CN102971632A - 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法 - Google Patents

肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102971632A
CN102971632A CN2011800302025A CN201180030202A CN102971632A CN 102971632 A CN102971632 A CN 102971632A CN 2011800302025 A CN2011800302025 A CN 2011800302025A CN 201180030202 A CN201180030202 A CN 201180030202A CN 102971632 A CN102971632 A CN 102971632A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glu
label
hepatopathy
hepatitis
blood
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2011800302025A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102971632B (zh
Inventor
曽我朋义
杉本昌弘
末松诚
斋藤贵史
河田纯男
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keio University
Original Assignee
Keio University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Keio University filed Critical Keio University
Publication of CN102971632A publication Critical patent/CN102971632A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102971632B publication Critical patent/CN102971632B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7004—Stress
    • G01N2800/7009—Oxidative stress

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

迅速鉴定肝病。测定血液中的γ-Glu-X（X为氨基酸和胺）肽类的浓度或AST、ALT的值，由该测定值进行例如多元逻辑回归（MLR），从而鉴定健康人（C）、药物性肝损伤（DI）、无症状乙型肝炎携带者（AHB）、慢性乙型肝炎（CHB）、HCV阳性ALT持续正常者（CNALT）、慢性丙型肝炎（CHC）、丙型肝硬化（CIR）、肝癌（HCC）、单纯性脂肪肝（SS）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）等肝病。

Description

肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法
技术领域
本发明涉及肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法，特别是，涉及将各种肝病患者与健康人识别开从而能够进行筛选的肝病标记物、其测定方法、装置和使用了该肝病标记物的医药品的检验方法。
背景技术
肝病包括药物性肝损伤、乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化、肝癌等多种各样的肝病，另外还存在无症状的乙型病毒、丙型病毒的携带者。特别是，七成的丙型肝炎病毒（hepatitis type Cvirus：HCV）感染者由于慢性的肝脏炎症（慢性肝炎）而逐渐丧失正常的肝细胞，肝脏纤维化，然后发展为肝硬化，进而甚至发展为肝癌。据报道，10-15%的丙型慢性肝炎患者、80%的肝硬化患者会罹患肝癌。虽然慢性肝炎的状态下不会对生命造成危险，但若产生肝癌，或者肝硬化发展而引起肝功能衰竭的话，则生命面临危险。因此，需要在早期诊断丙型肝炎、驱除病毒。
丙型肝炎会无症状地从肝硬化发展为肝癌，肝脏的功能极度降低，产生倦怠感、黄疸、意识障碍等各种障碍，但目前在该阶段还没有有效的治疗法。因此，需要在肝脏的功能恶化之前，尽早检测症状的发展，实施投与干扰素等的治疗等。但是，现状是尚未确立可准确且迅速鉴定各种肝损伤的方法。
通常若被怀疑是肝病，会进行问诊、视诊、触诊，同时测定血中的天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、γ-谷氨酸丙酮酸转氨酶（GPT）、碱性磷酸酶（AL-P）、胆碱酯酶（ChE）、胆红素等肝功能标记物。这些生物化学检查值存在异常时，进行乙型、丙型肝炎病毒检查、超声波检查、X射线、CT等影像检查。在癌的判断中，测定下述肿瘤标记物：血中的α-胎蛋白（AFP）、异常凝血酶原（PIVKA-II）、癌胚胎性抗原（CEA）等蛋白质。此外，需要准确判断的情况下，进行腹腔镜检查、肝活检（需要住院一周左右）（非专利文献1）。
这样为了鉴定肝病，必须接受许多检查，在得到判断之前需要花费数天。另外，腹腔镜检查、肝活检还会将患者暴露于危险之下，使其遭受肉体上的痛苦。腹腔镜检查、肝活检对患者的负担较大，因此不能为了进行病情的确认等而频繁进行。此外，在现有方法中，许多检查、判断必须由专家来进行，将负担强加于短缺的医疗工作者。因此，强烈期望一种不对患者造成负担、迅速、准确且简便的肝病的判断方法。
已知的是，肝炎、肝硬化、肝癌等许多肝损伤都是因活性氧的生成（氧化应激）和将其去除的生物体防御系统的崩溃而引起的（非专利文献2）。生物体对活性氧等氧化应激的防御中的主要一种是由谷胱甘肽系统承担的。组织中以最高浓度存在的抗氧化物质包括还原型谷胱甘肽（GSH：以下称为谷胱甘肽），通过谷胱甘肽与活性氧、亲电物质轭合，这些物质被还原，氧化应激得到抑制。
但是，若谷胱甘肽减少，则组织、细胞暴露于氧化应激中，会引起各种病情（非专利文献3）。据报道，实际上肝损伤中也会因乙型、丙型肝炎病毒的感染而导致氧化应激亢进、谷胱甘肽减少，还报道了在丙型肝炎、肝硬化、肝癌的患者、小鼠中谷胱甘肽减少（非专利文献2、4）。
通过服用药物而诱发的药物性肝损伤也是因氧化应激而引起。解热镇痛药扑热息痛（APAP）在肝脏中代谢，生成高毒性的亲电物质N-乙酰对苯醌亚胺（NAQPI）。该NAQPI通过与在肝脏中以高浓度存在的谷胱甘肽（GSH）轭合，从而被解毒、排泄。但是，亲电物质大量存在时，谷胱甘肽会枯竭，从而使亲电物质在细胞内中蓄积（氧化应激），与生物体高分子反应。已知其结果是：导致细胞功能紊乱，引起药物性肝损伤等病情。
迄今为止发明人等发现：若对小鼠大量投与APAP，则为了解除APAP的代谢所生成的亲电物质NAQPI的毒性，谷胱甘肽减少，视晶酸与之成反比地剧增（参照图1的（B）），肝脏和血中的视晶酸的增加表明肝脏的谷胱甘肽由于亲电物质而枯竭（专利文献1、非专利文献5）。
其机制如下所述。如图1所示，谷胱甘肽（γ-Glu-Cys-Gly）和视晶酸（γ-Glu-2AB-Gly）是由相同的两种酶即γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶生物合成的三肽，差别在于底物（起始物质）是半胱氨酸（Cys）还是2-氨基丁酸（2AB）。在图1的（A）所示的通常的还原状态下，肝脏内大量存在谷胱甘肽，最初的酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶被反馈（FB）抑制。
因此，视晶酸几乎不被生物合成。但是，如图1的（B）所示的氧化状态那样，若存在亲电物质、活性氧种，则由于解毒而消耗谷胱甘肽。通过谷胱甘肽的减少，反馈抑制被解除，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活化，谷胱甘肽和视晶酸被生物合成。视晶酸在肝脏内蓄积，还排泄到血中。这样通过亲电物质等而形成氧化状态时，肝脏、血液中的视晶酸增加，因此视晶酸成为氧化应激的生物标记物。
另外，还有文献报道，在因肥胖而使内脏脂肪增加从而成为问题的非酒精性脂肪肝疾病（non-alcoholic fatty liver disease：NAFLD）中，氧化应激标记物血清硫氧还蛋白（TRX）对于由肝硬化向肝癌发展的非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholicsteatohepatitis：NASH）和有一个良性过程的单纯性脂肪肝（simple steatosis：SS）的识别是有用的（非专利文献6）。
另一方面，根据基于毛细管电泳-质谱仪（CE-MS）的试样中的代谢物质测定法的、细胞内的代谢物质的网罗性的测定方法（例如，参照非专利文献7~9），为了监测人或动物的身体状态，定性地且/或定量地确定来自该人或动物的身体的液体样品的低分子化合物（代谢物质）谱和/或肽谱，此处，该液体样品的代谢物质和肽通过毛细管电泳而被分离，接着直接被离子化，然后用通过接口与计算机连接的质谱仪进行检测。为了长期监测该人或动物的身体状态，将表示该状态的参照值和样品值、以及由该值导出的偏差和一致性自动地存储在数据库中。在组合毛细管电泳和质量分析而对阴离子性化合物进行分离分析的情况下，已知一种阴离子性化合物的分离分析方法，其特征在于，使用毛细管的内表面预先包覆为阳离子性的包覆毛细管，将电渗流反转（例如，参照专利文献2）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-192746号公报
专利文献2：日本专利第3341765号公报
非专利文献
非专利文献1：Callewaert,N.et al.Nat.Med.10,429-434,2004.
