饮料、茶、清凉剂、酒精饮料及维生素复合剂等,并均包括通常意义上的健康食品。在将本发明的组合物用作食品添加物的情况下,可直接添加上述提取物或可以与其他食品或食品成分同时使用,并可根据通常的方法适当使用。可根据使用目的(预防、健康或治疗性处置)适当地确定。通常,在健康食品中,相对于总食品重量可添加0.1重量份至90重量份的上述化合物。但是,在以健康及卫生为目的或将健康调节作为目的长时间的摄取的情况下,上述量可以为上述范围以下,并在安全性范明无任何问题,因此还能够以上述范围以上的量使用有效成分。
本发明的健康饮料组合物与通常的饮料相同可含有多种香味剂或天然碳水化物等作为追加成分。作为上述碳水化合物,例如有作为单糖的葡萄糖、果糖等、作为二塘的麦芽糖、蔗糖等、作为多糖的糊精、环糊精等及木糖醇、山梨糖醇及赤藓糖醇等的糖醇。作为香味剂可使用天然香味剂,如奇异果甜蛋白,甜叶菊提取物等天然香味剂或合成香味剂,如糖精、阿斯巴甜等。上述天然碳水化合物的比率通常为每100g本发明的组合物约1g至20g,优选地,为约5g至12g。除上述之外,本发明的组合可含有各种营养剂、维生素、电解质、风味剂、着色剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、使用于碳酸饮料的碳酸化剂等。另外,本发明可以含有天然果汁,果汁饮料及用于制备蔬菜饮的果肉。这些成分可以独立使用或组合使用。
以下,通过实施例、实验例对本发明进行详细说明。
只是,以下实施例、实验例例示本发明,本发明的内容并不限定于以下实施例及实验例。
实施例1.混合生药材提取物的制备
1-1.生药材筛选及预处理工序
对于150g的当归、150g的白芍、150g的白术、150g的茯苓、100g的栀子、100g的甘草、100g的桔梗、50g的干姜及50g的薄荷去除异物后,细切成5cm左右,从而容易提取,并利用水干净地清洗。细切生药材的目的在于,使其处理和提取变得容易。
1-2.混合生药材热水提取物的制备
向提取装置放入在上述工序中取得的材料,并利用提取溶剂提取。作为提取溶剂,相对于生药材添加5倍的纯水,来利用冷却提取装置在95℃的温度下,提取6小时。将提取液自然浸渍1~2小时后,利用棉布滤纸进行过滤,从而分离了生药材和热水提取液。通过对所过滤的热水提取液进行减压浓缩,来以冷冻干燥去除水分,从而获取了生药材热水提取物(TM-3)。
1-3.混合生药材乙醇提取物的制备
相对于生药材,向在上述工序中取得的材料添加5倍的95%乙醇,然后在80℃的温度下,在搅拌反应器中,提取12小时以上后,利用过滤器过滤,并对进行离心分离(5000rpm、4℃、10分钟)历来取得的上清液进行冷冻干燥来获取了生药材乙醇提取物。
1-4.桔梗热水提取物的制备
细切1kg的桔梗,并利用水清洗后,以与上述1-2相同的方法制备了桔梗热水提取物(TM-5)。
1-5.无添加桔梗混合生药材热水提取物的制备
制备了在上述1-1工序中取得的材料中,除了桔梗以外的混合生药材热水提取物。
具体地,混合150g的当归、150g的白芍、150g的白术、150g的茯苓、100g的栀子、100g的甘草、50g的干姜及50g的薄荷后,与上述1-2相同的方法制备了无添加桔梗的混合生药材热水提取物(TM-1)。
1-6.添加有低浓度桔梗提取物的混合生药材热水提取物的制备
在上述1-1工序中取得的材料中,将100g的桔梗变更为50g后,与上述1-2相同的方法制备了添加有低浓度桔梗提取物的生药材热水提取物(TM-2)。
1-7.添加有高浓度桔梗提取物的混合生药材热水提取物的制备
在上述1-1工序中取得的材料中,将100g的桔梗变更为200g后,与上述1-2相同的方法制备了添加有高浓度桔梗提取物的生药材热水提取物(TM-4)。
实施例2.成骨细胞的活性评价
2-1.细胞培养及分化诱导
