KR101867808B1

KR101867808B1 - 간장질환 마커, 그 측정방법, 장치 및 의약품의 검정방법

Info

Publication number: KR101867808B1
Application number: KR1020127033075A
Authority: KR
Inventors: 토모요시 소가; 마사히로 스기모토; 마코토 스에마츠; 타카후미 사이토; 스미오 카와타
Original assignee: 각고호우징 게이오기주크
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2011-05-17
Publication date: 2018-06-18
Also published as: CN102971632B; WO2011158590A1; JP5809136B2; JPWO2011158590A1; US20130116148A1; CN102971632A; KR20130084239A

Abstract

본 발명은 간장질환을 신속하게 특정하는 것이다. 또한, 본 발명은 혈액 중의 γ-Glu-X(X는 아미노산 및 아민) 펩티드류의 농도나 AST, ALT의 값을 측정하고, 그 측정치로부터, 예를 들면 다중 로지스틱 회귀(MLR)를 하고, 정상인(C), 약제성 간장해(DI), 무증상 B형 간염 보균자(AHB), 만성 B형 간염(CHB), HCV 양성 ALT지속 정상자(CNALT), 만성 C형 간염(CHC), C형 간경변(CIR), 간암(HCC), 단순 지방간(SS), 비알코올성 지방간염(NASH) 등의 간장질환을 특정하는 것이다.

Description

간장질환 마커, 그 측정방법, 장치 및 의약품의 검정방법{LIVER DISEASE MARKER, METHOD AND APPARATUS FOR MEASURING SAME, AND TEST METHOD FOR PHARMACEUTICAL PREPARATION}

본 발명은 간장질환 마커, 그 측정 방법, 장치 및 의약품의 검정방법에 관하고, 특히, 각종 간장질환 환자를 정상인과 식별하여 스크리닝 가능한 간장질환 마커, 그 측정방법, 장치 및 당해 간장질환 마커를 사용한 의약품의 검정방법에 관한 것이다.

간장질환은 약제성 간장해, B형, C형 간염, 간경변, 간암 등으로 다양하고, 또 무증상의 B형, C형 바이러스 보균자인 사람도 존재한다. 특히, C형 간염 바이러스(hepatitis type C virus：HCV) 감염자의 7할은 만성적인 간장의 염증(만성간염) 때문에, 서서히 정상적인 간세포를 잃어 간장이 섬유화되고, 간경변으로 진행하여, 또한 간암으로까지 발전한다. C형 만성간염 환자의 10~15%, 간경변 환자의 80%에서 간암이 발생하는 것이 보고되고 있다. 만성간염상태에서는 생명에 위험이 생길 일은 없지만, 간암이 발생하거나 간경변이 진행되어 간부전을 일으키면 생명의 위험이 닥쳐온다. 따라서, 조기에 C형 간염을 진단하여 바이러스를 구제하는 일이 필요하다.

C형 간염은 간경변에서 간암으로 증상도 없이 진행되고, 간장의 기능을 극도로 저하시켜 권태감이나 황달, 의식장해 등 여러 장해를 일으키지만, 이 단계에서는 현재 유효한 치료법은 없다. 따라서, 간장의 기능이 악화되기 전에 가능한 한 빨리 증상의 진행을 검출하여, 인터페론 투여 등의 치료 등을 하는 것이 필요하다.그러나, 각종의 간장해를 정확하고도 신속하게 특정하는 방법은 아직 확립되어 있지 않은 것이 현상황이다.

일반적으로 간장질환이 의심되면, 문진, 시진, 촉진과 함께 혈중의 아스파라긴 아미노트란스페라제(AST), 알라닌 아미노트란스페라제(ALT), γ-글루타민산 피루빈산 트란스아미나제(GPT), 알칼리포스파타제(ALP), 코린에스테라제(ChE), 빌리루빈 등의 간기능 마커를 측정한다. 이들 생화학 검사치에 이상이 있었을 경우에는 B형이나 C형 간염 바이러스 검사, 초음파 검사, X선, CT 등의 화상검사가 이루어진다. 암의 판정에서는 혈중의 α-페트프로테인(AFP), 이상 프로트론빈(PIVKA-II), 암태아성 항원(CEA) 등의 단백질의 종양마커를 측정한다. 또한, 정확한 판정이 필요한 경우에는 복강경 검사나 간생검(1주간 정도의 입원이 필요)을 한다(비특허문헌 1).

이와 같이 간장병을 특정하려면 많은 검사를 받아야 하고, 판정이 나오기까지 몇일이나 소비한다. 또 복강경 검사나 간생검은 환자를 위험에 노출시키고, 육체적인 고통을 준다. 복강경 검사나 간생검은 환자의 부담이 크기 때문에, 병태의 체크 등을 위하여 빈번히 실시할 수 없다. 또한, 종래법에서는 많은 검사나 판정은 전문가가 아니면 할 수 없어, 부족한 의료 관계자에게 부담을 강요한다. 따라서, 환자에게 부담이 가지 않고, 신속하며 정확하고도 간편한 간장질환의 판정법이 강하게 소망되고 있다.

간염, 간경변, 간암 등 많은 간장해는 활성산소의 생성(산화 스트레스)과 그것을 제거하는 생체의 방어 시스템의 파탄에 의하여 야기되는 것이 알려져 있다(비특허문헌 2). 활성산소 등의 산화 스트레스에 대한 생체의 방어의 주요한 하나로, 글루타티온 시스템에 의한 것이 있다. 조직에 가장 고농도로 존재하는 항산화물질로서 환원형 글루타티온(GSH：이하 글루타티온)이 있고, 활성산소나 친전자 물질에 글루타티온이 포합되는 것에 의하여 이들 물질은 환원되어, 산화 스트레스는 억제된다.

그러나, 글루타티온이 감소하면 조직이나 세포는 산화 스트레스에 노출되어, 여러 병태를 야기한다(비특허문헌 3). 실제로 간장해에서도 B형이나 C형의 간염 바이러스의 감염에 의해, 산화 스트레스가 항진하여 글루타티온이 감소하는 것이나, C형 간염, 간경변, 간암환자나 마우스에서 글루타티온이 감소하는 것이 보고되고 있다(비특허문헌 2, 4).

약물의 복용에 의하여 유발되는 약제성 간장해도 산화 스트레스에 의하여 야기 된다. 해열진통약인 아세트아미노펜(APAP)은 간장에서 대사되어 독성이 높은 친전자 물질 N-아세틸벤조퀴논이민(NAQPI)을 생성시킨다. 이 NAQPI는 간장에 고농도로 존재하는 글루타티온(GSH)이 포합하는 것에 의하여 해독, 배설된다. 그러나, 친전자 물질이 대량으로 존재하는 경우에는 글루타티온이 고갈되고, 친전자 물질이 세포 내에 축적되어(산화 스트레스), 생체 고분자와 반응한다. 그 결과, 세포의 기능이 교란되어 약제성 간장해 등의 병태를 야기하는 것이 알려져 있다.

지금까지 발명자들은 마우스에 APAP를 대량으로 투여하면, APAP의 대사에 의하여 생성된 친전자 물질 NAQPI를 해독하기 위하여 글루타티온이 감소하고, 반비례 하여 오프탈민산이 급증하는 것(도 1(B) 참조), 간장 및 혈중의 오프탈민산의 증가는 친전자 물질에 의하여 간장의 글루타티온이 고갈한 것을 나타낸다는 것을 발견하였다(특허문헌 1, 비특허문헌 5).

그 기작은 이하와 같다. 도 1에서 나타내듯이, 글루타티온(γ-Glu-Cys-Gly)과 오프탈민산(γ-Glu-2AB-Gly)은 같은 두 개의 효소 γ-글루타밀시스테인 합성효소와 글루타티온 합성효소에 의하여 생합성되는 트리펩티드이고, 기질(출발물질)이 시스테인(Cys)인지, 2-아미노부티르산(2AB)인지의 차이이다. 도 1(A)에서 나타내는 통상의 환원상태에서는 간장 내에 글루타티온이 대량으로 존재하고, 최초의 효소 γ-글루타밀시스테인 합성효소가 피드백(FB) 저해되고 있다.

따라서, 오프탈민산은 거의 생합성 되지 않는다. 그러나, 도 1(B)에서 나타내는 산화상태처럼, 친전자 물질이나 활성산소종이 존재하면, 해독을 위하여 글루타티온이 소비된다. 글루타티온의 감소에 의하여 피드백 저해가 해제되고, γ-글루타밀시스테인 합성효소가 활성화하여, 글루타티온과 오프탈민산이 생합성 된다. 오프탈민산은 간장내에 축적되고, 혈중에도 배설된다. 이와 같이 친전자 물질 등에 의하여 산화상태가 되면 간장이나 혈액의 오프탈민산이 증가하기 때문에, 오프탈민산은 산화 스트레스의 바이오 마커가 된다.

또, 비만에 의하여 내장지방이 증가하면 문제가 되는 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease：NAFLD)에 있어서, 산화 스트레스 마커인 혈청 티오레드키신(TRX)이, 간경변에서 간암으로 진행하는 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis：NASH)과 양호하게 진행되는 단순 지방간(simple steatosis：SS)의 식별에 유용한 것도 보고되고 있다(비특허문헌 6).　