非专利文献2：Loguercio,Carmela et al.Free Radic.Biol.Med.34,1-10,2003.
非专利文献3：Yadav,Dhiraj et al.Am.J.Gastroenterol.97,2634-2639,2002.
非专利文献4：Moriya,K.et al.Cancer Res.61,4365-4370,2001.
非专利文献5：Soga,T.et al.J.Biol.Chem.281,16768-16776,2006.
非专利文献6：谷川久一编“酸化ストレスと肝疾患<第5卷”（氧化应激与肝病＜第5卷>).Me dical Tribune公司,3-37页,2009.5.7.
非专利文献7：Soga,T.et al.J.Proteome Res.2.488-494,2003.
非专利文献8：Soga,T.et al.J.Boil Chem.Vol.281,No.24,(June 16,2006)16768-16776
非专利文献9：Hirayama,A.et al.Cancer.Res.69：(II).(June1,2009)4918-4925
非专利文献10：Pignatelli,B.et al.Am.J.Gastroenterol.96,1758-1766,2001.
发明内容
发明要解决的问题
然而，一直以来，难以通过一次检查识别并鉴定药物性肝损伤（drug induced liver injury：DI）、无症状乙型肝炎携带者（asymptomatic hepatitis B carrier：AHB）、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B：CHB）、丙型肝炎病毒携带者且ALT值正常的HCV阳性ALT持续正常者（hepatitis C with persistentlynormal ALT：CNALT）、慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C：CHC）、丙型肝硬化（cirrhosis type C：CIR）、肝癌（hepatocellularcarcinoma：HCC）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、单纯性脂肪肝（SS）等。
本发明是为了消除前述现有问题而进行的，其课题在于，通过测定血液中的低分子生物标记物，能够迅速地鉴定药物性肝损伤（DI）、无症状乙型肝炎携带者（AHB）、慢性乙型肝炎（CHB）、HCV阳性ALT持续正常者（CNALT）、慢性丙型肝炎（CHC）、丙型肝硬化（CIR）、肝癌（HCC）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、单纯性脂肪肝（SS）等肝病。
用于解决问题的方案
如上所述，肝炎、肝硬化、肝癌等多种肝损伤与氧化应激具有很深的关系，因而可以预测到视晶酸浓度因各种肝损伤而变动。因此，从健康人（C）、药物性肝损伤（DI）、无症状乙型肝炎携带者（AHB）、慢性乙型肝炎（CHB）、HCV阳性ALT持续正常者（CNALT）、慢性丙型肝炎（CHC）、丙型肝硬化（CIR）、肝癌（HCC）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、单纯性脂肪肝（SS）的患者采集血液，测定血清中的视晶酸。但是，与小鼠不同，从健康人（C）、药物性肝损伤（DI）患者中几乎检测不到视晶酸。（小鼠血清中的视晶酸的浓度约为2μM，人血清中的浓度约为1/20左右，在健康人（C）、药物性肝损伤（DI）患者中几乎检测不到。）
但是，发明人等发现了在各种肝炎患者的血清中显著增加的物质，鉴定这些物质为γ-Glu-X肽类（注：X表示氨基酸和胺）。图2中，示意性地示出各种肝损伤患者中生物合成γ-Glu-X肽类的机制。此外，通过使用血清中的肝功能标记物AST和ALT的值和γ-Glu-X肽类，基于多元逻辑回归（MLR）模型进行多变量分析，从而成功地将各种肝炎患者与其他对象进行区分。
根据本发现，通过测定血液中的γ-Glu-X肽类的浓度、AST、ALT的值，能够迅速地鉴定健康人（C）、药物性肝损伤（DI）、无症状乙型肝炎携带者（AHB）、慢性乙型肝炎（CHB）、HCV阳性ALT持续正常者（CNALT）、慢性丙型肝炎（CHC）、丙型肝硬化（CIR）、肝癌（HCC）、单纯性脂肪肝（SS）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）等肝病。
本发明是基于上述见解而进行的，涉及一种肝病标记物，其特征在于，其为用于检测哺乳动物的组织中的氧化应激的标记物，并且其为γ-Glu-X（X为氨基酸和胺）肽。此处，可以通过多元逻辑回归（MLR）分析选择多种γ-Glu-X（X为氨基酸和胺）肽的组合。
另外，为健康人（C）识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表2所示，其为至少含有葡糖胺（Glucosamine）、γ-Glu-Ala、蛋氨酸亚砜（Methioninesulfoxide）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、AST、ALT、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Met、γ-Glu-Gln的组合。
另外，为药物性肝损伤（DI）识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表2所示，其为至少含有γ-Glu-牛磺酸（Taurine）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Arg、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Met、γ-Glu-瓜氨酸（Citrulline）的组合，且排除比数比（odds ratio）接近1的AST、ALT和γ-Glu-Gly。此外，添加AST、ALT、γ-Glu-Gly中的至少一个，可以提高精度。
另外，为无症状乙型肝炎携带者（AHB）识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表2所示，其为至少含有γ-Glu-牛磺酸（Taurine）、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、AST、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Arg、γ-Glu-Met、γ-Glu-Gln的组合，且排除比数比接近1的ALT。此外，添加ALT，可以提高精度。
另外，为慢性乙型肝炎（CHB）识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表3所示，其为至少含有γ-Glu-Ala、蛋氨酸亚砜（Methionine    sulfoxide）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Glu、AST、ALT、γ-Glu-Arg、γ-Glu-Ser、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Met、γ-Glu-瓜氨酸（Citrulline）的组合。
另外，为HCV阳性ALT持续正常者（CNALT）识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表3所示，其为至少含有葡糖胺（Glucosamine）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、AST、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Gln、γ-Glu-瓜氨酸（Citrulline）的组合，且排除比数比接近1的ALT。此外，添加ALT，可以提高精度。
另外，为慢性丙型肝炎（CHC）识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表3所示，其为至少含有葡糖胺（Glucosamine）、γ-Glu-Lys、γ-Glu-His的组合，且排除比数比接近1的蛋氨酸亚砜（Methionine sulfoxide）和ALT。此外，添加蛋氨酸亚砜（Methionine sulfoxide）和/或ALT，可以提高精度。
另外，为丙型肝硬化（CIR）识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表4所示，其为至少含有葡糖胺（Glucosamine）、蛋氨酸亚砜（Methionine    sulfoxide）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Met、γ-Glu-Gln、γ-Glu-瓜氨酸（Citrulline）的组合，且排除比数比接近1的AST和ALT。此外，添加AST和/或ALT，可以提高精度。
另外，为肝癌（HCC）识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表4所示，其为至少含有γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ser、γ-Glu-瓜氨酸（Citrulline）的组合，且排除比数比接近1的蛋氨酸亚砜（Methioninesulfoxide）、AST和ALT。此外，添加蛋氨酸亚砜（Methioninesulfoxide）AST、ALT中的至少一个，可以提高精度。