从美国模式培养物集存库(ATCC,American Type Culture Collection)中购买来源于生鼠的MC3T3-E1成骨细胞(MC3T3-E1 osteoblastic cells)。MC3T3-E1细胞通过使用在α-最低必须培养基(α-MEM,吉毕科公司(Gibco-Invitrogen))中添加10%的胎牛血清(FBS,fetal bovine serum)、100U/mL的青霉素(penicillin)、100U/mL的链霉素(streptomycin)的细胞培养液来在37℃的润湿的CO2培养器(5%CO2/95%的空气(air))中进行培养。若细胞填满培养皿的80%左右,则利用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)清洗细胞的单层,并处理0.25%的胰蛋白酶(trypsin)-2.65mM的乙二胺四乙酸(EDTA)来进行继代培养,并每2天更换培养基。
在MC3T3-E1细胞填满培养皿的90%左右时,为了诱导细胞分化,利用在α-最低必须培养基中添加10mM的β甘油磷酸盐(β-glycerophosphate)(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Co.))和50μg/mL的抗坏血酸(ascorbic acid)(西格玛奥德里奇公司)的成骨细胞分化培养液更换细胞培养液,来培养细胞,每三天更换成骨细胞分化培养液。
2-2.细胞生存率的测定
MC3T3-E1细胞的细胞生存率利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法(MTT Assay)(Denizot F and Lang R.J Immunological Method 89:271-277,1986)测定,以5×104细胞/孔(cells/well)将MC3T3-E1细胞接种于24-孔板(well plate)来培养24 小时后,利用含有多种浓度(0μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL)的试验物质(TM-1、TM-2、TM-3、TM-4、TM-5)的培养基更换细胞培养液,来将细胞培养24、48小时。然后利用1mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐((MTT,3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,Amresco公司)溶液更换细胞培养液,来对细胞追加培养2小时后,并利用异丙醇(isopropanol)溶出在存活的细胞中形成的甲臜(formazan),利用SpectraMaxM2酶标仪(SpectraMaxM2 Microplate reader)(分子器件(Molecular Devices))在570nm下,通过测定吸光度来测定了细胞的增殖能力。
2-3.碱性磷酸酶(ALP,Alkalinephosphatase)活性测定
为了评价碱性磷酸酶活性以2×104细胞/孔的方式将MC3T3-E1细胞接种于48孔板。利用含有不同浓度(0μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、25μg/mL)的桔梗含有量不同的5种试验物质的成骨细胞分化培养液更换细胞培养液,来培养了5天。经5天的分化诱导的细胞的碱性磷酸酶活性而言,通过使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)&碱性磷酸酶检测试剂盒(assaykit)(宝生物工程株式会社(Takara Bio Inc.)),来按照示出的方法测定。
2-4.胶原蛋白(collagen)合成测定
通过使用作为强力地与胶原蛋白分子相结合的阴离子染剂(anionic dye)的天狼星红(Sirius Red),来染色细胞测定胶原蛋白合成程度。以2×104细胞/孔的方式将MC3T3-E1细胞接种于48孔板,并稳定24小时。利用以多种浓度(0μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、25μg/mL)含有所选定的试验物质(TM-3)的成骨细胞分化培养液更换细胞培养液,来培养了8天。经8天的分化诱导的细胞的胶原蛋白而言,通过使用天狼星红胶原蛋白检测试剂盒(Siriusred collagen detection kit)(Chondrex),来按照制备公司示出的方法测定。
2-5.无机质矿化(mineralization)测定
