JPS637791A - Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＬ−フェニルアラニ／の製造方法に関し、詳し
くは特定の微生物を利用してフェニルピルビン酸からＬ
−フェニルアラニンを製造する方法に関する。

〔従来の技術１発明が解決しようとする問題点〕微生物
を利用してフェニルピルビン＆からし一フェニルアラニ
ンを製造する方法としては、エネルギー源、無機アン七
ニクム化合物または尿素およびｉ！＆累の存在下にフェ
ニルピルビン酸に特定の微生物を作用させる方法（特開
昭６０−１６０８９０号公報）、フマール酸、アンモニ
ウムイオンまたは尿素の存在下にフェニルピルビン酸に
特定の微生物を作用させる方法（特開昭６１−１５６９
７号公報）などが知られている。

しかしながら、これらの方法は安定的Ｋ　Ｌ　−フェニ
ルアラニンを製造することが困難である等の問題点があ
る。

Ｃ問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、Ｌ−フェニルアラニンの効率的な製造法
を確立すべく、使用する微生物について検討したところ
、シュードモナス属に属する微生物を用いることによっ
て目的が達成できることを見出し１本発明を完成するに
至った。

すなわち、本発明はシュードモナス属に属し、アミノ基
供与物質の存在下フェニルピルビン酸をＬ−フェニルア
ラニンに変換する能力を有する微生物を、アミノ基供与
物質の存在下フェニルピルビン散に作用させることを％
徴とするＬ−７エニルアラニンの製造方法に関する。

本発明に使用できる微生物としては、上記能力を肩する
ものであればよいが、具体的にはシュードモナス・エル
ギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　朋ヒ１叫朋、）Ｔ
−５７８１４株およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓ、
　ｐｕｔｉｄａ　）　Ｔ−５８１０２０株がある。これ
ら微生物はいずれも千葉県君津郡の土壌から下記の方法
にて本発明者らによって分離されたものである。

下表に示すＳＩ培地成分を蒸留水１２に溶解し、ｐＨ７
，０に調整したものを５００ゴ容振とう７ラスコに５０
１１４分注し、１２０℃で１５分間加圧滅菌する。この
培地に、滅菌水１０−に土壌１１を懸濁させたものを１
ｄ添加し、３０℃で７日間好気的に培養を行なう。

得られた培養液を用い、上記Ｓｌ培地に寒天２０？を加
えてｖ４１１！した平板培地にその１白金耳を画線し、
３０℃で７日間培養を行なう。生じたコロニーを単離し
て上記微生物を得た。

Ｓｌ培地 ＮａＨＰＯ，・１２　Ｈ２Ｏ１，５？ ＫＨ，ＰＯ４０，５Ｐ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０Ｑ、２　Ｐ ＦｅＳＯ４−４Ｈ２Ｏ０，００５７ 酵母エキス　　　　　　　３？ ＮＨ４Ｎｏ、　　　　　　　　　３　Ｐフェネチルアル
コール　　　　５１ シユードモナス・エルヤノーサＴ−５７８１４株および
シュードモナス・プチダＴ−５８１０２０株の菌学的性
質は以下に示す通りである。