另外，为单纯性脂肪肝（SS）识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表4所示，其为至少含有γ-Glu-牛磺酸（Taurine）、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Glu、AST、ALT、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Gln的组合。
另外，为非酒精性脂肪性肝炎识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表4所示，其为至少含有葡糖胺（Glucosamine）、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Val、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Gln、γ-Glu-瓜氨酸（Citrulline）的组合，且排除比数比接近1的AST和ALT。此外，添加AST和/或ALT，可以提高精度。
另外，本发明为肝病标记物测定方法，其特征在于，测定样品中的γ-Glu-X（X为氨基酸和胺）肽作为肝病标记物。
另外，一种肝病标记物的测定装置，其特征在于，其具备以下单元：由样品制作适于分析的试样的单元；以及分析单元，用于测定试样中的Y-Glu-X（X为氨基酸和胺）肽作为肝病标记物。
另外，一种医药品的检验方法，其特征在于，其包括以下工序：在医药品的投与前和投与后采集的血液中测定前述任一项肝病标记物的浓度的工序；以及在前述医药品的投与前的血液和投与后的血液之间比较前述测定结果的工序。
另外，一种医药品的检验方法，其特征在于，其包括以下工序：对于从由投与了医药品的一个以上个体组成的第1组中采集的血液和从由未投与前述医药品的一个以上个体组成的第2组中采集的血液，测定前述任一项的肝病标记物的浓度的工序；以及在第1组和第2组之间比较所测定的前述肝病标记物的浓度的工序。
另外，本发明的肝病的诊断方法的特征在于，其包括以下工序：从作为诊断对象的一个以上个体中采血的工序；通过上述任一项的测定方法测定采集的血液中的本发明的标记物的浓度的工序；以及将该标记物的浓度与一个以上正常个体的血液中的标记物浓度进行比较的工序。
本发明的医药品的亲电性的毒副作用（投与医药品时产生的氧化应激）的诊断方法的特征在于，其包括以下工序：由投与医药品前和投与医药品后的个体采血的工序；通过上述任一项的测定方法测定采集的血液中的本发明的标记物的浓度的工序；以及将该标记物的浓度与一个以上正常个体的血液中的标记物浓度进行比较的工序。此处，医药品可以为任意种类。
此处，测定标记物的浓度的工序既包括分别测定从个体采集的血液的工序，也包括测定从多个个体采集的血液的血池(pool)的工序。另外，比较所测定的标记物的浓度的工序既包括逐一比较各测定中得到的浓度的工序，也包括比较各测定中得到的浓度的累加值或平均值的工序。
可以使用标记物来检测组织中的氧化应激的哺乳动物，只要是能够随着组织中的氧化应激而在血中测定本发明的标记物的哺乳类，则没有限定，优选为人。
对于采集用于该诊断方法的血液的哺乳动物没有特别限定，优选为其血液中存在至少一种上述标记物的哺乳动物，更优选为小鼠、大鼠等啮齿类或人、猴、狗。
发明的效果
根据本发明，通过测定血液中的γ-Glu-X肽类的浓度和AST、ALT的值等，能够迅速地鉴定健康人（C）、药物性肝损伤（DI）、无症状乙型肝炎携带者（AHB）、慢性乙型肝炎（CHB）、HCV阳性ALT持续正常者（CNALT）、慢性丙型肝炎（CHC）、丙型肝硬化（CIR）、肝癌（HCC）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、单纯性脂肪肝（SS）等肝病。
附图说明
图1为示意性地示出由于亲电物质和活性氧（氧化应激）生物合成视晶酸的机制的图。
图2为示意性地示出在各种肝损伤患者中生物合成γ-Glu-X肽类的机制的图。
图3为示出对健康人（C）和肝癌（HCC）患者的血清中的γ-Glu-X（X为氨基酸和胺）肽类的LC-MS测定结果进行比较的图。
图4为示出对健康人（C）和无症状乙型肝炎携带者（AHB）患者的血清中的γ-Glu-X肽类的LC-MS测定结果进行比较的图。
图5为示出对单纯性脂肪肝（SS）患者和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者的血清中的γ-Glu-X肽类的LC-MS测定结果进行比较的图。
图6为示出对健康人、各肝炎患者的血清中的AST、ALT、γ-Glu-X肽类的测定结果进行比较的图。
图7为示出多元逻辑回归（MLR）模型的开发和评价的一个例子的步骤的流程图。
图8为示出利用AST、ALT、γ-Glu-X肽类进行健康人的筛选检查的精度的图。
图9为同样示出药物性肝损伤（DI）的筛选检查的精度的图。
图10为同样示出无症状乙型肝炎携带者（AHB）的筛选检查的精度的图。
图11为同样示出慢性乙型肝炎（CHB）的筛选检查的精度的图。
图12为同样示出丙型肝炎病毒携带者且ALT值正常的HCV阳性ALT持续正常者（CNALT）的筛选检查的精度的图。
图13为同样示出慢性丙型肝炎（CHC）的筛选检查的精度的图。
图14为同样示出丙型肝硬化（CIR）的筛选检查的精度的图。
图15为同样示出肝癌（HCC）的筛选检查的精度的图。
图16为同样示出单纯性脂肪肝（SS）的筛选检查的精度的图。
图17为同样示出非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的筛选检查的精度的图。
图18为示出对肝癌（HCC）患者和胃癌（gastric cancer：GC）患者的血清中的γ-Glu-X肽类的浓度进行比较的图。
图19为示出用于区别肝癌（HCC）患者与慢性丙型肝炎（CHC）患者、丙型肝硬化（CIR）患者的AFP和MLR的箱线图和接受者操作特征（receiver operating curve：ROC）曲线的图。
图20为示出投与了丁硫堇（buthionine sulfoximine：BSO）、马来酸二乙酯（Diethylmaleate：DEM）的小鼠的肝脏中的γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly的定量结果的图。
图21为同样示出投与了APAP的小鼠的肝脏中的γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly的定量结果的图。
图22为同样示出投与了APAP的小鼠的血清中的γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly的定量结果的图。
图23为示出健康人（C）、丙型肝硬化（CIR）、单纯性脂肪肝（SS）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者的部分数据的的图。
图24为同样示出健康人（C）、丙型肝硬化（CIR）、单纯性脂肪肝（SS）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者的另一部分数据的图。
图25为同样示出健康人（C）、丙型肝硬化（CIR）、单纯性脂肪肝（SS）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者的又一部分数据的图。
图26为同样示出健康人（C）、丙型肝硬化（CIR）、单纯性脂肪肝（SS）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者的剩余数据的图。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。
如上所述，已知肝炎、肝硬化、肝癌等多种肝损伤与氧化应激具有很深的关系。因此，测定53名健康人（C）、10名药物性肝损伤（DI）、9名无症状乙型肝炎携带者（AHB）、7名慢性乙型肝炎（CHB）、10名HCV阳性ALT持续正常者（CNALT）、24名慢性丙型肝炎（CHC）、10名丙型肝硬化（CIR）、19名肝癌（HCC）、11名非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、9名单纯性脂肪肝（SS）的血清，使用毛细管电泳-飞行时间质谱仪（CE-TOFMS）法测定视晶酸浓度。但是，发现其它物质在各肝炎患者中优势增加，鉴定它们均为γ-Glu-X肽类（注：X表示氨基酸和胺）。
1.从血清提取代谢物质
将从健康人和各种肝炎患者中采集的血清（100μl）加入到添加有标准物质的甲醇900μl中，使酶失活，停止代谢的亢进。加入400μl的超纯水、1000μl的氯仿后，在4℃下以4600g离心5分钟。静置后，使分离的水-甲醇相750μl通过分级分子量为5kDa的离心超滤器，去除蛋白质。冷冻干燥滤液后，加入50μl的Milli-Q水，将其供于CE-TOFMS和LC-MS测定。
2.利用毛细管电泳-质谱仪（CE-TOFMS）测定血清中的代谢物
使用CE-TOFMS，同时测定健康人和肝炎患者的血清中的低分子代谢产物。
CE-TOFMS分析条件
a.毛细管电泳（CE）的分析条件
毛细管使用熔融石英毛细管（内径50μm、外径350μm、全长100cm）。缓冲液使用1M甲酸（pH约为1.8）。以施加电压为+30kV、毛细管温度为20℃的条件进行测定。使用加压法，在50mbar下注入试样3秒钟（约3nl）。
b.飞行时间质谱仪（TOFMS）的分析条件