通过使用作为蒽醌(Anthraquinonoid)衍生物的茜素红S(Alizarin Red S),来测定矿化于成骨细胞的钙含量,来调查了成骨细胞的无机质矿化程度。利用以多种浓度(0μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、25μg/mL)含有所选定的试验物质(TM-3)的成骨细胞分化培养液更换细胞培养液更换细胞培养液,来培养了14天。细胞的无机质矿化而言,通过使用骨生成检测试剂盒(Osteogenesis assay kit)(密理博公司(Millipore)),来按照制备公司示出的方法测定。
2-6.骨钙素(OCN,Osteocalcin)含量的测定
以2×104细胞/孔的方式将MC3T3-E1细胞接种于48孔板,并稳定24小时。利用以多种浓度(0μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、25μg/mL)含有所选定的试验物质(TM-3)的成骨细胞分化培养液更换细胞培养液,来培养了14天。收取使细胞适应(condition)24小时的细胞培养液。细胞适应的细胞培养液内的骨钙素(osteoblast-secreted osteocalcin)水平而言,通过使用骨钙素酶联免疫试剂盒(ELISA Kit)(宝生物工程株式会社),来根据制备公司的提出方法进行测定。
实施例3.破骨细胞的活性评价
3-1.细胞培养及分化诱导
从美国模式培养物集存库(ATCC,American Type Culture Collection)中购买作为来源于生鼠的巨噬细胞的Raw264.7细胞。Raw264.7细胞通过使用在达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM,dulbecco's modified eagle medium,Welgene公司)中添加10%的胎牛血清、100units/mL的青霉素、100ug/mL的链霉素的细胞培养液来在37℃的润湿的CO2培养器(5%CO2/95%的空气(air))中进行培养。若细胞填满培养皿的80%左右,则利用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)清洗细胞的单层后,并添加细胞培养液来来取出细胞进行继代培养,并每2天更换培养基。
为了诱导Raw264.7细胞的分化,利用在α-最低必须培养基中添加50ng/mL的受体活化因子配基(RANKL)(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Co.))和10μM的PD98059(圣克鲁斯(Santa CruzA))的成骨细胞分化培养液更换细胞培养液,来培养细胞,每三天更换成骨细胞分化培养液。
3-2.细胞生存率的测定
Raw264.7细胞的细胞生存率利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法(MTT Assay)测定。以5×104细胞/孔(cells/well)将Raw264.7细胞接种于24孔板(well plate)来培养24小时后,利用含有多种浓度(0μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL)的试验物质(TM-1、TM-2、TM-3、TM-4、TM-5)的培养基更换细胞培养液,来将细胞培养24、48小时。然后利用1mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(Amresco公司)溶液更换细胞培养液,来对细胞追加培养2小时后,并利用异丙醇溶出在存活的细胞中形成的甲臜,利用SpectraMaxM2酶标仪(分子器件)在570nm下,通过测定吸光度来测定了细胞的增殖能力。
3-3.抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP,Tartrate-resistant acidphosphatase)活性评价