한편, 캐필러리 전기영동-질량분석장치(CEMS)에 의한 시료 중의 대사물질측정법에 따른 세포 내 대사물질의 망라적인 측정방법(예를 들면, 비특허문헌 7~9 참조)은, 인간 또는 동물의 신체상태를 모니터링 하기 위하여 당해 인간 또는 동물의 신체유래의 액체샘플의 저분자화합물(대사물질) 패턴 및/또는 펩티드 패턴을 정성적이고/또는 정량적으로 결정하는 방법이며, 여기서, 당해 액체샘플의 대사물질 및 펩티드는 캐필러리 전기영동에 의하여 분리되고 이어서 직접 이온화되며 그리고 온라인으로 인터페이스를 개입시켜, 접속된 질량분석계에서 검출된다. 장기간에 걸쳐서 당해 인간 또는 동물의 신체상태를 모니터링 하기 위하여, 당해 상태를 나타내는 참조값 및 샘플값, 및 당해 값으로부터 도출된 편차 및 대응은 자동적으로 데이타베이스에 기억된다. 캐필러리 전기영동과 질량분석을 조합시켜 음이온성 화합물을 분리분석하는 경우는, 캐필러리의 내표면이 미리 양이온성으로 코팅된 코팅 캐필러리를 사용하고, 전기 침투류를 반전하는 것을 특징으로 하는 음이온성 화합물의 분리분석방법(예를 들면, 특허문헌 2 참조)이 알려져 있다.

일본국 특개 2007-192746호 공보 일본국 특허 제3341765호 공보

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그러나, 종래는 약제성 간장해(drug induced liver injury：DI), 무증상 B형 간염 보균자(asymptomatic hepatitis B carrier：AHB), 만성 B형 간염(chronic hepatitis B：CHB), C형 간염 바이러스 보균자에서 ALT의 값이 정상적인 HCV 양성 ALT 지속 정상자(hepatitis C with persistently normal ALT：CNALT), 만성 C형 간염(chronic hepatitis C：CHC), C형 간경변(cirrhosis type C：CIR), 간암(hepatocellular carcinoma：HCC), 비알코올성 지방간염(NASH), 단순 지방간(SS) 등을 1회의 검사로 식별하여 특정하는 것은 곤란하였다.

본 발명은 상기 종래의 문제점을 해소하기 위하여 이루어진 것으로, 혈액 중의 저분자 바이오 마커를 측정하는 것에 의하여 약제성 간장해(DI), 무증상 B형 간염 보균자(AHB), 만성 B형 간염(CHB), HCV양성 ALT지속 정상자(CNALT), 만성 C형 간염(CHC), C형 간경변(CIR), 간암(HCC), 비알코올성 지방간염(NASH), 단순 지방간(SS) 등의 간장질환을 신속히 특정 가능하게 하는 것을 과제로 한다.

상술한 바와 같이 간염, 간경변, 간암 등 많은 간장해는 산화 스트레스와 깊은 관계가 있기 때문에, 각 간장해에서 오프탈민산 농도가 변동하는 것이 예상되었다. 여기서, 정상인(C), 약제성 간장해(DI), 무증상 B형 간염 보균자(AHB), 만성 B형 간염(CHB), HCV양성 ALT지속 정상자(CNALT), 만성 C형 간염(CHC), C형 간경변(CIR), 간암(HCC), 비알코올성 지방간염(NASH), 단순 지방간(SS)의 환자로부터 혈액을 채취하여 혈청 중의 오프탈민산을 측정하였다. 그러나, 마우스와는 다르게 정상인(C)이나 약제성 간장해(DI) 환자에게서 오프탈민산은 거의 검출되지 않았다.(마우스 혈청 중의 오프탈민산의 농도는 약 2μM였지만, 인간 혈청 중의 농도는 약 1/20 정도이며, 정상인(C)이나 약제성 간장해(DI) 환자에서는 거의 검출되지 않았다.)

그러나, 발명자들은 각 간염 환자의 혈청 중에서 현저히 증가하는 물질을 발견하고, 그것들이 γ-Glu-X 펩티드류(주：X는 아미노산 또는 아민을 나타낸다)인 것을 정하였다. 도 2에, 각종 간장해 환자에서 γ-Glu-X 펩티드류가 생합성 되는 메카니즘을 모식적으로 나타낸다. 또한, 혈청 중의 간기능 마커인 AST와 ALT의 값과 γ-Glu-X 펩티드류를 사용하여 다중 로지스틱 회귀(MLR) 모델에 의한 다변량 해석을 실시하여 각종의 간염 환자를 다른 것과 구별하는 것에 성공하였다.

본발견에 의하여, 혈액 중의 γ-Glu-X 펩티드류의 농도나 AST, ALT의 값을 측정함으로써 정상인(C), 약제성 간장해(DI), 무증상 B형 간염 보균자(AHB), 만성 B형 간염(CHB), HCV양성 ALT지속 정상자(CNALT), 만성 C형 간염(CHC), C형 간경변(CIR), 간암(HCC), 단순 지방간(SS), 비알코올성 지방간염(NASH) 등의 간장질환을 신속히 특정하는 것이 가능하게 되었다.

본 발명은 상기 지견에 근거하여 이루어진 것으로, 포유동물 조직중의 산화 스트레스를 검출하기 위한 마커이며, 복수의 γ-Glu-X(X는 아미노산 또는 아민) 펩티드의 조합인 것을 특징으로 하는 간장질환 마커이다. 여기서, 복수의 γ-Glu-X(X는 아미노산 또는 아민) 펩티드의 조합은 다중 로지스틱 회귀(MLR) 분석에 의하여 선택할 수 있다. 추가로, 글루코사민, 메티오닌술폭시드, AST, ALT 중에서 적어도 하나를 포함할 수 있다.

또, 상기의 간장질환 마커이며, 후출표 2에서 명확한 것처럼 적어도 Glucosamine(글루코사민), γ-Glu-Ala, Methionine　sulfoxide(메티오닌술폭시드),γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, AST, ALT, γ-Glu-Phe, γ-Glu-Met, γ-Glu-Gln를 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는 정상인(C) 식별용 간장질환 마커이다.

또, 상기의 간장질환 마커이며, 뒤에 나오는 표 2에서 명확한 것처럼 오즈비가 1에 가까운 AST 및 ALT를 제외한, 적어도 γ-Glu-Taurine(타우린), γ-Glu-Leu, γ-Glu-Glu, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Arg, γ-Glu-Ser, γ-Glu-Phe, γ-Glu-Met, γ-Glu-Citrulline(시트룰린)을 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는 약제성 간장해(DI) 식별용 간장질환 마커이다. 또한, AST, ALT 중에서 적어도 1개를 추가하여 정도(精度)를 높일 수 있다.

또, 상기의 간장질환 마커이며, 뒤에 나오는 표 2에서 명확한 것처럼 오즈비가 1에 가까운 ALT를 제외한, 적어도γ-Glu-Taurine(타우린), γ-Glu-Ala, γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, AST, γ-Glu-Lys, γ-Glu-Arg, γ-Glu-Met, γ-Glu-Gln을 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는 무증상 B형 간염 보균자(AHB) 식별용 간장질환 마커이다. 또한, ALT를 추가하여 정도를 높일 수 있다.

또, 상기의 간장질환 마커이며, 뒤에 나오는 표 3에서 명확한 것처럼 적어도 γ-Glu-Ala, Methionine　sulfoxide(메티오닌술폭시드), γ-Glu-Leu, γ-Glu-Glu, AST, ALT, γ-Glu-Arg, γ-Glu-Ser, γ-Glu-His, γ-Glu-Phe, γ-Glu-Met, γ-Glu-Citrulline(시트룰린)을 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는 만성 B형 간염(CHB) 식별용 간장질환 마커이다.

또, 상기의 간장질환 마커이며, 뒤에 나오는 표 3에서 명확한 것처럼 오즈비가 1에 가까운 ALT를 제외한, 적어도 Glucosamine(글루코사민), γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, AST, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Gln, γ-Glu-Citrulline(시트룰린)을 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는 HCV양성 ALT지속 정상자(CNALT) 식별용 간장질환 마커이다. 또한, ALT를 추가하여 정도를 높일 수 있다.

또, 상기의 간장질환 마커이며, 뒤에 나오는 표 3에서 명확한 것처럼 오즈비가 1에 가까운 Methionine　sulfoxide(메티오닌술폭시드)와 ALT를 제외한, 적어도 Glucosamine(글루코사민), γ-Glu-Lys, γ-Glu-His를 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는 만성 C형 간염(CHC) 식별용 간장질환 마커이다. 또한, Methionine　sulfoxide(메티오닌술폭시드) 및/또는 ALT를 추가하여 정도를 높일 수 있다.

