FR2714908A1

FR2714908A1 - Famille de peptides appelés xénoxines.

Info

Publication number: FR2714908A1
Application number: FR9400202A
Authority: FR
Inventors: Hanno V J Kolbe; Ulla B Rasmussen; Kreil Gunther
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1994-01-11
Filing date: 1994-01-11
Publication date: 1995-07-13

Abstract

Famille de peptides appelés xénoxines, dont des membres représentatifs peuvent être isolés de la matière sécrétée par la peau de de Xenopus laevis et qui possèdent des propriétés pharmacologiques de valeur.

Description

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FAMILLE DE PEPTIDES APPELES XENOXINES

La présente invention se rapporte à une famille de peptides, appelés xénoxines, aux membres de la famille peptidique, ainsi qu'à des procédés pour les préparer et aux séquences d'ADN les encodant. Elle concerne également les compositions pharmaceutiques renfermant lesdites xénoxines ainsi que les trousses de diagnostic les

contenant ou contenant des anticorps anti-xénoxine.

2 o Un nombre important de peptides avec des fonctions biologiques diverses ont déjà été isolés de la peau d'amphibiens. (V. Erspamer et P. Melchiorri, Neuroendocrine Perspectives, E.E. M ller et McLeod, Eds., (Elsevier Science Publishers B.V.) 2, (1983), p 37; C.L. Bevins et coll.; Ann. Rev. Biochem. 59; (1990); p 395). Dès le début on a trouvé que plusieurs de ces peptides étaient très similaires voire même identiques à des 2 5 hormones et des neurotransmetteurs de mammifères (V. Erspamer et coil., Trends

Pharmacol. Sci. 1, (1980), p 391).

Ainsi la peau de grenouille est réputée être une source de peptides avec des propriétés pharmacologiques ou antibiotiques intéressantes. Plus particulièrement, la peau 3 0 de Xenopus laevis, une grenouille d'origine africaine, contient d'importantes concentrations

de peptides divers.

Le rôle biologique que peuvent jouer ces peptides que l'on retrouve dans la matière sécrétée par la peau de Xenopus laevis n'est que partiellement connu. D'une part, les 3 5 sécrétions pourraient avoir une fonction protectrice étant donné que la matière sécrétée semblerait être nuisible aux prédateurs. D'autre part, la matière sécrétée contient des peptides qui limitent la croissance des bactéries et des champignons et qui pourraient donc - 2 -

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se comporter comme antibiotiques sur la peau mouillée de la grenouille ou combattre les

infections pendant la cicatrisation de blessures.

Ces peptides antibiotiques contiennent en général entre 21 et 26 acides aminés, sont basiques et sont exempts de tyrosine. L'identité des séquences d'acides aminés des différents peptides antibiotiques est souvent très limitée. Par contre ces peptides ont en commun leur configuration en hélice alpha amphipathique. Au niveau des séquences signal

d'environ 20 acides aminés l'identité des séquences d'acides aminés n'est que de 55 %.

Toutefois on retrouve des segments conservés, communs aux séquences signal des différents peptides antibiotiques. En plus, ils partagent tous une séquence N'-terminale

Arg-Xaa-Val-Arg qui serait le site d'action d'un enzyme de maturation commun.

Comme autres exemples de peptides isolés et caractérisés chez le Xenopus laevis, on peut citer la caeruléine, membre de la famille de peptides cholécystokinine/gastrine

(Anastasi et coll., Brit. J. Pharmacol. 38, (1970), p 221); spasmolysine I et II (W.

Hoffmann, J. Biol. Chem. 263 (16), (1988), p 7686); thyrotrophine releasing peptide (K.

Richter et coll., EMBO J. 3(3), (1984), p 617) et xénopsine (KI Araki et coll., Chem. Pharmacol. Bull. 21 (12), (1973), p 2801). La plupart de ces peptides sont membres d'une

famille de peptides qui contient entre autres des peptides analogues d'origine mammaliens.

2 o Bombésine et kassinine par exemple, ont servi comme référence pour identifier respectivement la gastrine releasing peptide et la substance K chez les mammifères (C.L Bevins et coll, vi supra). Effectivement la matière sécrétée par la peau de grenouille contient des peptides en quantité abondante, tandis que, chez les mammifères le peptide analogue n'est souvent présent qu'en quantité faible. C'est pourquoi les peptides de

grenouille se prêtent à l'identification des peptides mammaliens utiles.

La présente invention concerne une nouvelle famille de peptides, que l'on a nommés xénoxines et qui possèdent des propriétés pharmaceutiques de valeur et en particulier la propriété d'influencer le fonctionnement des canaux ioniques 3 0 transmembranaires tout en ne présentant pas d'activité neurotoxique. De plus, on a trouvé

que ces peptides ont la propriété avantageuse d'éliminer les effets de l'activine.

Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à une xénoxine caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'acides aminés, laquelle: a. contient au moins 8 cystéines qui sont reliées par 4 ponts disulfure suivant la configuration cys1 avec cys3, cys2 avec cys4, cys5 avec cys6 et cys7 avec cys8;

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b. contient 0 à 3 acides aminés du côté N'-terminal du cys1, 9 à 14 acides aminés entre cys1 et cys2, 3 à 7 acides aminés entre cys2 et cys3, 11 à 18 acides aminés entre cys3 et cys4, 1 à 6 acides aminés entre cys4 et cys5, 7 à 15 acides aminés entre cys5 et cys6, aucun acide aminé entre cys6 et cys7, 3 à 5 acides aminés entre cys7 et cys8 et 0 à 10 acides aminés du côté C'-terminal du cys8; et c. présente une identité d'acides aminés après alignement, d'au moins 40 % avec la séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3,

ou un fragment dérivé de cette séquence.

La présente invention concerne également les peptides intermédiaires qui n'ont pas encore adopté leur conformation repliée mais qui contiennent au moins 8 cystéines, susceptibles de se relier par 4 ponts disulfure suivant la configuration cys1 avec cys3, cys2

avec cys4, cys5 avec cys6 et cys7 avec cys8.

C'est pourquoi, la présente invention se rapporte à un peptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés, laquelle: a. contient au moins 8 cystéines qui, lorsque le peptide adopte sa conformation repliée, sont reliées par 4 ponts disulfure suivant la configuration cysl avec cys3, cys2 avec cys4, cys5 avec cys6 et cys7 avec cys8; b. contient 0 à 3 acides aminés du côté N'- terminal du cysl, 9 à 14 acides aminés entre cys1 et cys2, 3 à 7 acides aminés entre cys2 et cys3, 11 à 18 acides aminés entre cys3 et cys4, 1 à 6 acides aminés entre cys4 et cys5, 7 à 15 acides aminés entre cys5 et cys6, aucun acide aminé entre cys6 et cys7, 3 à 5 acides aminés entre cys7 et cys8 et 0 à 10 acides aminés du côté C'-terminal du cys8; et c. présente une identité d'acides aminés après alignement, d'au moins 40 % avec la séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3,

3 5 ou un fragment dérivé de cette séquence.

Les peptides préférés de la présente invention contiennent 2 acides aminés du côté N'-terminal du cysi, 10 à 13 acides aminés entre cys1 et cys2, 4 à 6 acides aminés entre cys2

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et cys3, 12 à 17 acides aminés entre cys3 et cys4, 1 à 5 acides aminés entre cys4 et cys5, 8 à 14 acides aminés entre cys5 et cys6, aucun acide aminé entre cys6 et cys7, 4 acides aminés

entre cys7 et cys8 et 2 acides aminés du côté C'-terminal du cys8.

D'autres peptides, également préférés, de la présente invention présentent une identité d'acides aminés d'au moins 50 %, de manière particulièrement préférée d'au moins 60 % et de manière avantageuse d'au moins 70 % avec la séquence d'acides aminés

identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3.

Les peptides particulièrement préférés conformes à l'invention sont les xénoxines caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'acides aminés laquelle: a. contient au moins 8 cystéines qui sont reliées par 4 ponts disulfure suivant la configuration cysI avec cys3, cys2 avec cys4, cys5 avec cys6 et cys7 avec cys8; b. contient 0 à 3 acides aminés du côté N'-terminal du cysl, 13 acides aminés entre cys1 et cys2, 6 acides aminés entre cys2 et cys3, 12 acides aminés entre cys3 et cys4, 5 acides aminés entre cys4 et cys5, 14 acides aminés entre cys5 et cys6, aucun acide aminé entre cys6 et cys7, 4 acides aminés entre cys7 et cys8 2 0 et 0 à 10 acides aminés du côté C-terminal du cys8; et c. présente une identité d'acides aminés après alignement, d'au moins 80 %, de préférence 90 %, avec la séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro

SEQ ID NO: 3.

Les peptides selon l'invention comportent de préférence de 42 à 86 acides aminés, de préférence de 51 à 75 acides aminés et de manière particulièrement préférée de 62 à 75

acides aminés.

3 o La présente invention concerne également des peptides de 66 acides aminés qui présentent une identité d'acides aminés après alignement, d'au moins 80 %, de manière préférée d'au moins 90 % et de manière particulièrement préférée d'au moins 95 %, avec

la séquence d'acides aminés telle que identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3.

3 5 Comme exemples de peptides particulièrement préférés on peut citer le peptide, xénoxine-1 tel que identifié sous le numéro SEQ ID NO: 3, ainsi que la xénoxine-2 selon

SEQ ID NO: 4 et la xénoxine-3 selon SEQ ID NO: 5.