为了评价抗酒石酸酸性磷酸酶活性以1×104细胞/孔的方式将Raw264.7细胞接种于48孔板,并稳定24小时。利用以多种浓度(0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)含有桔梗含有量不同的5种试验物质的成骨细胞分化培养液更换细胞培养液,来培养了5天。经5天的分化诱导的细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性而言,通过使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)和碱性磷酸酶检测试剂盒(宝生物工程株式会社),来按照示出的方法测定。
3-4.破骨细胞的形态学观察
以1×104细胞/孔的方式将Raw264.7细胞接种于24孔板,并稳定24小时。利用以多种浓度(0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)含有所选定的试验物质(TM-3)的成骨细胞分化培养液更换细胞培养液,来培养了5天。去除培养基,并利用磷酸盐缓冲液清洗后,通过利用4%的多聚甲醛(Para-formaldehyde)和0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)进行处理,来固定了细胞。所固定的细胞而言,为了染色肌动蛋白(actin)和核,分别利用Alexa Fluor 594鬼笔环肽(Alexa Fluor 594 Phalloidin)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行染色。一染色的细胞通过使用光学显微镜(卡尔蔡司Carl Zeiss),来观察了已分化的破骨细胞的激动蛋白环的形态变化。
实验例1.与骨质疏松症模型的卵巢摘除相关的动物实验
1-1.实验动物准备及饲育
购买无特定病原体(specific pathogen free)的6周龄的摘除卵巢的雌性ICR小鼠(ICR mouse)((株)斗裂生物技术)使用。购买的小鼠经过一周的检疫和适应过程后,筛选物体重减少的健康的小鼠用作实验用。实验小时在以23±3℃的温度、50±10%的相对湿度、10~15次/小时的换气次数、12小时的照明时间(08:00~20:00)、150~300Lux的照度设定的饲育环境下进行饲育,在一周的适应期间自由摄取实验动物用固体饲料(韩国群山(株)嘉吉艾格瑞普瑞纳)和饮水。
1-2.骨质疏松症的诱发及药物服用
经过1周的适应后,筛选健康的动物,来根据随机区组设计分为6个组。即,将实验组分为作为正常对照组的假手术组、卵巢切除的小鼠组、对卵巢切除小鼠以300mg/kg/天(day)的浓度进行作为在实施例1-2中制备的生药材提取物的TM-3的饮食摄取的组、对卵巢切除小鼠以600mg/kg/天的浓度进行作为生药材提取物的TM-3的饮食摄取的组、对卵巢切除小鼠以900mg/kg/天的浓度进行作为生药材提取物的TM-3的饮食摄取的组以及以400mg/kg/天的浓度对阳性对照物质(锺根堂,健康结实关节)进行饮食摄取的阳性对照组,来进行实验。
对全部实验组将基本饮食AIN-93饮食(AIN-93 diet)(美国新泽西新布伦瑞克特殊饲料公司(Research Diets,Inc.(New Brunswick.NJ,USA))(参照表1)摄取6周,并发生骨质疏松症后,按各个定量将含有生药材提取物的饮食供给8周。在实验期间自由摄取饮食和饮水。
表1
1-3.基于药物服用的体重变化及体重增加量、体重变化及体重增加量、饮食摄入量及饮食效率测定
根据上述1-2的方法每周测定服用混合生药材提取物的实验动物的体重,并服用规定期间后,通过测定体重增加量、饮食摄入量及饮食效率来比较了假实验组、实验组及对照组的体重。在表2表示动物的体重变化,并在表3表示动物的体重增加量、饮食摄入量及饮食效率。
如表2所示,在卵巢切除小鼠组的情况下,与假手术组相比呈现急剧地体重增加,本发明的生药材提取物的900mg/kg/天的服用组呈现与阳性对照组类似的体重增加。
并且,确认了如表3所示,不随着本发明的生药材提取物的摄取量增加,饮食效率增加,并呈现假手术组和卵巢切除小鼠组的中间程度的饮食效率。
因此,确认了本发明的生药材提取物与卵巢切除小鼠组和阳性对照组相比对体重变化、饮食摄取量及饮食效率不产生影响,无体内技术的变化从而安全。
表2