또, 상기의 간장질환 마커이며, 뒤에 나오는 표 4에서 명확한 것처럼 오즈비가 1에 가까운 AST와 ALT를 제외한, 적어도 Glucosamine(글루코사민), Methionine　sulfoxide(메티오닌술폭시드), γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, γ-Glu-Glu, γ-Glu-Gly,γ-Glu-Met, γ-Glu-Gln, γ-Glu-Citrulline(시트룰린)을 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는 C형 간경변(CIR) 식별용 간장질환 마커이다. 또한, AST 및/또는 ALT를 추가하여 정도를 높일 수 있다.

또, 상기의 간장질환 마커이며, 뒤에 나오는 표 4에서 명확한 것처럼 오즈비가 1에 가까운 Methionine　sulfoxide(메티오닌술폭시드), AST 및 ALT를 제외한, 적어도 γ-Glu-타우린, γ-Glu-Glu, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Ser, γ-Glu-Citrulline(시트룰린)을 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는 간암(HCC) 식별용 간장질환 마커이다. 또한, Methionine　sulfoxide(메티오닌술폭시드), AST, ALT의 적어도 1개를 추가하여 정도를 높일 수 있다.

또, 상기의 간장질환 마커이며, 뒤에 나오는 표 4에서 명확한 것처럼 적어도γ-Glu-Taurine(타우린), γ-Glu-Ala, γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, γ-Glu-Glu, AST, ALT, γ-Glu-Thr, γ-Glu-Gln을 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는 단순 지방간(SS) 식별용 간장질환 마커이다.

또, 상기의 간장질환 마커이며, 뒤에 나오는 표 4에서 명확한 것처럼 오즈비가 1에 가까운 AST와 ALT를 제외한, 적어도 Glucosamine(글루코사민), γ-Glu-Ala, γ-Glu-Val, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Gln, γ-Glu-Citrulline(시트룰린)를 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는 비알코올성 지방간염 식별용 간장질환 마커이다. 또한, AST 및/또는 ALT를 추가하여 정도를 높일 수 있다.

본 발명은, 또, 간장질환 마커로서 샘플 중의 복수의 γ-Glu-X(X는 아미노산 또는 아민) 펩티드의 조합을 측정하는 것을 특징으로 하는 간장질환 마커 측정 방법이다.

또, 샘플에서 분석에 적절한 시료를 작성하는 수단과, 시료 중의 복수의 γ-Glu-X(X는 아미노산 또는 아민) 펩티드의 조합을 간장질환 마커로서 측정하기 위한 분석수단을 구비한 것을 특징으로 하는 간장질환 마커의 측정장치이다.

또, 의약품의 투여 전 및 투여 후에 채취된 혈액에 있어서, 상기 어느 하나의 간장질환 마커의 농도를 측정하는 공정과 상기 측정의 결과를 상기 의약품의 투여 전의 혈액과 투여 후의 혈액으로 비교하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약품의 검정방법이다.

또, 의약품이 투여된 1 이상의 개체로부터 이루어지는 제1군으로부터 채취된 혈액 및 상기 의약품을 투여하지 않은 1 이상의 개체로부터 이루어지는 제2군으로부터 채취된 혈액에 대하여, 상기 어느 하나의 간장질환 마커의 농도를 측정하는 공정과 제1군과 제2군과의 사이에서 측정된 상기 간장질환 마커의 농도를 비교하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약품의 검정방법이다.

또, 본 발명에 관한 간장질환의 진단방법은, 진단대상인 1 이상의 개체로부터 채혈하는 공정과, 상기 어느 하나의 측정방법에 따라 채혈한 혈액에서의 본 발명에 관한 마커의 농도를 측정하는 공정과 그 마커의 농도를 1 이상의 정상개체의 혈액에서의 마커농도와 비교하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 관한 의약품의 친전자성의 독성 부작용(의약품을 투여했을 경우에 발생하는 산화 스트레스)의 진단방법은 의약품 투여 전과 의약품 투여 후의 개체로부터 채혈하는 공정과, 상기 어느 하나의 측정 방법에 의하여 채혈한 혈액에서의 본 발명에 관한 마커의 농도를 측정하는 공정과 그 마커의 농도를 1 이상의 정상 개체의 혈액에서의 마커농도와 비교하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 의약품은 어떤 종류라도 좋다.

여기서, 마커의 농도를 측정하는 공정은 개체로부터 채취한 혈액을 개별적으로 측정하는 것도, 복수의 개체로부터 채취한 혈액풀을 측정하는 것도 포함한다. 또, 측정된 마커의 농도를 비교하는 공정은, 각 측정에서 얻어진 농도를 하나씩 비교하는 것도, 각 측정에서 얻어진 농도의 적산치 혹은 평균치를 비교하는 것도 포함한다.

조직중의 산화 스트레스를 검출하기 위하여 마커를 사용할 수 있는 포유동물은, 조직에서의 산화 스트레스에 따라 혈중에서 본 발명에 관한 마커를 측정할 수 있는 포유류라면 제한은 없고, 인간인 것이 바람직하다.

이 진단방법에 사용되는 혈액을 채취하는 포유동물은 특별히 제한이 없지만, 상기 마커 중 적어도 하나가 그 혈액 중에 존재하는 포유동물인 것이 바람직하고, 마우스나 래트 등의 설치류나 인간, 원숭이, 개인 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 의하면 혈액 중의 γ-Glu-X 펩티드류의 농도나 AST, ALT의 값 등을 측정하는 것에 의하여, 정상인(C), 약제성 간장해(DI), 무증상 B형 간염 보균자(AHB), 만성 B형 간염(CHB), HCV 양성 ALT 지속 정상자(CNALT), 만성 C형 간염(CHC), C형 간경변(CIR), 간암(HCC), 비알코올성 지방간염(NASH), 단순 지방간(SS) 등의 간장질환을 신속히 특정하는 것이 가능해진다.

[도 1] 친전자 물질과 활성산소(산화 스트레스)에 의하여 오프탈민산이 생합성되는 메카니즘을 모식적으로 나타내는 도
[도 2] 각종 간장해 환자에서 γ-Glu-X 펩티드류가 생합성 되는 메카니즘을 모식적으로 나타내는 도
[도 3] 정상인(C)과 간암(HCC) 환자의 혈청 중의 γ-Glu-X(X는 아미노산 또는 아민) 펩티드류의 LC-MS 측정결과를 비교하여 나타내는 도
[도 4] 정상인(C)과 무증상 B형 간염 보균자(AHB) 환자의 혈청 중의 γ-Glu-X 펩티드류의 LC-MS 측정결과를 비교하여 나타내는 도
[도 5] 단순 지방간(SS) 환자와 비알코올성 지방간염(NASH) 환자의 혈청 중의 γ-Glu-X 펩티드류의 LC-MS 측정결과를 비교하여 나타내는 도
[도 6] 정상인, 각 간염 환자의 혈청 중의 AST, ALT,γ-Glu-X 펩티드류의 측정결과를 비교하여 나타내는 도
[도 7] 다중 로지스틱 회귀(MLR) 모델의 개발과 평가의 일례의 순서를 나타내는 흐름도
[도 8] AST, ALT, γ-Glu-X 펩티드류에 의한 정상인의 스크리닝 검사의 정도를 나타내는 도
[도 9] 마찬가지로 약제성 간장해(DI)의 스크리닝 검사의 정도를 나타내는 도
[도 10] 마찬가지로 무증상 B형 간염 보균자(AHB)의 스크리닝 검사의 정도를 나타내는 도
[도 11] 마찬가지로 만성 B형 간염(CHB)의 스크리닝 검사의 정도를 나타내는 도
[도 12] 마찬가지로 C형 간염 바이러스 보균자에서 ALT의 값이 정상적인 HCV 양성 ALT지속 정상자(CNALT)의 스크리닝 검사의 정도를 나타내는 도
[도 13] 마찬가지로 만성 C형 간염(CHC)의 스크리닝 검사의 정도를 나타내는 도
[도 14] 마찬가지로 C형 간경변(CIR)의 스크리닝 검사의 정도를 나타내는 도
[도 15] 마찬가지로 간암(HCC)의 스크리닝 검사의 정도를 나타내는 도
[도 16] 마찬가지로 단순 지방간(SS)의 스크리닝 검사의 정도를 나타내는 도
[도 17] 마찬가지로 비알코올성 지방간염(NASH)의 스크리닝 검사의 정도를 나타내는 도
[도 18] 간암(HCC) 환자와 위암(gastric cancer：GC) 환자의 혈청 중의 γ-Glu-X 펩티드류의 농도를 비교하여 나타내는 도
[도 19] 간암(HCC) 환자를 만성 C형 간염(CHC) 환자나 C형 간경변(CIR) 환자로부터 구별하기 위한 AFP와 MLR의 박스 플롯과 수신자 동작 특성(receiver operating curve：ROC) 곡선을 나타내는 도
[도 20] 부티오닌술폭시민(buthionine sulfoximine：BSO), 말레인산디에틸(Diethylmaleate：DEM) 투여 마우스의 간장의 γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly의 정량결과를 나타내는 도
[도 21] 마찬가지로 APAP 투여 마우스의 간장의γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly의 정량결과를 나타내는 도
[도 22] 마찬가지로 APAP 투여 마우스 혈청 중의γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly의 정량결과를 나타내는 도
[도 23] 정상인(C), C형 간경변(CIR), 단순 지방간(SS), 비알코올성 지방간염(NASH) 환자의 데이터의 일부를 나타내는 도
[도 24] 마찬가지로 정상인(C), C형 간경변(CIR), 단순 지방간(SS), 비알코올성 지방간염(NASH) 환자의 데이터의 다른 일부를 나타내는 도
[도 25] 마찬가지로 정상인(C), C형 간경변(CIR), 단순 지방간(SS), 비알코올성 지방간염(NASH) 환자의 데이터의 더욱 다른 일부를 나타내는 도
[도 26] 마찬가지로 정상인(C), C형 간경변(CIR), 단순 지방간(SS), 비알코올성 지방간염(NASH) 환자의 데이터의 나머지를 나타내는 도

이하, 본 발명의 실시 형태를 상세하게 설명한다.

상술한 바와 같이, 간염, 간경변, 간암 등 많은 간장해는, 산화 스트레스와 깊은 관계가 있는 것이 알려져 있다. 여기서, 정상인(C) 53명, 약제성 간장해(DI) 10명, 무증상 B형 간염 보균자(AHB) 9명, 만성 B형 간염(CHB) 7명, HCV 양성 ALT 지속 정상자(CNALT) 10명, 만성 C형 간염(CHC) 24명, C형 간경변(CIR) 10명, 간암(HCC) 19명, 비알코올성 지방간염(NASH) 11명, 단순 지방간(SS) 9명의 혈청을 측정하고, 캐필러리 전기영동-비행시간형 질량 분석계(CE-TOFMS) 법을 이용하여 오프탈민산 농도를 측정하였다. 그러나, 그 밖의 물질이 각 간염 환자에서 우위로 증가하고 있는 것을 발견하고, 이들은 모두 γ-Glu-X 펩티드류(주：X는 아미노산 또는 아민을 나타낸다)인 것을 특정하였다.

1.혈청으로부터 대사 물질의 추출

정상인 및 각종 간염 환자로부터 채취한 혈청(100μl)을 표준물질이 들어있는 메탄올 900μl에 넣어 효소를 실활시키고, 대사의 항진을 멈추었다. 400μl의 초순수, 1000μl의 클로로포름을 첨가한 후, 4℃에서 5분간, 4600g로 원심하였다. 정치 후, 분리한 물-메탄올상 750μl를 분획분자량 5kDa의 원심 한외여과필터에 통과시켜 제단백하였다. 여과액을 동결건조 후, Milli-Q수 50μl를 첨가하여 그것을 CE-TOFMS 및 LC-MS 측정에 제공하였다.

2.캐필러리 전기영동-질량분석장치(CE-TOFMS)에 의한 혈청 중의 대사물 측정

CE-TOFMS를 사용하여 정상인 및 간염 환자의 혈청 중의 저분자 대사산물을 일제히 측정하였다.

CE-TOFMS 분석 조건

a.캐필러리 전기영동(CE)의 분석조건

캐필러리로는 퓨즈드 실리카 캐필러리(내경 50μm, 외경 350μm, 전체 길이 100cm)를 사용하였다. 완충액으로는 1M 개미산(pH 약 1.8)을 사용하였다. 인가전압은 ＋30kV, 캐필러리 온도는 20℃로 측정하였다. 시료는 가압법을 사용하여 50 mbar로 3초간(약 3nl) 주입하였다.

b.비행시간형 질량 분석계(TOFMS)의 분석조건

정이온 모드를 사용하고, 이온화 전압은 4kV, 플래그먼트 전압은 75V, 스키머 전압은 50V, OctRFV 전압은 125V로 설정하였다. 건조가스로는 질소를 사용하고, 온도 300℃, 압력 10psig로 설정하였다. 시스액은 50% 메탄올 용액을 사용하고, 질량교정용으로 레제르핀(m/z　609.2807)을 0.5μM가 되도록 혼입하여 10μl/min로 송액하였다. 레제르핀(m/z　609.2807)과 메탄올의 어덕트 이온(m/z　83.0703)의 질량수를 사용하여 얻어진 모든 데이터를 자동교정하였다.

3.액체 크로마토그래피-질량분석장치(LC-MSMS)에 의한 혈청 중의 γ-Glu-X 펩티드류 측정

고감도로 측정하기 때문에, 혈청 중의 γ-Glu-X 펩티드류는 LC-MSMS를 사용하여 측정하였다.

a.액체 크로마토그래피(LC)의 분석 조건

분리칼럼으로는 노무라 화학(Nomura Chemical Co.)사제 Develosil RPAQUEOUS-AR-3(내경 2mm×길이 100mm, 3μm)을 사용하고, 칼럼오븐은 30℃로 설정하였다. 시료는 1μl주입하였다. 이동상 A에는 0.5% 개미산, B에는 아세트니트릴을 사용하고, B액이 0%(0min)-1%(5min)-10%(15min)-99%(17min)-99%(19min)의 유속 0.2ml/min의 구배용출법을 사용하여 γ-Glu-X 펩티드류를 분리하였다.

b.3연속 사중극형 질량분석계(QqQMS)의 분석조건

어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystem)사제 API3000 3연속 사중극형 질량분석계를 사용하여 포지티브이온 모드인 MRM 모드로 측정하였다. 각 질량분석계의 파라미터를 이하에 나타냈다.

이온 스프레이 전압：5.5kV

네뷸라이저가스 압력：12psi

커텐가스 압력：8psi

충돌가스：8unit

질소가스 온도：550℃

각 γ-Glu-X 펩티드류를 MRM(Multiple Reaction Monitering) 모드로 측정하기 위하여 최적화된 MRM 파라미터를 표 1에 나타낸다.

4.간장해 바이오 마커의 탐색 및 평가

도 3에 정상인(C)과 간암(HCC) 환자의 혈청 중의 γ-Glu-X 펩티드류를 LC-MS를 사용하여 측정한 결과를 나타내고, 도 4에 정상인(C)과 무증상 B형 간염 보균자(AHB) 환자의 혈청 중의 γ-Glu-X 펩티드류를 LC-MS를 사용하여 측정한 결과를 나타내며, 도 5에 단순 지방간(SS) 환자와 비알코올성 지방간염(NASH) 환자의 혈청 중의 γ-Glu-X 펩티드류를 LC-MS를 사용하여 측정한 결과를 나타낸다. 도 3, 도 4에 있어서, 1은 γ-Glu-Gly, 2는 γ-Glu-Ala, 3은 γ-Glu-Ser, 4는 γ-Glu-Val, 5는 γ-Glu-Thr, 6은 γ-Glu-타우린, 7은 γ-Glu-Ile, 8은 γ-Glu-Leu, 9는 γ-Glu-Asn, 10은 γ-Glu-Lys, 11은 γ-Glu-Gln, 12는 γ-Glu-Glu, 13은 γ-Glu-Met, 14는 γ-Glu-His, 15는 오프탈메이트(γ-Glu-2AB-Gly), 16은 γ-Glu-Phe, 17은 글루타티온 산화형(GSSG), 18은 γ-Glu-Tyr, 19는 γ-Glu-Glu-Gly이다. 많은 γ-Glu-X 펩티드류가 정상인(C)에 비해 간암(HCC) 환자나 무증상 B형 간염 보균자(AHB) 환자에서 증가하고 있는 것 및 단순 지방간(SS) 환자와 비알코올성 지방간염(NASH) 환자에서 차이가 있는 것이 판명되었다. 또, 다른 간장해에서도 γ-Glu-X 펩티드류의 농도는 정상인에 비해 유의적으로 높았다.

도 6에 정상인(C) 및 각종 간염 환자의 혈청 중의 AST, ALT치 및 γ-Glu-X 펩티드류의 측정결과를 나타낸다. 도 중, 화살표는 최대치, 최소치를 나타내고, 박스의 위가 순위에서 25%의 값, 박스의 아래가 순위에서 75%의 값을 나타내며, 박스속의 횡선이 중앙치를 나타낸다.

종래의 간기능 검사치인 AST, ALT치는 약제성 간장해(DI), 만성 B형 간염(CHB), 만성 C형 간염(CHC)에서는 상승했지만, 다른 간염에서는 정상인의 값과 유의적인 차이는 없었다.

그러나, γ-Glu-Ser, γ-Glu-Thr 등의 γ-Glu-X 펩티드류는 정상인(C)보다 약제성 간장해(DI)에서 높고, 다른 간염은 더욱 높은값을 나타냈다. 특히 무증상 B형 간염 보균자(AHB)나 무증상 C형 간염 보균자(AHC)나 간암(HCC)에서도, γ-Glu-X 펩티드류는 높은값을 나타냈다. 또 상세하게 보면 몇 개의 γ-Glu-X 펩티드류에서 무증상 B형 간염 보균자(AHB)보다 무증상 C형 간염 보균자(AHC)가 높거나, 무증상 B형 간염 보균자(AHB)보다 만성 B형 간염(CBC)이 높거나, 같은 C형 간염에서도 무증상(AHC), 만성 간염(CHC), 간암(HCC)으로 질환이 진행함에 따라, 값이 낮아지는 경향을 볼 수 있었다.

이와 같이, 각 질환에 따라서 AST, ALT와 각 γ-Glu-X 펩티드류의 혈중 농도가 차이나기 때문에, 이들 성분의 값을 사용하면, 각 질환을 나눌 수 있는 것은 아닐까 생각하였다. 여기서, 각 간장질환을 구별하기 위한 바이오 마커의 선정을 목적으로 다변량 해석방법의 다중 로지스틱 회귀(MLR) 분석을 실시하였다. 결과를 표 2~표 4에 나타낸다.

다중 로지스틱 회귀(MLR) 분석에서는 목적변수인 비율 p에 대하여 k개의 설명변수 x₁, x₂, x₃,…, x_k를 사용하고,

　　ln(p/1-p)=b₀＋b₁x₁＋b₂x₂＋b₃x₃＋ … ＋b_kx_k　　···(1)

이라는 p의 회귀식을 구하지만, 표 2~표 4 중의 파라미터의 값이 (1)식의 b₀, b₁,…b_k에 들어가는 구체적인 값이 된다. (절편)은 정수항(b₀)의 값을 가르킨다.

또, 증례마다 확률을 계산할 때는, 예를 들면 약제성 간장해(DI)의 그룹에서는 표 중의 (절편)의 값 -4.12를 b₀, γ-Glu-Taurine(타우린)의 값 2.34를 b₁, γ-Glu-Leu의 값 17.9를 b₂, γ-Glu-Glu의 값 0.322를 b₃, AST의 값 -0.0346을 b₄, ALT의 값 0.0521을 b₅, γ-Glu-Gly의 값 0.110을 b₆, γ-Glu-Arg의 값 3.57을 b₇,γ-Glu-Ser의 값 1.25를 b₈, γ-Glu-Phe의 값 7.94를 b₉, γ-Glu-Met의 값 10.9를 b₁₀, γ-Glu-Citrulline(시트룰린)의 값 -6.21을 b₁₁로 하고, γ-Glu-Taurine(타우린)의 정량치를 x₁, γ-Glu-Leu의 정량치를 x₂, γ-Glu-Glu의 정량치를 x₃, AST의 정량치를 x₄, ALT의 정량치를 x₅, γ-Glu-Gly의 정량치를 x₆, γ-Glu-Arg의 정량치를 x₇, γ-Glu-Ser의 정량치를 x₈, γ-Glu-Phe의 정량치를 x₉, γ-Glu-Met의 정량치를 x₁₀, γ-Glu-Citrulline의 정량치를 x₁₁에 대입하여 구체적인 값을 낸다. 추정한 파라미터의 표준오차 및 95% 신뢰구간도 표 중에 나타낸다.

이 해석결과로부터, 정상인(C)도 포함하여 많은 종류의 간염 환자를 선택적으로 구별할 수 있는 바이오 마커 후보가 발견되었다. 예를 들면, 정상인(C)을 식별하는 바이오 마커는 Glucosamine(글루코사민), γ-Glu-Ala, Methionine sulfoxide(메티오닌술폭시드), γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, AST, ALT, γ-Glu-Phe, γ-Glu-Met, γ-Glu-Gln이고, 이들 값에 의하여 다른 간장질환과 구별할 수 있다는 것이 판명되었다. 이 중에서도, 정량치 x₁이 1 증가했을 경우에 확률 p가 얼마나 변화하는지를 나타내는 오즈비가 1을 넘어, 가장 큰 γ-Glu-Met의 값이 정상인(C)의 판정에 가장 기여하고 있다. 한편, 오즈비가 0인 γ-Glu-Leu, γ-Glu-Phe는 이들 물질의 증가가 정상인 이외(비 C)로 판정하는 것에 기여하고 있다. 또, 도 6으로부터 γ-Glu-Ala, γ-Glu-Thr, γ-Glu-시트룰린, 메티오닌술폭시드를 사용할 수도 있는 것을 알 수 있다.

또, 약제성 간장해(DI)의 바이오 마커는 γ-Glu-Taurine, γ-Glu-Leu, γ-Glu-Glu, AST, ALT, γ-Glu-Gly, γGlu-Arg, γ-Glu-Ser, γ-Glu-Phe, γ-Glu-Met,γ-Glu-Citrulline이며, 이들을 조합하여, 예를 들면 다중 로지스틱 회귀(MLR) 분석하여, 맨-휘트니 시험의 p의 값이 소정값, 예를 들면 0.5보다 큰 것에 의하여 다른 간장질환과 구별할 수 있다. 이 중에서도, 정량치 x₁이 1 증가했을 경우에 확률 p가 얼마나 변화하는지를 나타내는 오즈비가 1을 넘어, 가장 큰 γ-Glu-Met의 값이 약제성 간장해(DI)의 판정에 가장 기여하고 있다. 한편, 오즈비가 0에 가까운 γ-Glu-시트룰린은 그 물질의 증가가, 정상인(C)으로 판정하는 것에 기여하고 있다. AST와 ALT는 오즈비가 각각 0.96599, 1.05346로, 변수에 증가를 수반하는 p의 변화가 없는 1.0에 가깝기 때문에 기여가 작아, 생략할 수도 있다.

또, 간암(HCC)의 바이오 마커는 γ-Glu-Taurine(타우린), Methionine　sulfoxide(메티오닌술폭시드), γ-Glu-Glu, AST, ALT, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Ser, γ-Glu-Citrulline(시트룰린)이며, 이들을 조합하여, 예를 들면 다중 로지스틱 회귀(MLR) 분석하고, p의 값이 소정값, 예를 들면 0.5보다 큰 것에 의하여 다른 간장질환과 구별할 수 있다. 이 중에서도 오즈비가 1을 넘어, 가장 큰 γ-Glu-시트룰린의 값이 간암(HCC)의 판정에 가장 기여하고 있다. 한편, 오즈비가 0에 가까운 γ-Glu-Glu는 이 물질의 증가에 따라 간암 이외(비 HCC)를 판정하는 것에 기여하고 있다. 또, 오즈비가 1에 가까운 메티오닌술폭시드, AST, ALT는 생략할 수도 있다.

마찬가지로, 다른 질환에 대해서도 표 2~표 4에 나타낸 각각의 바이오 마커 후보가 발견되었다.

무증상 B형 간염 보균자(AHB)는 γ-Glu-Taurine(타우린), γ-Glu-Ala, γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, AST, ALT, γ-Glu-Lys, γ-Glu-Arg, γ-Glu-Met, γ-Glu-Gln이고, 만성 B형 간염(CHB)은 γ-Glu-Ala, Methionine　sulfoxide(메티오닌술폭시드), γ-Glu-Leu, γ-Glu-Glu, AST, ALT, γ-Glu-Arg, γ-Glu-Ser, γ-Glu-His, γ-Glu-Phe, γ-Glu-Met, γ-Glu-Citrulline(시트룰린)이며, HCV 양성 ALT 지속 정상자(CNALT)는 Glucosamine(글루코사민), γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, AST, ALT, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Gln, γ-Glu-Citrulline(시트룰린)이고, 만성 C형 간염(CHC)은 Glucosamine(글루코사민), Methionine　sulfoxide(메티오닌술폭시드), ALT, γ-Glu-Lys, γ-Glu-His이며, C형 간경변(CIR)은 Glucosamine(글루코사민), Methionine　sulfoxide(메티오닌술폭시드), γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, γ-Glu-Glu, AST, ALT, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Met, γ-Glu-Gln, γ-Glu-Citrulline(시트룰린)이고, 단순 지방간(SS)은 γ-Glu-Taurine(타우린), γ-Glu-Ala, γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, γ-Glu-Glu, AST, ALT, γ-Glu-Thr, γ-Glu-Gln이며, 비알코올성 지방간염(NASH)은 Glucosamine(글루코사민), γ-Glu-Ala, γ-Glu-Val, AST, ALT, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Gln, γ-Glu-Citrulline(시트룰린)이었다.

이 중, 오즈비가 1에 가까운 것, 예를 들면 무증상 B형 간염 보균자(AHB)를 판별할 때의 ALT(1.083254)나, HCV 양성 ALT 지속 정상자(CNALT)를 판별할 때의 ALT(0.957388), 만성 C형 간염(CHC)을 판별할 때의 메티오닌술폭시드(0.989493), ALT(0.993806), C형 간경변(CIR)을 판별할 때의 AST(1.012402), ALT(0.973926), 비알코올성 지방간염(NASH)을 판별할 때의 AST(0.949237), ALT(1.039583) 등은 생략할 수도 있다.

이들 바이오 마커의 기여율은, 증례 데이터의 추가에 의하여 모델을 재학습시키고, 각 판별로 사용하는 바이오 마커의 조합과 다중 로지스틱 회귀(MLR) 모델에서의 계수의 수정을 하며, 또한 MLR 모델의 정도를 높일 수도 있다.

도 7에 MLR 모델의 개발과 평가의 일례의 순서를 나타낸다. 바이오 마커 발견 단계에 있어서, 217개의 시료를 클러스터링 하여(스텝 100), 큰 변화를 나타내는 요소(γ-글루타밀펩티다아제, 메타보라이트, 트랜스 아미나제)를 선택하였다. 선택한 요소는 병 또는 정상인의 시료를 다른 모든 그룹으로부터 구별하기 위한 중요성에 따라, 서포트 벡터 머신-요소선택(SVMFS) 법에 의하여 그 중요도의 순위를 매겼다(스텝 102).

