JP2001506495A - 抗微生物活性を有するポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ペプチド（１）：ＦＬＰＬＩＧＲＶＬＳＧＩＬ−アミド、ＬＬＰＩＶＧＮＬＬＫＳＬＬ−アミド、ＬＬＰＩＬＧＮＬＬＮＧＬＬ−アミド、ＬＬＰＩＶＧＮＬＬＮＳＬＬ−アミド、ＶＬＰＩＩＧＮＬＬＮＳＬＬ−アミド、ＦＬＰＬＩＧＫＶＬＳＧＩＬ−アミド、ＦＦＰＶＩＧＲＩＬＮＧＩＬ−アミド、ＬＳＰＮＬＬＫＳＬＬ−アミド、ＬＬＰＮＬＬＫＳＬＬ−アミド、ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＲＩＬ−アミドおよびＧＬＬＳＧＬＫＫＶＧＫＨＶＡＫＮＶＡＶＳＬＭＤＳＬＫＣＫＩＳＧＤＣならびにその機能性誘導体および医薬的に許容される塩から選択されるポリペプチド、これらのポリペプチド１種または２種以上を含有する医薬組成物、およびこのようなポリペプチドを使用する動物における微生物の増殖の阻止方法。

Description

【発明の詳細な説明】 抗微生物活性を有するポリペプチド 本発明は、治療的に使用される新規なポリペプチドならびにその機能性誘導体 および医薬的に許容される塩に関する。これらの新規なポリペプチドはそれ自体 でまたは１種もしくは２種以上のペプチドの組合せて抗細菌剤または抗かび剤と しての用途を有する。 カエルの皮膚分泌物は、多くの様々なタイプの抗細菌性ペプチドを含んでいる （最近の総説として、Barra，D．& Simmaco，M.，Amphibian skin：apromising resource for antimicrobial peptides，Trends Biotechnol．13：205-209，199 5参照）。多様なこの種のペプチドは特にアカガエル属（Rana）の数種から単離 されている。それらはすべて、COOH末端に近く２個のシステイン残基を含有し、 これらが分子内ジスルフィド結合を形成する。これらのペプチドは４種の異なる グループに分けることができる。一つはブレビニン１ファミリーであり、これに はRana brevipoda porsaからのブレビニン１(Morikawa，N.，Hagiwara，K．& Na kajima，T.，Brevinin-1 and Brevinin-2，unique antimicrobial peptides fro m the skin of the frog，Rana brevipoda porsa，Biochem．Biophys．Res．Com mun．189：184-190，1992)，Rana esculentaからのブレビニン１Ｅ(Simmaco，M. ，Mignogna，G.，Barra，D．& Bossa，F.，Antimicrobial peptides from skin secretion of Rana esculenta．Molecular cloning of cDNA encoding esculent in and isolation of new active peptides",J．Biol．Chem．269：11956-11961 ，1994)、Rana catesbeianaからのラナレキシン(Clark，D.P.，Durell，S.，Mal oy，W.L．& Zasloff，M.，Ranalexin，a novel antimicrobial peptide from bu llfrog（Rana catesbeiana）skin，structurally related to the bacterial an tibiotic，polymixin，J．Biol．Chem．269：10849-10855， 1994)、ならびにRana rugosaからのゲグリン５および６（Park，J.M.，Jung，J. -E．& Lee，B.J.，Antimicrobial peptides from the skin of akorean frog，R ana rugosa，Biochem．Biophys．Res．Commun．205：948-954，1994）が包含さ れる。これらのペプチドは20〜24のアミノ酸残基から構成される。それらの抗細 菌活性に加えて、ブレビニン１Ｅおよびラナレキシンはまた、強力な溶血作用も 有する。第二のグループはブレビニン２ペプチドであり、これらは29〜34個のア ミノ酸残基を含有する。R．brevipodaporsaからのブレビニン２（Morikawa，N. ，Hagiwara，K．& Nakajima，T.，Brevinin-1 and Brevinin-2，unique antimic robial peptides from the skin of the frog，Rana brevipoda porsa"，Bioche m．Biophys．Res．Commun．189：184-190，1992）に加え、さらにR．esculenta からの数種類のペプチド(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D．& Bossa，F. ，Anti-microbial peptides from skin secretion of Rana esculenta．Molecul arcloning of cDNA encoding esculentin and isolation of new activepeptide s”，J．Biol．Chem．269：11956-11961，1994)、ゲグリン１〜３（Park，J.M. ，Jung，J.-E．& Lee，B.J.，Antimicrobial peptides from the skin of a kor ean frog，Ranarugosa，Biochem．Biophys．Res．Commun．205：948-954，1994 ）ならびにR．rugosaからのルゴシンＡおよびＢ(Suzuki，S.，Ohe，Y.，Okubo， T.，Kakegawa，T．& Tatemoto，K.，Isolation and characterization of novel antimicrobial peptides，rugosin A．B and C，from the skin of the frog， Rana rugosa，Biochem．Biophys．Res．Commun．212：249-254，1995)はこのフ ァミリーに属する。第三のグループには、37残基ペプチドであるR．esculentaか らのエスキュレンチン２(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D．& Bossa，F. ，Anti-microbial peptides from skin secretion of Rana esculenta．Molecul ar cloning of cDNA encoding esculentin and isolation of new activepeptides ”，J．Biol．Chem．269：11956-11961，1994)、ゲグリン４(Park，J.M.，Jung ，J.-E．& Lee，B.J.，Antimicrobial peptides from the skin of a korean fr og，Rana rugosa，Biochem．Biophys．Res．Commun．205：948-954，1994)、お よびR．rugosaからのルゴシンＣ（Suzuki，S.，Ohe，Y.，Okubo，T.，Kakegawa ，T.& Tatemoto，K.，Isolation and characterization of novel antimicrobia l peptides，rugosin A，B and C，from the skin of the frog，Ranarugosa，B iochem．Biophys．Res．Commun．212：249-254，1995）がある。最後に、46アミ ノ酸残基のペプチドであり、これまでに性質が明らかにされたすべてのアカガエ ル属ペプチド中で最も高い抗細菌活性を有するR．esculentaの皮膚分泌物から得 られているエスキュレンチン１（Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D．& Bos sa，F.，Antimicrobial peptides from skins ecretion of Rana esculenta．Mo lecular cloning of cDNA encoding esculentin and isolation of new active peptides，J．Biol．Chem．269：11956-11961，1994）がある。それはさらにCan dida albicans，Saccharomyces cerevisiaeおよびPseudomonasaeruginosaに対し ても活性である。 本発明の目的は抗微生物活性を有する比較的小分子のポリペプチドを提供する ことにある。 本発明の他の目的は、抗細菌剤または抗かび剤としての用途を有するこのよう な新規のポリペプチドを提供することにある。 本発明のさらに他の目的は、このようなポリペプチドの１種または２種以上を 医薬的に許容されるマトリックス中に含有してなる医薬組成物を提供することに ある。 