值以平均值±SEM表示(Values are expressed as mean±SEM)
与A组相比,*<0.05、**p<0.01、***p<0.001(p<0.05、**p<0.01***、p<0.001compared with the A group)。
与B组相比,#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001(p<0.05、##p<0.01、###p<0.001compared with the B group)。
表3
值以平均值±SEM表示。
与A组相比,*<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
与B组相比,#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001。
1-4.基于药物服用的器官重量变化测定
根据上述1-2的方法,将生药材提取物服用规定期间后,通过测定实验动物的器官重量,来比较了假手术组、实验组及对照组的器官重量。在表4中示出动物的器官重量的变化。
如表4所示,在卵巢切除小鼠组的情况下,与假手术组相比,器官的重量在整体上增加。相反地,在实验租的情况下,确认随着生药材提取物的摄取量增加,器官的重量减少,并回复到正常组水平,并确认以900mg/kg/天服用生药材提取物的服用组呈现与阳性对照组类似的器官重量。
因此,确认了本发明的生药材提取物与假手术组及阳性对照组相比,在整体上对器官重量不产生变化,从而摄取于体内时安全。
表4
值以平均值±SEM表示。
与A组相比,*p<0.05、**p<0.01***、p<0.001。
与B组相比,#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001。
1-5.股骨重量、长度变化及骨密度测定
剖检当日采血后,通过摘除实验动物的股骨,来去除粘贴于骨骼的肌肉、韧带及脂肪后,测定股骨的重量及长度后,通过使用骨密度测定仪(PIXImusTM,GELUVAR,美国威斯康星州麦迪逊(Medison,WI,USA)),来测定骨密度(BMD)。在表5中示出股骨的重量及长度,并在表6中示出骨密度。
其结果,如表5所示,在与假手术组进行比较时,在卵巢切除小鼠组中,股骨的重量和长度急剧增加,并且还在生药材混合提取物服用组中股骨的重量及长度增加,随着增加服用量,骨头的重量和长度成比例增加。在900mg/kg/天的生药材混合提取物服用组的情况下,呈现阳性对照组和假手术组的股质量及骨长度的1/2左右的数值。
相反地,在骨密度(BMD,Bone mineral density)的情况下,确认了如下:如表6所示,在卵巢切除小鼠组中骨密度值急剧减少,并且在生药材混合提取物服用组中,随着服用量增加呈现骨密度增加的形态,在900mg/kg/天的生药材混合提取物的服用组的情况下,与阳性对照组无差异。
因此,确认在卵巢切除小鼠组的情况下,与股骨重量及长度增加的程度相比,骨密度减少诱发骨质疏松症,并确认了本发明的生药材提取物服用组与股骨的重量及长度增加一同骨密度也增加,并与阳性对照组不呈现大的差异,对骨质疏松症的预防及治疗具有显著地效果。
表5
值以平均值±SEM表示。
与A组相比,*p<0.05、**p<0.01***、p<0.001。
与B相比,#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001,与B组相比,##p<0.01、###p<0.001(#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001 compared with the B##p<0.01、###p<0.001 comparedwith the B group)。
表6
值以平均值±SEM表示。
与A组相比,*p<0.05、**p<0.01***、p<0.001。
与B组相比,#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001。
1-6.血液的生化指标测定