使用正离子模式，设定为离子化电压4kV、破裂器电压75V、锥孔电压（skimmer voltage）50V、Oct RFV电压125V。干燥气体使用氮气，设定为温度300℃、压力10psig。鞘液使用50%甲醇溶液，为了用于质量校正而混入0.5μM利血平（m/z609.2807），以10μl/min输送液体。使用利血平（m/z 609.2807）和甲醇的加合离子（m/z 83.0703）的质量数，对得到的全部数据进行自动校正。
3.利用液相色谱仪-质谱仪（LC-MSMS）测定血清中的γ-Glu-X肽类
为了高灵敏度地进行测定，使用LC-MSMS测定血清中的γ-Glu-X肽类。
a.液相色谱仪（LC）的分析条件
分离柱使用野村化学（Nomura Chemical Co.Ltd.）公司制造的Develosil RPAQUEOUS-AR-3（内径2mm×长度100mm，3μm），柱温箱设定为30℃。注入1μl试样。流动相A使用0.5%甲酸、流动相B使用乙腈，利用B液为0%（0min）-1%（5min）-10%（15min）-99%（17min）-99%（19min）的流速0.2ml/min的梯度洗脱法将γ-Glu-X肽类分离。
b.三重串联四极杆质谱仪（QqQMS）的分析条件
使用Applied Biosystem公司制造的API3000三重串联四极杆质谱仪，以正离子模式的MRM模式进行测定。各质谱仪的参数如下所示。
离子源喷射电压：5.5kV
雾化气压力：12psi
气帘气压力：8psi
碰撞气体：8unit
氮气温度：550℃
将优化后的、用于在MRM（Multiple Reaction Monitering，多反应监测）模式下测定各γ-Glu-X肽类的MRM参数示于表1。
[表1]
Figure BDA00002611217700161
4.肝损伤生物标记物的探索和评价
图3示出了使用LC-MS测定健康人（C）和肝癌（HCC）患者的血清中的γ-Glu-X肽类的结果，图4示出了使用LC-MS测定健康人（C）和无症状乙型肝炎携带者（AHB）患者的血清中的γ-Glu-X肽类的结果，图5示出了使用LC-MS测定单纯性脂肪肝（SS）患者和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者的血清中的γ-Glu-X肽类的结果。图3、图4中，1为γ-Glu-Gly、2为γ-Glu-Ala、3为γ-Glu-Ser、4为γ-Glu-Val、5为γ-Glu-Thr、6为γ-Glu-牛磺酸、7为γ-Glu-Ile、8为γ-Glu-Leu、9为γ-Glu-Asn、10为γ-Glu-Lys、11为γ-Glu-Gln、12为γ-Glu-Glu、13为γ-Glu-Met、14为γ-Glu-His、15为视晶酸（ophthalmate）（γ-Glu-2AB-Gly）、16为γ-Glu-Phe、17为谷胱甘肽氧化型（GSSG）、18为γ-Glu-Tyr、19为γ-Glu-Glu-Gly。可知，与健康人（C）相比，许多γ-Glu-X肽类在肝癌（HCC）患者、无症状乙型肝炎携带者（AHB）患者中增加，以及在单纯性脂肪肝（SS）患者和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者中存在差异。另外，在其他肝损伤中，γ-Glu-X肽类的浓度也显著高于健康人。
图6示出了健康人（C）和各种肝炎患者的血清中的AST、ALT值和γ-Glu-X肽类的测定结果。图中，箭头表示最大值、最小值，箱的上方表示上四分位数、箱的下方表示下四分位数，箱中的横线表示中位数。
以往的肝功能检查值即AST、ALT值在药物性肝损伤（DI）、慢性乙型肝炎（CHB）、慢性丙型肝炎（CHC）中上升，但在其它肝炎中与健康人的值没有显著性差异。
但是，与健康人（C）相比，γ-Glu-Ser、γ-Glu-Thr等γ-Glu-X肽类在药物性肝损伤（DI）中浓度高，在其它肝炎中显示更高值。特别是在无症状乙型肝炎携带者（AHB）、无症状丙型肝炎携带者（AHC）、肝癌（HCC）中γ-Glu-X肽类均显示出高值。另外，具体来看，对于几种γ-Glu-X肽类而言，与无症状乙型肝炎携带者（AHB）相比在无症状丙型肝炎携带者（AHC）中更高，或者与无症状乙型肝炎携带者（AHB）相比在慢性乙型肝炎（CBC）中更高，或者即便是相同的丙型肝炎，随着疾病以无症状（AHC）、慢性肝炎（CHC）、肝癌（HCC）的步骤发展，观察到值降低的倾向。
这样，AST、ALT和各γ-Glu-X肽类的血药浓度因各疾病而异，因而考虑是否可以利用这些成分的值来判断各疾病。因此，以选择用于区别各肝病的生物标记物为目标，进行了多变量分析手法的多元逻辑回归（MLR）分析。结果示于表2~表4。
[表2]
Figure BDA00002611217700181
[表3]
Figure BDA00002611217700191
[表4]
Figure BDA00002611217700201
在多元逻辑回归（MLR）分析中，对于作为目标变量的比率p，使用k个解释变量x1、x2、x3、…、xk，求出
ln(p/1-p)＝b0+b1x1+b2x2+b3x3+…+bkxk…（1）
这样的p的回归式，表2~表4中的参数值为放入（1）式的b0、b1、…bk中的具体值。（截距）是指常数项（b0）的值。
另外，对每种病例计算概率时，例如在药物性肝损伤（DI）的组中，使表中的（截距）的值-4.12为b0、γ-Glu-牛磺酸（Taurine）的值2.34为b1、γ-Glu-Leu的值-17.9为b2、γ-Glu-Glu的值0.322为b3、AST的值-0.0346为b4、ALT的值0.0521为b5、γ-Glu-Gly的值0.110为b6、γ-Glu-Arg的值3.57为b7、γ-Glu-Ser的值1.25为b8、γ-Glu-Phe的值7.94为b9、γ-Glu-Met的值10.9为b10、γ-Glu-瓜氨酸（Citrulline）的值-6.21为b11，将γ-Glu-牛磺酸（Taurine）的定量值代入x1、γ-Glu-Leu的定量值代入x2、γ-Glu-Glu的定量值代入x3、AST的定量值代入x4、ALT的定量值代入x5、γ-Glu-Gly的定量值代入x6、γ-Glu-Arg的定量值代入x7、γ-Glu-Ser的定量值代入x8、γ-Glu-Phe的定量值代入x9、γ-Glu-Met的定量值代入x10、γ-Glu-Citrulline的定量值代入x11，得出具体的值。将推测的参数的标准误差和95%置信区间也示于表中。
由该分析结果发现了能够选择性地区别包括健康人（C）在内的多种肝炎患者的候补生物标记物。例如可知，识别健康人（C）的生物标记物为葡糖胺（Glucosamine）、γ-Glu-Ala、蛋氨酸亚砜（Methionine sulfoxide）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、AST、ALT、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Met、γ-Glu-Gln，通过这些值能够与其它肝病区分。其中，比数比超过1的、最大的γ-Glu-Met的值最有助于健康人（C）的判断，这里，比数比是表示定量值x1增加1时概率p有多大变化的值。另一方面，对于比数比为0的γ-Glu-Leu、γ-Glu-Phe，这些物质的增加有助于除健康人以外（非C）的判断。另外，从图6可知，也可以使用γ-Glu-Ala、γ-Glu-Thr、γ-Glu-瓜氨酸、蛋氨酸亚砜。
另外，药物性肝损伤（DI）的生物标记物为γ-Glu-Taurine、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Glu、AST、ALT、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Arg、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Met、γ-Glu-Citrulline，通过将它们组合，进行例如多元逻辑回归（MLR）分析，mann-whitney检验的p值大于规定值、例如大于0.5，从而能够与其它肝病区分。其中，比数比超过1的、最大的γ-Glu-Met的值最有助于药物性肝损伤（DI）的判断，这里，比数比是表示定量值x1增加1时概率p有多大变化的值。另一方面，对于比数比接近0的γ-Glu-瓜氨酸，该物质的增加有助于健康人（C）的判断。AST和ALT的比数比分别为0.96599、1.05346，接近于P未随着变量增加而变化的1.0，因此贡献小，可以省略。
另外，肝癌（HCC）的生物标记物为γ-Glu-牛磺酸（Taurine）、蛋氨酸亚砜（Methionine sulfoxide）、γ-Glu-Glu、AST、ALT、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ser、γ-Glu-瓜氨酸（Citrulline），通过将它们组合，进行例如多元逻辑回归（MLR）分析，p值大于规定值、例如大于0.5，从而能够与其它肝病区分。其中，比数比超过1的、最大的γ-Glu-瓜氨酸的值最有助于肝癌（HCC）的判断。另一方面，对于比数比接近0的γ-Glu-Glu，该物质的增加有助于除肝癌以外（非HCC）的判断。另外，比数比接近1的蛋氨酸亚砜、AST、ALT可以省略。
同样地，对于其它疾病，也发现了表2~表4所示的各个候补生物标记物。
无症状乙型肝炎携带者（AHB）候补生物标记物为γ-Glu-牛磺酸（Taurine）、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、AST、ALT、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Arg、γ-Glu-Met、γ-Glu-Gln，