本発明のさらに他の目的は、動物たとえばヒトを含めた哺乳動物における 微生物の増殖を阻害する方法を提供することにある。 これらのおよび以下の開示から明らかになる他の目的のために、本発明は以下 の新規なペプチドを提供する。 ＦＬＰＬＩＧＲＶＬＳＧＩＬ−アミド、 ＬＬＰＩＶＧＮＬＬＫＳＬＬ−アミド、 ＬＬＰＩＬＧＮＬＬＮＧＬＬ−アミド、 ＬＬＰＩＶＧＮＬＬＮＳＬＬ−アミド、 ＶＬＰＩＩＧＮＬＬＮＳＬＬ−アミド、 ＦＬＰＬＩＧＫＶＬＳＧＩＬ−アミド、 ＦＦＰＶＩＧＲＩＬＮＧＩＬ−アミド、 ＬＳＰＮＬＬＫＳＬＬ−アミド、 ＬＬＰＮＬＬＫＳＬＬ−アミド、 ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＲＩＬ−アミド、 ＧＬＬＳＧＬＫＫＶＧＫＨＶＡＫＮＶＡＶＳＬＭＤＳＬＫＣＫＩＳＧＤＣ。 特に好ましいポリペプチドは以下の通りである。 ＦＬＰＬＩＧＲＶＬＳＧＩＬ−アミド、 ＬＬＰＩＶＧＮＬＬＫＳＬＬ−アミド、 ＦＬＰＬＩＧＫＶＬＳＧＩＬ−アミド、 ＦＦＰＶＩＧＲＩＬＮＧＩＬ−アミド、 ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＲＩＬ−アミド。 本発明の範囲内にはまた、上述のポリペプチドの機能的誘導体および医薬的に 許容される塩も包含される。 本発明によるポリペプチドは、それぞれそれ自体で使用可能であるか、または ２種またはそれ以上のポリペプチドの組合わせとして使用することができる。 本発明のポリペプチドは、たとえば抗細菌剤または抗かび剤としての用途を含 む抗微生物的用途により治療的に有用である。 本発明はまた、抗微生物活性を有する医薬の製造のための上に開示されたポリ ペプチド１種または２種以上の使用を提供する。 さらに、本発明は、活性成分として上述のポリペプチド１種または２種以上の 有効量を医薬的に許容される担体または希釈剤とともに含有してなる医薬組成物 を提供する。上記担体または希釈剤は、経口、静脈内、筋肉内または皮下投与に 適当に適用される。 本発明によればまた、以下に開示されるようにクローンＲｔ−５、Ｒｔ−６お よびＲｔ−17として示す配列から選択される配列を有するcDNAクローンを提供す る。 最後に、本発明は、動物たとえばヒトを含めた哺乳動物における微生物の増殖 を阻害する方法において、微生物の攻撃によって生じる障害に罹患しやすい動物 対象に上述のポリペプチドの１種もしくは２種以上またはその組成物の阻害量を 投与する工程からなる方法を提供する。 このような方法は徐放性の形態とした上に定義された組成物の経口投与のより 構成される腸での使用を意図することができる。この方法はまた、注射用の剤形 の組成物の注射による投与を意図することもできる。 「その機能的誘導体」の表現に関しては、本発明の関連する技術分野において は周知であるように、ポリペプチドの機能に全くまたは実質的に影響を与えない 微小なアミノ酸置換をポリペプチドに実施できることを意味する。 考えられる置換の決定は本技術分野の熟練者には周知の操作に従って達成される 。すなわち、実質的に同じアミノ酸配列、実質的に同じラセン構造ならびに実質 的に同じ生物活性たとえば抗微生物および溶菌活性を有するすべてのポリペプチ ドは本発明の範囲内に包含される。 同様に本発明のポリペプチドの医薬的に許容される塩も本発明の範囲内に包含 される。このような塩は熟練した技術者に周知の方法により形成される。すなわ ちポリペプチドのたとえば塩基塩は慣用の方法に従って製造することができる。 請求の範囲を含めて本開示においてポリペプチドの語が使用された場合、その語 は機能性誘導体および医薬的に許容される塩の両者を包含する意図である。 本発明の活性なポリペプチドは、治療的または予防的目的で医薬または獣医薬 としての使用のために製剤化することができる。活性なポリペプチドは通常、活 性成分と医薬的に許容される担体を配合してなる医薬製剤または組成物の形態、 たとえば固体、半固体もしくは液体、または経口投与の場合にはカプセル中に含 有させた形態で、経口的に、経直腸的にまたは非経口的たとえば注射により投与 される。投与はまた局所投与の形態とすることもできる。医薬製剤の例としては 錠剤、点滴剤、液剤および坐剤を挙げることができる。通常、活性成分は製剤の 微小部分、たとえばその約0.1％〜約50重量％を構成する。 経口的に適用される用量単位の形態に医薬組成物を製造するためには、本発明 のポリペプチドを固体、粉末または他の担体、たとえばラクトース、サッカロー ス、ソルビトール、マンニトール、デンプンたとえば馬鈴薯デンプン、トーモロ コシデンプン、ミロペクチン、セルロース誘導体またはゼラチンと混合し、また 滑沢剤たとえばステアリン酸マグネシウムまたはカルシウムまたはポリエチレン グリコールワックスを含有させ、圧縮し錠剤または糖衣錠の核を形成させること ができる。用量単位はまた腸溶性のコーティング型で提供することもできる。 担体または希釈剤の幾つかの層を用いることにより、徐放性に働く錠剤を調製 することができる。 経口的適用または注射用の液体製剤はエリキシール、シロップまたは懸濁液の 形態、たとえば0.1〜20重量％の活性物質、糖ならびにエタノール、水、グリセ ロール、ポリエチレングリコール、および場合により慣用の他の添加物を含有す る溶液に調製することができる。 活性成分が投与される用量は広範囲の限界内で変動させることが可能であり、 様々な因子たとえば障害の重症度，患者の年齢および体重に依存し、個々に調整 することができる。 本発明による新規なポリペプチドの発見には、中央ヨーロッパの多くの部分で 見出されるアカガエルRana temporariaの皮膚を使用した。このカエルの皮膚か ら調製したcDNAライブラリーをR.esculentaからのエスレンチン１の前駆体のシ グナルペプチドをコードするDNAフラグメントでスクリーニングした。このアプ ローチを用いて、新規なペプチドの前駆体をコードする可能性がある挿入体をも つ数種のクローンを単離することができた。R.temporariaの皮膚分泌物から単離 することができた新規なペプチドはテンポラリンと命名され、それ自体でまたは 相乗的な配合物として生物活性たとえば抗細菌活性をもつことが見出された。 本発明を次に、以下の開示すなわち非限定的実施例によってさらに説明する。 この開示は図面を参照して行われる。 図１（配列表）は、３種のクローンおよびその中に存在する挿入体、ならびに 推定アミノ酸配列を示す。 図２（添付図面１）には、R．temporariaの皮膚分泌物の逆相HPLCクロマトグ ラフィーのダイアグラムを示す。 材料および方法 酵素および試薬：分析用化学物質はMerckから、HPLC用の溶媒はCarloErbaから 、配列決定用の化学物質はPerkin Elmerから入手した。抗微生物アッ セイ用の培地はDifcoから、アガロース（A6013）はSigmaから購入した。制限酵 素およびDNA修飾酵素はBoehringer Mannheimから、デオキシリボヌクレオチドは Pharmaciaから入手した。DNA配列は［a-³⁵S］dATPを用い「シクエナーゼキット 」(バージョン2.0，U.S．Biochemicals)によって決定した。合成ペプチドはTANA Laboratories（Huston，USA）から購入した。 RNAの単離およびクローニング操作：これらの試験には、R．temporariaの２種 の皮膚を使用した。ポリ(Ａ)−濃縮RNAのオリゴ(dT)−セルロース上親和性クロ マトグラフィーによる単離およびcDNAライブラリーの調製はRichterら（Richter ，K.，Egger，R．& Kreil，G.，Molecular cloning of a cDNA encoding the bo mbesin precursor in skin of Bombina variegata，FEBS Lett．262：353-355， 1990b）に従って実施した。 約10,000個のクローンからなるcDNAライブラリーをエスキュレンチン１のcDNA をHindIIIにより消化して得られた240bpフラグメント（Simmaco，M.，Mignogna ，G.，Barra，D．& Bossa，F.，Antimicrobial peptides from skin secretion of Rana esculenta．Molecular cloning of cDNA encoding esculentin and iso lation of new active peptides，J．Biol.Chem．269:11956-11961，1994）によ ってスクリーニングした。このフラグメントはエスキュレンチン１前駆体のプレ プロ領域をコードする。プローブはランダムプライミングによって標識した(Boe hringer Mannheim)。ハイブリダイゼーションは、850mM NaCl、１mM EDTA、10× デンハルト溶液、0.1％SDSおよび100mg／mlの酵母tRNAを含有する100mMリン酸ナ トリウム緩衝液，pH7.2中55℃で16時間行った。ろ紙（Whatman 541，11cm×11cm ）は、SSPE(0.3Ｍ NaCl，20mMリン酸ナトリウム，pH7.4，2mM EDTA)、0.2％SDS で50℃において15分間洗浄した。陽性のクローンを選択し、制限酵素切断および ヌクレオチド配列決定によって分析した。 ノーザンブロット分析：ポリ(Ａ)一濃縮ＲＮＡ（５mg）を0.8Ｍホルムアルデ ヒドを含有する1.2％アガロースゲル中電気泳動によって分画化し(Arrand,J.E. ，Preparation of nucleic acid probes，in Nucleic acid hybridization：a p ractical approach（Hames，B.D．& Higgins，S.J.，eds）pp．17-45，IRL Pres s，Oxford)、Nytranシート（Schleicher & Schuell）上に直接ブロッティングし た。クローンRt−17の挿入体をランダムプライミングで標識し、ノーザンブロッ トのプロービングに使用した。ろ液は0.1×SSPE，0.1％SDS中55℃で洗浄し、つ いでオートラジオグラフィーに用いた。 皮膚分泌物の収集および精製：R．temporaria（それぞれ30〜35ｇ）の３種をS alzburg（Austria）の近辺で捕獲した。それらは本発明者らの実験室の飼育箱に １年間維持し、ゴミムシダマシの幼虫で飼育した。皮膚の分泌物は３週間隔で穏 和な電気ショック（12V，足から頭へ）により収集した。分泌物は１匹のカエル の表面からその背部を0.05容量％の酢酸で洗浄して収集した。３匹のカエルの分 泌物を合わせて凍結乾燥した。適当なアリコートをBeckman 332型システム上逆 相カラム（AquaporeRP-300，７mm×250mm，Applied Biosystems）を使用し、0.2 容量％トリフルオロ酢酸中10〜70％のアセトニトリル／イソプロパノール（４： １）の勾配により流速1.8ml／分で溶出させるHPLCによって分画化した。ペプチ ドの溶出はBeckman 165分光光度計により220nmでモニタリングした。ピークの分 画を集めて凍結乾燥した。各ピークの小アリコートをＮ−末端分析に付し、つい でダンシルクロリドにより誘導体化して逆相HPLCで分離した(Simmaco，M.，De B iase，D.，Barra,D．& Bossa，F.，“Automated amino acid analysis and dete rmination of amidated residues using pre-column derivatization with dans yl-chloride and reverse-phase high performance liquid chromatography"，J．Chromatogr．504：129-138，1990b)。ペプチドの更なる精 製はマクロポーラスなC₁₈カラム（4.6mm×150mm，Supelco）を用い、上述したの と同じ溶媒系の適宜改変した勾配によって展開した。 構造分析：アミノ酸分析は，ペプチド（１〜２nmol）を６Ｎ HCl中で24時間気 相加水分解したのち、イオン交換カラムおよびニンヒドリン誘導体化装置を装着 したBeckman System Goldアナライザーによって実施した。ペプチドの配列はPer kin-Elmer AB476A型シーケンサーを用い自動化Edman分解によって決定した。場 合によって、Ｃ末端のアミド化状態に関する情報をマススペクトル分析および／ またはカルボキシペプチダーゼＹ消化によって確認した(Simmaco，M.，DeBiase ，D.，Barra，D．& Bossa，F.，Automated amino acid analysis and determina tion of amidated residues using pre-column derivatization with dansyl-ch loride and reverse-phase high performance liquid chromatography，J．Chro matogr．504：129-138，1990b)。 抗微生物アッセイ：抗細菌活性は２×10⁵個の生存細菌を接種したＬＢブロス ／１％アガロースプレート上における阻止域アッセイ（Hultmark,D.， Insect immunity．Attacin，a family on antibacterial proteins from Hyulop hora cecropin，EMBO J．2：571-576，1983）を用いBacillus megaterium BM11 ，Staphylococcus aureus Cowahl，Staphylococcus pyogenes b hemolytic grou p A，Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692，Escherichia coli D21，E.coli D21 e7，E.coli D21f1，E.coliD21f2およびE.coli D22に対して試験した。Candida a lbicans ATCC 10261の新鮮な培養液をＷＢブロース、pH6.5に接種し、37℃でほ ぼ0.6 OD₆₀₀に達するまで増殖させた。プレーティングの前に、培養液を300倍に 希釈し、ついで、アミ ノ酸分析によって確立された濃度の試験ペプチドの存在下、37℃において一夜イ ンキュベートした。阻止域を測定し、試験物質の系列希釈において得られた阻止 域の直径から致死濃度（ＬＣ，増殖を阻止する最低濃度）を、 & Boman，H.G.，Insect immunity．Attacin，a family on antibacterial prote ins from Hyulophora cecropin，EMBO J．2：571-576，1983に与えられた式から 計算した。値は１希釈工程未満の相違内での少なくとも５回の実験の平均として 表す。 円二色性の測定：ＣＤの測定は、光路長２mmの石英セルを用い、DP520プロセ ッサーを装着したJasco J710分光偏光計によって20℃で行った。ＣＤスペクトル は３回の一連の走査の平均とした。楕円率は、deg・cm²dmol^-1で表した平均モル 残留楕円率として記録される。ペプチド濃度はアミノ酸分析によって決定した。 結果 前駆体をコードするcDNAクローンの分析：エスキュレンチン１前駆体のシグナ ルペプチドおよびプロ部分をコードする240bp HindIIIフラグメントをプローブ として使用して、R．temporariaの皮膚から調製されたcDNAライブラリーをスク リーニングした。６個の陽性のクローンが検出された。クローンＲｔ−５、Ｒｔ −６およびＲｔ−17中に存在する挿入体の配列を図１（後記配列表）に示す。ポ リ(Ａ)テイルを除いて、これらのcDNAはそれぞれ323、356および329のヌクレオ チドから構成される。最初のメチオニンコドンののちに、それらは58(Ｒｔ−６) または61アミノ酸（Ｒｔ−５およびRt−17）を含有するポリペプチドに翻訳でき るオープンリーディングフレームを含んでいる。推定された配列はすべてペプチ ド前駆体に典型的な特徴を有する。それらは疎水性残基クラスターを含有するシ グナルペプチドに始まる。シグナル ペプチドの切断部位は位置22のシステイン残基の後に位置するとするのが最も考 えやすい(von Heine，G.，Patterns of amino acids near signal-sequence cle avage sites，Eur．J．Biochem．133：17-21，1983)。推定される成熟ペプチド の配列はプロホルモンコンバーターゼの典型的なプロセッシング部位であるLys −Argによって先行される。これらのすべての前駆体ポリペプチドは配列Gly−Ly sにより終結する。カルボキシペプチダーゼＥによる加水分解により、COOH末端 アミドの形成に必要なＣ末端グリシンが露出される。予想される最終産物は，ク ローンＲｔ−５およびＲｔ−17については13アミノ酸を含有するアミド化ペプチ ドであり、一方Ｒｔ−６についてはこの領域に９bpの欠失を有し、したがってデ カペプチドがコードされるのみである。 ノーザンブロット分析：R．temporariaの皮膚からのポリ(Ａ)−濃縮RNAでは、 クローンＲｔ−17から誘導されたプローブにより認識される豊富なメッセージが 400〜500ヌクレオチドの範囲のかなり単一広いバンドとして検出された。同じ条 件下に、他の両生類種、たとえばR.esculennta，XenopuslaevisおよびBufo viri disの皮膚からはシグナルは得られなかった。 皮膚分泌物からのペプチドの単離および分析：R．temporariaの３種の電気刺 激後に、約20mgの凍結乾燥物質を得ることができた。予備的なHPLC精製（図２＝ 添付図面１）後に、各分画をＮ末端分析に付し、cDNA配列から予想されたアミノ 末端LeuまたはPheをもつ配列を同定した。関連分画をHPLCによりさらに精製し、 アミノ酸および配列分析に付した。このアプローチののちに、３種の予想された 配列が分泌物中に実際に存在することが見出された。これらのペプチドに構造的 に類似する他の分子も単離された。テンポリンと命名されたこれらのペプチド配 列を表１に示す。この表中、分泌物から回収された各ペプチドの量も掲載する。 図２に記録したHPLCプロファイルととも に、各種ペプチドの溶出位置を指示する。そのＮ末端にValを有し、一部テンポ リンＤと共溶出するテンポリンＥの構造も表に示す。テンポリンはすべて、前駆 体の構造（上記参照）から予測されたようにそれらのＣ末端がアミド化され、豊 富に疎水性アミノ酸を含有する。これらのペプチドは、10残基長のテンポリンＨ およびＫの例外を除いて13個の残基を含有する。テンポリンＣ、ＤおよびＥを除 いて、これらのペプチドはすべて少なくとも１個の塩基性残基（LysまたはArg） を有する。この分析の過程で、22−残基をもつペプチドも発見された(表１参照) 。その配列はミツバチ毒液からの溶血性ペプチド、メリチン（Haberman，E.，Be e and wasp venoms，Science 251：1481-1485，1972）に類似する部分を示す。 したがって、メリチン様ペプチド（MLP）と命名された。 生物活性のアッセイ：精製されたテンポリンは最初、B．megateriumおよびE.c oli D21に対する抗微生物活性が試験された。テンポリンＡ、Ｂ、Ｆ、Ｇおよび Ｌは両細菌種に活性であったが、テンポリンＣ、Ｄ、Ｅ、ＨおよびＫは最も感受 性の高い細菌であるB．megateriumにある程度の活性を示すのみであった。 一部のテンポリンが回収される量はきわめて少ないのでそれらの生物学的性質 の詳細を明らかにすることはできなかった。構造の確認とさらに大量の材料を得 るために、テンポリンＡ、Ｂ、ＤおよびＨを化学的に合成した。致死濃度の値で 示した合成テンポリンＡおよびＢの抗微生物活性は、赤血球の溶解に対して得ら れた結果とともに表２に記載する。参考としてR.esulentaからのエスレンチン１ (Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D．& Bossa，F.，Antimicrobial peptide s from skin secretion of Rana esculenta．Molecular cloning of cDNA encod ing esculentin and isolation of new activepeptides，J．Biol．Chem．269： 11956-11961，1994)、昆虫の血 A.，Bennich，H．& Boman，H.G.，Sequence and specificity of two antibacte rial proteins involved in insect immunity，Nature 292：246-248，1981）お よびミツバチ毒液からのメリチン（Haberman，E.，Bee and wasp venoms，Scien ce251：1481-1485，1972）を包含する。 合成テンポリンＡおよびＢはそれらの天然の相当物質と同じ活性を示したが、 テンポリンＤおよびＨはそれら自体の生物活性も他のカエルペプチドの増強剤と しても何らの活性も見出されなかった。テンポリンＡはテンポリンＢに比較して S．aureusおよびS．pyrogenesに対しては約３倍の活性を示す。他方、これらの ２種のテンポリンはE.coli D21に対しては弱い活性しか示さず、P．aeruginosa に対しては完全に不活性であった。これは、テンポリンＡおよびＢが特にグラム 陽性菌に特異的に作用することを指示している。 セクロピンのように直鎖状の硫黄を含まない抗細菌ペプチドはかびに対して不 活性であるが、デフェンシン（３個のＳ−Ｓ橋を有する）は抗かび活性を示す。 テンポリンＡおよびＢはC．albicansに対し活性で、それらの強度は南米産のカ エルPhyllomedusa Sauvagei（Mor，A.，Hani，K．& Nicolas，P.，The vertebra te peptide antibiotics dermaseptins have overlapping structural features but target specific microorganisms，J．Biol．Chem．269：31635-61641，19 94）について報告されているのと同じオーダーである。 テンポリンＡおよびＢの抗細菌活性はＬＰＳの側鎖の欠失が順次増加していく 連続的な突然変異を有する大腸菌の３種の株、Ｄ21、Ｄ21ｅ７、Ｄ21f１および Ｄ21f２（Boman，H.G．& Monner，D.A.，Characterization of lipopolysacchar ides from Escherichia coli K12 mutants，J．Bacteriol． 121：455-464，1075）に対しても試験した。株Ｄ22はenvＡ遺伝子における突然 変異により透過性外膜を有する(Normark，S.，Boman,H.G．& Matsson，E.