使牺牲之前的实验动物绝食12小时后,通过使用利用叔戊醇(tertiaryamylalcohol)稀释三溴乙醇(tertiary amylalcohol)制成的麻醉剂麻醉后,进行眼眶采血。血液装于血浆分离管(等离子体单独的管(plasma separate tube))(美国贝蒂医疗公司(Becton Dickinson,USA))在室温条件下放置30分钟,并在3000rpm下离心分离20分钟,来分离血浆,分析之前为止保存于-70℃。
对于在剖检当日采集的血液中分离的血清,利用血液生化分析仪(KoneLab 20XT芬兰沃尔瑟姆赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Finland))测定了天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase;AST)、谷丙转氨酶(alanineaminotransferase;ALT)、中性脂肪(Triglycerides,TG)、总胆固醇(Total cholesterol、TC)、高密度蛋白质(high density lipoprotein;HDL)-胆固醇及低密度蛋白质(lowdensity lipoprotein;LDL)-胆固醇。
其结果,如表7所示,与假手术组相比,在卵巢切除小鼠组中总胆固醇数值(TC)增加。在本发明的生药材提取物摄取组的情况下,随着生药材提取物的摄取量增加总胆固醇量增加。但是,与阳性对照组相比,其增加程度不大。
因此,当摄取生药材提取物时,整体的体内胆固醇量可增加,但是在与摄取阳性对照组的情况相比,其增加量不大,并与阳性对照组相比对体内产生的影响少,从而确认了比较安全。
表7
值以平均值±SEM表示。
与A组相比,*p<0.05、**p<0.01***、p<0.001。
与B组相比,#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001。
1-7.血液的钙和磷含量测定
根据上述1-6的方法测定采集的血液的钙和磷含量,并在表8表示其结果。
其结果,如表8所示,在卵巢切除小鼠组的情况下,钙和磷含量与假手术组相比减少,并且在本发明的300mg/kg/天的生药材提取物服用组的情况下,呈现假手术组水平的钙和磷含量,随着本发明的生药材提取物的服用量增加,按比例血液内的钙和磷含油量显著增加。
因此,确认了本发明的生药材提取物与卵巢切除组及假手术组相比,在血液中使作为构成骨头的主要元素的钙和磷含量增加,可有效地适用于骨质疏松症的预防及治疗。
表8
值以平均值±SEM表示。
与A组相比,*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
与B组相比,#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001。
实验例2.骨疾病治疗用混合生药材提取物的最优配合比的确认
2-1.利用成骨细胞的细胞生存率的确认
为了调查在MC3T3-E1细胞中试验物质的细胞毒性,对细胞培养液处理多种浓度的(0μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL)的试验物质(TM-1、TM-2、TM-3、TM-4、TM-5),来将细胞分别培养24小时、48小时后,通过实施3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法来测定的存活的细胞数。
其结果,如表9所示,当对各个试验物质处理24小时时,与未处理试验物质的对照组(0μg/mL)相比,5种的试验物质均随着处理浓度变高,细胞增殖显著增加。当培养48小时时,TM-1、TM-2及TM-5随着处理浓度变高,细胞增殖显著增加,TM-3和TM-4呈现基于处理浓度增加的细胞增殖增加的倾向,但是未呈现显著地差异(表9)。
因此,确认了在MC3T3-E1细胞中,以800μg/mL以下的浓度处理5种试验物质的情况下,不呈现细胞毒性。
表9
2-2.碱性磷酸酶活性的确认
碱性磷酸酶几乎存在于全部组织,尤其,当活跃地进行骨代谢时,存在于骨组织的碱性磷酸酶其活性增加。通过在MC3T3-E1成骨细胞中,测定基于处理试验物质的碱性磷酸酶的活性,来确认了对骨代谢活性产生的影响。通过预实验结果,将5种试验物质的碱性磷酸酶活性的适当作用的浓度范围确定为1~25μg/mL,并以10μg/mL的浓度处理试验物质而进行。