慢性乙型肝炎（CHB）候补生物标记物为γ-Glu-Ala、蛋氨酸亚砜（Methionine    sulfoxide）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Glu、AST、ALT、γ-Glu-Arg、γ-Glu-Ser、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Met、γ-Glu-瓜氨酸（Citrulline），
HCV阳性ALT持续正常者（CNALT）候补生物标记物为葡糖胺（Glucosamine）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、AST、ALT、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Gln、γ-Glu-瓜氨酸（Citrulline），
慢性丙型肝炎（CHC）候补生物标记物为葡糖胺（Glucosamine）、蛋氨酸亚砜（Methionine sulfoxide）、ALT、γ-Glu-Lys、γ-Glu-His，
丙型肝硬化（CIR）候补生物标记物为葡糖胺（Glucosamine）、蛋氨酸亚砜（Methionine sulfoxide）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Glu、AST、ALT、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Met、γ-Glu-Gln、γ-Glu-瓜氨酸（Citrulline），
单纯性脂肪肝（SS）候补生物标记物为γ-Glu-牛磺酸（Taurine）、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Glu、AST、ALT、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Gln，
非酒精性脂肪性肝炎（NASH）候补生物标记物为葡糖胺（Glucosamine）、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Val、AST、ALT、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Gln、γ-Glu-瓜氨酸（Citrulline）。
其中，比数比接近1的生物标记物，例如判断无症状乙型肝炎携带者（AHB）时的ALT（1.083254）；判断HCV阳性ALT持续正常者（CNALT）时的ALT（0.957388）；判断慢性丙型肝炎（CHC）时的蛋氨酸亚砜（0.989493）、ALT（0.993806）；判断丙型肝硬化（CIR）时的AST（1.012402）、ALT（0.973926）；判断非酒精性脂肪性肝炎（NASH）时的AST（0.949237）、ALT（1.039583）等也可以省略。
对于这些生物标记物的贡献率而言，根据病例数据的追加，重新研究模型，进行各判断中使用的生物标记物的组合和多元逻辑回归（MLR）模型中的系数的修正，还可以进一步提高MLR模型的精度。
图7中示出MLR模型的开发和评价的一个例子的步骤。在生物标记物发现阶段，对217个试样进行聚类（步骤100），选择显示较大变化的因素（γ-谷氨酰二肽酶、代谢产物、转氨酶）。根据用于将患者或健康人的试样与其它所有组加以区分的重要性，通过支持向量机-因素选择（support vector machine-factorselection，SVM-FS）法，对所选择的因素的重要性进行排名（步骤102）。
在模型开发阶段，使用重要度排名第1位至第N位以内的因素开发MLR模型，例如使用142个训练数据确定了式（1)的系数和常数项（步骤110、112）。作为MLR的预测精度的接受者操作特征（ROC）曲线下面积（area under the receiver-operatingcurve：AUC）大于0.8或N变为4时（步骤114的判断结果为Yes），将该模型选择为最终预测变量。
接着，使用例如75个评价数据评价该MLR模型的预测精度（步骤120）。用MLR模型预测训练数据和评价数据时的精度、即ROC曲线和AUC值示于图8~图17。
图8~图17中示出了用于区别某个疾病组与其它所有疾病组的多元逻辑回归（MLR）模型的精度。例如，在药物性肝损伤（DI）的情况下，进行DI与DI以外的区分。如图8~图17中所示，所有疾病的ROC曲线下面积（area under the receiver-operatingcurve：AUC）为0.855~1.000，可以确认利用了这些生物标记物的各肝病筛选检查能够以高精度鉴定各疾病。特别是，图8示出的健康人（C）、图11示出的慢性乙型肝炎（CHB）、图12示出的HCV阳性ALT持续正常者（CNALT）的AUC均为1.000，可知通过本发明可以以极高的精度对它们进行鉴定。
5.其它疾病中的γ-Glu-X肽的评价
确认γ-Glu-X肽类在其它疾病中是否也上升。图18示出了肝癌（HCC）患者和胃癌（GC）患者的血清中的γ-Glu-X肽类的浓度。在胃癌（GC）患者中，γ-Glu-X肽类的浓度与健康人（C）相同，没有观察到肝癌（HCC）患者那样的γ-Glu-X肽类的增加。(注：有文献报道，幽门螺旋杆菌的感染是胃癌的原因，由于幽门螺旋杆菌的感染，氧化应激得到抑制（参考文献10）。由于胃癌没有暴露于氧化应激下，因此推测γ-Glu-X肽类的浓度低。)
图19示出了用于区别肝癌（HCC）患者（个体数32）与慢性丙型肝炎（CHC）患者（个体数35）、丙型肝硬化（CIR）患者（个体数18）的α-胎蛋白（AFP）和MLR的箱线图和ROC曲线。MLR模型使用γ-Glu-Ala、γ-Glu-瓜氨酸、γ-Glu-Thr和γ-Glu-Phe。AFP、MLR基于mann-whitney检验的p值均小于0.0001。AFP的箱线图中，HCC组的6个结果在图的范围外（>500ng/ml）。ROC曲线中的值示出了ROC以下的面积及其95%置信区间。
另外，在糖尿病患者中，血中的γ-Glu-X肽类的浓度也低，肝病的情况下，特异性地观察到血中的γ-Glu-X肽类的增加。
6.γ-Glu-X肽类的生物合成机制的解明
使用小鼠阐明γ-Glu-X肽类的生物合成机制。如图2的（B）所示，可知，在活性氧、亲电物质所致的氧化应激条件下，为了去除这些物质，谷胱甘肽枯竭，与之相伴γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCS）被活化，各种氨基酸成为底物（起始物质），生物合成γ-Glu-X二肽类、γ-Glu-X-Gly三肽类。以下示出实验步骤。
a.对小鼠投与GCS抑制剂BSO和活化剂DEM
对断食一晚的雄性小鼠腹膜内注射戊巴比妥钠（每1Kg体重为60mg）使其麻醉后，分别以每1Kg体重为4mmol/kg（BSO888mg、DEM688mg）的量对腹腔内注射γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCS）抑制剂BSO、亲电物质（GCS活化剂）DEM、以及作为正常情况的生理盐水。投与1小时后从小鼠采集肝脏（约300mg）（各5次）。
b.从肝脏提取代谢物质
将从小鼠中摘出的肝脏（约300mg）立即放入添加有内标物质的甲醇1ml中，均质化而使酶失活，停止代谢的亢进。加入500μl的纯水后，取出300μl的溶液，加入200μl的氯仿并充分搅拌后，再在4℃的条件下以15000rpm离心15分钟。静置后，使分离的水-甲醇相300μl通过分级分子量为5kDa的离心超滤器，除去蛋白质。冷冻干燥滤液后，加入50μl的Milli-Q水，将其供于CE-TOFMS测定。
c.表示氧化应激的γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly肽类生物标记物的鉴定结果
将投与生理盐水（正常情况）、BSO、DEM后的小鼠的肝脏和血清中的氨基酸、γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly肽类的测定结果的一部分示于图11。左侧表示从投与各试剂的小鼠的肝脏检测出的氨基酸（X）、γ-Glu-X肽、γ-Glu-X-Gly肽的定量结果，右侧表示血清中的氨基酸（X）、γ-Glu-X肽、γ-Glu-X-Gly肽的定量结果。
例如，最上面为Cys、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Cys-Gly（谷胱甘肽）的结果。与正常情况相比，肝脏中的谷胱甘肽量在投与BSO、DEM的小鼠中急剧减少（投与BSO的情况下，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶被抑制，因此谷胱甘肽减少；投与亲电物质DEM的小鼠中，为了解毒而有所消耗，因此谷胱甘肽减少）。从血清中未检测出谷胱甘肽相关物质。
通过以下方法来确认所检测出的γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly肽类是由谷胱甘肽生物合成路径合成的。如图2所示，如果这些肽类是由谷胱甘肽生物合成路径合成的，则肝脏中的γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly肽应该会因投与BSO（由于γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶被抑制）而与正常情况相比减少，因投与亲电物质DEM（由于γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶被活化）而增加。