Ｔ−５７８１４Ｔ−５８１０２０ ａ）形態的性質 （り形　　　桿菌　　桿菌 （２１大きさ　　　　　０．７〜１．Ｉ　Ｘ　１．１〜
２．３０．７〜１．０ＸＬ２〜１゜５（３）運動性　　
　　　　　あ　リ　　　　　あ　シ鞭毛　　　　　　　
極鞭毛　　　　極鞭毛（４）胞子形成　　　　　　　な
　し　　　　な　しく５）ダラム染色　　　　　陰　性
　　　　陰　性（６）好気下の生育　　　　良　好　　
　　良　好ｂ）生理学的性質 ｉｌ＋生育の範囲 温度（’Ｃ）　　　　　　　８〜４８　　　６〜４０ｐ
ｉ（３，９１〜９．７９　　３．９１〜９．７９（３）
螢光色素の生成　　　　　　＋　　　　　−（５）カロ
チノイドの生成　　　　　　−−（６１４１℃での生育
　　　　　　　　十　　　　　　−（７）シュークロー
スから　　　　　　−　　　　　　−レバンの産生 （８；アルヤニン分解性　　　　　　＋　　　　　　＋
（９）ゼラチンの液化　　　　　　　十　　　　　　−
αＧデンゾンの加水分解　　　　　　−−ａｎ硝酸塩の
還元　　　　　　　十　　　　　−〇３カタラーゼ　　
　　　　　　＋　　　　　十０３チトクロームオキシダ
ービ　　　　　＋　　　　　　　＋＋１４０−Ｆテスト
　　　　　　　酸化的　　　酸化的α９炭素源の利用性 グ″３−ス　　　　　　　　　　＋　　　　　　＋トレ
ハロース　　　　　　　　　　＋　　　　　　　＋メソ
ーイノジット　　　　　　　−　　　　　　−ｒラニオ
ール　　　　　　　　　十　　　　　　　−β−アラニ
ン　　　　　　　　　＋　　　　　　＋ＤＬ−アルギニ
ン　　　　　　　＋　　　　　　　＋Ｌ−バリン　　　
　　　　　＋　　　　　＋αｅその他 キシロース分解性　　　　　＋　　　　　＋マンニット
分解性　　　　　＋　　　　　　＋マルトース分解性　
　　　　−− アシルアミダーゼ　　　　　十　　　　　−ＤＮ−エー
ス産生　　　　　＋　　　　　−クエン徹の利用　　　
　　　＋　　　　　　＋以上の菌学的性質を基にして細
菌の分類同定法〔長谷用武治、「微生物の分類と同定」
、学会出版センター、１９８５年およびバージエイのマ
ニュアル・オプ・デイタミナテイプ・バクテリオロジー
（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉ−ｏｌｏｇｙ）、第
８版、１９７５年〕にしたがって分類した。その結果１
両菌株ともダラム染色陰性、極鞭毛、好気性、カメラー
ゼ（ト）、チトクロームオキシダーゼ（イ）、　Ｏ−Ｆ
テスト（０）であることからシュードモナス属に属する
菌株であると分類した。

次に、Ｔ−５７８１４株はトレハロースの利用（培地ニ
ドレバロース５　！ｉ’　、　ＮａＣに３５　Ｐ　、　
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２７、（ＮＨ４）Ｈ，ＰＯ４
１Ｖ　、　Ｋ２ＨＰＯ４１Ｐ　。

ブロムチモールブルー０．２％水溶液１２１．蒸留水１
０００ｍ）においてバージエイのマニュアルに記載され
ているシュードモナス・エルギノーザと異なるが、他の
性質が一致していることがら重曹ヲシュードモナス・エ
ルギノーザと同定した。

萱だ、Ｔ−５８１０２０株は螢光色素の生成（培地：キ
ン≦どＡおよびキングＢ）およびトレハロ−スの利用（
培地二上記と同じ）においてバージエイのマニュアルに
記載されているシュードモナス・プチダと異なるが、他
の性質が一致していることがら重曹をシュードモナス・
プチダと同定した。

シュードモナス・エルギノーサＴ−５７８１４株および
シュードモナス・プチダＴ−５８１０２０株はそれぞれ
ＦＥＲＭ　Ｐ　−８７８１号、同８７８２号として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

微生物は様々な形態で使用することができ、たとえば増
殖期の菌体、休止期の菌体、固定化された菌体などのい
ずれであってもよく、さらには微生物菌体から抽出処理
して得た酵累系を含む抽出処理物であってもよい。ここ
で、微生物菌体の固定化は、担体結合法、架橋法、包括
法などの常法の固定化技術を適用して行なうことができ
る。また、抽出処理としては、微生物菌体の懸濁液を超
音波、フレンチプレス、高圧ホモジナイデーなどにより
破砕したのち遠心分離等によって可溶性抽出物を得る方
法などを採用することができる。

フェニルぎルピン酸を原料としてＬ−フェニルアラニン
を製造するには、アミノ基供与物質の存在が必要である
。アミノ基供与物質としては種々の化合物を使用できる
が１本発明では安価かつ容易に入手できる無機アンモニ
ウム化合物、たとえばアンモニアガス、アンモニア水、
［化アンモニウム、硝酬アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウムなどや尿素が好適である。