，Muta nt of Escherichia coli with anomalous cell division and ability to decre ase episomally and chromosomally mediated resistance to ampicillin and s everal antibiotics．J．Bacteriol．97：1334-1342，1969)。テンポリンの活性 は、基底培地Ｅの不存在下もしくは存在下にテストした(Vogel，H.J．& Bonner ，D.M.，Acetylornithinase of Escherichia coli：partial purification and someproperties，J．Biol．Chem．218：97-106，1956)。 表３の結果は培地Ｅが試験したすべての株でテンポリンの活性を増大させるこ とを示している。ＣＤスペクトルは、以前にFALL−39で見出されているように（ Ageberth，G.，Gunne，H.，Odeberg，J.，Kogner，P.，Boman，H.G & Gudmundss on，G.H.，FALL-39，a putative human peptide antibiotic，is cysteine-free and expressed in bone marrow and testis，Proc．Natl Acad．Sci．USA 92： 195-199，1995）活性の増大がヘリックス形成の上昇に相関することを示した。 本明細書で用いられる「機能的誘導体」の語には、遊離のカルボキシル基を有 するペプチドおよび酸付加塩も包含される。したがって、本発明は開示された特 定のペプチドに限定されるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 14/46 14/46 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｅ，ＤＫ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＷ (72)発明者 ジマーコ，マウリツィオ イタリア国イ―00185 ローマ．ラ・サピ エンツァ・ピアッツァーレ・アールド・モ ロ．デパートメント・オブ・バイオケミカ ル・サイエンセズ．ユニヴァーシティ・オ ブ・ローマ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下のペプチド： ＦＬＰＬＩＧＲＶＬＳＧＩＬ−アミド、 ＬＬＰＩＶＧＮＬＬＫＳＬＬ−アミド、 ＬＬＰＩＬＧＮＬＬＮＧＬＬ−アミド、 ＬＬＰＩＶＧＮＬＬＮＳＬＬ−アミド、 ＶＬＰＩＩＧＮＬＬＮＳＬＬ−アミド、 ＦＬＰＬＩＧＫＶＬＳＧＩＬ−アミド、 ＦＦＰＶＩＧＲＩＬＮＧＩＬ−アミド、 ＬＳＰＮＬＬＫＳＬＬ−アミド、 ＬＬＰＮＬＬＫＳＬＬ−アミド、 ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＲＩＬ−アミド、 ＧＬＬＳＧＬＫＫＶＧＫＨＶＡＫＮＶＡＶＳＬＭＤＳＬＫＣＫＩＳＧＤＣ ならびにその機能的誘導体および医薬的に許容される塩から選択されるポリペ プチド。 ２．治療的に使用するための請求項１記載の１種または２種以上のポリペプチド 。 ３．抗微生物剤として使用するための請求項２記載の１種または２種以上のポリ ペプチド。 ４．抗細菌剤または抗かび剤として使用するための請求項４記載の１種または２ 種以上のポリペプチド。 ５．抗微生物活性を有する医薬の製造のための請求項１〜４のいずれかに記載の １種または２種以上のポリペプチドの使用． ６．医薬は抗細菌活性または抗かび活性を有する請求項５記載の使用。 ７．活性成分として請求項１記載の１種または２種以上のポリペプチドの有 効量を医薬的に許容される担体または希釈剤とともに含有する医薬組成物。 ８．上記量は抗微生物的に活性な量である請求項７記載の医薬組成物。 ９．上記量は抗細菌的にまたは抗かび的に活性な量である請求項８記載の医薬組 成物。 10．担体または希釈剤は経口投与、静脈内投与、筋肉内投与または皮下投与に適 合する請求項７〜９のいずれかに記載の医薬組成物。 11．クローンＲｔ−５、Ｒｔ−６およびＲｔ−１７として示した配列から選択さ れる配列を有するcDNAクローン。 12．動物たとえばヒトを含む哺乳動物における微生物の増殖を阻止する方法にお いて、微生物の攻撃により生じる障害に罹患しやすい動物対象に請求項１記載の １種もしくは２種以上のポリペプチドまたは請求項７〜１０のいずれかに記載の 組成物の阻止有効量を投与する工程からなる方法。 13．細菌またはかびの増殖を阻止する請求項１２記載の方法。 14．注射用剤形である請求項７〜１０のいずれかに記載の組成物を注射によって 投与する請求項１２または１３記載の方法。