其结果,确认了如表10所示,5种的试验物质均与对照组(0μg/mL)相比,碱性磷酸酶活性显著增减,尤其,TM-3与作为桔梗独立处理组的TM-5和无添加桔梗的TM-1相比,呈现显著的碱性磷酸酶活性。只是,在以低浓度添加桔梗的TM-2及以高浓度添加桔梗的TM-4的情况下,由于添加桔梗,从而与无添加桔梗的混合生药材提取物(TM-1)相比,碱性磷酸酶活性减少,因而,通过添加桔梗,来确认了具有显著的骨疾病治疗效果的组合物为TM-3(表10)。
表10
2-3.利用破骨细胞的细胞生存率的确认
为了调查在Raw264.7细胞中试验物质的细胞毒性,对细胞培养液处理多种浓度的(0μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL)的试验物质(TM-1、TM-2、TM-3、TM-4、TM-5),来将细胞分别培养24小时、48小时后,通过实施3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法来测定的存活的细胞数。
其结果,确认了如表11所示,在以200μg/mL的浓度处理各个试验物质的情况下,细胞增殖与对照组(0μg/mL)相比显著增加,但是在大于200μg/mL的高浓度处理的情况下,细胞增殖与对照组相比减少。
通过上述结果,将不抑制细胞增殖的适当作用浓度确定为200μg/mL以下。
表11
2-4.抗酒石酸酸性磷酸酶活性的确认
TARP作为破骨细胞的特异性标记物,当进行骨吸收作用时使分泌增加,因此用于通过测定其活性来确认破骨细胞分化程度。因此,通过对将Raw264.7分化诱导为破骨细胞的破骨细胞分化液处理试验物质,来培养细胞,并测定抗酒石酸酸性磷酸酶活性来示出于表12。
其结果,确认了如表12所示,5种的试验物质(TM-1、TM-2、TM-3、TM-4、TM-5)均随着处理浓度增加,抗酒石酸酸性磷酸酶活性显著减少。并且,在以200μg/mL的浓度处理TM-1、TM-2、TM-4及TM-5的情况下,抗酒石酸酸性磷酸酶的活性与对照组(0μg/mL)相比,分别减少了42.6%、45.3%、42.5%及47.6%。尤其,TM-3还在100μg/mL下,抗酒石酸酸性磷酸酶活性为7.616±0.208μg/mL,与对照组相比,抗酒石酸酸性磷酸酶活性被抑制50.2%(表12)。
因此,作为包含本发明的桔梗的混合生药材提取物的TM-3与物添加桔梗的混合生药材提取物、桔梗独立提取物相比,呈现显著的效果,尤其,还与以多种浓度添加桔梗的TM-2及TM-4相比,呈现显著的效果,从而确认了具有显著的骨疾病治疗效果的组合物为TM-3。
表12
实验例3.在本发明中确认的混合生药材提取物的骨疾病治疗效果确认
因此,通过使用作为包含通过上述实验例2确立的桔梗的混合生药材提取物的TM-3,来确认了对成骨细胞及破骨细胞活性产生的效果。
3-1.胶原蛋白合成的确认
胶原蛋白作为分布于人体的各个结合组织的蛋白质第一型胶原蛋白丰富地存在于皮肤、骨头及韧带,主要通过成骨细胞进行合成,并占有整个骨蛋白的85~90%。确认了对作为包含通过上述实验例2确立的桔梗的混合生药材提取物的TM-3的成骨细胞的胶原蛋白合成能力产生的影响。
其结果,确认了如表13所示,胶原蛋白合成借助TM-3处理显著增加,尤其,在以10μg/mL的浓度处理TM-3的情况下,胶原蛋白合成为163.42±13.17μg/mL,与对照组(0μg/mL)相比,胶原蛋白合成增加了52%(表13)。
表13
3-2.无机质矿化确认
骨石灰化形成能力为对成骨细胞的分化重要的标记物。茜素(Alizarin)被染色于无机质化的细胞的基质,因而已石灰化的量和染色程度相互成比例。因此,通过实施茜素红(Alizarin red)染色来确认了基于TM-3处理的无机质的矿化。
其结果,确认了如表14所示,在1μg/mL的浓度下为70.67±5.14μM,与对照组相比,无机质矿化显著增加,在10μg/mL、25μg/mL下,分别75.00±5.29μM、80.17±4.06μM,无机质矿化增加(表14)。
表14
3-3.骨钙素含量确认
众所周知,骨钙素主要由成骨细胞生成,是活性活泼的成骨细胞的特异性标记物的骨基质蛋白质。骨钙素作为作为骨形成生物化学标记物的维生素K依赖性蛋白质,由成骨细胞合成。通过TM-3处理,测定在MC3T3-E1细胞中生成的骨钙素的量来示出于表15。
其结果,确认了如表15所示,对照组的骨钙素含量为1.381±0.026ng/mL,当以1μg/mL、10μg/mL及25μg/mL的浓度处理TM-3时,骨钙素的含量分别为1.719±0.034ng/mL、1.724±0.081ng/mL及1.930±0.083ng/mL,骨钙素的生成于对照组相比显著增加(表15)。
表15
TM-3 | 0μg/mL | 1μg/mL | 10μg/mL | 25μg/mL |
骨钙素(ng/mL) | 1.381±0.026 | 1.719±0.034 | 1.724±0.081 | 1.930±0.083 |
3-4.形成破骨细胞的肌动蛋白环的确认
骨细胞表面的肌动蛋白环结构为必须,并通过上述吸收骨基质。若破骨细胞分化,则其大小变巨大,并表面形成肌动蛋白环来参与骨吸收过程。因此,形成破骨细胞的肌动蛋白环成为与细胞可吸收骨头的能力相关的重要指标。
确认了如图1所示,在对照组的情况下,肌动蛋白环最清楚,细胞密集,但是随着TM-3的浓度增加肌动蛋白环显著减少(图1)。即,确认了TM-3的处理显著抑制使破骨细胞分化为可进行骨头吸收的步骤。
Claims (12)
1.一种组合物的用途,用作骨疾病的预防及治疗用药学组合物,其特征在于,
包含当归、白芍、白术、茯苓及桔梗的提取物,
还包含选自由栀子、甘草、干姜及薄荷组成的组中的一种以上的提取物。
2.根据权利要求1所述的骨疾病的预防及治疗用途,其特征在于,上述组合物包含当归、白芍、白术、茯苓、栀子、甘草及桔梗提取物,还含有干姜或薄荷提取物。
3.根据权利要求1所述的骨疾病的预防及治疗用途,其特征在于,上述组合物含有当归、白芍、白术、茯苓、栀子、甘草、桔梗、干姜及薄荷提取物。
4.根据权利要求1所述的骨疾病的预防及治疗用途,其特征在于,在上述组合物中,相对于100重量份的总组合物,包含5重量份至15重量份的桔梗提取物。
5.根据权利要求1所述的骨疾病的预防及治疗用途,其特征在于,在上述组合物中,相对于100重量份的总组合物,包含8重量份至13重量份的桔梗提取物。
6.根据权利要求1所述的骨疾病的预防及治疗用途,其特征在于,
上述组合物包含10重量份至20重量份的当归提取物、10重量份至20重量份的白芍提取物、10重量份至20重量份的白术提取物、10重量份至20重量份的茯苓提取物及5重量份至15重量份的桔梗提取物,
还含有选自由5重量份至15重量份的栀子提取物、5重量份至15重量份的甘草提取物、1重量份至10重量份的干姜提取物及1重量份至10重量份的薄荷提取物组成的组中的一种以上的提取物。
7.根据权利要求1所述的骨疾病的预防及治疗用途,其特征在于,上述组合物包含10重量份至20重量份的当归提取物、10重量份至20重量份的白芍提取物、10重量份至20重量份的白术提取物、10重量份至20重量份的茯苓提取物、5重量份至15重量份的桔梗提取物、5重量份至15重量份的栀子提取物、5重量份至15重量份的甘草提取物、1重量份至10重量份的干姜提取物及1重量份至10重量份的薄荷提取物。
8.根据权利要求1所述的骨疾病的预防及治疗用途,其特征在于,上述提取物是利用水、C1至C2的低级醇或它们的混合溶剂提取的。
9.根据权利要求1所述的骨疾病的预防及治疗用途,其特征在于,上述骨疾病为选自由类风湿性关节炎、退行性关节炎、骨质疏松症、骨硬化病、佩吉特氏病、骨软化症、骨质减少症、骨萎缩、外伤性骨折及骨关节炎组成的组中的一种。
10.根据权利要求1所述的骨疾病的预防及治疗用途,其特征在于,上述组合物使骨密度及骨含量增加。
11.根据权利要求1所述的骨疾病的预防及治疗用途,其特征在于,上述组合物用于促进成骨细胞的分化,并减少破骨细胞的分化。
12.一种组合物的用途,用作骨疾病的预防及改善用健康食品,其特征在于,
包含当归、白芍、白术、茯苓及桔梗的提取物,
还包含选自由栀子、甘草、干姜及薄荷组成的组中的一种以上的提取物。
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