图20示出投与BSO、DEM的小鼠肝脏的测定结果；图21示出了投与扑热息痛（APAP）的小鼠肝脏的测定结果；图22示出了投与扑热息痛（APAP）的小鼠血清的测定结果。如图20~图22所示，除谷胱甘肽相关的γ-Glu-Cys、GSH、γ-Glu-Ser-Gly以外的肝脏中的γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly肽类物质与正常情况相比，因投与BSO而减少，因投与DEM而增加，确认到的确是通过谷胱甘肽生物合成路径而生成的。
即可知，这些γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly肽类在谷胱甘肽由于活性氧、亲电物质等氧化应激而减少时在肝脏内生物合成。
d.利用苏氨酸同位素追踪生物合成路径
进而，腹腔内投与苏氨酸（Thr）的13C、15N的同位素，加入产生亲电物质、提供氧化应激的APAP时，结果从小鼠的肝脏中检测出Thr的13C、15N的γ-Glu-Thr、γ-Glu-Thr-Gly，确认到的确在氧化应激条件下由Thr生物合成γ-Glu-Thr、γ-Glu-Thr-Gly。
另一方面，在小鼠血清中的物质中，与正常情况相比因投与BSO而减少、因投与亲电物质DEM而增加的γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly肽类仅为γ-Glu-2AB和视晶酸（γ-Glu-2AB-Gly）（图22）。因此认为，在小鼠的情况下，在谷胱甘肽由于亲电物质等氧化应激而减少时，在血中增加的仅为γ-Glu-2AB和视晶酸。
但是，在各种肝炎患者的血清测定中，与γ-Glu-2AB、视晶酸相比，其他γ-Glu-X肽类的浓度更高。该差异推测是因为，在生物物种间，底物浓度、代谢酶的底物特异性和活性、转运体的种类、功能、表达量等不同。
本发明的利用血清中的γ-Glu-X肽类测定的诊断法，还可以对肝硬化（cirrhosis）、非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）、单纯性脂肪肝（SS）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）等各种肝损伤进行诊断。
图23~图26示出了健康人（C）与丙型肝硬化（CIR）患者、单纯性脂肪肝（SS）患者、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者的数据，可知，通过*号所示的p值小于0.05的AST、γ-Glu-Val、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Phe，可以识别单纯性脂肪肝（SS）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。
本次记载了各种肝损伤的候补标记物AST、ALT、γ-Glu-X肽类的组合的例子，但不限定于此，今后通过进一步进行多样品的详细调查，也可以改变候补生物标记物的种类组合。
另外，本次血清中的γ-Glu-X肽类测定使用了LC-MS法，不限定于气相色谱法（GC）、液相色谱法（LC）、毛细管电泳（CE）、芯片LC、芯片CE、对它们组合了质谱仪（MS）的GC-MS、LC-MS、CE-MS法、各种MS单独的测定法、NMR法、将γ-Glu-X肽类衍生为荧光物质、UV吸收物质后进行测定的方法、制作抗体后用ELISA法等进行测定等的测定法，能够用所有分析法进行测定。
本发明的医药品的检验方法为在哺乳动物中对于从投与了该医药品的哺乳动物采集的血液和从未投与该医药品的哺乳动物采集的血液测定本发明的标记物的浓度的方法。需要说明的是，对于采集用于该检验方法的血液的哺乳动物没有特别限定，优选为其血液中存在至少一种上述标记物的哺乳动物，更优选为小鼠、大鼠等啮齿类或人、猴、狗。
此处，在检验医药品作为针对亲电物质毒性和活性氧（氧化应激）的治疗药的有效性的情况下，适用医药品的对象疾病只要是由氧化应激所产生的疾病则没有限定，与上述那样的作为标记物的使用对象的疾病相同。另外，在检验由投与医药品所产生的氧化应激的强度的情况下，医药品的种类完全不受限定，例如，有害药物也包含在医药品中。
需要说明的是，本发明的检验方法的目的为：检验作为针对由氧化应激所产生的疾病的治疗药的医药品的有效性、以及检验由投与医药品所产生的氧化应激的强度，具体地说可在各种情况下使用。以下，对代表性的使用例进行说明，但本发明的检验方法不限于这些例子。
（1)作为治疗药的有效性的检验
以下，说明针对肝炎的使用例，但本发明的检验方法不限于这些例子。
（1-1）特定个体中的药效检验
例如，使用本发明的检验方法，可以判断某种肝炎治疗药是否对治疗特定患者的肝炎有效。首先，在对罹患肝炎的患者投与肝炎治疗药的前后，从该患者采集血液。接下来，在该血液中，测定肝炎诊断标记物的浓度。在投与肝炎治疗药的前后对如此得到的血液中的标记物浓度进行比较。此时，如果肝炎治疗药投与后的血液中标记物浓度与投与前相比显著降低，则可以判断肝炎治疗药对治疗该患者的肝炎有效。
（1-2）一般性药效检验
进而，通过将本发明的检验方法适用于多个人个体，从而还可以检验该医药品作为肝炎治疗药的一般性有效性。
例如，在患有肝炎的多个人中，通过在投与肝炎治疗药的前后比较肝炎诊断标记物的浓度，从而能够调查该物质作为治疗药的普遍效果。
或者，作为其他方式，也可以在两组之间比较作为医药品的效果。首先，将罹患肝炎的患者分为两组。对一组患者投与肝炎治疗药，对另一组患者不投与该治疗药，或投与安慰剂。从这两组患者采集血液。接下来，在该血液中测定肝炎诊断标记物的浓度。此外，在两组之间对由该测定得到的血液中的标记物浓度进行比较。
需要说明的是，“组”可以仅包含一个个体，也可以包含多个个体，两组的个体数可以相同，也可以不同。测定中，可以将从相同组的个体中采集的血液形成血池，测定该血液中的标记物浓度，但优选对各个个体的血液分别测定标记物浓度。
投与医药品的前后或投与的有无等、包含多种血液的组间的标记物浓度的比较，可以对每一个血液分别进行比较，也可以将属于相同组的多种血液中的标记物浓度的累加值、平均值在组间进行比较。该比较可以使用本领域技术人员公知的任何统计学方法来进行。这样比较的结果，如果在治疗药的投与后与投与前相比血液中标记物浓度显著降低，或者在治疗药的投与组中与非投与组相比显著降低的话，则可以判断该治疗药对于肝炎的治疗有效。另外，还可以根据降低的程度来判断具有何种程度的有效性。
这样，通过对作为肝炎治疗药的一般性有效性进行检验，能够进行肝炎治疗药的筛选。另外，通过使用多种肝炎治疗药，对不同浓度的各肝炎治疗药进行治疗效果的调查，比较依赖于浓度的药效的差异，从而还可以调查各肝炎治疗药的强度。
（2）氧化应激的强度的检验
氧化应激强时副作用的表现强，因此，以下，作为一个例子对于医药品的副作用的使用例进行说明，但本发明的检验方法不限于这些例子。
（2-1）特定个体中的副作用的强度的检验
使用本发明的检验方法，可以判断某种医药品是否会对特定的哺乳动物个体带来副作用。首先，在对个体投与治疗用的医药品的前后，从该个体采集血液。接下来，在该血液中测定氧化应激检测标记物的浓度。在投与医药品的前后对如此得到的血液中的标记物浓度进行比较。此时，若投与医药品后的血液中标记物浓度与投与前相比显著增加，则可以判断所投与的医药品在该个体中产生氧化应激，对该个体带来了副作用。
（2-2）一般性副作用的强度的检验
此外，通过将本发明的检验方法适用于多个哺乳动物个体，还可以检验某种医药品的一般性副作用的强度。
例如，在患有某种疾病的多个个体中，通过在投与该疾病治疗用医药品的前后对氧化应激检测标记物的浓度进行比较，能够调查该医药品一般性副作用的强度。
或者，作为其他方式，也可以在两组之间比较副作用的强度。首先，将患有某种疾病的哺乳动物分为两组。对一组个体投与该疾病治疗用医药品，对另一组个体不投与该医药品或投与安慰剂。从这两组个体采集血液。接下来，在该血液中测定氧化应激检测标记物的浓度。此外，在两组之间对由该测定得到的血液中的标记物浓度进行比较。需要说明的是，“组”可以仅包含一个个体，也可以包含多个个体，两组的个体数可以相同，也可以不同。测定中，可以将从相同组的个体中采集的血液形成血池(pool)，测定该血液中的标记物浓度，但优选对各个个体的血液分别测定标记物浓度。
组间的标记物浓度的比较可以对每一个血液分别进行比较，也可以将属于相同组的多种血液中的标记物浓度的累加值、平均值在组间进行比较。该比较可以使用本领域技术人员公知的任何统计学方法来进行。这样比较的结果，如果在医药品的投与后与投与前相比血液中标记物浓度显著上升，或者在医药品的投与组中与非投与组相比显著上升的话，则可以判断该医药品具有副作用。
这样，通过检验作为医药品的副作用的强度，能够进行副作用弱的医药品的筛选。另外，通过使用多种医药品，对不同浓度的各医药品调查作为医药品的效果，同时比较依赖于浓度的副作用的差异，从而还可以对各医药品作为治疗药的适应性进行比较。
如上所述，本发明的氧化应激检测标记物能够用于肝病治疗用医药品的检验或者医药品的副作用的强度的检验、以及疾病的诊断等中。此时，通过使用多个标记物，能够提高检验精度和诊断精度。另外，也可以将除本发明的标记物以外的检验方法、诊断方法进行组合。
产业上的可利用性
本发明中发现的通过在生物体中产生的氧化应激而表现出谷胱甘肽的枯竭的γ-Glu-X肽生物标记物，不仅作为各种肝病患者的迅速的筛选法有用，而且作为掌握生物体的氧化应激的标记物，能够在广泛的生命科学领域中使用。

Claims (15)

1.一种肝病标记物，其特征在于，其为用于检测哺乳动物的组织中的氧化应激的标记物，
并且其为γ-Glu-X肽，其中，X为氨基酸和胺。
2.一种健康人识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求1所述的肝病标记物，