上記微生物を培地に培養して目的とするし一フェニルア
ラニンを得るために用いる培地としては。

炭素源、窒素源などのエネルギー源となる物質を含む天
然培ｍ−ｙ合成培地が任意に使用できる。

炭素源としてはグルコース、フラクトース、シュークロ
ース、マルトース等の糖０−！’デンプン。

糖蜜等の粘質原料；エタノール、プロパツール。

エチレンクリコール、フロピレンゲリコール等のアルコ
ール類；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪醇等の飽和カル
ボン醗；グリコール醇、乳酸等のオキシ酸などがあげら
れる。でた、窒素源としては前記した無機アンモニウム
化合物や尿素などのほか酢酸アンモニウム等の有機アン
モニウム化合物ｆ肉エキス、ペプト／なども使用できる
。さらに、必要に応じてリン酸カリウム塩、硫酸鉄塩、
硫酸マンガン塩などの無機塩類や微生物の生育に必要な
栄養物質を適宜培地に添加することができる。

フェニルピルビン酸は培地に最初から加えてもよく、培
養を開始してから適当な時期に添加してもよい。また、
その添加は一度に行なってもよく。

あるいは数回に分割して加えてもよい。

本発明による反応は好気的条件下および嫌気的条件下の
いずれで行なってもよく、使用する微生物の性質を考慮
して５〜５５°Ｃ１好ましくは２５〜４５℃の温度％ｐ
Ｈ３〜１２．好１しくは６〜９の範囲にて１〜４日間培
徴することによって目的とするし一フェニルアラニンを
製造することができる。

反応終了後、培養液などからし一フェニルアラニンを回
収するには、イオン交換樹脂や活性炭などを用いる常法
、によって行なえばよく、回収後、必要に応じて精製処
理を行なう。

〔発明の効果〕

本発明によれば、食品工業、医薬品工業の分野において
有用なＬ−フェニルアラニンをシュードモナス属に属す
る微生物を用いて効率よく製造することができる。また
１本発明ではＬ−フェニルアラニンの製造を嫌気的条件
下で行なうことも可能であり、これにより長時間にわた
り高活性を維持してＬ−フェニルアラニンを製造できる
。

〔実施例〕

次に１本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１ シュードモナス・エルギノーサＴ−５７８１４株（ＦＥ
ＲＭ　Ｐ　−８７８１）をペプトン、肉エキス寒天斜面
培地で３０℃にて２４時間培養した。第１表に示す組成
の培地１００ｍを５００＋ｊ容坂ロフラスコに分注し、
１２０℃で１５分間加圧滅菌したのち、これに前記種培
養の１白金耳を接種し。

３０℃にて２４時間振とり培養を行なった。得られた培
養液を５℃、１１，０ＯＯＸＧの条件で１０分間遠心分
離して得た菌体を０．１　Ｍ　９ンＷｋＩ！！衝液（ｐ
Ｈ７）で３回洗浄したのち同一リン酸緩衝液ｌＯ−に懸
濁した。

１８１表 肉エキス　　　　　５？ ペプトン　　　　１５Ｐ ＮａＣｅ５　Ｐ Ｋ、ＨＰＯ４５ノ 蒸留水　　　　　　１ｐ （ＩＮ　ＨＣｌ３．　ＩＮ　ＮａＯＨを用い−７に調整
）この菌体懸濁液を第２表に示した組成の原料混合液に
添加し、好気的条件下（空気存在下）。

３０℃で２４時間反応を行なった。

反応終了後、菌体を除いた反応液について液体クロマト
グラフィー・ＨＰＬＣ（カラムＣ８８）法により分析し
たところ％Ｌ−フェニルアラニン５．Ｏ１／ノを生成し
ていた。

第２表 Ｌ−フェニルピルビン酸　　　　１０１プロピレングリ
コール　　　　　２０？ＮＨ，Ｃ４１０？ ０．１Ｍリン酸緩衝液　　　　　　　　ｌ！（ＩＮ　Ｈ
ＣＡ、　ＩＮ　ＮａＯＨを用いＰ）（７に調整）実施例
２ 実施例１において反応を漁猟的条件下（窒素ガス雰囲気
下）で行なったこと以外は実施例１と同様に行なったと
ころ、Ｌ−フェニルアラニン４．５？／２が得られた。

実施例３〜１６ 実施例１におけるエネルイー源のプロピレングリコール
の代シに種々の物質を用い、反応を好気的または排気的
条件下で行なったこと以外は実施例１と同様に行なった
。Ｌ−フェニルアラニンの第３表 ３　　グルコース　　　　好気的　　　２．７４　　　
〃　　　　嫌気的　　２．４ ５　　　エタノール　　　好気的　　　３．３６　　　
　　　　　嫌気的　　３．０ ７　　プロパツール　　好気的　　　λ９８　　　〃　
　　　嫌気的　　３．４ ９　　酢散ナトリウム　　好気的　　　　２．６１０〃
　　　　　嫌気的　　２．５ １１　　　乳酸ナトリウム　　好気的　　　　λ３１２
〃　　　　　嫌気的　　２．５ １３　　　マンニトール　　　好気的　　　　３．８１
４　　　　〃　　　　　嫌気的　　２．４１５　２−ｆ
ｆノン−，４４ｔ−ル　好気的　　３．１１６　　　　
Ｎ　　　　　嫌気的　　２，８実施例１７ 実施例１においてシュードモナス・エルギノーサＴ−５
７８１４株の代りにシュードモナス・プチダＴ−５８１
０２０株（ＦＥＲＭ　Ｐ　−８７８２’）を用いたこと
以外は実施例１と同様に行なった。

このときのＬ−フェニルアラニンの生成量は３．０？／
ぶであった。

実施例１８ 実施例１７において反応を嫌気的条件下（窒素ガス雰囲
気下）で行なったこと以外は実施例１７と同様に行なっ
たところ、Ｌ−フェニルアラニンの生成量は２．４ＳＬ
／Ｊであった。

実施例１９〜３２ 実施例１７におけるエネルギー源のプロピレングリコー
ルの代りに種々の物質を用い１反応を好気的または嫌気
的条件下で行なったこと以外は実施例１７と同様に行な
った。Ｌ−フェニルアラニンの生成量をｇ４表に示す。

第４表 １９　　　グルコース　　　　好気的　　　３．４２０
〃　　　　嫌気的　　３．２ ２１　　　エタノール　　　　好気的　　　　３．８２
２〃　　　　　嫌気的　　４．１ ２３　　　プロパツール　　　好気的　　　２．５２４
〃　　　　　嫌気的　　４．２ ２５　　　酢酸ナトリウム　　好気的　　　　３．４２
６　　　　　　　　　嫌気的　　３．６２７　　　マン
ニトール　　　好気的　　　３．７２８〃　　　　　嫌
気的　　３．６ ２９　２−ブテン−１，４−ジオール　好気的　　　　
　λ５３０〃　　　　　嫌気的　　２．０ ３１　　コハク酸　　好気的　　２．８３２〃　　　　
　嫌気的　　２．６ 実施例３３ 実施例１７においてプロピレングリコールの代りに乳酸
ナトリウムを用い、かつ２４時間毎に原料混合液を交換
して微生物の活性を検討した。所定時間後のＩ、−フェ
ニルアラニン生成量を第５表に示す。

実施例３４ 実施例３３において反応を嫌気的条件下で行なったこと
以外は同様にして行なった。結果を第５表に示す。

第　　５　　表

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）シュードモナス属に属し、アミノ基供与物質の存
   在下フェニルピルビン酸をＬ−フェニルアラニンに変換
   する能力を有する微生物を、アミノ基供与物質の存在下
   フェニルピルビン酸に作用させることを特徴とするＬ−
   フェニルアラニンの製造方法。
2. （２）アミノ基供与物質が無機アンモニウム化合物また
   は尿素である特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）微生物が増殖期の菌体、休止期の菌体、固定化さ
   れた菌体および菌体抽出処理物の中のいずれかである特
   許請求の範囲第１項記載の方法。