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Les peptides selon l'invention peuvent être sous forme de leurs sels d'addition d'acides non toxiques pharmaceutiquement acceptables. Comme exemples d'acides pharmaceutiquement acceptables, on peut citer les acides minéraux comme les acides chlorhydriques, sulfuriques, phosphoriques, etc. et les acides organiques comme les acides sulfoniques et carboxyliques telles que l'acide acétique, lactique, palmitique, stéarique, maléique, tartrique, ascorbique, citrique, etc. Les peptides selon l'invention peuvent également être sous forme de leurs sels

d'addition de base étant donné qu'ils contiennent des groupements carboxyliques libres.

Comme exemples de sels pharmaceutiquement acceptables on peut citer les sels de sodium, de potassium, de calcium ou de magnesium et les dérivés d'ammonium quaternaire. Etant donné que les peptides selon l'invention contiennent à la fois des groupements carboxylique et amine libres, ils peuvent être sous forme de leurs sels internes

ou sous forme combinée de sels d'additions et de sels internes.

Pour déterminer l'identité d'acides aminés on aligne les cystéines de telle façon qu'elles se trouvent en position identique avec les cystéines de la séquence d'acides aminés 2 o telle que présentée sous SEQ ID NO: 3 et on introduit des écarts pour maximaliser l'alignement des séquences tout en gardant le nombre d'écarts à un minimum. On identifie alors les acides aminés identiques qui se trouvent en position identique, y compris les cystéines. L'identité d'acides aminés est exprimée en pourcentage et calculée selon la formule (1) suivante: n x100 (1) 66 + p 3 o dans laquelle n est le nombre d'acides aminés identiques, 66 est le nombre d'acides aminés de la séquence identifiée sous le numéro SEQ ID

NO: 3,

p est le nombre d'écarts introduits.

Une famille de xénoxines selon l'invention comprend des peptides qui sont issus de différentes espèces d'amphibiens ou de mammifères. Comme exemple d'amphibiens on peut citer les espèces qui appartiennent au superordre des Salienta, anoures telles que les grenouilles, les crapauds, les rainettes, etc; ou à l'ordre des Caudata, urodèles telles que 4 0 les salamandres, les tritons etc.; ou encore à l'ordre des Gymnophiona, apodes telles que

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les anguilles, les murènes etc. Il est également possible d'obtenir des xénoxines de

mammifère notamment de souris, de porc ou d'homme.

Les xénoxines selon l'invention ont en commun des propriétés pharmaceutiques chez le mammifère basée notamment sur leurs interactions avec le fonctionnement des

canaux ioniques transmembranaires et leur interraction avec l'activine.

L'identité d'acides aminés des différentes xénoxines peut varier à cause des divergences interespèces ou alleliques. Le plus souvent il s'agit de substitutions conservatives qui permettent de conserver la conformation squelettique du peptide. Ainsi de façon préférée, dans les xénoxines selon l'invention une substitution en position homologue, comparée à la séquence identifiée sous SEQ ID NO: 3, se fait avec un acide aminé ayant une fonctionnalité équivalente pour ce qui concerne ses propriétés hydrophobiques, de charge ou d'espacement. On choisi par exemple parmi le groupe des acides aminés hydrophobes entre alanine, isoleucine, leucine, méthionine, phénylalanine, proline, tryptophane et valine; parmi le groupe des acides aminés polaires non chargés asparagine, cystéine, glutamine, glycine, sérine, thréonine et tyrosine; parmi les acides aminés chargés positivement arginine, histidine et lysine; parmi les acides aminés chargés négativement acide aspartique et acide glutamique et parmi le groupe des acides aminés

d'espacement équivalent alanine, glycine et sérine.

Une modification post-traductionnelle telle que la formation des ponts disulfure entre les cystéines du peptide stabilise la conformation repliée des xénoxines, ce qui

permet l'exercice de leurs activités pharmacologiques.

Les différents ponts disulfure ne se forment pas de façon aléatoire. Quand on permet à la séquence d'acides aminés de s'enrouler, les groupements disulfures qui se relient sont ceux de deux cystéines voisines dans le peptide replié. Cest pourquoi la conformation du squelette peptidique peut être décrite par la configuration des ponts disulfure. A cet effet, on décrit les liaisons qui se sont formées entre les cystéines dans le peptide replié et on donne une indication du nombre d'acides aminés entre les différentes

cystéines successives dans la séquence primaire des peptides.

Il existe donc une double similarité structurelle entre les peptides de la même 3 5 famille, notamment au niveau du squelette peptidique, et au niveau de l'identité d'acides aminés. Ainsi, quand on compare deux peptides de la même famille, il peut se trouver qu'ils possèdent des séquences d'acides aminés avec une disparité significative, voir même une identité d'acides aminés aussi faible que 40 %. Par contre, la similitude de la

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configuration des cystéines impliquées dans la formation des ponts disulfure sera frappante. Les xénoxines selon l'invention sous forme totale ou sous forme de fragment peuvent également être introduites dans des structures chimiques ou physico-chimiques plus complexes destinées à faciliter leur activité ou à leur conférer des propriétés

thérapeutiques avantageuses comme par exemple la forme retard ou protégée.

L'invention concerne également les xénoxines qui présentent éventuellement des modifications connues pour les peptides telle que la glycosylation notamment, ainsi que les

produits déglycosylés ou non-glycosylés notamment.

Les xénoxines conformes à la présente invention peuvent être isolées selon le procédé suivant: a. on divise en fractions la matière sécrétée par la peau de grenouille par précipitation à l'aide de sulfate d'ammonium, ou un agent précipitant équivalent, 2 o b. on soumet les précipités qui se forment entre 30 % et 70 % de saturation en sulfate d'ammonium, de préférence entre 30 % et 60 %, ou en conditions équivalentes, à une chromatographie par perméation de gel, et

c. on récolte la fraction peptidique qui élue tardivement.

Si on le désire, le mélange de xénoxines ainsi obtenu peut ensuite être purifié par

HPLC d'échange de cations et suivi de HPLC phase inverse.

Selon un aspect préféré de la présente invention, la matière sécrétée par la peau de

3 o grenouille est issue de Xenopus laevis.

Dans le procédé selon l'invention on précipite la fraction de peptides avantageusement à l'aide de sulfate d'ammonium. Toutefois, d'autres agents précipitants peuvent être utilisés tels que le polyéthylène glycol, l'éthanol ou le sulfate de sodium. Il 3 5 appartient à l'homme de métier de choisir la fourchette de saturation en agent précipitant nécessaire pour obtenir les précipités exempts de protéines d'une part et de peptides avec

des poids moléculaires inférieurs à 10.000 Da, de préférence 8.000 Da, d'autre part.

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Normalement, la chromatographie par perméation de gel permet de séparer les molécules en fonction de leur poids moléculaire. Dans le procédé selon l'invention cette chromatographie permet d'écarter tous les molécules de poids moléculaire important des

peptides concernés en récoltant uniquement la fraction qui élue tardivement de la colonne.

De ce fait chaque type de gel de perméation ayant une zone de fractionnement au delà de 10 kDa peut être utilisé. Dans le commerce ce genre de gel est disponible sous le nom, par exemple, de Sephacryl S5300 (Pharmacia), Sephadex (Pharmacia), Fractogel

(Merck) ou Toyopearl (Toso Haas).

On peut également synthétiser chimiquement les peptides selon l'invention par des méthodes de synthèse connues de l'homme du métier. A titre de référence on citera E.

Bayer, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30, (1991), p 113.

La présente invention concerne également l'expression des xénoxines dans des

systèmes cellulaires autres que le système cellulaire naturel dont elles sont issues.

Pour ce faire, l'invention concerne également les séquences d'ADN isolées codant pour lesdites xénoxines, ainsi que des cassettes d'expression desdites séquences assurant

2 o leur expression dans la cellule désirée.

Par fragment d'ADN isolé, on entend un fragment d'ADN qui n'est plus associé à l'ensemble des régions naturelles qui contrôlent son expression dans l'organisme dont il est

issu, c'est à dire dans le cas de l'exemple cité ci-dessous duXénopus laevis.

Parmi les séquences d'ADN isolé qui comprennent une séquence codant pour un peptide selon l'invention, il faut citer en particulier l'ADN qui est repris dans la liste d'identification des séquences sous le numéro SEQ ID NO: 1, et plus particulièrement la partie de la SEQ ID NO: 1 de la position 39 à 290 et la partie de la SEQ ID NO: 1 de la

3 o position 93 à 290.

L'invention concerne des cassettes d'expression desdites séquences d'ADN codant

pour un peptide selon l'invention.

3 5 Une telle cassette d'expression comprend notamment un fragment d'ADN isolé qui est placé sous le contrôle d'éléments permettant sa transcription et sa traduction dans la

cellule hôte considérée.

-9- Ces éléments de contrôle sont essentiellement un promoteur de la transcription approprié ainsi que des cxdons d'initiation et de fin de traduction. Dans certains cas, il est aussi avantageux d'ajouter un termninateur de transcription et un peptide signal, ou séquence pr6, éventuelleument suivie d'une séquence pro. On préférera, tout particulièrement, la séquence pro de la défensine A de Plujrmia ernranovae (Dimarcq et coll., EMBO J, 9 (3990) p. 2507) fonctionnelle dans les cellules eucaryotes et notamment la

levure comme Saccharomyces cerevisiae.

L'invention concerne également une cellule qui est transformée avec une cassette d'expression qui comprend un fragment d'ADN selon l'invention. La cassette d'expression peut être soit Intégrée dans le génome de la cellule soit portée par un vecteur d'expression

approprié tel que par exemple un plasmide ou un vecteur viral.

La présente invention concerne également l'utilisation de vecteurs d'expression susceptibles d'être administrés pour produire les xénoxines in situ chez l'homme ou

l'animal, notammenrt lorsque le vecteur est un vecteur viral.

Enfin, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un peptide selon l'invention qui consiste à cultiver une cellule transformée selon l'invention et à récolter

ledit peptide à partir de la culture.

Les technologies permettant le clonage et l'expresion d'un gêne étranger dans des cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes sont connues de l'homme du métier. Elles seront illustrées dans les exemples ci-dessous, 6tant entendu que d'autres vecteurs et d'autres 2;5 cellules hôtes peuvent être utilisés. L'homme du métier sait bien évidemment choisir le promoteur de la transcription approprié en fonction de l'hôte dans lequel on souhaite exprimer le fragment d'ADN et en fonction du vecteur dans lequel la cassette d'expression

doit être insérée pour assurer sa réplication.

Selon un procédé préféré de préparation d'un peptide selon l'invention le fragment d'ADN isolé est exprimé dans des cellules hôtes qui permettent la sécrétion des peptides synthétisés dans le milieu de culture afin d'assurer la formation des ponts disulfure. A titre d'exemple, on peut citer les cellules hôtes de procaryotes tel que E. coli, de eucaryotcs inférieurs tel que Saccharomnycca ccrevLslae ou de eucaryotes supérieurs tel que l'homme ou

l'animal.

Pour diriger un peptide vers le système de sécrétion des cellules hôtes on prévoit dans la cassette d'expression une séquence peptidique généralement connue sous le nom -10- peptide signal qui est située de façon avantageuse du côté de l'extrémnlté 5' de l'ADN k exprimer. Pendant le processus de translocation ce peptide signal sera clivé par un enzyme, la peptidase signal. C'est alors un peptide mature qui est sécrété dans le milieu de culture

ou dans le périplasme de l'hôte.

Le peptide signal préférablement utilisé e"t issu de igènes dont il est connu que le produit qu'ils encodent est sécrété de façon efficace. A titre d'exemple on cite les peptides signal de l'invertase périplasmique SUC2 (R.A. Smith et colil., Science 229, (1985), p 1219; C.N. Chang et colil., Mol. Cell. Biol. 6, (1986), p 1812), ainsi que les peptides signal toxines 1 0 "killer" de Kluyveromyces lactis (C. Baldazi et coll., EMBO J. 6,(1987), p 229) ou de Saccharmyces cerevisiae (M. Tokunaga et colil.. Nuclelc Acids Res. 16, (1988), p 7499). A titre d'indication on précise toutefois que le peptide signal du gène BGL2 Issu de S.

cerevisiae (T. Achstetter et coll., Gene 110, (1992) p 25), et utilisé dans les exemples ci-

dessous, permet d'obtenir de très bons résultats.

Dans certains cas, le peptide obtenu pourra ne pas présenter la bonne configuration, il pourra alors etre néceaire de procéder à son réarrangement par des méthodes chimiques comporant, par exemple, la mise en solution et le repliement en utilisant dca

conditions de pl et l'urée par exemple.

La présente invention concerne également les anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-xénoxines qui peuvent être obtenus par des procédés connus ainsi que leur application

tan en thérapie que dans le domaine diagnostic pour identifier ou quantifier les xénoxines.

La présente invention concerne donc également des trousses de diagnostic utilisant

les xénoxines ou les anticorps correspondants.

Les peptides selon l'invention ont des applications thérapeutiques chez les mammifères et notamment chez l'homme étant donné leurs propriétés de pouvoir influencer le fonctionnement des canaux ioniques transmembranaires, et de l'activine, sans

avoir d'activité neurotoxique.

En conséquence l'invention se rapporte également A: - une composition pharmaceutique qui comprend & titre d'agent actif au moins un peptide selon l'invention; - l'usage thérapeutique d'un peptide selon l'invention;

- il -

La composition pharmaceutique selon l'invention est en particulier destinée au traitement préventif ou curatif de maladies telles que par exemple des arythmies cardiaques dues à une hyper ou hypotension: des maladies fibrokystiques d'origine génétique telle que la maladie fibrokystique du pancréas, mieux connue sous le nom de mucoviscidose; les troubles associés à un déséquilibre de gonadotrophine chorionique humaine pendant la grossesse; les maladies dues i une sécrétion déséquilibrée des hormones FSH, STH et ACTH (respectivement, pour follicle stimulating hormone, somatotropic hormone et adenocorttcotropic hormone en Anglais); les compositions

1 0 pharmnnaceutiques selon l'invention permettent également le réglage de l'êrythropoiése.

Les compositions pharmaceutiques renfermant les peptides selon l'invention peuvent étre administrées par la vole la plus appropriée A sa distination finale, notamment par voie

orale, parent&ale ou rectale.

Les compositions pharmaceutiques utilisables pour l'administration orale peuvent être solides ou liquides, par exemple sous forme de comprimés (enrobés ou non), pilules, dragées, capsules en gélatine, solutions, sirops, etc. De même, les compositions utilisables pour l'administration par voie parentérale, sont les formes pharmaceutiquement connues pour ce genre d'administration, par exemple

des solutions, des suspensions ou émulsions aqueuses ou huileuses, qui conviennent e.a.

pour des injections intramusculaires, intraveineuses, Intrapéritonéales, sous cutanées ou

des applications cutanées ou transmuqueuse, par exemple par spray, pommades ctc.

Pour l'administration par voie rectale, les compositions contenant les composés dc

l'invention se présentent généralement sous forme de suppositoires.

Les composés selon l'invention pourront également re préparés sous une forme à libération contrôlée et en fonction de la voie d'administration retenue sous une forme

protégée appropriée afin d'éviter une dégration trop rapide du peptide.

Les formes pharmaceutiques telles que solutions injectables, suspensions injectables, comprimés, gouttes, suppositoires, etc. sont préparées selon les méthodes couramment utilisées par les pharmaciens. Les formes pharmaceutiques comprennent également les compositions qui permettent de délivrer le peptidc actif d'une manière progressive. On mélange les compulsés de l'invention avec un véhicule solide ou liquide, non toxique, pharmaoeutiquement acceptable, et 6ventuellement avec un agent dispersant, un agent -12- désintégrant, un agent stabilisant etc. On peut y ajouter, par exemple, des agents 6dulcorunts, des agents colorants, etc. Le pourcentage de produit actif dans les compositions pharmaceutiques peut varier dans des limites très larges, selon le patient et le

mode d'administratlon, en particulier selon la fréquence d'administration.

Les exemples qui suivent illustrent la présente invention, sans la limiter, il y est fait

référence aux figures 1 à 4.

La figure 1 représente un SDS-PAOE coloré au bleu de Coomassie de deux stades 1 0 différents de purification. (1) fraction peptidique récoltée après chromatographie par permeation de gel Sephacryl S300: (2) Marqueurs de poids molculaire d'en bas jusqu'en haut: lysozyme (14.300 Da), inhibiteur de trypslne (21.500 Da), anhydrase carbonique (30.000 Da), ovalbumine (46.000 Da), albumine de sérum bovin (69.000 Da) phosphorylase b (92.500 Da) et myoslne (200.000 Da); (3) xénoxine-1 purifiée par HPLC d'échange de

1 5 cations et phase inverse selon l'exemple I ci-dessous.

La figure 2 représente un profil d'élution obtenu après HPLC A change de cations de la fraction peptidique issue de sécrétion de la peau de Xenopus laevis obtenue par précipitation au sulfate d'ammonium suivie d'une chromatographie par perrnméation de gel dans les conditions de l'exemple 1 qui est repris ci-dessous. Leas fractions qui contiennent respectivement xénoxine-1, xénoxine-3 et xénoxine-2 sont indiquées par des flèches successives. La figure 3 A représente l'alignement de (a) xénoxine-I avec (b) la cytotoxine issue de Naja naju kuouthia, Naja naja slamensL, un cobra monocle (S. Inoue et ol., FEBS Lett. 218, (1987), p 17) et (c) la neurotoxine d courte de Latlcauda coubrina, un bungare de mer aux lèvres jaunes (N. Tamiya et colil. Toxicon (Suppl. 3), (1983), p 445). Des

écartements (-) sont Introduits et les ponts disulfure indiqués. La figure 3 B représente le nombre d'acides aminés entre les cyst6ines

successives dans les séquences primaires pour les trois familles de peptides xénoxines, cytotoxincs et

ncurotoxines courtes, respectivement.

La figure 4 représente l'alignement de xénoxine-1 avec 27 acides anminés du site de

fixation N'-terminal de 116 résidus du récepteur humain de l'activine.

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Exemple 1: Purification et caractérisation des xénoxines.

1.1 Isolement et purification des xénoxines.

Les Xenopi laevis, (Herpetologic Institute, DeRover, Pays Bas) sont maintenus dans des bacs aérés et alimentés avec du foie de porc haché. Toutes les trois semaines, les animaux sont soumis à un léger choc électrique (15 V) et les sécrétions de leur peau sont récoltées dans une solution de 0,9 % de NaCI selon la méthode décrite par C. Mollay et coll. , Eur. J. Biochem. 160, (1986), p 31. Le mucus ainsi extrait est soumis à deux extractions successives par le n-butanol à volume égal. La fraction insoluble est éliminée par centrifugation pendant 15 minutes à 15.000 tours par minutes (Sorvall RC-5B, rotor SS34). Du sulfate d'ammonium est ensuite ajouté au surnageant et le matériel précipitant entre 30 et 60 % de saturation est récupéré. Ce précipité est dissous et dialysé dans l'acétate d'ammonium 50 mM, pH 5,0 et soumis à une chromatographie par perméation de gel en utilisant une colonne Sephacryl S300 (2,7 cm x 120 cm; Pharmacia) équilibrée avec le même tampon. La fraction peptidique est détectée à 280 nm et élue tardivement sous

forme d'un pic large. Seule cette fraction tardive est collectée et lyophilisée.

On établit un SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie pour vérifier que les

2 o molécules de poids moléculaire au delà de 10kDa sont écartées, (voir Figure 1).

La fraction peptidique lyophilisée est reprise dans 50 ml d'acétonitrile 5 %, dans l'acétate d'ammonium 20 mM à pH 4,6 puis centrifugée pendant 15 minutes à 15.000 tours par minute (Sorvall RC-5B, rotor SS34). Le surnageant est filtré sur filtre Millex GV de

2 5 0,22 pm (Millipore) et des aliquotes de 5ml sont congelées à - 80 C.

Un aliquot de 5 ml de la solution est dilué dans 90 ml de tampon CE1 (acétonitrile % dans du phosphate de potassium monobasique 5 mM ajusté à pH 3,0 à l'aide de l'acide phosphorique). La conductivité de la solution est ajustée à 8 mS à l'aide du tampon 3 0 CE 1 et si nécessaire, le pH est ajusté à 3,0 à l'aide de l'acide phosphorique. La solution ainsi obtenue est alors séparée en trois aliquots qui sont successivement soumis à une séparation par HPLC (Chromatographie Liquide Haute-Performance) d'échange de cations (Shimadzu) avec détection UV à 215 nm, de la façon suivante: 3 5 - l'aliquot est chargé sur une colonne HPLC (poly-Sulfoéthyle Aspartamide SCX; 9,4 mm x 200 mm; The Nest Group) à un débit de 1,6 ml/minutes;

- 14- 2714908

la colonne est lavée avec le tampon CE 1 jusqu'à ce que la ligne de base à 215 run se soit stabilisée; un gradient 0 à 100 % de tampon CE2 (chlorure de potassium 600 mM dans du tampon CE1) est appliqué en 40 minutes, pour éluer le matériel adsorbé qui est collecté manuellement par fractions de 1,6 ml; - la colonne est lavée par le tampon CE2 pendant 10 minutes; - un gradient 100 % tampon CE2 à 100 % de tampon CE1 est appliqué en 5 minutes; et

- la colonne est lavée par le tampon CE1 pendant 15 minutes.

On obtient respectivement la xénoxine-1 qui élue entre 362 et 392 mM de chlorure de potassium après 33,3 à 35,5 minutes; la xénoxine-3 (398-415 mM; 35,9-37,1 minutes); et la xénoxine-2 (415-435 mM; 37,1-38,6 minutes) qui sont indiquées par les flèches

successives sur le diagramme de la Figure 2.

Une étape de séparation en HPLC phase inverse (Hewlett-Packard 1090A) avec détection UV à 205 nm est ensuite réalisée. A cet effet, les fractions individuelles issues de la chromatographie HPLC d'échange de cations sont directement chargées sur une colonne HPLC Vydac C18 (10 mm x 250 mm; Vydac Separation Group) équilibrée avec le tampon RP1 (0,10 % (v/v) d'acide trifluoroacétique (TFA) dans l'eau dé-ionisé par le système de

préparation d'eau réactif de Millipore (eau Milli Q)) à un débit de 1,5 ml/minute.

Pour chaque fraction chargée, les xénoxines sont éluées de la colonne selon la procédure suivante: - 100 % tampon RP1 pendant 5 minutes pour restabiliser la colonne; - un gradient 100 % de tampon RP1 à 71,4 % de tampon RP2 (30/70/0,10 (v/v/v) d'eau Milli Q/acétonitrile/TFA) est appliqué en 3 o 100 minutes; - la colonne est lavée par 71,4 % de tampon RP2 pendant 10 minutes; - un gradient 71, 4 % de tampon RP2 à 100 % de tampon RP1 est appliqué en 5 minutes; et

- la colonne est lavée par 100 % de tampon RP1 pendant 15 minutes.

Les fractions sont collectées manuellement et les xénoxines désalées et purifiées

sont concentrées à l'aide d'un Speed Vac Concentrator (Savant) et stockées à -20 C.

- 15 - 2714908

On obtient ainsi, à partir d'un équivalent de sécrétions de peau de 150 Xenopi laevis,

800 pg de xénoxine-1, 650 pg de xénoxine-2 et 200 pg de xénoxine-3.

1.2 Caractérisation des xénoxines 1.2.1 Réduction et alkylation g de xénoxines purifiées et concentrées selon l'exemple 1.1 sont repris dans un tampon d'alkylation (Tris-HCl 250 mM, pH 8,5; chlorure de guanidinium 6M; EDTA 1 mM) à une concentration de 250gg/ml, puis homogénéisées au vortex et soniquées 5 minutes. Ensuite 5/il de 20/80 (v/v) B- mercaptoéthanol en eau Milli Q sont ajoutés, le mélange est rnis sous argon et laissé à 37 C. Après 2 heures, 10gl de 4-vinylpyridine (4VP; Janssen) sont ajoutés, le mélange est à nouveau mis sous argon et laissé à température ambiante. Après 2 heures, le mélange de réaction est congelé et gardé à -20 C jusqu'à son

utilisation pour digestion ou désalage.

1.2.2 Digestion à la clostripaine (CL), trypsine (T) ou au bromure de cyanogène (CNBr).

La clostripaïne (Sigma) est activée à une concentration de 1 mg/ml dans du tampon CL (Tris-HCI 100mM, pH 7,5; dichlorure de calcium lmM, DT 2,5 mM) à 37 C pendant 2 heures. 12 gg de xénoxine préparée selon l'exemple 1.1. (alkylée avec 4VP, selon l'exemple 1.2.1, ou non-alkylée), sont incubés dans le tampon CL pendant 16 heures à 37 C à une concentration de 150 mg/ml et un rapport protéase/substrat de 1:10 (w/w). 8 pl d'acide acétique glacial et 70Il du tampon RP1 (voir ci-dessus) sont ensuite ajoutés. La solution ainsi obtenue est alors utilisée pour déterminer la carte peptidique par

chromatographie HPLC phase inverse comme décrit dans l'exemple 1.2.3, cidessous.

La trypsine (1 mg/ml dans HCI lmM) (Boehringer) est diluée 10 fois dans du tampon TR (N-éthylmorpholine-HCI 100mM, pH 8,3; dichlorure de calcium 0,1 mM). 25 3 0 pg de xénoxine préparée selon l'exemple 1.1. (alkylée avec 4VP ou non-alkylés), sont incubés dans le tampon TR pendant 16 heures à 37 C à une concentration de 240 pg/rnl et un rapport protéase/substrat entre 1:5 et 1:100 (w/w). 2pl de tampon TFA pure et 100 ml de tampon RP1 sont ensuite ajoutés et la solution ainsi obtenue est utilisée pour déterminer la carte peptidique par chromatographie HPLC phase inverse comme décrit

3 5 dans l'exemple 1.2.3.

pl de CNBr 1% (w/v) (Pierce) dans de l'acide formique 70 % sont ajoutés à pg de xénoxine préparée selon l'exemple 1.1. (alkylée avec 4VP ou nonalkylée). La

- 16 - 2714908

réaction se poursuit pendant 16 heures après addition de 300 pl d'eau Milli Q. Le mélange de réaction est séché à l'aide d'un Speed Vac Concentrator. 250 ml de tampon RP1 sont ajoutés. La solution ainsi obtenue est utilisée pour déterminer la carte peptidique par

chromatographie HPLC phase inverse comme décrit dans l'exemple 1.2.3.

1.2.3. Détermination de la carte peptidique par chromatographie HPLC phase inverse.

La carte peptidique est réalisée par chromatographie HPLC phase inverse à l'aide

d'une unité HPLC 1090A (Hewlett-Packard) avec détection UV à 205 nm.

Les molécules de xénoxine intactes, leurs fragments protéolytiques ainsi que leur équivalent alkylé avec 4VP sont chargés sur une colonne HPLC Superspher 100C18 (4 mm x 125mm; Merck) équilibrée avec TFA 10 mM dans 10/90 (v/v). acétonitrile/eau Milli Q à un débit de 1 ml/minute. Les peptides sont alors élués suivant le protocole suivant: La colonne est lavée avec TFA 10 mM dans 10/90 (v/v) acétonitrile/eau Milli Q pendant 15 minutes; et un gradient linéaire jusqu'à TFA 10 mM dans 50/50 (v/v)

2 o acétonitrile/eau Milli Q est appliqué en 40 minutes.

Les fractions éluées sont collectées manuellement et concentrées à l'aide d'un

Speed Vac Concentrator.

2 5 Les temps de rétention observés sont repris dans les tableaux I, II et III ci-dessous.

1.2.4. Détermination de la séquence en acides aminés.

Les peptides obtenus selon l'exemple 1.2.3. sont solubilisés dans une solution 3 o d'acide formique 80 % et la détermination de la séquence N-terminale est réalisée à l'aide d'un séquenceur de protéines de type 477A couplé à un analyseur HPLC d'acides aminés phénylthiocarbamique (Applied Biosystems Inc.) selon les procédures standards. Les

résultats du séquençage sont présentés dans les tableaux I, II et III ciaprès.

- 17 -

TABLEAU I

Co a5 Peptide (1) temps SEQUENCE EN ACIDES AMINES [,,, de elN rétention 10 20 30 40 5 0 60 (minutes) xénoxine-1, alkyléea 37,5 LKCVNLQANGIKMTQECAKEDTKCLTLRSLKKTLKFC xénoxine-1, ally1. 34,0 LKCVNLQANGIKXXQECAKEDTKCLTLRSLKKTLKFCAXXXTC fragment CNBRI1 ,d TQECAKEDTKCLTXRSLKKTLKFCAXGRTCT xénoxine-1, aly1ée 27,7 LKCVNLQA fragment CL1 SLKKTLKFCASG xénoxine-1 33,4 TXTTMK fragment Tlb,d IMSLPGEQITXXEGNMXNA xénoxine-1, alkylé! 28,2 SLPGEQITCCEGN fragment CNBR2Uc KIMSLPGEQITCCEGN xénoxine-1, alkylée 32,9 IMSLPGEQITCCEGNMCN fragment CL2 xénoxine-1 40,0 LKCVNLQANGIKMTQECAKEDTKCLTLRSLKKTLKFCASGRTCTTMKIMSLPGEQITCCEGNMCNA (1) CNBR, CL ou T précisent la méthode protéolitique utilisée a Molécule complète, seule la partie analysée est présentée b Deux séquences peptidiques sont lues en parallèle c Un peptide dérive d'un clivage incomplet d Les résidus marqués X ne sont pas identifiables

- 18 -

TABLEAU II

co -, Peptide(1) temps SEQUENCE EN ACIDES AMINES [" de rétention 10 20 30 40 5 0o 60 (minutes) xénoxine-2, alkyléea 37,5 LKCVNLQANG I KMTQECAKEDNKCLTLRSLKKTLKFCAXDRICKTMKIMSLPGEXI xénoxine-2a,b 40,0 LKXVNLQANGIKMTQEXAKEDNKXLTLRSLKKTLKFCASDX I XKTMK xénoxine-2, alkylée 23,0 ITCCEGNMCNA fragment CL3 xénoxine-2 28,0 IMSLPGEK fragment T3 xénoxine- 2 40,0 LKCVNLQANGIKMTQECAKEDNKCLTLRSLKKTLKFCASDRICKTMKIMSLPGEKITCCEGNMCNA (1) CL ou T précisent la méthode protéolitique utilisée a Molécule complète, seule la partie analysée est présentée b Les résidus marqués X ne sont pas identifiables

- 19 -

TABLEAU I!!

Co m;- Peptide (1) temps SEQUENCE EN ACIDES AMINES "f de cqN rétention 10 20 30 40 50 60 (minutes) xénoxine-3, alkyléeabc 35,5 LXCVNLQANGXKMXQECXKE

KCVNLQANGVKMTQECAKED

CVNLQANGVKMTQECAKEDT

xénoxine-3, alkylée 7,0 FCASDR fragment T4 xénoxine-3, alkylée ? IASLPGEQITCCEGNMCNA fragment T5 xénoxine-3, f.kylée ? IASLPGEQITXXEGNMXNA fragment T6 I. xénoxine-3d 40,0 LKCVNLQANGVKMTQECAKEDTKCLTLRSLKKTLKFCASDRICKTMKIASLPGEQITCCEGNMCNA (1) T précise la méthode protéolitique utilisée a Molécule complète, seule la partie analysée est présentée b Les résidus marqués X ne sont pas identifiables 3 0 c Trois séquences peptidiques sont lues en parallèle d Les acides aminés en italiques sont déduits des séquences des xénoxine-1 et xénoxine-2

-20- 2714908

1.2.5 Spectrométrie de masse Les mesures de spectrométrie de masse sont effectuées par ESMS (Electrospray Mass Spectrometry) sur un spectromètre de masse de type VG Bio Tech BioQ (VG Biotech Ltd.). Les protocoles utilisés sont connus de l'homme du métier et sont repris par exemple dans A. Van Dorsselaer et coll., Biomed. Environ. Mass Spectrom. 19, (1990), p 692. Les masses moléculaires calculées sont données comme des valeurs moyennes basées sur les valeurs des masses atomiques des éléments C, H, N, O et S suivantes:

C = 12,011; H = 1,0079; N = 14, 0067; O = 15,9994 et S = 32,06.

Les résultats sont présentés dans le tableau IV ci-après.

TABLEAU IV

SPECTROMETRIE DE MASSE

Peptide Masse moléculaire Masse moléculaire expérimentale calculée xénoxine-1 7228,3 + 0,1 Daa 7227,6 Dab 2 0 xénoxine-1, alkylée 8077,7 0,4 Dae 8076,7 Dad xénoxine-1, T1 2693, 5 + 0,2 Da 2694,6 Da xénoxine-1, T2 1662,0 0, 2 Da 1662,0 Daf mélange de fragments 2329,2 0,6 Da 2329,7 Dag trypsiques 1164,5 0,4 Da 1164,3 Dah 2 5 xénoxine-1, aikylée 744,4 Da 744,8 Dai 709,4 Da 709,5 Dai xénoxine-2 7337,5 0,5 Da 7337,8 DaD xénoxine-2, alkylée 8188,7 0,5 Dac 8186,9 Dad xénoxine-2, fragment T2' 1661,9 0,6 Da 1662,0 Daf 3 0 mélange de fragments 1473,0 0,2 Da 1473,7 Dak trypsiques 1164,7 + 0,2 Da 1164,3 Dah xénoxine-2, aikylée 873,5 Da 874,1 Dal 709,5 Da 709,5 Dai xénoxine-3 7251,2 _ 0, 4 Da 7250,6 DaD 3 5 xénoxine-3, alkylée 8100,6 0,8 Dac 899,8 Dad

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a Masse correspondant au signal majoritaire; un signal moins intense donne une masse de 7243,8 0,4 Da, probablement dû à l'addition d'un atome d'oxygène à la

première méthionine.

b En admettant que les 4 ponts disulfure soient intacts. c Indiquant 8 composés 4VP par protéine; pour la xénoxine-1 un signal moins intense donne une masse de 8091,8 0,9 Da, probablement dû à l'addition d'un atome d'oxygène.

d Xénoxine réduite, alkylée avec 8 composants 4VP.

e TCTTIMK, cystéine liée à IMSLPGEQITCCEGNMCNA; en admettant que les 2

ponts disulfure soient intacts.

f CVNLQANGIK, cystéine liée à CLTLR, en admettant que le pont disulfure soit intact.

g IMSLPGEQITCCEGNMCNA, alkylé par 3 composés 4VP.

h CVNLQANGIK, alkylé par un composé 4VP.

i FCASGR, alkylé par un composé 4VP.

j CLTLR, alkylé par un composé 4VP.

k ITCCEGNMCNA, alkylé par 3 composés 4VP.

1 IMSLPGEK

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Exemple 2: Clonage de l'ADN complémentaire codant pour des xénoxines Pour plus de précisions sur les techniques générales de manipulation des acides nucléiques et de clonage moléculaire qui ne sont pas détaillées dans l'exemple qui suit, on peut se reporter à l'ouvrage de Maniatis et coil. (Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990)).

2.1. Synthèse des amorces oligonucléotidiques En utilisant un synthétiseur d'oligonucléotides ABI 380B (Applied Biosystems Inc.) suivant les procédures standards préconisées par le constructeur, 0,2 4mole des oligonucléotides suivants sont synthétisés. Les bases dégénérées sont exprimées selon leur code à une lettre de l'International Union of Biochemistry" (I.U.B.); I correspond à l'inosine.

OTG3278 (5'-ATGTCGACCARGARTGYGCIAARGARGA-3'), ie. brin sens-Q-

E-C-A-K-E-D avec addition d'un site de restriction SalI à l'extrémité 5' afin de faciliter le sous clonage ultérieur; et

OTG3279 (5'-ATAAGCTrCACATRTTCCYTCRCARCA-3'), i.e. brin antisens-C-

C-E-G-N-M-C avec addition d'un site HindIII à l'extrémité 5' afin de faciliter le sous

clonage ultérieur.

Après déprotection, les oligonucléotides sont purifiés sur;à-Bondapak C18 (3,5 mm 2 5 x 300mm; Waters) à l'aide d'un gradient 20% - 30% d'acétonitrile en présence de triéthylamine/acide acétique 100mM, pH 6,9. Les oligonucléotides sont détritylés suivant les conditions standard bien connues par l'homme du métier et quantifiés à l'aide de leur

spectre UV entre 230 et 340 nm.

* 3 o 2.2. Amplification génique De l'ARN messager de Xenopus laevis est obtenu selon la méthode décrite dans K Richter, et coll, J. Biol. Chem. 261, (1986), p 3676 et est alors soumis à une transcription inverse initiée par des amorces dégénérées. On obtient ainsi l'ADNc qui servira de matrice 3 5 pour l'amplification. Une étape d'amplification génique par PCR (Polymerase Chain Reaction) est alors réalisée sur 0,5 pg de l'ADNc dans 50 ul contenant 250 ng des oligonucléotides OTG3278 (brin sens) et OTG3279 (brin anti-sens) synthétisés selon l'exemple 2.1, ainsi que Tris-HCl 10 mM, pH 8,3; chlorure de potassium 10mM;

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dichlorure de magnésium 1,6 mM; DIT 1 mM; 200iM de chacun des désoxyribonucléosides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) (Pharmacia) et 2,5 unités d'ADN Polymérase AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus). Une unité étant la quantité d'enzyme qui permet la synthèse de 10 nmoles d'ADN pendant 30 minutes d'incubation. 30 cycles d'amplification sont réalisés selon le protocole suivant: Lors des 5 premiers cycles: Dénaturation à 93 C pendant 1 minute (3 minutes lors du premier cycle); hybridation des amorces à 50 C pendant 2 minutes; polymérisation effectuée à 72 C pendant 30 secondes, avec une augmentation de température de l C par 20 secondes; Lors des 25 cycles restants: dénaturation à 93 C pendant 1 minute; hybridation à 60 C pendant 1 minute; et

polymérisation à 72 C pendant 45 secondes.

2.3. Analyse En électrophorèse sur gel d'agarose (1%) un aliquot de 5gl du produit de PCR

présente une large bande d'environ 120 paires de base.

2.4. Clonage de l'ADNc-PCR L'ADN restant est soumis à une digestion à l'aide des enzymes de restriction HindIII et Sal, (Gibco-BRL) puis les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille à 3 o l'aide d'agarose à point de fusion bas (agarose type IL, Sigma). Les ADN ainsi séparés sont purifiés et clonés dans un bactériophage M13 selon les procédures standards. Les fragments d'ADNc-PCR ainsi clonés sont utilisés comme sonde pour le criblage de la

banque d'ADNc de peau de Xenopus laevis.

3 5 2.5. Criblage de la banque d'ADNc de peau de Xenopus laevis.

On prépare une sonde marquée au 32p en utilisant le fragment d'ADNc-PCR, PCR1, d'un clone préparé selon l'exemple 2.4. La séquence de l'insert PCR1 est

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représentée dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO: 28. PCR1 est marquée avec a[32P]dATP (Amersham) selon la méthode des amorces aléatoires (Boehringer Mannheim). Pour le criblage, on utilise la banque d'ADNc de la peau de Xenopus laevis construite dans le vecteur d'expression xgtl 1, selon Kuchler et coll., J. Biol. Chem. 265, (1990), p 11731. Des boîtes contenant environ 2 x 104 plages de phage sont préparées et

une empreinte est réalisée sur filtre de nitrocellulose BA85 (Schleicher & Schull).

Les filtres empreintes sont alors hybridés avec la sonde PCR1 32p dans 2 x SET

(chlorure de sodium-EDTA-Tris-HCl), 10 x solution de Denhardt et SDS 0, 1% t à 55 C.

Les clones positifs sont utilisés dans deux criblages consécutifs.

2.6. Séquençage des clones d'ADNc L'ADN des phages positifs est isolé et les inserts d'ADNc sont sous-clonés dans des

vecteurs M13TG130 (Kieny et coll., Gene 26, (1983), p 91) selon les méthodes standards.

2 0 Le séquençage de ces inserts d'ADNc est fait selon la méthode enzymatique de Sanger et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, (1977), p 5463 à l'aide du Sequenase Kit (US Biochemical Corp.) La séquence nucléotidique d'un clone avec un insert d'ADNc constitué de 462 2 5 paires de bases a été établie. Cette séquence est représentée dans la liste des séquences

sous le numéro SEQ ID. NO: 1 et contient un cadre de lecture ouvert codant pour la pré-

xénoxine-1 qui contient 84 acides aminés. Le peptide pré-xénoxine-1 tel que déduit de la séquence d'ADNc commence avec une méthionine d'initiation encodée par le codon ATG (pb 39 à 41), suivie d'un peptide signal de 18 acides aminés qui précède la séquence de la 3 o xénoxine- 1 mature. La séquence d'acides aminés de la xénoxine-1 mature déduite correspond exactement à la séquence complète d'acides aminés déterminée par dégradation d'Edman de la xénoxine-1 purifiée selon l'exemple 1.1 et représentée dans la

liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO: 3.

3 5 Le signal de polyadénylation AATAAA se trouve 12 paires de bases en amont de

l'extrémité 3'.

2.7. Analyse des séquences peptidiques

-25- 2714908

Les séquences des xénoxines ont été comparées à la banque de données SWISS-

PROT/PIR/GBTRAN release 24 en utilisant PROSCAN, Ver.6.0. du logiciel DNA STAR

(DNA STAR Inc).

Cette recherche a seulement permis d'identifier des familles de peptides qui ont une similarité structurelle au niveau du squelette peptidique mais non pas au niveau de l'identité d'acides aminés. Comme illustré à la Figure 3 A, l'identité n'est que de 25,9 % avec un membre représentatif de la famille des cytotoxines, et seulement de 21,3 % avec une neurotoxine courte bien que la configuration des ponts disulfure soit la même. A part les cystéines ce ne sont que Asn5, Thr14 et Asn7T qui sont conservées dans les trois familles de peptides. Les Gly20, Pro5 et Lys51 qui sont communes aux cytotoxines et aux

neurotoxines courtes sont des substitutions non-conservatives comparées aux xénoxines.

Les Arg4l et Gly42 sont délétées chez les xénoxines.

En ce qui concerne le nombre d'acides aminés entre les cystéines on se réfère à la Figure 3B. Pour les trois familles le nombre est comparable du côté N'-termrninal jusqu'au cys3 et à partir du cys6 jusqu'au côté C'terminal. Par contre, chez les xénoxines le nombre de résidus entre cys3 et cys4 est plus petit et entre cys4 et cys5 et entre cys5 et cys6 il est plus

2 o important.

Il existe également une similarité au niveau des cystéines entre les xénoxines et la famille multigénique du alloantigène Ly-6 de murin (K.P. Le Clair et coll., EMBO J. 5, (1986), p 3227). Par contre, l'identité n'est que de 26,0 % pour le fragment Tyr29 à Phe96

2 5 de 67 acides aminés du Ly-6 avec la xénoxine-1.

De même pour la similarité des xénoxines avec la famille à laquelle appartient le facteur humain MACIF (Y. Sugita et coll., J. Biovhem. 106, (1989), p555). Bien que très similaire au niveau des cystéines, l'identité du fragment Tyr3O à Vallo6 de 76 acides aminés

3 o du MACIF n'est que de 20,9 % par rapport à la xénoxine-1.

Comme illustré dans la Figure 4, la partie C'-terminale des xénoxines (Cys37 à Asn65, 29 résidus) comprenant les cys4 à cys8 partage une identité d'acides aminés de 50 %

avec 27 acides aminés (Cys85 à Asnlll) du récepteur humain de l'activine. Du côté N'-

3 5 terminal des xénoxines, on ne retrouve pas d'identité des séquences même pas au niveau

des cystéines.

Exemple 3: Préparation des xénoxines recombinantes

-26- 2714908

3.1. Construction d'un vecteur d'expression de la xénoxine Les xénoxines selon l'invention peuvent être obtenues par des techniques de génie génétique, notamment en utilisant comme cellule hôte des levures Saccharomyces cerevisiae. Pour ce faire on synthétise un fragment d'ADN codant pour la xénoxine-1 mature telle qu'identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 1, allant de la base en position 93 jusqu'à la base en position 290 et cloné dans le bactériophage M13TG131 (M.P. Kieny et coll. , Gene

1 0 26, (1983), p91).

On construit un plasmide d'expression de la xénoxine-1 qui permet la synthèse et la sécrétion par S. cerevisiae selon la demande de brevet internationale PCT/FR90/00306 qui

décrit des peptides signal utiles pour la sécrétion d'une protéine hétérologue par la levure.

Le fragment SphI -SmaI de 1045 paires de bases du bactériophage M13TG3846 décrit dans l'exemple 1.E. de ladite demande de brevet internationale est transféré dans le vecteur M13TG3869 (décrit dans l'exemple 1.D. de la même demande) préalablement digéré par SphI et SmaI. On obtient ainsi le vecteur M13TG4803 qui porte: - le promoteur du gène MFal, suivi d'un codon ATG, - la séquence XII (voir PCT/FR/90/00306), - la séquence "pro" mutée du gène MFal suivi des codons codant pour Lys-Arg,

- la séquence codant pour rHV2Lys47.

Afin de remplacer la séquence codant pour rHV2Lys47 par celle codant pour la xénoxine-1 on introduit un site HindIII dans la séquence codant pour "pro" mutée de MFal

selon l'exemple 3.B. de la demande internationale.

Puis, on introduit un fragment HindIII -BamHI qui porte la séquence codant pour la xénoxine-1 dans ce vecteur préalablement traité par HindIII et BamHI pour éliminer la

séquence codant pour rHV2Lys47.

Le fragment SphI-SalI de M13TG4803 est introduit dans le plasmide pTG3828 (voir exemple 1.B. de la demande internationale) ouvert aux sites SphI et SalI pour donner le vecteur d'expression de la xénoxine-1 qui comporte: la séquence du gène URA3 délétée de son promoteur (URA3-d),

-27- 2714908

le promoteur du gène MFal, suivi d'un ATG, la séquence XII comme peptide signal, la séquence "pro" mutée du gène MFa1 suivi des codons codant pour Lys-Arg, la séquence codant pour la xénoxine-1, - le terminateur de transcription du gène codant pour PGK de la levure, un fragment de pBR322 qui permet la réplication et la sélection chez E. coli, un fragment du plasmide 2g qui possède des éléments structuraux nécessaires à

la réplication et à l'équipartition mitotique dans la levure.

1 0 On transforme une souche de S. cerevisiae que l'on mettra en culture dans des

conditions connues.

3.2. Construction de pTG8709 et analyse de la xénoxine-1 mature secrétée dans le milieu

de culture.

On amplifie par PCR la séquence codant pour la xénoxine-1 mature munie d'un site EagI en 5' et d'un site SalI en 3'. On utilise à titre de matrice M13TG4414 ou pTG4414 (Kolbe et coll., J. Biol. Chem., 268, (1993) p. 16458) et les amorces:

2 0 OTG5770:

'-TACGTCGGCCGTTACAAGAGACTGAAATGTGTGAAITrACAAGCG-3' et

OTG5771:

'-AG'TTGTCGACTCAAGCATTGCACATGTTCCT-3'.

Le fragment ainsi généré est intégré dans M13TG9800 préalablement digéré par EagI et SalI pour donner M13TG8703. Le vecteur M13TG9800 est issu de M13TG131 dans lequel sont insérés les éléments essentiels à l'expression d'une protéine d'intérêt, à savoir:

- Le promoteur du gène MFal suivi d'un codon ATG (Inokuchi et coll., Mol. Cell.

Biol. 7(1987) p.3185) - La séquence pré BGL2 (B-glucanase 2; Klebl et Tanner, J. Bacteriol., 171 (1989) p.

6259).

-28- 2714908

La séquence pro de la défensine A (Dimarcq et coll., EMBO J. 9 (1990) p. 2507) dans laquelle on a introduit, de manière silencieuse, un site EagI à son extrémité 3'

(couvrant les codons précédents ceux codant pour les résidus Lys Arg en 3').

- Des sites de restriction pour l'insertion d'une séquence d'ADN d'intérêt. On introduit le fragment SphI-SalI isolé de M13TG8703 et portant la cassette d'expression de la xénoxine-1 mature entre les mêmes sites de pTG4812 pour obtenir pTG8709. Le vecteur pTG4812 est dérivé de pTG3828 mais comprend en outre une 1 0 cassette pour l'expression du gène KEX2 de levure insérée au niveau de la jonction de la

partie 21i et de la partie pBR322.

pTG8709 est transformé dans une souche Saccharomyces cerevisiae. On peut citer à titre d'exemples TGY47.1 (MATacx, pral, prbl, prcl, cpsl, ura3delta5, leu2-3, leu 2-112, 1 5 his) ou TGY73.4 qui dérive de la précédente mais présente une prototrophie pour la

leucine (Leu d.

On sélectionne un transformant TGY73.4/pTG8709 que l'on cultive à 28 C en milieu sélectif minimum (0,67% de bases azotées pour levure YNB (Yeast Nitrogen Base) sans

acide aminé, 1% de casaminoacides, 2% de glucose et 2% de bactoagar). Après 60 heures de culture, le surnageant de culture est concentré par

ultrafiltration sur membrane YM2/centrifugation selon les techniques conventionnelles. Le concentré est soumis à une electrophorèse dénaturante sur gel de polyacrylamide (15,3 % en polyacrylamide). Les protéines sont transférées sur membrane PVDF et le matériel correspondant au poids moléculaire attendu (environ 7kDa) est soumis à un séquençage

des acides aminés N-terminaux.

On lit, de façon majoritaire, une séquence qui correspond à la séquence N-terminale

attendue pour la xénoxine-1 mature.

-29 -

LISTE DE SEQUENCES

NOMBRE DE SEQUENCES: 28

INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 462 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:

(A) NOM/CLE: CDS

(B) EMPLACEMENT: 39..293

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /codonstart= 39 /product= "prexenoxine-1" /note= "le peptide signal comprend les dix-huit premier residus d'acides amines"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

AAGATGTGCT GTGATTGGTT GAAAGCTTGA GCCACACA ATG CGT TAC GCC ATC 53

Met Arg Tyr Ala Ile

1 5

GTC TTC TTT CTC GTT TGT GTC ATT ACT CTT GGA GAA GCA CTG AAA TGT 101

Val Phe Phe Leu Val Cys Val Ile Thr Leu Gly Glu Ala Leu Lys Cys

15 20

GTG AAT TTA CAA GCG AAT GGA ATA AAG ATG ACA CAA GAG TGT GCA AAG 149

Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Met Thr Gln Glu Cys Ala Lys

30 35

GAG GAT ACC AAA TGC TTA ACA TTA AGA TCA TTA AAA AAA ACT TTA AAG 197

Glu Asp Thr Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys Thr Leu Lys

45 50

TTT TGT GCC TCT GGT CGA ACA TGT ACG ACT ATG AAA ATA ATG TCT TTG 245

Phe Cys Ala Ser Gly Arg Thr Cys Thr Thr Met Lys Ile Met Ser Leu

60 65

CCT GGG GAA CAG ATT ACA TGC TGT GAA GGA AAC ATG TGC AAT GCT TGAGATGATT 300

Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Ala

75 80 85

CTTCCAATGG AGGTTGCCGG GATTTTCTCT TCTCACATGA AGCAATGGCC CTACCAAAAC 360

ATTTGTCCTC TCCTCTCTCC TCTTTTCCCT TCTGTCCACT CTCCTATAGA TACTAGGGTG 420

TAGCTTGATT CCTAATATCC ATTAAATAAA GCACTCAACT GC 462

-30- 2714908

- 30 -

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 84 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

Met Arg Tyr Ala Ile Val Phe Phe Leu Val Cys Val Ile Thr Leu Gly

1 5 10 15

Glu Ala Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Met Thr

25 30

Gln Glu Cys Ala Lys Glu Asp Thr Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu

40 45

Lys Lys Thr Leu Lys Phe Cys Ala Ser Gly Arg Thr Cys Thr Thr Met

55 60

Lys Ile Met Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn

70 75 80

Met Cys Asn Ala

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 66 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Met Thr Gln Glu

1 5 10 15

Cys Ala Lys Glu Asp Thr Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys

25 30

Thr Leu Lys Phe Cys Ala Ser Gly Arg Thr Cys Thr Thr Met Lys Ile

40 45

Met Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys

55 60

Asn Ala

-31 - 2714908

-31-

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Met Thr Gln Glu

1 5 10 15

Cys Ala Lys Glu Asp Asn Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys

25 30

Thr Leu Lys Phe Cys Ala Ser Asp Arg Ile Cys Lys Thr Met Lys Ile

40 45

Met Ser Leu Pro Gly Glu Lys Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys

55 60

Asn Ala

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 66 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Val Lys Met Thr Gln Glu

1 5 10 15

Cys Ala Lys Glu Asp Thr Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys

25 30

Thr Leu Lys Phe Cys Ala Ser Asp Arg Ile Cys Lys Thr Met Lys Ile

40 45

Ala Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys

55 60

Asn Ala

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: -32- (A) LONGUEUR: 37 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..37

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "partie analysee de xenoxine-1, alkylee"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Met Thr Gln Glu

1 5 10 15

Cys Ala Lys Glu Asp Thr Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys

25 30

Thr Leu Lys Phe Cys

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 43 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..43

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, alkylee fragement CNBR1(1)"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Xaa Xaa Gln Glu

1 5 10 15

Cys Ala Lys Glu Asp Thr Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys

25 30

Thr Leu Lys Phe Cys Ala Xaa Xaa Xaa Thr Cys

40

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 31 acides aminés (B) TYPE: acide aminé

- 33 -2714908

- 33 -

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..31

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, alkylee fragment CNBR1(2)"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:

Thr Gln Glu Cys Ala Lys Glu Asp Thr Lys Cys Leu Thr Xaa Arg Ser

1 5 10 15

Leu Lys Lys Thr Leu Lys Phe Cys Ala Xaa Gly Arg Thr Cys Thr

25 30

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 8 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..8

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, alkylee fragment CL1(1)"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:

Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala

1 5

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 12 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..12

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, alkylee fragment CL1(2)"

-34 2714908

-34 -

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:

Ser Leu Lys Lys Thr Leu Lys Phe Cys Ala Ser Gly

1 5 10

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..6

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, fragment T1(1)"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:

Thr Xaa Thr Thr Met Lys

1 5

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 19 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..19

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, fragment T1(2)"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:

Ile Met Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Xaa Xaa Glu Gly Asn Met

1 5 10 15

Xaa Asn Ala

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 13 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire

-35 - 2714908

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..13

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, alkylee fragment CNBR2(1)"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:

Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn

1 5 10

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 16 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..16

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, alkylee fragment CNBR2(2)"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:

* Lys Ile Met Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn

1 5 10 15

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..18

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, alkylee fragment CL2"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:

Ile Met Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met

1 5 10 15

-36- 2714908

-36- Cys Asn

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 56 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..56

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "partie analysee de xenoxine-2, alkylee"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:

Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Met Thr Gln Glu

1 5 10 15

Cys Ala Lys Glu Asp Asn Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys

25 30

Thr Leu Lys Phe Cys Ala Xaa Asp Arg Ile Cys Lys Thr Met Lys Ile

40 45

Met Ser Leu Pro Gly Glu Xaa Ile

55

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 47 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..47

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "partie analysee de xenoxine-2"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:

Leu Lys Xaa Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Met Thr Gln Glu

1 5 10 15

37- 2714908

-37- Xaa Ala Lys Glu Asp Asn Lys Xaa Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys

25 30

Thr Leu Lys Phe Cys Ala Ser Asp Xaa Ile Xaa Lys Thr Met Lys

40 45

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 11 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..11

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-2, alkylee fragment CL3"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:

Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Ala

1 5 10

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 19:

(B) EMPLACEMENT: 1..8

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-2, fragment T3"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:

Ile Met Ser Leu Pro Gly Glu Lys

1 5

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 20:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 acides aminés

-38- 2714908

(B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..20

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "partie analysee de xenoxine-3, alkylee(1)"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:

Leu Xaa Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Xaa Lys Met Xaa Gln Glu

1 5 10 15

Cys Xaa Lys Glu

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 21:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..20

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "partie analysée de xenoxine-3, alkylee(2)"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:

Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Val Lys Met Thr Gln Glu Cys

1 5 10 15

Ala Lys Glu Asp

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 22:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:

- 39 -2714908

- 39 -

(A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..20

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "partie analysée de xenoxine-3, alkylee(3)"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:

Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Val Lys Met Thr Gln Glu Cys Ala

1 5 10 15

Lys Glu Asp Thr

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 23:

(B) EMPLACEMENT: 1..6

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-3, alkylee fragment T4"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:

Phe Cys Ala Ser Asp Arg

1 5

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 24:

(B) EMPLACEMENT: 1..19

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-3, alkylee fragment T5"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:

Ile Ala Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met

1 5 10 15

Cys Asn Ala

-40- 2714908

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 25:

(B) EMPLACEMENT: 1..19

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-3, alkylee fragment T6"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:

Ile Ala Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Xaa Xaa Glu Gly Asn Met

1 5 10 15

Xaa Asn Ala

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 26:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 28 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: modified base

(B) EMPLACEMENT: 20

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /modbase= i (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: miscfeature

(B) EMPLACEMENT: 1..28

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "oligonucleotide

0TG3278"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26:

ATGTCGACCA RGARTGYGCN AARGARGA 28

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 27:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 28 paires de bases

-41- 2714908

(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: modifiedbase

(B) EMPLACEMENT: 17

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /mod base= i (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: miscfeature

(B) EMPLACEMENT: 1..28

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "oligonucleotide

0TG3279"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27:

ATAAGCTTCA CATRTTNCCY TCRCARCA 28

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 28:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 149 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: miscfeature

(B) EMPLACEMENT: 1..149

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "PCR1" /note= "fragment d'ADNc-PCR utilise pour le

criblage decrit dans l'exemple 2.5."

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28:

CAGGAGTGTG CGAAGGAGGA TAACAAATGC TTAACATTAA GATCGTTAAA AAAAACTTTA 60

AAGTTTTGTG CCTCTGATCG AATATGTAAG ACTATGAAAA TAATGTCTCT GCCTGGGGAA 120

AAGATTACAT GCTGCGAAGG CAACATGTG 149

- 42 -

Claims

REVENDICATIONS

1. Peptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés, laquelle: a. contient au moins 8 cystéines qui sont reliées par 4 ponts disulfure suivant la configuration cys l avec cys 3 cys2 avec cys4, cys5 avec cys6 et cys7 avec cye b. contient 0 à 3 acides aminés du côté N'-terminal du cys,19 à 14 acides aminés entre cys let cys 2, 3 à 7 acides aminés entre cys 2et cys 3 11 à 18 acides aminés entre cys 3et cys 4 1 à 6 acides aminés entre cys 'et cys 5 7 à 15 acides aminés entre cys 5 et cys 6 aucun acide aminé entre cys {t cys 73 à 5 acides aminés entre cys 7et cys 8et 0 à 10 acides aminés du côté C'- terminal du cys 8 et c. présente une identité d'acides aminés après alignement, d'au moins 40 % avec la séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3,

ou un fragment dérivé de cette séquence.

2. Peptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés, laquelle a. contient au moins 8 cystéines qui, lorsque le peptide adopte sa conformation repliée, sont reliées par 4 ponts disulfure suivant la configuration cys a'ec cys, 3 cys2 avec cys4, cys5 avec cye et cys7 avec cy$; b. contient 0 à 3 acides aminés du côté N'- terminal du cys,19 à 14 acides aminés entre cys let cys 2, 3 à 7 acides aminés entre cys 2et cys 3 11 à 18 acides aminés entre cys 3et cys 4 1 à 6 acides aminés entre cys 4et cys 5 7 à 15 acides aminés entre cys 5et cys 6 aucun acide aminé entre cys it cys 73 à 5 acides aminés entre cys 7et cys 8et 0 à 10 acides aminés du côté C'-terminal du cys 8 et c. présente une identité d'acides aminés après alignement, d'au moins 40 % avec la séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3,

ou un fragment dérivé de cette séquence.

3. Un peptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés contient 2 acides aminés du côté N'-terminal du cys, 10 à 13 acides aminés

- 43 -

entre cys let cys 2, 4 à 6 acides aminés entre cys 2et cys 312 à 17 acides aminés entre cys3 et cys4, 1 à 5 acides aminés entre cys 4et cys 5 8 à 14 acides aminés entre cys 5et cys6, aucun acide aminé entre cys (et cys 74 acides aminés entre cys &t cys &t 2 acides aminés du côté C'- terminal du cys.8

4. Un peptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence

d'acides aminés présente une identité d'acides aminés d'au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, avec la séquence des aminés identifiée sous le numéro

SEQ ID NO: 3.

5. Un peptide selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'identité d'acides aminés

est au moins 70 %.

6. Un peptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés laquelle contient 0 à 3 acides aminés du côté N'-terminal du cys1, 13 acides aminés entre cys let cys 2 6 acides aminés entre cys êt cys 312 acides aminés entre cys Jt cys 45 acides aminés entre cys St cys,514 acides aminés entre cys 5et cys 6 aucun acide aminé entre cys Et cys,74 acides aminés entre cys eêt cys8 et 0 à 10 acides aminés du côté C'-terminal du cys 8, et qui présente une identité d'acides aminés après alignement, d'au moins 80 %, de préférence 90 %, avec la

séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3.

7. Un peptide selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés comprend une séquence telle que identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 4 ou

SEQID NO: 5.

8. Un peptide selon la revendication 6 caractérisé en ce que l'identité d'acides aminés est au moins 95 % avec la séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro SEQ

ID NO: 3.

9. Un peptide selon la revendication 8, caractérisé en ce que la séquence d'acides

aminés comprend une séquence telle que identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3.

10. Un procédé de préparation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 9,

caractérisé en ce que pour isoler ledit peptide à partir de la matière sécrétée par la peau d'une grenouille, de préférence de Xenopus laevis, 44- a. on divise en fractions la matière sécrétée par la peau de grenouille par précipitation à l'aide de sulfate d'ammonium, ou d'un agent précipitant équivalent, b. on soumet les précipités qui se forment entre 30 % et 70 % de saturation en sulfate d'ammonium, de préférence entre 30 % et 60 %, ou en conditions équivalentes, à une chromatographie par perméation de gel, et c. on récolte la fraction peptidique qui élue tardivement, et si nécessaire, d. on soumet cette fraction peptidique à une chromatographie HPLC d'échange de

cations éventuellement suivi d'une chromatographie HPLC phase inverse.

11. Un fragment d'ADN isolé caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant

pour un peptide selon l'une des revendications 1 à 9.

12. Un fragment d'ADN selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend une

séquence codant pour le précurseur d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 9.

13. Un fragment d'ADN selon la revendication 11, caractérisé en ce que la séquence code pour une séquence d'acides aminés telle que identifiée sous le numéro SEQ ID

NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5.

14. Un fragment d'ADN selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés telle que identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 1 et allant de la base en position 93 jusqu'à la

base en position 290.

15. Un fragment d'ADN selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés telle que identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 1 et allant de l'acide nucléique en position 39

jusqu'à l'acide nucléique en position 290.

16. Une cassette d'expression d'un fragment d'ADN isolé selon l'une des revendications

11 à 15, caractérisé en ce que ledit fragment d'ADN est placé sous le contrôle

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d'éléments permettant sa transcription et/ou sa traduction dans la cellule

transformée consid6rie.

17. Une cassette d'expression selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'eUe comprend en outre une séquence pré et une séquence pro, notamment la séquence

pro de la défensine A de Phornnia terranovaó.

18. Une casseur d'expression selon la revendication 16 ou 17, caractérisée en ce qu'elle

comprend un fragment d'ADN selon la revendication 12.

19. Une cellule transformée avec une cassette d'expression selon l'une des revendications

16 A 18, caractérisée en ce que ladite cassette d'expression est soit intégrée dans le

génome de la cellule tranformnée ou soit portée par un vecteur d'expression.

20. Une cellule transformée selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'ellue est

choisie parmi le groupe constitué de S. ccrcvis/a et E. coU'.

21. Une cellule transformée selon la revendlcation 19, caractérisée en ce que la cellule

est d'origine mammifère.

22. Procédé de préparation d'un peptide selon l'une des revendications 1 A 9. caractérisé

en ce qu'on cultive une cellule transformée selon l'une des revendications 19 à 21 sur

un milieu approprié et l'on récupère le peptide i partir de ladite culture.

23. Composition pharmaceutique à usage humaine ou vétérinaire caractérisée cn cc qu'elle comprend comme agent actif au moins un peptide sclon l'une des

revendications I a 9, un vecteur contenant une cassette d'expression selon l'une des

revendications 16 à 18 ou une cellule transformée selon l'une des revendications 19 à

21. 24. Un anticorps, monoclonal ou polyclonal, caractérisé en co qu'il reconnait un peptide

sWlon l'une des revendications I à 9.