并且其为至少含有葡糖胺、γ-Glu-Ala、蛋氨酸亚砜、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、AST、ALT、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Met、γ-Glu-Gln的组合。
3.一种药物性肝损伤识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求1所述的肝病标记物，
并且其为至少含有γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Arg、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Met、γ-Glu-瓜氨酸的组合。
4.一种无症状乙型肝炎携带者识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求1所述的肝病标记物，
并且其为至少含有γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、AST、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Arg、γ-Glu-Met、γ-Glu-Gln的组合。
5.一种慢性乙型肝炎识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求1所述的肝病标记物，
并且其为至少含有γ-Glu-Ala、蛋氨酸亚砜、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Glu、AST、ALT、γ-Glu-Arg、γ-Glu-Ser、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Met、γ-Glu-瓜氨酸的组合。
6.一种HCV阳性ALT持续正常者识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求1所述的肝病标记物，
并且其为至少含有葡糖胺、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、AST、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Gln、γ-Glu-瓜氨酸的组合。
7.一种慢性丙型肝炎识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求1所述的肝病标记物，
并且其为至少含有葡糖胺、γ-Glu-Lys、γ-Glu-His的组合。
8.一种丙型肝硬化识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求1所述的肝病标记物，
并且其为至少含有葡糖胺、蛋氨酸亚砜、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Met、γ-Glu-Gln、γ-Glu-瓜氨酸的组合。
9.一种肝癌识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求1所述的肝病标记物，
并且其为至少含有γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ser、γ-Glu-瓜氨酸的组合。
10.一种单纯性脂肪肝识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求1所述的肝病标记物，
并且其为至少含有γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Glu、AST、ALT、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Gln的组合。
11.一种非酒精性脂肪性肝炎识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求1所述的肝病标记物，
并且其为至少含有葡糖胺、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Val、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Gln、γ-Glu-瓜氨酸的组合。
12.一种肝病标记物的测定方法，其特征在于，测定样品中的γ-Glu-X肽作为肝病标记物，其中，X为氨基酸和胺。
13.一种肝病标记物的测定装置，其特征在于，其具备以下单元：
由样品制作适于分析的试样的单元；以及
分析单元，用于测定试样中的γ-Glu-X肽作为肝病标记物，其中，X为氨基酸和胺。
14.一种医药品的检验方法，其特征在于，其包括以下工序：
在医药品的投与前和投与后采集的血液中测定权利要求1~10中任一项所述的肝病标记物的浓度的工序；以及
在所述医药品的投与前的血液和投与后的血液之间比较所述测定结果的工序。
15.一种医药品的检验方法，其特征在于，其包括以下工序：
对于从由投与了医药品的一个以上个体组成的第1组中采集的血液和从由未投与所述医药品的一个以上个体组成的第2组中采集的血液，测定权利要求1~11中任一项所述的肝病标记物的浓度的工序；以及
在第1组和第2组之间比较所测定的所述肝病标记物的浓度的工序。
CN201180030202.5A 2010-06-18 2011-05-17 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法 Active CN102971632B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-139736 2010-06-18
JP2010139736 2010-06-18
PCT/JP2011/061340 WO2011158590A1 (ja) 2010-06-18 2011-05-17 肝臓疾患マーカー、その測定方法、装置及び医薬品の検定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102971632A true CN102971632A (zh) 2013-03-13
CN102971632B CN102971632B (zh) 2015-09-02

Family

ID=45347999

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180030202.5A Active CN102971632B (zh) 2010-06-18 2011-05-17 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20130116148A1 (zh)
JP (1) JP5809136B2 (zh)
KR (1) KR101867808B1 (zh)
CN (1) CN102971632B (zh)
WO (1) WO2011158590A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106977583A (zh) * 2017-03-31 2017-07-25 华南理工大学 一种寡肽及其制备方法与应用
CN107090013A (zh) * 2017-03-31 2017-08-25 华南理工大学 一种寡肽及其制备方法与应用
CN107110867A (zh) * 2014-12-12 2017-08-29 首尔大学校产学协力团 用于肝癌诊断的生物标记物及其用途

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010073870A1 (ja) * 2008-12-24 2010-07-01 学校法人 慶應義塾 肝臓疾患マーカー、その測定方法、装置及び医薬品の検定方法
JP6173667B2 (ja) * 2012-09-20 2017-08-02 ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 代謝物の抽出方法
CN105765383B (zh) 2013-10-28 2018-04-10 唾液科技有限公司 胰腺癌用唾液生物标记物以及使用了胰腺癌用唾液生物标记物的胰腺癌的诊断方法
KR101942538B1 (ko) * 2017-03-23 2019-04-11 전남대학교산학협력단 다이펩타이드 Glu-Phe를 이용한 대사성질환 개선용 약학조성물 및 건강기능성식품

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1854736A (zh) * 2005-04-28 2006-11-01 穆海东 乙丙型肝炎与多种肿瘤标志物蛋白芯片检测试剂盒
EP1975621A1 (en) * 2006-01-20 2008-10-01 Keio University Method for determination of oxidative stress
WO2010073870A1 (ja) * 2008-12-24 2010-07-01 学校法人 慶應義塾 肝臓疾患マーカー、その測定方法、装置及び医薬品の検定方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3341765B1 (ja) 2001-07-25 2002-11-05 学校法人慶應義塾 陰イオン性化合物の分離分析方法及び装置