모델 개발 단계에 있어서, MLR 모델을 중요도의 랭크가 1위부터 N위 이내인 요소를 사용하여 개발하고, 예를 들면 142개의 트레이닝 데이터를 사용하여, 식(1)의 계수와 정수항을 결정하였다(스텝 110, 112). MLR의 예측 정도인 수신자 동작 특성(ROC) 곡선의 아래쪽 면적(area under the receiver-operating curve：AUC)이 0.8보다 크거나, N이 4가 되었을 경우(스텝 114의 판정결과 Yes), 그 모델을 최종 예측 변수로서 선택하였다.

이어서, 이 MLR 모델의 예측 정도를, 예를 들면 75개의 평가 데이터를 사용하여 평가하였다(스텝 120). MLR 모델로 트레이닝 데이터와 평가 데이터를 예측했을 때의 정도, 즉 ROC 곡선과 AUC값을 도 8~도 17에 나타낸다.

도 8~도 17중에, 어느 질환군과 다른 모든 질환군을 구별하는 다중 로지스틱 회귀(MLR) 모델의 정도를 나타냈다. 예를 들면, 약제성 간장해(DI)의 경우는 DI와 DI 이외 모든 구별을 한다. 도 8~도 17에서 나타낸 것처럼, 모든 질환에서 ROC 곡선 아래면적(area under the receiver-operating curve：AUC)은, 0.855에서 1.000이고, 이들의 바이오 마커에 의한 각 간장질환 스크리닝 검사는 고정도로 각 질환을 특정할 수 있는 것이 확인되었다. 특히, 도 8에 나타낸 정상인(C), 도 11에 나타낸 만성 B형 간염(CHB), 도 12에 나타낸 HCV 양성 ALT 지속 정상자(CNALT)는 모두 AUC=1.000으로, 본 발명법에 의하여 지극히 고정도로 특정되는 것을 알 수 있었다.

5.다른 질환에서의γ-Glu-X 펩티드의 평가

γ-Glu-X 펩티드류가 다른 질환에서도 상승하는지 확인하였다. 도 18에 간암(HCC) 환자와 위암(GC) 환자의 혈청 중의 γ-Glu-X 펩티드류의 농도를 나타냈다.위암(GC) 환자에서 γ-Glu-X 펩티드류의 농도는 정상인(C)과 동등하고, 간암(HCC) 환자와 같은 γ-Glu-X 펩티드류의 증가는 볼 수 없었다.(주-헬리코박터 파일로리의 감염이 위암의 원인이며, 헬리코박터 파일로리의 감염에 의하여 산화 스트레스는 억제된다고 하는 보고가 있다(참고 문헌 10). 위암은 산화 스트레스에 노출되지 않기 때문에, γ-Glu-X 펩티드류의 농도는 낮은 것으로 추측된다.)

도 19에, 간암(HCC) 환자(개체수 32)를 만성 C형 간염(CHC) 환자(개체수 35)나 C형 간경변(CIR) 환자(개체수 18)와 구별하기 위한 α-페토프로테인(AFP)과 MLR의 박스 플롯과 ROC 곡선을 나타낸다. MLR 모델은 γ-Glu-Ala, γ-Glu-시트룰린, γ-Glu-Thr 및 γ-Glu-Phe를 사용하고 있다. 맨-휘트니 시험에 의한 p값은 AFP, MLR 모두 0.0001 미만이었다. AFP의 박스 플롯에 있어서, HCC 그룹의 6 플롯이 플롯(＞500ng/ml)의 밖이었다. ROC 곡선 중의 값은 ROC 이하의 면적 및 그 95% 신뢰구간을 나타낸다.

또 당뇨병 환자에서도 혈중의 γ-Glu-X 펩티드류의 농도는 낮고, 혈중의 γ-Glu-X 펩티드류의 증가는 간장질환 특이적으로 관찰되었다.

6.γ-Glu-X 펩티드류의 생합성 기작의 해명

마우스를 사용하여 γ-Glu-X 펩티드류의 생합성 기작을 해명하였다. 도 2(B)에 나타낸 것처럼, 활성산소나 친전자 물질에 의한 산화 스트레스 조건하에서는, 이들 물질의 제거를 위하여 글루타티온이 고갈하고, 그에 따라 γ-글루타밀시스테인 합성효소(GCS)가 활성화되어, 각종 아미노산이 기질(출발 물질)이 되고, γ-Glu-X 디펩티드류나 γ-Glu-X-Gly 트리펩티드류가 생합성 되는 것이 판명되었다. 이하에 실험 순서를 나타낸다.

a.GCS 저해제 BSO 및 활성화제 DEM의 마우스에의 투여

하룻밤 절식시킨 수컷 마우스에 펜토바비탈나트륨(체중 1Kg당 60mg)을 복막내에 주사하여 마취 후, γ-글루타밀시스테인 합성효소(GCS) 저해제인 BSO, 친전자 물질(GCS 활성화제)인 DEM, 또한 건상으로서 생리 식염수를 체중 1Kg당 각각 4 mmol/kg(BSO 888mg, DEM 688mg)을 복강내에 주사하였다. 투여 1시간 후에 마우스에서 간장(약 300mg)을 채취하였다(각 5회).

b.간장에서 대사물질의 추출

마우스에서 적출한 간장(약 300mg)은 즉시 내부표준물질이 들어있는 메탄올 1ml에 넣어 동질화하고 효소를 실활시켜, 대사의 항진을 멈추었다. 500μl의 순수를 첨가한 후, 300μl의 용액을 꺼내어 200μl의 클로로포름을 첨가하여 잘 교반한 후, 4℃에서 15분간, 15000rpm으로 더욱 원심하였다. 정치 후, 분리한 물-메탄올상 300μl를 분획분자량 5kDa의 원심 한외여과 필터에 통과시켜 제단백 하였다. 여과액을 동결건조 후, Milli-Q수 50μl를 첨가하여 그것을 CE-TOFMS 측정에 제공하였다.

c.산화 스트레스를 나타내는 γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly 펩티드류 바이오 마커의 특정 결과

생리 식염수(건상), BSO, DEM 투여 후의 마우스의 간장 및 혈청 중의 아미노산, γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly 펩티드류의 측정결과의 일부를 도 20~도 22에 나타낸다. 도 20, 21은 각각의 시약을 투여한 마우스의 간장에서 검출된 아미노산(X), γ-Glu-X 펩티드, γ-Glu-X-Gly 펩티드의 정량결과, 도 22는 혈청 중의 아미노산(X), γ-Glu-X 펩티드, γ-Glu-X-Gly 펩티드의 정량결과를 나타낸다.

예를 들면, 맨 위는 Cys, γ-Glu-Cys, γ-Glu-Cys-Gly(글루타티온)의 결과이다. 간장 중의 글루타티온량은 건상과 비교하여, BSO, DEM 투여 마우스에서는 급격하게 감소하였다(BSO 투여에서는 γ-글루타밀시스테인 합성효소가 저해되기 때문에 글루타티온은 감소하고, 친전자 물질 DEM 투여 마우스에서는 해독하기 위하여 소비되므로 글루타티온은 감소한다). 혈청으로부터 글루타티온 관련물질은 검출되지 않았다.

검출된 γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly 펩티드류가, 글루타티온 생합성 경로에서 합성되고 있는 것을 이하의 방법으로 확인하였다. 도 2에 나타나는 것처럼, 이들 펩티드류가 글루타티온 생합성 경로에서 합성되면, 간장 중의 γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly 펩티드는 BSO 투여로(γ-글루타밀시스테인 합성효소가 저해되기 때문에) 정상보다 감소하고, 친전자 물질 DEM 투여로(γ-글루타밀시스테인 합성효소가 활성화되기 때문에) 증가할 것이다.

도 20에 BSO, DEM 투여 마우스의 간장의 측정결과, 도 21에 아세트아미노펜(APAP) 투여 마우스의 간장의 측정결과, 도 22에 아세트아미노펜(APAP) 투여 마우스 혈청의 측정결과를 나타낸다. 도 20~도 22과 같이, 글루타티온 관련 γ-Glu-Cys, GSH, γ-Glu-Ser-Gly 이외의 간장 중의 γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly 펩티드류 물질은 정상보다 BSO 투여로 감소하고, DEM 투여로 증가하고 있어, 확실히 글루타티온 생합성 경로에 의하여 생성되고 있는 것이 확인되었다.

즉, 이들 γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly 펩티드류는 활성산소나 친전자 물질 등의 산화 스트레스에 의하여, 글루타티온이 감소했을 때에 간장 내에서 생합성 되는 것을 알 수 있었다.

d.트레오닌 동위체에 의한 생합성 경로 추적

트레오닌(Thr)의 ¹³C, ¹⁵N의 동위체를 복강내에 더 투여하고, 친전자 물질을 발생시켜 산화 스트레스를 주는 APAP를 추가한 바, 마우스의 간장에서 Thr의 ¹³C, ¹⁵N의 γ-Glu-Thr, γ-Glu-Thr-Gly가 검출되어, 확실히 산화 스트레스 조건하에서는 Thr로부터 γ-Glu-Thr, γ-Glu-Thr-Gly가 생합성 되는 것이 확인되었다.

한편, 마우스 혈청 중의 물질에서는, 건상보다 BSO 투여로 감소하고, 전자 물질 DEM 투여로 증가하는 γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly 펩티드류는, γ-Glu-2AB와 오프탈민산(γ-Glu-2AB-Gly) 뿐이었다(도 22). 따라서 마우스의 경우는 친전자 물질 등의 산화 스트레스에 의하여, 글루타티온이 감소했을 때에 혈중에서 증가하는 것은 γ-Glu-2AB와 오프탈민산만이라고 생각할 수 있다.

그러나, 각종 간염 환자의 혈청측정에서는 γ-Glu-2AB, 오프탈민산 보다 다른 γ-Glu-X 펩티드류의 농도가 높았다. 이 차이는 생물종 사이에서 기질 농도, 대사효소의 기질 특이성이나 활성, 트랜스 포터의 종류, 기능, 발현량 등이 다르기 때문이라고 추정된다.

본 발명에 의한 혈청 중의 γ-Glu-X 펩티드류 측정에 의한 진단법은, 간경변(cirrhosis)이나 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 단순 지방간(SS), 비알코올성 지방간염(NASH) 등의 각종 간장해의 진단도 가능하다.　

도 23~도 26에, 정상인(C)과 C형 간경변(CIR) 환자, 단순 지방간(SS) 환자, 비알코올성 지방간염(NASH) 환자의 데이터를 나타내는, *표로 나타내는 p값 0.05 미만의 AST, γ-Glu-Val, γ-Glu-Leu, γ-Glu-Phe에 의하여 단순 지방간(SS)과 비알코올성 지방간염(NASH)을 식별할 수 있다는 것을 알 수 있다.

이번에는 각종 간장해의 마커후보인 AST, ALT, γ-Glu-X 펩티드류의 조합예를 적었지만, 그들에 특정되는 것은 아니고, 향후, 다검사대상 물체의 정밀조사를 더 하는 것으로, 바이오 마커 후보의 종류 조합은 변경되는 경우도 있다.

또, 이번은 혈청 중의 γ-Glu-X 펩티드류 측정에 LC-MS법을 사용했지만, 가스 크로마토그래피(GC), 액체 크로마토그래피(LC), 캐필러리 전기영동(CE), 팁 LC나, 팁 CE, 그들에 질량 분석계(MS)를 조합한 GC-MS, LC-MS, CEMS법, 각종 MS 단독의 측정법, NMR법, γ-Glu-X 펩티드류를 형광물질이나 UV흡수물질에 유도체화하고 나서 측정하는 방법, 항체를 작성하여 ELISA법 등으로 측정하는 등, 측정법에 구애받지 않고, 모든 분석법으로 측정하는 것이 가능하다.

본 발명에 관한 의약품의 검정방법은, 포유동물에서 그 의약품이 투여된 포유동물로부터 채취된 혈액과 투여되어 있지 않은 포유동물로부터 채취된 혈액에 대하여, 본 발명의 마커의 농도를 측정하는 방법이다. 또한, 이 검정방법에 사용되는 혈액을 채취하는 포유동물은 특별히 제한이 없지만, 상기 마커 중 적어도 하나가 그 혈액 중에 존재하는 포유동물인 것이 바람직하고, 마우스나 래트 등의 설치류나, 인간, 원숭이, 개인 것이 보다 바람직하다.

여기서, 의약품의 친전자 물질 독성과 활성산소(산화 스트레스)에 대한 치료약으로서의 유효성을 검정하는 경우, 의약품의 적용이 되는 대상 질병은 산화 스트레스에 의하여 발생하는 질병이면 한정되지 않고, 상술한 것과 같은 마커의 사용대상이 되는 질병과 같다. 또, 의약품의 투여에 의하여 발생하는 산화 스트레스의 강도를 검정하는 경우, 의약품의 종류는 전혀 한정되지 않고, 예를 들면, 유해약물도 의약품에 포함된다.

또한, 본 발명에 관한 검정방법의 목적은, 산화 스트레스에 의하여 생긴 질병에 대한 치료약으로서 의약품의 유효성을 검정하는 것 및 의약품의 투여에 의하여 발생하는 산화 스트레스의 강도를 검정하는 것이지만, 구체적으로는, 여러가지 국면에서 사용된다. 이하에서, 대표적인 사용예를 서술하지만, 본 발명의 검정방법은 이들 예로 한정되지 않는다.

(1) 치료약으로서의 유효성의 검정

이하에서, 간염에 대한 사용예를 서술하지만, 본 발명의 검정방법은 이들예로 한정되지 않는다.

(1-1) 특정 개체에 있어서의 약효 검정

예를 들면, 본 발명의 검정방법을 사용하여, 어떤 간염 치료약이 특정환자의 간염을 치료하는데 유효한지 여부를 판정할 수 있다. 우선, 간염에 이환한 환자에게 간염 치료약을 투여한 전후로, 그 환자로부터 혈액을 채취한다. 이어서, 그 혈액에서 간염 진단 마커의 농도를 측정한다. 이렇게 하여 얻어진 혈액 중의 마커농도를 간염 치료약의 투여 전후로 비교한다. 이 때, 간염 치료약 투여 후의 혈액 중 마커농도가, 투여전과 비교하여 유의적으로 저하되고 있으면, 간염 치료약이 그 환자의 간염을 치료하는데 유효하다라고 판단할 수 있다.

(1-2) 일반적인 약효검정

또한, 본 발명의 검정방법을 복수의 인간개체에 적용하는 것에 의하여, 그 의약품의 간염 치료약으로서의 일반적인 유효성을 검정하는 것도 가능하다.

예를 들면, 간염을 앓은 복수의 사람에서, 간염 치료약의 투여 전후로 간염 진단 마커의 농도를 비교함으로써 그 물질의 치료약으로서의 보편적 효과를 조사할 수 있다.

혹은, 다른 형태로서 2개의 군 사이에 의약품으로서의 효과를 비교하여도 좋다. 우선, 간염에 이환하고 있는 환자를 2개의 군으로 나눈다. 한 군의 환자에게는 간염 치료약을 투여하고, 또 다른 군의 환자에게는 그 치료약을 투여하지 않거나, 또는 플라시보를 투여한다. 이들 2개 군의 환자로부터 혈액을 채취한다. 이어서, 그 혈액에서 간염 진단 마커의 농도를 측정한다. 또한, 이 측정에 의하여 얻어진 혈액 중의 마커농도를 2개의 군의 사이에 비교한다.

또한, 「군」은 한 개체 밖에 포함하지 않아도 좋고, 복수의 개체를 포함해도 좋으며, 2개의 군의 개체수가 같아도, 달라도 좋다. 측정은 같은 군의 개체로부터 채취한 혈액을 모아 그 혈액중의 마커농도를 측정해도 좋지만, 각 개체의 혈액에서 각각 마커농도를 측정하는 것이 바람직하다.

의약품 투여의 전후나 투여의 유무와 같은, 복수의 혈액을 포함하는 그룹 간에서의 마커농도의 비교는, 1 혈액씩을 대상으로 하여 비교해도, 같은 그룹에 속하는 복수의 혈액에서의 마커농도의 적산치나 평균치를 그룹 간에 비교해도 좋다. 이 비교는 당업자에게 주지인 어느 통계학적 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 이와 같이 비교한 결과, 치료약의 투여 후에 있어서, 투여 전과 비교하여 혈액 중 마커농도가 유의적으로 저하되어 있거나, 치료약의 투여군에 있어서, 비투여군과 비교하여 유의적으로 저하되어 있으면, 그 치료약이 간염의 치료에 유효하다라고 판단할 수 있다. 또, 저하의 정도에 따라 어느 정도의 유효성을 가지는 지도 판단할 수 있다.

이와 같이, 간염 치료약으로서의 일반적인 유효성을 검정하는 것에 의하여, 간염 치료약의 스크리닝을 실시할 수 있다. 또, 복수의 간염 치료약을 사용하여 각 간염 치료약이 다른 농도에 대해 치료효과를 조사하여, 농도에 의존한 약효의 차이를 비교함으로써, 각 간염 치료약의 강도를 조사하는 것도 가능하다.

(2) 산화 스트레스의 강도 검정

산화 스트레스가 강하면 부작용이 강하게 나타나기 때문에, 이하에서 일례로서 의약품의 부작용에 대한 사용예를 말하지만, 본 발명의 검정방법은 이들 예에 한정되지 않는다.

(2-1) 특정 개체에 있어서의 부작용의 강도 검정

본 발명의 검정방법을 사용하여, 어떤 의약품이 특정 포유동물 개체에 부작용을 가져올지를 판정할 수 있다. 우선, 개체에 치료용의 의약품을 투여한 전후에 그 개체로부터 혈액을 채취한다. 이어서, 그 혈액에서 산화 스트레스 검출 마커의 농도를 측정한다. 이렇게 하여 얻어진 혈액 중의 마커농도를 의약품의 투여 전후로 비교한다. 이 때, 의약품 투여 후의 혈액 중 마커농도가, 투여전과 비교하여 유의적으로 증가하고 있으면, 투여한 의약품이 그 개체에서 산화 스트레스를 발생시켜 그 개체에 부작용을 가져오고 있다고 판단할 수 있다.

(2-2) 일반적인 부작용의 강도 검정

또한, 본 발명의 검정방법을 복수의 포유동물 개체에 적용하는 것에 의하여, 어느 의약품의 일반적인 부작용의 강도를 검정하는 것도 가능하다.

예를 들면, 어느 질환을 앓은 복수의 개체에 있어서, 당해 질환치료용 의약품의 투여 전후로 산화 스트레스 검출 마커의 농도를 비교하는 것에 의하여, 그 의약품의 일반적인 부작용의 강도를 조사할 수 있다.

혹은, 다른 형태로서 2개의 군의 사이에서 부작용의 강도를 비교해도 좋다.우선, 어느 질환에 이환하고 있는 포유동물을 2개의 군으로 나눈다. 한 군의 개체에는 해당 질환 치료용 의약품을 투여하고, 또 다른 군의 개체에는 그 의약품을 투여하지 않거나, 또는 플라시보를 투여한다. 이들 2개의 군의 개체로부터 혈액을 채취한다. 이어서, 그 혈액에서 산화 스트레스 검출 마커의 농도를 측정한다. 또한, 이 측정에 의하여 얻어진 혈액 중의 마커농도를, 2개의 군 사이에서 비교한다. 또한, 「군」은 한 개체 밖에 포함하지 않아도 좋고, 복수의 개체를 포함해도 좋으며, 2개의 군의 개체수가 같아도, 차이가 나도 좋다. 측정은 같은 군의 개체로부터 채취한 혈액을 모아 그 혈액 중의 마커농도를 측정해도 좋지만, 각 개체의 혈액에서 각각 마커농도를 측정하는 것이 바람직하다.

그룹간에서의 마커농도의 비교는, 1 혈액씩을 대상으로 하여 비교해도, 같은 그룹에 속하는 복수의 혈액에서의 마커농도의 적산치나 평균치를 그룹간에 비교해도 좋다. 이 비교는 당업자에게 주지인 어느 통계학적 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 이와 같이 비교한 결과, 의약품의 투여 후에 있어서, 투여 전과 비교하여 혈액 중 마커농도가 유의적으로 상승하고 있거나, 의약품의 투여군에 있어서 비투여군과 비교하여 유의적으로 상승하면, 그 의약품에 부작용이 있다고 판단할 수 있다.

이와 같이, 의약품으로서의 부작용의 강도를 검정하는 것에 의하여, 부작용이 약한 의약품의 스크리닝을 실시할 수 있다. 또, 복수의 의약품을 사용하여 각 의약품이 다른 농도에 대하여 의약품으로서의 효과를 조사하는 것과 동시에, 농도에 의존한 부작용의 차이를 비교하는 것에 의하여, 각 의약품의 치료약으로서의 적합성을 비교하는 것도 가능하다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 산화 스트레스 검출마커는 간장질환 치료용 의약품의 검정 혹은 의약품의 부작용의 강도검정, 및 질병의 진단 등에 사용할 수 있다. 이 때, 복수의 마커를 사용하는 것에 의하여, 검정정도나 진단정도를 올릴 수 있다. 또, 본 발명의 마커 이외의 검정방법이나 진단방법을 조합하여도 상관없다.

본 발명에서 발견한 생체에서 생긴 산화 스트레스에 의하여 글루타티온의 고갈을 나타내는 γ-Glu-X 펩티드 바이오 마커는 각종 간장해 환자의 신속한 스크리닝법으로서 유용할 뿐만이 아니라, 생체의 산화 스트레스를 파악하는 마커로서 폭넓은 생명과학 분야에서 사용하는 것이 가능하다.

Claims

적어도 글루코사민, γ-Glu-Ala, 메티오닌술폭시드, γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, AST, ALT, γ-Glu-Phe, γ-Glu-Met, γ-Glu-Gln를 모두 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는, 약제성 간장해, 무증상 B형 간염 보균자, 만성 B형 간염, HCV양성 ALT지속 정상자, 만성 C형 간염, C형 간경변, 간암, 단순 지방간, 비알코올성 지방간염으로부터 이들을 보유하지 않은 정상인을 식별하기 위한 간장질환 마커.
적어도 γ-Glu-타우린, γ-Glu-Leu, γ-Glu-Glu, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Arg, γ-Glu-Ser, γ-Glu-Phe, γ-Glu-Met, γ-Glu-시트룰린을 모두 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는, 무증상 B형 간염 보균자, 만성 B형 간염, HCV양성 ALT지속 정상자, 만성 C형 간염, C형 간경변, 간암, 단순 지방간, 비알코올성 지방간염 및 이들을 보유하지 않은 정상인으로부터 약제성 간장해를 식별하기 위한 간장질환 마커.
적어도 γ-Glu-타우린, γ-Glu-Ala, γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, AST, γ-Glu-Lys, γ-Glu-Arg, γ-Glu-Met, γ-Glu-Gln을 모두 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는, 약제성 간장해, 만성 B형 간염, HCV양성 ALT지속 정상자, 만성 C형 간염, C형 간경변, 간암, 단순 지방간, 비알코올성 지방간염 및 이들을 보유하지 않은 정상인으로부터 무증상 B형 간염 보균자를 식별하기 위한 간장질환 마커.
적어도 γ-Glu-Ala, 메티오닌술폭시드, γ-Glu-Leu, γ-Glu-Glu, AST, ALT, γ-Glu-Arg, γ-Glu-Ser, γ-Glu-His, γ-Glu-Phe, γ-Glu-Met, γ-Glu-시트룰린을 모두 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는, 약제성 간장해, 무증상 B형 간염 보균자, HCV양성 ALT지속 정상자, 만성 C형 간염, C형 간경변, 간암, 단순 지방간, 비알코올성 지방간염 및 이들을 보유하지 않은 정상인으로부터 만성 B형 간염을 식별하기 위한 간장질환 마커.
적어도 글루코사민, γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, AST, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Gln, γ-Glu-시트룰린을 모두 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는, 약제성 간장해, 무증상 B형 간염 보균자, 만성 B형 간염, 만성 C형 간염, C형 간경변, 간암, 단순 지방간, 비알코올성 지방간염 및 이들을 보유하지 않은 정상인으로부터 HCV양성 ALT지속 정상자를 식별하기 위한 간장질환 마커.
적어도 글루코사민, γ-Glu-Lys, γ-Glu-His를 모두 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는, 약제성 간장해, 무증상 B형 간염 보균자, 만성 B형 간염, HCV양성 ALT지속 정상자, C형 간경변, 간암, 단순 지방간, 비알코올성 지방간염 및 이들을 보유하지 않은 정상인으로부터 만성 C형 간염을 식별하기 위한 간장질환 마커.
적어도 글루코사민, 메티오닌술폭시드, γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, γ-Glu-Glu, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Met, γ-Glu-Gln, γ-Glu-시트룰린을 모두 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는, 약제성 간장해, 무증상 B형 간염 보균자, 만성 B형 간염, HCV양성 ALT지속 정상자, 만성 C형 간염, 간암, 단순 지방간, 비알코올성 지방간염 및 이들을 보유하지 않은 정상인으로부터 C형 간경변을 식별하기 위한 간장질환 마커.
적어도 γ-Glu-타우린, γ-Glu-Glu, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Ser, γ-Glu-시트룰린을 모두 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는, 약제성 간장해, 무증상 B형 간염 보균자, 만성 B형 간염, HCV양성 ALT지속 정상자, 만성 C형 간염, C형 간경변, 단순 지방간, 비알코올성 지방간염, 및 이들을 보유하지 않은 정상인으로부터 간암을 식별하기 위한 간장질환 마커.
적어도 γ-Glu-타우린, γ-Glu-Ala, γ-Glu-Leu, γ-Glu-Val, γ-Glu-Glu, AST, ALT, γ-Glu-Thr, γ-Glu-Gln을 모두 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는, 약제성 간장해, 무증상 B형 간염 보균자, 만성 B형 간염, HCV양성 ALT지속 정상자, 만성 C형 간염, C형 간경변, 간암, 비알코올성 지방간염 및 이들을 보유하지 않은 정상인으로부터 단순 지방간을 식별하기 위한 간장질환 마커.
적어도 글루코사민, γ-Glu-Ala, γ-Glu-Val, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Gln, γ-Glu-시트룰린을 모두 포함하는 조합인 것을 특징으로 하는, 약제성 간장해, 무증상 B형 간염 보균자, 만성 B형 간염, HCV양성 ALT지속 정상자, 만성 C형 간염, C형 간경변, 간암, 단순 지방간 및 이들을 보유하지 않은 정상인으로부터 비알코올성 지방간염을 식별하기 위한 간장질환 마커.
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