US20030134339A1 (en) * 2002-01-14 2003-07-17 Thomas Brown Proteomics based method for toxicology testing
US6986995B2 (en) * 2002-02-28 2006-01-17 Prometheus Laboratories, Inc. Methods of diagnosing liver fibrosis
US20060172012A1 (en) * 2005-01-28 2006-08-03 Finley John W Anti-inflammatory supplement compositions and regimens to reduce cardiovascular disease risks
BRPI0811270A8 (pt) * 2007-05-08 2017-06-27 Ajinomoto Kk Alimento de baixo teor de gordura, e, agente de intensificação de sabor
WO2009059150A2 (en) * 2007-11-02 2009-05-07 Metabolon, Inc. Biomarkers for fatty liver disease and methods using the same
EP2225386A2 (en) * 2007-12-28 2010-09-08 Unilever PLC Process for the enzymatic preparation of a gamma-glutamyl compound
CA2716780A1 (en) * 2008-02-25 2009-09-03 National University Corporation Hokkaido University Prophylactic or therapeutic agent for diabetes or obesity
CN102083470B (zh) * 2008-05-02 2015-05-20 通用电气公司 应用超极化13c-丙酮酸盐,通过13c-mr检测测定丙氨酸转氨酶(alt)活性的方法
US8658351B2 (en) * 2009-02-06 2014-02-25 Metabolon, Inc. Determining liver toxicity of an agent using metabolite biomarkers

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1854736A (zh) * 2005-04-28 2006-11-01 穆海东 乙丙型肝炎与多种肿瘤标志物蛋白芯片检测试剂盒
EP1975621A1 (en) * 2006-01-20 2008-10-01 Keio University Method for determination of oxidative stress
WO2010073870A1 (ja) * 2008-12-24 2010-07-01 学校法人 慶應義塾 肝臓疾患マーカー、その測定方法、装置及び医薬品の検定方法
CN102265160A (zh) * 2008-12-24 2011-11-30 学校法人庆应义塾 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107110867A (zh) * 2014-12-12 2017-08-29 首尔大学校产学协力团 用于肝癌诊断的生物标记物及其用途
CN106977583A (zh) * 2017-03-31 2017-07-25 华南理工大学 一种寡肽及其制备方法与应用
CN107090013A (zh) * 2017-03-31 2017-08-25 华南理工大学 一种寡肽及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011158590A1 (ja) 2011-12-22
KR101867808B1 (ko) 2018-06-18
US20130116148A1 (en) 2013-05-09
CN102971632B (zh) 2015-09-02
KR20130084239A (ko) 2013-07-24
JPWO2011158590A1 (ja) 2013-08-19
JP5809136B2 (ja) 2015-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102265160B (zh) 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法
CN102971632B (zh) 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法
JP4840804B2 (ja) 酸化ストレスの判定方法
Ozer et al. The current state of serum biomarkers of hepatotoxicity
US10274496B2 (en) Biomarkers for detecting and monitoring colon cancer
CN105209909B (zh) 与肾功能相关的生物标记及其使用方法
CN111602055A (zh) 作为癌症生物标志物的挥发性有机化合物
Flasch et al. Stable isotope-assisted metabolomics for deciphering xenobiotic metabolism in mammalian cell culture
Bennuru et al. Metabolite profiling of infection-associated metabolic markers of onchocerciasis
van Swelm et al. Application of urine proteomics for biomarker discovery in drug-induced liver injury
Cabré et al. Plasma metabolic alterations in patients with severe obesity and non‐alcoholic steatohepatitis
JP2012517596A (ja) 薬剤の肝毒性の判定
Hu et al. Quantitative determination of osteopontin in bovine, buffalo, yak, sheep and goat milk by Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and stable isotope dimethyl labeling
US8563318B2 (en) Method for the diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis based on a metabolomic profile
Liu et al. Identification of antigenic proteins associated with trichloroethylene-induced autoimmune disease by serological proteome analysis
EP2711708A1 (en) Determination of tryptophan metabolites for assessing liver cell function
TWI721462B (zh) 非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法、非酒精性脂肪肝疾病檢測用試劑盒和非酒精性脂肪肝疾病檢測用生物標記
Gundamaraju et al. Metabolomics as a functional tool in screening gastro intestinal diseases: where are we in high throughput screening?
Jeong et al. A pulsed amperometric detection method of galactose 1-phosphate for galactosemia diagnosis
Vulturar et al. A severe neonatal argininosuccinic aciduria case investigated by 1H-NMR spectroscopy
Wu et al. Increased detection rate of melamine-containing calcium urolithiasis by using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique in clinical practice
De Pinho et al. Cancer Metabolomics 2018
Arun et al. Metabolomics and its application in advance diagnostic microbiology field
CN110118845A (zh) 检测多种氨基酸和酰基肉碱、甲基丙二酸的方法和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant