CN107921103A

CN107921103A - 涉及长半衰期凝血复合物的方法和组合物

Info

Publication number: CN107921103A
Application number: CN201680050833.6A
Authority: CN
Inventors: J·凯利
Original assignee: Cellular Machinery Ltd By Share Ltd
Current assignee: Cellular Machinery Ltd By Share Ltd
Priority date: 2015-08-12
Filing date: 2016-08-10
Publication date: 2018-04-17
Also published as: JP2018529760A; KR20180031775A; US10596232B2; BR112018002838A2; EP3334452A4; EP3334452A1; CA2994971A1; AU2016304842A1; IL257406A; US20180228872A1; WO2017027545A1; US20200289624A1

Abstract

本文公开了涉及凝血因子复合物的方法和组合物，所述凝血因子复合物包含凝血因子；融合蛋白；以及修饰分子，其中所述修饰分子以允许被所述融合蛋白结合的这样一种方式与所述凝血因子偶联，由此产生修饰的凝血因子；其中所述修饰的凝血因子和所述融合蛋白在至少两个独立的位点中相互作用。

Description

涉及长半衰期凝血复合物的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年8月12日提交的美国临时申请号62/203,973的优先权权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。

背景

血液凝固由一系列非常复杂的检查和平衡控制，以使得仅在出血时触发凝血(Smith,Travers,&Morrissey,2015)。损伤引起这些酶的活化，从而导致密封伤口的反应的放大级联。血友病由编码这些蛋白质中的一种的基因中的缺陷引起，以使得级联过早中断并继续出血。血友病、A型血友病、B型血友病和冯维勒布兰德病(Willebrand’s disease)的最常见形式长期一直通过纯化的因子浓缩物的输注治疗，从而置换缺陷酶并恢复血液凝结的能力。

输注因子非常有效，从而允许本来可能在童年死亡的患病个体具有正常预期寿命(Hoots，2003)。随着越来越多地使用预防措施，即定期输注因子以维持合理的保护水平，这些患者可过上基本正常的生活(Srivastava等人，2012)。这并非没有代价，字面上地和比喻地。由于因子VIII(FVIII)(在所述形式的疾病中缺失的蛋白质)的短循环半衰期，所以患有严重A型血友病的患者需要每隔一天输注因子。这产生许多问题，如持续的静脉通路和不依从。

另一个非常严重的问题在患者产生针对输注的FVIII的抑制性抗体时遇到(Kempton&Meeks，2014)。约30％的所有A型血友病患者在其治疗中的某一时刻将产生抗体，但约5％发展如此严重的抑制剂问题，以致于FVIII输注不再有效。这需要使用“旁路”疗法。凝血因子VIIa(FVIIa)是凝血级联的引发剂中的一种并且可用于在所述过程中避开对FVIII或因子IX(FIX)的需求。这需要非常高浓度的FVIIa和非常频繁的给药，因为FVIIa具有仅两个小时的循环半衰期。

由于这些原因和其他原因，较长的半衰期因子是非常合乎需要的(Pipe，2010)。不太频繁的给药应改善依从性、静脉通路问题并使患者暴露于较小量的纯化蛋白质，从而可能减少抑制剂形成。此外，半衰期较长的蛋白质可使治疗扩展至全球估计70％的尚未接受治疗的血友病患者。成本因素是主要问题，血友病患者、尤其是儿童所需的复杂医疗服务也是主要问题。由于因子需要静脉输注而不是简单地皮下注射，所以患有严重疾病的儿童最常在专门的血友病治疗中心进行治疗。他们的治疗的明显障碍是，他们必须每周多次被运送至所述，在欠发达国家这可使治疗无法到达。持续较长时间段的因子可使这些旅程减少至每周一次或甚至每月两次。

一段时间以来这一问题已被认识到，并且已经存在许多尝试来延长因子的半衰期。存在两种用于增加治疗性蛋白质的半衰期的常用策略。首先是用聚乙二醇的链修饰蛋白质，通常称为聚乙二醇化(Ginn,Khalili，Lever和Brocchini，2014)。PEG链增加蛋白质周围的水合水，这导致对某些受体和抗体的亲和力降低。第二种策略是经由将靶蛋白与免疫球蛋白或人血清白蛋白的Fc部分融合来利用新生儿Fc受体(FcRN)(Andersen等人，2011)。由于它们与FcRN的相互作用以及受FcRN保护，所以免疫球蛋白和白蛋白两者均具有长循环半衰期。当白蛋白或免疫球蛋白内化于各种细胞中时，它们与FcRN结合并被再循环至表面而不是被降解。因此这两种蛋白质均具有数周的半衰期。

这些策略已成功用于增加人因子IX(在B型血友病中涉及的蛋白质)的半衰期(Mannucci和Mancuso，2014)。它们一直在延长FVIII的半衰期方面不太成功(Buyue等人，2014；Stennicke等人，2013)。FVIII本身是一种不稳定的蛋白质并且需要存在冯维勒布兰德因子(vWF)。在vWF不存在下FVIII具有仅几分钟的半衰期。复合物的半衰期由vWF的半衰期决定，因此对FVIII的修饰仅具有很小的作用，将半衰期从12小时增加至18小时。

类似的策略已被尝试用于FVIIa，包括聚乙二醇化、与白蛋白和Fc融合(Oldenburg和Albert，2014；Schulte，2008；van der Flier等人，2015)。这些修饰中的每一种都使半衰期从2小时增加至超过10小时，但未能解决FVIIa的另一个问题。FVIIa在与组织因子(TF)的复合物中最具活性。在不存在TF的情况下，需要非常高浓度的FVIIa来实现止血。在工程化FVIIa的一些情况下，这已经导致抑制剂形成。

因此，需要用于长半衰期凝血复合物的组合物和方法。

概述

本文公开了一种凝血因子复合物，所述凝血因子复合物包含：凝血因子；融合蛋白，所述融合蛋白包含与白蛋白或白蛋白片段融合的第一蛋白质；以及修饰分子，其中所述修饰分子以允许被所述融合蛋白结合的这样一种方式与所述凝血因子偶联，由此产生修饰的凝血因子；其中所述修饰的凝血因子和所述融合蛋白在至少两个独立的位点中相互作用。

公开了包括本文公开的凝血因子复合物的试剂盒。

还公开了治疗患有需要凝血因子输注的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的凝血因子复合物。所述疾病例如可以是血友病。向所述受试者施用所述凝血因子复合物可使得所述凝血因子复合物的血液水平半衰期大于在单独施用所述凝血因子时获得的血液水平半衰期。所述凝血因子复合物可经由注射、吸入、鼻内或口服施用至受试者。

本发明的一个或多个实施方案的细节在附图以及下文说明中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将是从说明书和附图以及权利要求清楚的。

附图描述

图1示出用于构建长半衰期凝血因子VIII(凝血因子复合物，包括修饰的凝血因子)的方案。

图2示出用于构建长半衰期、高活性凝血因子VIIa(凝血因子复合物，包括修饰的凝血因子)的示意图。

图3A和3B示出修饰分子与FVIII的连接不干扰其活性。图3A示出用马来酰亚胺-PEG1000-月桂酸酯或马来酰亚胺-PEG1000-异硫氰酸荧光素修饰的FVIII展示与未修饰的FVIII相同的活性。图3B示出未处理的FVIII、经受相同实验条件但无修饰分子的FVIII以及用修饰分子马来酰亚胺-PEG1000-月桂酸酯处理的FVIII具有相同的活性。

图4A和4B示出修饰分子连接至FVIII的重链。图4A示出使用未处理的FVIII(对照)和修饰的FVIII(修饰的FVIII)的银染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶(4％至20％)。修饰分子是马来酰亚胺-PEG1000-生物素。图4B示出类似凝胶的电印迹。用抗生物素蛋白辣根过氧化物酶(HRP)探测印迹，然后针对HRP染色以可视化修饰分子。

图5A-5C示出白蛋白结合至修饰的FVIII。图5A示出在20mM HEPES(pH 7.4)、150mMNaCl、4mM CaCl₂、0.01％吐温20中在Superdex S200Increase上进行色谱分析并测定FVIII活性的FVIII。图5B示出在相同缓冲液中在色谱分子之前与10μg/ml人血清白蛋白一起预孵育的修饰的FVIII(马来酰亚胺-PEG1000-月桂酸酯)。白蛋白使分子量向更高偏移。图5C示出白蛋白不影响修饰的FVIII的活性。

图6A-6D示出融合蛋白的结构和修饰的因子复合物的形成。图6A示出融合蛋白单体CM110的结构和SDS丙烯酰胺凝胶电泳。图6B示出融合蛋白二聚体CM210的结构和SDS丙烯酰胺凝胶电泳。图6C示出在20mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、4mM CaCl₂、0.01％吐温20中在Superdex S200Increase上色谱分析之前，与10μg/ml的融合蛋白单体(CM110)一起预孵育的修饰的FVIII(用马来酰亚胺-PEG1000-月桂酸酯或马来酰亚胺-PEG1000-肉豆蔻酸酯修饰的)。图6D示出添加CM110对修饰的FVIII的活性没有影响。

图7A-7D示出将修饰的FVIII连接至融合蛋白的点击化学。图7A示出用于修饰FVIII的点击化学试剂的结构。图7B示出马来酰亚胺-PEG4-6甲基四嗪(MPT)不影响FVIII的活性。图7C示出MPT修饰的FVIII与用马来酰亚胺-PEG3-反式环辛烯修饰的融合蛋白CM110一起的孵育产生高分子量复合物，所述复合物在20mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、4mMCaCl₂、0.01％吐温20中在Superdex S200Increase上色谱分析后保留FVIII活性。图7D示出复合物的形成不影响FVIII活性。

详述

通过参考公开主题的特定方面的以下详细描述和本文包括的实施例和图，可更容易地理解本文描述的材料、组合物和方法。

在公开和描述本发明的材料、组合物和方法之前，应理解以下描述的方面不限于特定的合成方法或特定的试剂，因此当然可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定方面的目的，并且不意图是限制性的。

此外，贯穿本说明书提及了多种出版物。这些出版物的公开内容特此以引用的方式整体并入本申请以便更充分地描述所公开的主题涉及的领域的现状。所公开的参考文献也以引用的方式个别或具体地并入本文，因为其中所含的材料在依赖参考文献的语句中论述。

定义

在本说明书和随附权利要求书中，将会提及许多术语，所述术语应被定义为具有以下含义：

贯穿本说明书和权利要求，词语“包含(comprise)”和所述词语的其他形式如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”是指包括但不限于并且不意图排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。

除非上下文另外明确规定，否则如在描述和随附的权利要求书中所使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括多个指示物。因此，例如，提及“一种酶”包括两种或更多种此类酶的混合物，提及“所述益生菌”包括两种或更多种此类益生菌的混合物等。

“任选的”或“任选地”是指后面描述的事项或情形可能发生，或者可能不发生，并且所述描述包括所述事项或情形发生的情况和不发生的情况。

在本文中，范围可表达为从“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。“约”可指在所陈述值的5％以内。当表述这种范围时，另一个方面包括从所述一个特定值和/或至所述另一个特定值。类似地，当多个值表述为近似值时，通过使用先行词“约”，将理解所述特定值形成另一个方面。应进一步理解，所述范围的每个端点相对于另一个端点以及独立于另一个端点都是有意义的。还应理解，本文公开了多个值，并且在本文中每个值除所述值本身之外也公开为“约”所述特定值。例如，如果公开了值“5”，那么也公开了“约5”。

本文公开了多肽的片段或变体及其任何组合。当提及本发明的多肽结合结构域或结合分子时，术语“片段”或“变体”包括保留参考多肽的至少一些性质(例如，FVIII变体或片段的凝血活性或FVIII对vWF片段的结合活性、或白蛋白片段的再循环活性)的任何多肽。除了本文其他地方论述的特定抗体片段之外，多肽的片段还包括蛋白水解片段以及缺失片段，但不包括天然存在的全长多肽(或成熟多肽)。本发明的多肽结合结构域或结合分子的变体包括如上所述的片段，并且还包括由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然或非天然存在的。非天然存在的变体可使用本领域已知的诱变技术来产生。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。

“冯维勒布兰德因子”(在本文中也称为“vWF”)是参与止血的血糖蛋白。基本vWF单体是2050个氨基酸的蛋白质。每个单体含有许多具有特定功能的特定结构域，包括与因子VIII结合的D'D3结构域(冯维勒布兰德因子D型结构域)。

如本文所用，术语“内源性vWF”表示天然存在于血浆中的vWF分子。内源性vWF分子可以是多聚体，但也可以是单体或二聚体。血浆中的内源性vWF与FVIII结合并与FVIII形成非共价复合物。

如本文所用的术语“白蛋白片段”是指全长白蛋白的保留延长融合蛋白的半衰期的能力的任何白蛋白片段或变体，如本文所述。此类白蛋白片段和变体是本领域的技术人员已知的。例如，Otagiri等人(2009),Biol.Pharm,Bull.32(4),527-534公开了77种白蛋白变体是已知的，这些中25种具有结构域III中的突变。在羧基末端缺少C端175个氨基酸的天然变体已经显示具有减少的半衰期(Andersen等人(2010),Clinical Biochemistry 43,367-372)。Iwao等人(2007)使用小鼠模型研究了天然存在的人白蛋白变体的半衰期，并且发现K541E和K560E具有减少的半衰期，E501K和E570K具有增加的半衰期，并且K573E对半衰期几乎没有影响(Iwao等人(2007)B.B.A.Proteins and Proteomics 1774,1582-1590)。Galliano等人(1993)Biochim.Biophys.Acta 1225,27-32公开了天然变体E505K。Minchiotti等人(1990)公开了天然变体K536E。Minchiotti等人(1987)Biochim.Biophys.Acta 916,41 1-418公开了天然变体K574N。Takahashi等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,4413-4417公开了天然变体D550G。Carlson等人(1992).Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89,8225-8229公开了天然变体D550A。关于其涉及白蛋白片段和变体的教义，这些全部以引用的方式整体并入。

本文使用的术语“vWF片段(vWF fragment)”或“vWF片段(vWF fragments)”是指与FVIII相互作用并保留通常通过全长vWF提供至FVIII的至少一种或多种性质的任何vWF片段，所述性质例如防止过早活化为FVIIIa、防止过早蛋白水解、防止与可导致过早清除的磷脂膜缔合、防止与可结合裸FVIII但不结合vWF结合的FVIII的FVIII清除受体结合、和/或稳定FVIII重链和轻链相互作用。如本文所用的术语“vWF片段”不包括全长或成熟vWF蛋白。在一个具体实施方案中，如本文所用的“vWF片段”包含VWF蛋白的D'结构域和D3结构域，但不包括VWF蛋白的A1结构域、A2结构域、A3结构域、D4结构域、B1结构域、B2结构域、B3结构域、CI结构域、C2结构域以及CK结构域。vWF片段和变体是本领域的技术人员已知的并且在本文中公开。

“融合”或“嵌合”蛋白包含连接至其在自然界中不天然连接的第二氨基酸序列的第一氨基酸序列。在一个实施方案中，如本文所用的术语“融合蛋白”是指冯维勒布兰德因子片段的融合，例如，D'D3与白蛋白或白蛋白片段的融合。还公开了与因子VIIa的组织因子(TF)连接的白蛋白。

本文公开了“修饰分子”。修饰分子是能够修饰凝血因子以使得其可与融合蛋白相互作用、同时保留凝血因子，例如因子VIII(FVIII)的凝血增强活性的任何分子。例如，FVIII可用聚乙二醇链进行修饰并用脂肪酸封端。本文论述修饰分子的各种实例。

“修饰的凝血因子”是指已通过修饰分子进行修饰以使得它能够与融合蛋白相互作用、同时保留足够的凝血活性的凝血因子。修饰的凝血因子也可在本文中称为衍生化的FVIII或F8F。修饰的凝血因子可例如结合至通过适当大小的接头连接至人白蛋白的D'D3的融合蛋白，其方式为使得白蛋白可结合连接至修饰的FVIII的脂肪酸以形成修饰的凝血因子复合物，例如本发明的因子VIII或因子VIIa复合物。

如本文所用，术语“半衰期”是指特定多肽在体内的生物半衰期。半衰期可由从动物的循环和/或其他组织中清除向受试者施用的量的一半所需的时间来表示。

如本文所用的术语“半衰期限制因子”或“FVIII半衰期限制因子”表示与野生型FVIII相比，防止FVIII蛋白的半衰期长于1.5倍或2倍的因子。例如，全长或成熟的vWF可通过诱导FVIII和vWF复合物通过一种或多种vWF清除途径从系统中清除而充当FVIII半衰期限制因子。在一个实例中，内源性vWF是FVIII半衰期限制因子。在另一个实例中，与FVIII蛋白非共价结合的全长重组vWF分子可以是FVIII半衰期限制因子。

如本文所用的术语“与......相互作用”或“与......连接”在一个实施方案中是指共价或非共价键联。术语“共价连接的”或“共价键联”是指例如共价键，例如二硫键、肽键或一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，“与......相互作用”或“与......连接”是指本文公开的蛋白质或蛋白质片段通过在连接在一起的两个蛋白质或蛋白质片段之间(例如在FVIII与白蛋白之间和/或在D'D3与白蛋白之间)的接头连接。第一氨基酸可直接连接至第二氨基酸或与第二氨基酸并置，或者可替代地插入序列可将第一序列共价连接至第二序列。术语“连接的”不仅可指第一氨基酸序列在C末端或N末端与第二氨基酸序列的融合，而且包括将整个第一氨基酸序列(或第二氨基酸序列)插入到第二氨基酸序列(或相应地第一氨基酸序列)中的任何两个氨基酸中。在一个实施方案中，第一氨基酸序列可通过肽键或接头连接至第二氨基酸序列。接头可以是肽或多肽或任何化学部分，例如点击化学。

本文公开的凝血因子复合物可预防性地使用。如本文所用，术语“预防性治疗”是指在出血发作之前或在正常活动期间始终施用分子以防止出血发作。在一个实施方案中，需要一般止血药剂的受试者正经历或将经历手术。凝血因子复合物可在手术之前或之后作为预防剂施用。凝血因子复合物可在手术期间或之后施用以控制急性出血事件。手术可包括但不限于肝移植、肝切除、牙科手术或干细胞移植。

本发明的凝血因子复合物也可用于按需(也称为“阵发性”)治疗。术语“按需治疗”或“阵发性治疗”是指响应于出血事件的症状或在可能导致出血的活动之前施用嵌合分子。在一方面，可在出血开始时(如损伤之后)或在预期出血时(如在手术前)向受试者给予按需(阵发性)治疗。在另一方面，按需治疗可在增加出血风险的活动(如接触性运动)之前给予。

如本文所用，术语“急性出血”是指不管潜在原因的出血事件。例如，受试者可能具有创伤、尿毒症、遗传性出血障碍(例如因子VII缺陷)、血小板障碍或由于发展对凝血因子的抗体而产生的抗性。

如本文所用，治疗(Treat)、治疗(treatment)、治疗(treating)是指例如疾病或病状的严重程度的降低；病程持续时间的缩短；与疾病或病状相关的一种或多种症状的改善；向患有疾病或病状的受试者提供有益作用，而不一定治愈所述疾病或病状，或预防与疾病或病状相关的一种或多种症状。

在一个实施方案中，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指通过施用本发明的凝血因子复合物在受试者中维持至少约1IU/dL、2IU/dL、3IU/dL、4IU/dL、5IU/dL、6IU/dL、7IU/dL、8IU/dL、9IU/dL、10IU/dL、11IU/dL、12IU/dL、13IU/dL、14IU/dL、15IU/dL、16IU/dL、17IU/dL、18IU/dL、19IU/dL或20IU/dL的FVIII谷水平。在另一个实施方案中，治疗(treating)或治疗(treatment)是指将FVIII谷水平维持介于约1与约20IU/dL之间、约2与约20IU/dL之间、约3与约20IU/dL之间、约4与约20IU/dL之间、约5与约20IU/dL之间、约6与约20IU/dL之间、约7与约20IU/dL之间、约8与约20IU/dL之间、约9与约20IU/dL之间或约10与约20IU/dL之间。疾病或病状的治疗(Treatment)或治疗(treating)还可包括将受试者的FVIII活性维持在相当于非血友病受试者的FVIII活性的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的水平下。治疗所需的最低谷水平可通过一种或多种已知的方法进行测量，并且可针对每个人进行调整(增加或减少)。

凝血因子复合物

人白蛋白具有一系列适用于构建本文所述的融合蛋白的性质。它具有通过结合至新生儿Fc受体而延长融合蛋白的半衰期的能力，并且它结合许多小分子，包括脂肪酸和胆红素。此外，它具有单个暴露的巯基，所述巯基可用于连接各种配体。如本文所用，这些性质允许构建长半衰期FVIII，以及FVIIa的长半衰期、高活性型式。本文公开的凝血因子复合物包含：凝血因子；融合蛋白，所述融合蛋白包含与白蛋白或白蛋白片段融合的第一蛋白质；以及修饰分子，其中所述修饰分子以允许被所述融合蛋白结合的这样一种方式与所述凝血因子偶联，由此产生修饰的凝血因子；其中所述修饰的凝血因子和所述融合蛋白在至少两个独立的位点中相互作用。修饰分子还可以允许融合蛋白与凝血因子结合或引起凝血因子与融合蛋白之间的化学反应的方式与融合蛋白偶联。凝血因子与修饰分子的组合可在本文中称为修饰的凝血因子，例如修饰的因子VIII和VIIa。修饰的凝血因子和融合蛋白在至少两个独立的位点中相互作用。例如，凝血因子可以是因子VIIa。在另一个实施方案中，凝血因子可以是因子VIII。

凝血因子

vWF是一种非常大的分子并作为这些大分子的大多聚体复合物循环(Lenting,Christophe,&Denis,2015)。它如此大以至于它被摄入巨噬细胞中并作为颗粒消化。工程化保护FVIII的vWF的较小片段(称为D'D3)的尝试一直成功并且将此片段融合至Fc区显著增加其半衰期(Yee et al.,2014)。在vWF缺陷型小鼠中，此D'D3-Fc融合体使FVIII的半衰期从约15小时增加至超过7天。

vWF与FVIII的结合常数是约0.3nM(Orlova,Kovnir,Vorobiev,Gabibov,&Vorobiev,2013)。由Yee等人(Yee et al.,2014)创建的D'D3-Fc融合体的测量的结合常数是1.5nM。FVIII与vWF紧密但可逆地结合，以使得在溶液中总是存在约1％至2％的游离FVIII。在小鼠和人中，vWF以比FVIII高约五十倍的浓度存在。在vWF的较低结合常数与高得多的浓度之间，FVIII可快速地从D'D3-Fc融合体中竞争赶走。

通过将D'D3与白蛋白融合发现了这些问题的一种可能的解决方案，从而产生如本文所提及的“融合蛋白”。白蛋白是血液中最丰富的蛋白质(Peters,1995)。如前所述，它在循环中的19天半衰期是由其结合至FcRN的能力决定的。它起到两个主要作用：一种作用是维持血液的摩尔渗透压浓度，并且第二种作用是运输疏水性分子。白蛋白是脂肪酸的主要转运蛋白。例如，已成功用于增加胰岛素的半衰期的策略是将胰岛素缀合至肉豆蔻酸(一种14碳脂肪酸)。这种分子被称为地特胰岛素(Philips&Scheen,2006)。在注射时，脂肪酸快速结合至白蛋白，从而使胰岛素的半衰期从4分钟增加至5小时。

这两种想法的组合在本文中(图1)在新颖分子中公开，以解决长期存在的半衰期问题并提供非常需要的解决方案。例如，首先，FVIII可用聚乙二醇链进行修饰并例如用脂肪酸封端。如本文所提及，“修饰分子”的这个实例产生“修饰的凝血因子”的实例。脂肪酸因此在一个实施方案中从FVIII分子突出以产生修饰的凝血因子。修饰的凝血因子也可在本文中称为衍生化的FVIII或F8F。接下来，修饰的凝血因子可结合至通过适当大小的接头连接至人白蛋白的源自vWF的D'D3的融合蛋白，其方式为使得白蛋白可结合连接至修饰的FVIII的脂肪酸以形成修饰的凝血因子复合物，例如本发明的因子VIII或因子VIIa复合物。D'D3片段可与修饰的FVIII上的其同源位点结合，并且脂肪酸可与白蛋白结合。修饰的凝血因子可在两个点栓系至融合蛋白，所述两个点均具有强结合常数。此外，融合蛋白中将D'D3连接至白蛋白的接头的长度可改变(更长或更短)，以使得D'D3可适当地或者最佳地用因子VIII结合位点定向以获得最佳半衰期延长。以这种方式，天然vWF将能够有效地竞争修饰的FVIII的可能性小得多并且附着至白蛋白大大增加半衰期。

修饰的凝血因子和融合蛋白可在一个、两个、三个、四个或更多个位点处相互作用。在一个实施方案中，修饰的凝血因子和融合蛋白在两个分子上的两个独立的位点处相互作用。“独立位点”是指一个或两个分子的非重叠或不同的区域。修饰的凝血因子的至少一个结合位点可以是天然结合位点。换句话说，结合位点天然存在于凝血因子上，而不是其修饰的一部分。修饰的凝血因子上的其他结合位点可被修饰，以使得所述位点中的一个或多个氨基酸对凝血因子不是自然的或天然的。

融合蛋白可包含两种、三种、四种或更多种融合在一起的蛋白质。例如，第一融合蛋白可包含冯维勒布兰德氏因子的D'D3片段。vWF的变体和片段是本领域的技术人员已知的，并且在本文中涵盖。这样的实例可在美国专利9,125,890和美国专利申请2014/0357564和2013/120939中找到。或者，第一融合蛋白可包含组织因子(TF)。第二种蛋白质可包含白蛋白或免疫球蛋白Fc片段。在一个实例中，免疫球蛋白Fc片段可包含对修饰的凝血因子具有特异性的单链可变区(scFv)。scFv可对修饰的凝血因子的修饰位点具有特异性。

图5表明白蛋白可与修饰的FVIII结合并且它再次对FVIII活性没有影响。图A示出在Superdex 200尺寸排阻柱上通过FVIII活性测定的用马来酰亚胺-PEG1000-月桂酸酯修饰的FVIII的色谱分析。图B示出如所预期，向衍生化的FVIII添加白蛋白使分子量向更高偏移。图C表明与衍生化的FVIII结合的白蛋白不损害FVIII活性。

已经通过转染到C3A细胞(ATCC CRL-10741)(一种人肝细胞系)中产生了融合蛋白的两种型式。图6中的CM110(图A)由冯维勒布兰德氏因子的D'D3片段，56个氨基酸的富含甘氨酸、丝氨酸的接头和全长人白蛋白组成。CM210(图6，图B)是此分子的二聚体，通过D'D3区域的巯基连接而连接。当用马来酰亚胺-PEG1000-月桂酸酯或马来酰亚胺-PEG1000-肉豆蔻酸酯修饰的FVIII与CM110一起孵育时，它们自发地形成修饰的凝血因子复合物，所述复合物使FVIII的活性向更高的分子量偏移，如图6，图C中所示。虽然在此实验中CM110过量，但重要的是注意所有的FVIII活性偏移至较高分子量。CM110和CM210两者都不影响修饰的FVIII的活性(图6，图D)。

这种双重结合策略可以许多其他方式完成，同时仍然维持所需的FcRN循环，如本领域的技术人员鉴于本公开将理解的。其他配体可替代修饰分子中的脂肪酸，因为已知白蛋白结合多种配体，如胆红素(Peters,1995)。

另一个实施方案是用抗体/小分子组替代白蛋白/脂肪酸对。存在许多具有同源单克隆抗体的小分子，并且这些小分子经常用于检测生物试样中的小分子(Bradbury,Sidhu,Dübel,&McCafferty,2011)。可构建对小分子(例如硝基酪氨酸)具有特异性的具有D'D3、氨基酸间隔区、免疫球蛋白的Fc区和单链可变区的分子。修饰分子然后可采取马来酰亚胺-PEG1000-硝基酪氨酸的形式。这将具有相同的双重结合作用和FcRN循环，但是使用基于免疫球蛋白的m。

使用修饰FVIII的类似策略的另一种替代方案可用于在凝血因子与融合蛋白之间产生共价连接。点击化学或生物正交化学描述被设计为在复杂的化学环境中仅与彼此反应的分子。图7中的图A示出具有通用结构马来酰亚胺-PEG_N-X的两种此类分子，其中在这种情况下X在一个分子上是甲基四嗪并且在另一个分子上是反式环辛烯(TCO)。如前所述，用含有甲基四嗪的分子修饰FVIII对活性没有影响(图B，图7)。CM110和CM210(本文描述的融合蛋白)上的仅有游离巯基是对应于白蛋白中的半胱氨酸34的那些。通过用马来酰亚胺-PEG3-TCO修饰CM110或CM210并用马来酰亚胺-PEG4-甲基四嗪修饰FVIII、然后混合，当TCO与甲基四嗪反应时形成共价连接的复合物。图C示出向马来酰亚胺-PEG4-甲基四嗪修饰的FVIII添加马来酰亚胺-PEG3-TCO修饰的CM110产生仍然保留FVIII活性的高分子量复合物。图D再次表明共价复合物的形成不影响活性。

分子内结合的数学已由Kramer和Karpen(Kramer&Karpen,1998)描述且由Zhou(Zhou,2006)更详细地描述。结合成为个体解离常数和有效局部浓度的函数。例如，融合蛋白中的白蛋白与修饰的FVIII之间的结合将D'D3片段栓系至修饰的FVIII。D'D3片段的局部浓度因此变得相当高，从而排除了内源性vWF的结合。由于D'D3与FVIII的结合或脂肪酸与白蛋白的结合的解离常数在纳摩尔范围内，所以融合蛋白与修饰的FVIII的结合应该是紧密的。在点击化学修饰的复合物的情况下，连接是共价的。

这种双重结合策略克服了Yee等人²(Yee et al.,2014)遇到的至少两个问题。首先是增加FVIII对融合蛋白的结合亲和力，并防止被血清中现有高浓度的vWF稀释。结合现在应该是结合常数和有效浓度两者的结果，因此游离vWF和游离脂肪酸两者都不能有效地竞争结合。

这种分子(在本文中称为修饰的凝血因子复合物)具有若干不由FVIII或其他长半衰期FVIII分子提供的理想特征。首先，非常紧密或共价结合确保几乎没有修饰的FVIII从融合蛋白中解离，从而防止所施用的FVIII丢失到大量正常vWF中。其次，通过将修饰的凝血因子复合物与内源性vWF分离并使用融合蛋白来延长半衰期，其应获得与由Yee等人(Yeeet al.,2014)针对其D'D3-Fc蛋白所示的半衰期(其超过7天)类似的半衰期。第三，通过施用修饰的凝血复合物而不是游离的FVIII，它能够降低抑制剂形成的发生率。第四，通过将白蛋白连接至融合蛋白而不是直接连接至FVIII，FVIII活性得以保留。白蛋白与FVIII的直接融合产生无活性的分子{Powell:2015gu}。将白蛋白定位为远离与FVIII直接接触应有助于通过FcRN有效回收。最后，这是在人细胞系统中产生的完全人蛋白质，其能够进一步降低抑制剂形成的发生率。

与单独凝血因子相比，包含修饰的凝血因子VIII的凝血因子复合物的半衰期可以是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更大。当与未修饰的凝血因子相比时，凝血因子复合物还可具有长2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或更多倍的半衰期。更具体地说，凝血因子复合物的半衰期可比单独FVIII蛋白的半衰期长至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍或至少约12倍或更多倍。在一个实施方案中，FVIII的半衰期比野生型FVIII的半衰期长约1.5倍至约20倍、约1.5倍至约15倍或约1.5倍至约10倍。在另一个实施方案中，与野生型FVIII或单独FVIII蛋白相比，当在凝血因子复合物中时FVIII的半衰期被延长约2倍至约10倍、约2倍至约9倍、约2倍至约8倍、约2倍至约7倍、约2倍至约6倍、约2倍至约5倍、约2倍至约4倍、约2倍至约3倍、约2.5倍至约10倍、约2.5倍至约9倍、约2.5倍至约8倍、约2.5倍至约7倍、约2.5倍至约6倍、约2.5倍至约5倍、约2.5倍至约4倍、约2.5倍至约3倍、约3倍至约10倍、约3倍至约9倍、约3倍至约8倍、约3倍至约7倍、约3倍至约6倍、约3倍至约5倍、约3倍至约4倍、约4倍至约6倍、约5倍至约7倍或约6倍至约8倍。在其他实施方案中，凝血因子复合物的半衰期是至少约17小时、至少约18小时、至少约19小时、至少约20小时、至少约21小时、至少约22小时、至少约23小时、至少约24小时、至少约25小时、至少约26小时、至少约27小时、至少约28小时、至少约29小时、至少约30小时、至少约31小时、至少约32小时、至少约33小时、至少约34小时、至少约35小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约60小时、至少约72小时、至少约84小时、至少约96小时或至少约108小时。在其他实施方案中，凝血因子复合物的半衰期是约15小时至约两周、约16小时至约一周、约17小时至约一周、约18小时至约一周、约19小时至约一周、约20小时至约一周、约21小时至约一周、约22小时至约一周、约23小时至约一周、约24小时至约一周、约36小时至约一周、约48小时至约一周、约60小时至约一周、约24小时至约六天、约24小时至约五天、约24小时至约四天、约24小时至约三天或约24小时至约两天。

在一些实施方案中，每位受试者凝血因子复合物的平均半衰期是约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时(1天)、约25小时、约26小时、约27小时、约28小时、约29小时、约30小时、约31小时、约32小时、约33小时、约34小时、约35小时、约36小时、约40小时、约44小时、约48小时(2天)、约54小时、约60小时、约72小时(3天)、约84小时、约96小时(4天)、约108小时、约120小时(5天)、约6天、约7天(1周)、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天。

长半衰期、高活性FVIIa

类似的策略可应用于产生长半衰期、高活性FVIIa(图3)。在正常凝血条件下，FVII首先通过蛋白水解活化为FVIIa。然而，FVIIa具有非常低的活性来执行功能，所述功能是活化因子X(FX)。当FVIIa在损伤部位遇到膜结合组织因子时，其结合以形成复合物，所述复合物产生FXa的活性高超过100倍(Vadivel&Bajaj,2012)。通常，FVIIa以非常低的浓度存在，并且仅用于引起凝血的放大级联。作为旁路剂，FVIIa以非常高的浓度施用，以使得其能够将足够的FX活化为FXa以提供形成纤维蛋白凝块所需的凝血酶爆发。

类似于上面公开的长半衰期FVIII实例，TF对FVIIa具有约1nM的解离常数(Vadivel&Bajaj,2012)。通过首先用水溶性脂肪酸衍生化FVIIa，然后将其与可溶性组织因子-白蛋白融合蛋白结合，应产生具有若干理想性质的复合物。关于FX的活化，所述复合物可具有2、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100或更多倍增加的活性。这允许比目前使用的具有显著更少蛋白质的有效旁路疗法，从而降低成本和免疫原性的可能性。作为白蛋白融合的结果，通过经由FcRN再循环可增加复合物的半衰期，从而导致较低施用频率。由于FVIIa的非常短的2小时半衰期，所以这是针对FVIIa的重要考虑因素。即使适度的延长也是有帮助的，但是这种分子可赋予特别长的半衰期。抗凝血酶III(ATIII)与FVIIa的结合是FVIIa活性的清除的主要途径之一(Lawson,Butenas,Ribarik,&Mann,1993)。ATIII在肝素存在下且在TF为膜结合时在使FVIIa失活方面最有效。ATIII介导的FVIIa失活的研究已经证明ATIII使FVIIa从TF移位，且然后防止重新结合。紧密连接的TF的存在应防止衍生化FVIIaF与膜结合的TF的结合并且可能防止ATIII失活。

修饰分子

如本文所公开，“修饰分子”可包含任何修饰凝血因子并使其能够与融合蛋白相互作用的分子。修饰分子可例如包含脂肪酸。例如，修饰分子可通过聚乙二醇链连接至修饰的凝血因子。例如，融合蛋白的第一和第二蛋白质可经由接头连接在一起。修饰的凝血因子可包含一种或多种修饰的氨基酸。另外或可替代地，融合蛋白可包含修饰的氨基酸。例如，本发明的凝血因子复合物可在一些实施方案中由通过肽键或修饰的肽键(即肽等排体)彼此连接的氨基酸组成，并且可含有除20基因编码的氨基以外的氨基酸。所述多肽可通过天然过程(如翻译后加工)或通过本领域中熟知的化学修饰技术进行修饰。此类修饰在基础教科书和更详细的专著以及大量研究文献中进行了充分说明。

修饰可发生于多肽中的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。应当理解，同一类型的修饰可在给定多肽的若干位点处以相同或不同程度存在。此外，给定多肽可含有许多类型的修饰。多肽可例如由于泛素化而是支链的，并且它们可以是环状的，有或没有分支。环状多肽、支链多肽和支链环状多肽可由翻译后天然过程产生，或可通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价附接黄素、共价附接血红素部分、共价附接核苷酸或核苷酸衍生物、共价附接脂质或脂质衍生物、共价附接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸(如精氨酰化)、以及泛素化。(参见,例如，PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES,第2版,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993)；POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,B.C.Johnson,编辑,AcademicPress,New York；第1-12页(1983)；Seifter等人,Meth.Enzymol.182:626-646(1990)；Rattan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62(1992))。

FVIII可通过大量具有通用结构马来酰亚胺-PEGn-X的修饰分子进行修饰，如表1所示。可使用各种这样的修饰分子。例如，马来酰亚胺-PEG的各种修饰是本领域的技术人员已知的，如在美国专利6,828,401中提出的那些，所述专利关于其涉及PEG-马来酰亚胺衍生物的公开内容特此以引用的方式整体并入。在本发明的实施例中，这种修饰对FVIII的活性没有任何观察到的影响。图3示出在用Mal-PEG-月桂酸酯或Mal-PEG-FITC修饰之前和之后的FVIII活性。图4示出含有SDS的聚丙烯酰胺凝胶。图A是银染色的凝胶，其示出衍生化对FVIII的分子量或结构没有影响。图B示出然后用链霉抗生物素蛋白-HRP探测以可视化修饰分子的另一种凝胶的蛋白质印迹，所述修饰分子在这种情况下是马来酰亚胺-PEG5000-生物素。结果表明Mal-PEG-生物素分子与FVIII的重链反应。修饰分子的实例可在表1中找到。

表1.用于修饰FVIII的分子

马来酰亚胺-PEG5000-生物素

马来酰亚胺-PEG1000-异硫氰酸荧光素

马来酰亚胺-PEG1000-月桂酸酯

马来酰亚胺-PEG1000-肉豆蔻酸酯

马来酰亚胺-PEG4-6-甲基四嗪

马来酰亚胺-PEG3-反式环辛烯

用于修饰凝血因子的化学部分可选自水溶性聚合物，如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇等。凝血因子可在分子内的随机位置处或在分子内的预定位置处修饰且可包括一个、两个、三个或更多个连接的化学部分。

所述聚合物可具有任何分子量，并且可为分支或未分支的。对于聚乙二醇，优选分子量在约1kDa与约100kDa之间(术语“约”指示在聚乙二醇的制剂中，一些分子的分子量将比所述分子量大，一些将比所述分子量小)以易于处理和制造。取决于所需的治疗概况(例如所需持续释放的持续时间、对生物活性的影响(如果有)、处理的容易性、抗原性程度或抗原性的缺乏和聚乙二醇对治疗性蛋白质或类似物的其他已知影响)，可使用其他大小。例如，聚乙二醇可具有约200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000kDa的平均分子量。

如上所述，聚乙二醇可具有分支结构。分支聚乙二醇例如描述于美国专利号5,643,575；Morpurgo等人,Appl.Biochem.Biotechnol.56:59-72(1996)；Vorobjev等人,Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750(1999)；以及Caliceti等人,Bioconjug.Chem.10:638-646(1999)中，所述文献各自的公开内容以引用的方式并入本文。

所述聚乙二醇分子(或其他化学部分)在连接至蛋白质时应考虑对蛋白质的功能性或抗原结构域的影响。存在可为本领域的技术人员所用的许多连接方法，例如像以引用的方式并入本文的EP 0 401 384中公开的方法(将PEG偶联于G-CSF)；还参见Malik等人,Exp.Hematol.20:1028-1035(1992)，其报道使用三氟乙烷磺酰氯使GM-CSF聚乙二醇化。例如，聚乙二醇可经由诸如游离氨基或羧基的反应性基团，通过氨基酸残基进行共价结合。反应性基团是活化的聚乙二醇分子可结合的基团。具有游离氨基的氨基酸残基可包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基；具有游离羧基的氨基酸残基可包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基和C末端氨基酸残基。巯基也可用作用于连接聚乙二醇分子的反应性基团。对于治疗目的而言优选的是在氨基处连接，如在N末端或赖氨酸基团处连接。

如以上所表明，聚乙二醇可经由键联于多种氨基酸残基中的任何残基来连接至蛋白质。例如，聚乙二醇可经由与赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸残基的共价键来连接于蛋白质。一种或多种反应化学可用于将聚乙二醇连接于蛋白质的特定氨基酸残基(例如赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸)或蛋白质的一种以上类型的氨基酸残基(例如赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸以及其组合)。

人们可能特别希望在N-末端处化学修饰的蛋白质。使用聚乙二醇作为本组合物的说明，可从各种聚乙二醇分子(通过分子量、支化等)、反应混合物中的聚乙二醇分子与蛋白质(或多肽)分子的比例、待进行的聚乙二醇化反应的类型以及获得所选择的N末端聚乙二醇化蛋白质的方法来选择。获得N末端聚乙二醇化制剂(即，如果需要，则将此部分与其他单聚乙二醇化的部分分开)的方法可通过从聚乙二醇化的蛋白质分子群体纯化N末端聚乙二醇化物质来进行。在N末端修饰处化学修饰的选择性蛋白质可通过还原性烷基化来完成，所述还原性烷基化利用特定蛋白质中可用于衍生化的不同类型的伯氨基的差别反应性(赖氨酸相对于N末端)进行。在适当的反应条件下，可实现以含有羰基的聚合物在N末端实质上选择性衍生化蛋白质。

如上所述，本发明的凝血因子的聚乙二醇化可通过许多方式来完成。例如，聚乙二醇可直接或通过插入接头连接至分子。用于将聚乙二醇连接至蛋白质的无接头系统描述于Delgado等人,Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sys.9:249-304(1992)；Francis等人,Intern.J.of Hematol.68:1-18(1998)；美国专利号4,002,531；美国专利号5,349,052；WO95/06058；以及WO 98/32466中，其各自的公开内容以引用的方式并入本文。

用于将聚乙二醇直接连接至蛋白质的氨基酸残基而无插入接头的一种系统采用通过使用三氟乙烷磺酰氯修饰单甲氧基聚乙二醇(MPEG)而产生的三氟乙磺酸化MPEG。在蛋白质与三氟乙磺酸化MPEG的反应后，聚乙二醇直接连接至蛋白质的氨基。因此，本发明包括通过使本发明的蛋白质与具有2,2,2-三氟乙烷磺酰基的聚乙二醇分子反应而产生的蛋白质-聚乙二醇缀合物。

也可使用许多不同的插入接头来使聚乙二醇连接至蛋白质。例如，美国专利号5,612,460(其全部公开内容以引用的方式并入本文)公开了用于将聚乙二醇连接至蛋白质的氨基甲酸酯接头。蛋白质-聚乙二醇缀合物(其中聚乙二醇通过接头连接至蛋白质)也可通过蛋白质与化合物如MPEG-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、用1,1'-羰基二咪唑活化的MPEG、MPEG-2,4,5-三氯苯基碳酸酯、MPEG-对硝基苯酚碳酸酯和各种MPEG-琥珀酸酯衍生物的反应来产生。用于将聚乙二醇连接至蛋白质的许多另外的聚乙二醇衍生物和反应化学描述于国际公布号WO 98/32466中，其全部公开内容以引用的方式并入本文。使用本文所述的反应化学产生的聚乙二醇化蛋白质产物包括在本发明的范围内。

连接至本发明的修饰的凝血因子的聚乙二醇部分的数量(即取代度)也可变化。例如，本发明的聚乙二醇化蛋白质可平均连接至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或更多个聚乙二醇分子。类似地，平均取代度在诸如1-3、2-4、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14、13-15、14-16、15-17、16-18、17-19或18-20个聚乙二醇部分/蛋白质分子的范围内。用于测定取代度的方法论述于例如Delgado等人,Crit.Rev.Thera.DrugCarrier Sys.9:249-304(1992)中。

本发明的多肽可通过标准方法从化学合成和重组细胞培养物中回收和纯化，所述标准方法包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法以及凝集素色谱法。最优选地，高效液相色谱法(“HPLC”)被用于纯化。当多肽在分离和/或纯化过程中变性时，可使用用于重新折叠蛋白质的熟知技术来再生活性构象。

本发明的修饰的凝血因子复合物的存在和量可使用ELISA(本领域中已知的熟知免疫测定)来测定。将适用于检测/定量本发明的修饰的分子的一种ELISA方案包括以下步骤：用抗人血清白蛋白抗体涂覆ELISA板，封闭所述板以防止非特异性结合，洗涤所述ELISA板，添加含有本发明分子(在一种或多种不同的浓度下)的溶液，添加与可检测标记偶联的第二抗治疗性蛋白特异性抗体(如本文所述或本领域中另外已知的)，以及检测所述第二抗体的存在。在这种方案的替代型式中，可将ELISA板用抗治疗性蛋白特异性抗体涂覆，并且标记的第二试剂可以是抗人白蛋白超家族特异性抗体。

多肽和多核苷酸片段和变体

本发明进一步涉及本文所述的凝血因子复合物的片段以及凝血因子复合物的单独组分的片段，如修饰的凝血因子、修饰分子或融合蛋白。这些修饰可包括本文公开的以增加活性或半衰期的方式修饰分子的那些，或者增强分子的性质或使其因其他原因而合乎需要的其他修饰。

即使一个或多个氨基酸的缺失导致一种或多种功能的修饰或丢失，所述复合物的凝血功能仍可保留。因此，本文所公开的分子的片段包括全长蛋白质以及从参考多肽的氨基酸序列中缺失一个或多个残基的多肽。

本申请涉及蛋白质，所述蛋白质含有与本文所述的参考多肽序列(例如，凝血因子、修饰分子或融合蛋白)或其片段至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。

“变体”是指与参考核酸或多肽不同、但保留其基本性质的多核苷酸或核酸。通常，变体总体上非常相似，并且在许多区域中与参考核酸或多肽相同。

如本文所用，“变体”是指本文公开的蛋白质，所述蛋白质在序列上与蛋白质的已知序列不同，但保留如本文其他地方所描述或本领域中已知的其至少一种功能和/或治疗性质(例如，治疗活性和/或生物活性，包括但不限于凝血)。通常，变体总体上非常相似，并且在许多区域中与目标蛋白质或白蛋白超家族蛋白质的氨基酸序列相同。

本发明还涉及蛋白质，所述蛋白质包含与例如凝血因子本身、融合蛋白或修饰分子的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或可替代地由所述氨基酸序列组成。还提供了这些多肽的片段(例如，本文所述的那些片段)。本发明所涵盖的其他多肽是由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格杂交条件下(例如，在约45℃下与6倍氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中的过滤器结合的DNA杂交，然后在约50℃-65℃下在0.2倍SSC、0.1％SDS中进行一次或多次洗涤)、在高度严格条件下(例如，在约45℃下与6倍氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中的过滤器结合的DNA杂交，然后在约68℃下在0.1倍SSC、0.2％SDS中进行一次或多次洗涤)或在本领域的技术人员已知的其他严格杂交条件下(参见，例如，Ausubel,F.M.等人,编辑,1989Current protocol in Molecular Biology,Green publishing associates,Inc.,and John Wiley&Sons Inc.,New York,第6.3.1-6.3.6和2.10.3页)与编码本发明的氨基酸序列的核酸分子的互补序列杂交。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。

至于具有与本发明的查询氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽，意图除主题多肽序列可在查询氨基酸序列的每100个氨基酸中包括至多五个氨基酸改变外，主题多肽的氨基酸序列与查询序列相同。换句话说，为获得具有与查询氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，主题序列中的至多5％的氨基酸残基可插入、缺失或被另一氨基酸取代。参考序列的这些改变可发生于参考氨基酸序列的氨基或羧基端位置或那些末端位置之间个别地散布于参考序列中的残基之间或以一个或多个连续群组散布于参考序列内的任何位置。

实际上，任何特定多肽是否与例如凝血因子或片段的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同可使用已知计算机程序依照惯例加以确定。一种用于确定查询序列(本发明的序列)与主题序列之间的最佳总体匹配的方法(也称为总体序列比对)可使用基于Brutlag等人(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))的算法的FASTDB计算机程序来测定。在序列比对中，查询序列与主题序列都是核苷酸序列或都是氨基酸序列。所述总体序列比对的结果是以同一性百分比形式表示。在FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数是：矩阵＝PAM 0，k-元组＝2，错配罚分＝1，连接罚分＝20，随机化组长度＝0，截断计分＝1，窗口大小＝序列长度，间隙罚分＝5，间隙大小罚分0.05，窗口大小＝500或主题氨基酸序列的长度，以较短者为准。

本发明的多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中含有改变。尤其优选的是含有改变的多核苷酸变体，所述改变产生沉默取代、添加或缺失，但不改变所编码的多肽的性质或活性。通过归因于遗传密码的简并性的沉默取代而产生的核苷酸变体是优选的。此外，其中少于50个、少于40个、少于30个、少于20个、少于10个或5-50个、5-25个、5-10个、1-5个或1-2个氨基酸以任何组合被取代、缺失或添加的多肽变体也是优选的。多核苷酸变体可出于多种原因产生，例如，用于优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成被细菌宿主(如酵母或大肠杆菌)偏爱的那些)。

天然存在的变体被称为“等位基因变体”且指占据生物体的染色体上的给定基因座的基因的若干替代形式之一(Genes II,Lewin,B.编辑,John Wiley&Sons,New York(1985))。这些等位基因变体可在多核苷酸和/或多肽水平上不同且包括于本发明中。或者，可通过诱变技术或直接合成来产生非天然存在的变体。

使用蛋白质工程化和重组DNA技术的已知方法，可生成变体以改进或改变本发明的多肽的特征。例如，可自本发明多肽的N末端或C末端缺失一个或多个氨基酸而不实质性损失生物功能。作为一个实例，Ron等人(J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993))报道甚至在缺失3、8或27个氨基末端胺基酸残基之后仍具有肝素结合活性的变异KGF蛋白。类似地，在自这种蛋白质的羧基末端缺失8-10个氨基酸残基之后，干扰素γ展现高多达10倍的活性。(Dobeli等人,J.Biotechnology 7:199-216(1988)。)

因此，本发明进一步包括具有功能活性(例如，生物活性和/或治疗活性)的多肽变体。在非常优选的实施方案中，本发明提供对凝血因子的修饰，所述修饰允许增加的功能活性，如延长的半衰期。

本发明的修饰的凝血因子复合物或其制剂可通过任何常规方法施用，所述方法包括胃肠外(例如皮下或肌内)注射或静脉内输注。治疗可由一段时间内的单次剂量或多次剂量组成。

本文公开的凝血因子复合物可作为药物制剂与一种或多种可接受的载体一起存在。载体在与凝血因子复合物相容的意义上必须是“可接受的”，并且对其接受者无害。

所述制剂可方便地以单位剂型呈现并且可通过制药领域中熟知的任何方法来制备。此类方法包括使凝血因子复合物与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。通常，所述制剂是通过均匀且紧密地使活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或两者缔合，且然后如果需要的话，使产物成形来制备。

试剂盒

本文还公开了包含凝血因子复合物的试剂盒。本发明的制剂或组合物可与关于凝血因子复合物的延长保质期的说明书或包装插入物一起包装或包括在试剂盒中。例如，考虑到本发明的凝血因子复合物的延长的或长期保质期，此类说明书或包装插入物可论述推荐的储存条件，如时间、温度和光。此类说明书或包装插入物还可论述本发明的凝血因子复合物的特定优点，如可能需要在现场、受控医院、诊所或办公室条件之外使用的制剂的储存容易性。如上所述，本发明的制剂可呈水性形式，并且可在不太理想的情况下储存而无治疗活性的显著损失。

治疗方法

本发明的凝血因子复合物和/或多核苷酸可单独施用或与其他治疗剂组合施用。它们可与本发明的其他凝血因子复合物和/或多核苷酸组合施用。组合可同时(例如，作为混合物)分别但同时地；或顺序地施用。这包括其中组合药剂作为治疗性混合物一起施用的呈现，以及还包括组合药剂分别但同时施用的程序，例如如穿过单独的静脉管线施用至同一个体中。“组合”施用进一步包括首先给予所述化合物或试剂中的一种、随后给予第二种的分开施用。

在具体方面，本发明的方法中使用的凝血因子复合物可包含在含有缓冲剂、糖和/或糖醇(包括但不限于海藻糖和甘露糖醇)、稳定剂(如甘氨酸)和表面活性剂(如聚山梨醇酯80)德尔制剂中。在其他实施方案中，所述制剂还可包含钠、组氨酸、钙和谷胱甘肽。

在一方面，包含凝血因子复合物的制剂在施用前被冻干。冻干是使用本领域中常见的技术来进行且应针对所开发的组合物进行优化(Tang等人,Pharm Res.21:191-200,(2004)和Chang等人,Pharm Res.13:243-9(1996)。

制备药物制剂的方法可包括以下步骤中的一个或多个：在冻干之前将如本文所述的稳定剂添加至所述混合物，在冻干之前将至少一种选自增积剂、渗透压调节剂以及表面活性剂(其各自如本文所述)的试剂添加至所述混合物。在一方面，冻干制剂至少包含缓冲剂、增积剂以及稳定剂中的一种或多种。在此方面，在冻干步骤期间或在复原期间聚集成为问题的情况下评估并选择表面活性剂的应用。包含适当缓冲剂以使制剂在冻干期间维持在稳定pH带内。

冻干材料的标准复原实践是添加回一定体积的纯水或无菌注射用水(WFI)(通常等于在冻干期间所移除的体积)，但是在用于胃肠外施用的药物的产生中有时使用抗细菌剂的稀溶液(Chen,Drug Development and Industrial Pharmacy,18:131 1-1354(1992))。

冻干材料可被复原为水溶液。多种水性载体，例如无菌注射用水、供多剂量使用的含防腐剂的水、或含适当量的表面活性剂的水(例如含有与适于制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性化合物的水性悬浮液)。在各种方面中，此类赋形剂是悬浮剂，例如(但不限于)羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、褐藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、黄蓍胶以及阿拉伯胶；分散或湿润剂是天然存在的磷脂，例如(但不限于)卵磷脂；或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如(但不限于)聚氧乙烯硬脂酸酯；或环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物，例如(但不限于)十七乙烯氧基十六醇(heptadecaethyl-eneoxycetanol)；或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如(但不限于)聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。在各种方面中，水性悬浮液还含有一种或多种防腐剂，例如(但不限于)对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。

在某些实施方案中，本发明的组合物是使用注射器或其他储存容器施用的液体制剂。在其他实施方案中，这些液体制剂由本文所述的复原为水溶液的冻干材料产生。另一方面，本发明的组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体。短语“药学上”或“药理学上”可接受是指分子实体和组合物在使用如下文所述在本领域中熟知的途径施用时稳定、抑制蛋白质降解(如聚集和裂解产物)，并且此外不产生过敏反应或其他不良反应。“药学上可接受的载体”包括任何和所有临床上适用的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，包括上文公开的药剂。

凝血因子复合物的单次或多次施用是采用由主治医师选择的剂量水平和模式进行。为预防或治疗疾病，适当剂量取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重性和病程、药物是出于预防还是治疗的目的施用、先前疗法、患者的病史和对药物的反应，以及主治医师的判断。

在其他实施方案中并且根据上述中的任一项，凝血疾病如A型血友病的治疗可涉及单独或与另一种药剂组合的凝血因子复合物的初始治疗，接着一次或多次重复剂量的凝血因子复合物和/或其他药剂。初始和然后后续重复施用的性质将部分取决于所治疗的疾病。

在其他方面，凝血因子复合物可以0.5IU/kg-200IU kg范围内的剂量施用至受试者。在一些实施方案中，凝血因子复合物以1-190、5-180、10-170、15-160、20-450、25-140、30-130、35-120、40-110、45-100、50-90、55-80或60-70IU/kg范围内的剂量施用。在其他实施方案中并且根据上述中的任一项，凝血因子复合物可以约1IU/kg至约150IU/kg之间的剂量施用至受试者。在其他实施方案中，以1.5IU/kg至150IU/kg、2IU/kg至50IU/kg、5IU/kg至40IU/kg、10IU/kg至20IU/kg、10IU/kg至100IU kg、25IU/kg至75IU/kg以及40IU kg至75IU/kg之间的剂量施用凝血因子复合物。在其他实施方案中，以2、5、7.5、10、15、20、25、30、35、40、45或50IU/kg施用凝血因子复合物。正如将会理解的并且如本文进一步所论述，可通过使用用于确定血液水平剂量的确立的测定结合适当的剂量-反应数据来确定凝血因子复合物的适当剂量。

在某些实例中，可将本发明的复合物输注或施用至肌肉以治疗A型血友病。如本文所述，凝血因子复合物的组合物可包含在药物制剂中。此类制剂可口服、局部、透皮、胃肠外、通过吸入喷雾、阴道、直肠或通过颅内注射来施用。如本文所用的术语胃肠外包括皮下注射、静脉内、肌内、脑池内注射或输注技术。也涵盖通过静脉内、皮内、肌内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射和或在特定部位手术植入进行施用。一般来说，组合物基本上不含热原以及可能会对接受者有害的其他杂质。

在一方面，本发明的制剂是通过初始大丸药，接着进行连续输注以便维持药物产品的治疗性循环水平来施用。作为另一个例子，本发明的化合物作为一次性剂量施用。本领域的一般技术人员将易于优化如根据良好的医学规范和个别患者的临床病状确定的有效剂量和施用方案。施用途径可以是但不限于通过静脉内、腹膜内、皮下或肌内施用。给药频率取决于药剂的药物代谢动力学参数和施用途径。最佳药物制剂取决于施用途径和所需剂量由本领域的技术人员确定，参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,1990,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.18042第1435-1712页，其全部公开内容出于所有目的且具体地关于与制剂、施用途径和药物产品的剂量相关的教义以引用的方式整体并入本文。此类制剂影响所施用药剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。取决于施用途径，根据体重、体表面积或器官大小计算合适的剂量。可通过使用用于测定血液水平剂量的确立的测定结合适当的剂量-反应数据来确定适当的剂量。最终剂量方案由主治医师考虑改变药物作用的各种因素来确定，所述因素例如药物比活性、患者的损伤严重程度和反应性、患者年龄、病状、体重、性别以及饮食、任何感染的严重程度、施用时间以及其他临床因素。例如，本发明的凝血因子复合物的典型剂量是大约50IU/kg、等于500μg/kg。在进行研究时，将出现关于用于各种疾病和病状的适当剂量水平和治疗持续时间的其他信息。

在一些实施方案中，凝血因子复合物单独施用于受试者。在一些实施方案中，凝血因子复合物与一种或多种其他凝血因子组合施用于受试者。

在其他实施方案中，凝血因子复合物每日不超过一次地施用于受试者。在其他实施方案中，将凝血因子复合物施用于受试者：每隔一天不超过一次、每三天不超过一次、每四天不超过一次、每五天不超过一次、每周不超过一次、每两周不超过一次、每月不超过一次。在其他实施方案中，凝血因子复合物每天不超过两次施用于受试者。

已经总体上描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，所述实施例是作为说明提供的而不是限制性的。

无需进一步说明，据信本领域的普通技术人员可使用前述的说明和以下说明性实施例，进行和利用本发明中检测到的改变并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实施例特别指出本发明的优选实施方案，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。

实施例

修饰凝血因子-FVIII和FVIIa由于它们在治疗A型血友病中的作用而是深入研究和修饰的分子。若干方法和蛋白质上的位点可用于修饰。Wakabayashi,等人(Wakabayashi,Koszelak,Mastri,&Fay,2001)用丙烯酰丹和荧光素在Cys310和Cys692处修饰FVIII，并且证明这在FVIII活性的两种不同的测定中对FVIII的活性没有影响。纯化的FVIII可与马来酰亚胺化合物在室温下反应1小时或在水性缓冲液中在4℃下过夜反应。马来酰亚胺与游离半胱氨酸特异性地反应，并广泛用于蛋白质标记实验。然后可如所描述经由离子交换色谱法分离标记的蛋白质(Wakabayashi和Fay，2013)。

用于修饰FVIII或FVIIa的另一种方法是将所需分子连接至修饰每种蛋白质的碳水化合物链上(Stennicke等人，2013)。用于修饰任一分子的第三种方法是将所需氨基酸靶标连接至蛋白质的任一端(Pasut和Veronese，2012)。

已知白蛋白结合多种小分子，包括胆红素、吲哚美辛、布洛芬等(Peters，1995)。大部分这些配体的结合不依赖于pH，且因此可取代在马来酰亚胺-聚乙烯间隔物末端的脂肪酸部分。

白蛋白融合蛋白的构建-可从Genbank获得人vWF的D'D3片段的核苷酸序列或TF的可溶性形式。然后构建含有编码序列和适当长度的氨基酸接头的质粒。这些序列可由来自人白蛋白基因的合适DNA侧接，以使得所述构建体可在来自帽部位的核苷酸111处同时插入C3A(人肝细胞系)中的人白蛋白基因中(Kelly和Sussman，2000)。这可使用Cas/CRISPR来完成，如所描述(Ran等人，2013)。另外，可从头合成含有适当序列的质粒。

白蛋白融合蛋白的纯化-可使用与针对人血清白蛋白的单克隆抗体缀合的琼脂糖珠粒从C3A细胞上清液中回收融合蛋白。然后可用人血清白蛋白洗脱融合蛋白，并通过大小选择性色谱法分离。

修饰的凝血因子复合物的形成-融合蛋白可与极限浓度的修饰的FVIII在4℃下孵育过夜，然后使用大小选择性色谱法进行纯化。类似地，可将TF-白蛋白融合体在4℃下与极限浓度的衍生化FVIIa一起孵育过夜，然后使用大小选择性色谱法进行纯化。

体内和体外表征-治疗性复合物的活性、药物代谢动力学和药效学的体内和体外表征可如所描述进行(Mei等人，2010；Yee等人，2014)。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义具有相同的含义。本文所引用的出版物和致使它们被引用的材料是以引用的方式特别并入。

本领域的技术人员仅仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等效案。此类等效方案意图由以下权利要求涵盖。

材料和方法

纯化的B缺失的重组因子VIII(FVIII)购自RayBiotech(Norcross,GA)。使用从Diapharma(West Chester Township,OH)获得的Coamatic FVIII测定来测定FVIII活性。从Affinity Biologicals(Ancaster,ON,CA)获得FVIII ELISA。从Abcam(Cambridge,MA)获得其他抗体和ELISA试剂盒。通过Creative PEGWorks(Chapel Hill,NC)合成了含脂肪酸的马来酰亚胺-PEG衍生物。从Nanocs(New York,NY)或Click Chemistry Tools(Scottsdale,AZ)获得其他马来酰亚胺-PEG衍生物。从Life Technologies(Carlsbad,CA)或SigmaAldrich(St.Louis,MO)获得细胞培养、分子生物学和一般试剂。从GE Lifesciences(Pittsburgh,PA)获得柱色谱法供应和设备。

CM110和CM210的合成-用于合成基因CM110和CM210的表达质粒由LifeTechnologies的Gene Art部门合成。使用6/1比例的PEI与DNA在含有5％限定的小牛血清的培养基中通过C3A细胞的基于聚乙烯亚胺(PEI)的转染产生了蛋白质。在24小时后，将培养基更换为含有Glutamax的无血清DMEM。每天更换和收集培养基持续四天。使上清液介质通过1ml HisTRAP柱，用10个柱体积的含20mM磷酸钾(pH 7.4)、0.5M NaCl和30mM咪唑的缓冲液洗涤。用含有300mM咪唑的相同缓冲液从柱上洗脱蛋白质。将含蛋白质的级分合并并浓缩，然后经由通过凝胶过滤离心柱更换成含有20mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、4mMCaCl₂、0.01％吐温20的缓冲液。然后将蛋白质溶液应用于10X 300mm Superdex200Increase柱，以0.5ml/分钟在Akta Pure色谱仪上的相同缓冲液中运行。合并含蛋白质的级分并浓缩。

修饰FVIII或CM210-用具有通用结构马来酰亚胺-PEGn-X的各种分子修饰因子VIII，其中X是生物素、异硫氰酸荧光素、月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、反式环辛烯或甲基四嗪。将因子VIII溶解于含有20mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl和4mM CaCl₂、0.01％吐温20的缓冲液中，然后在室温下与10μM马来酰亚胺-PEG-X试剂一起孵育1小时。经由通过凝胶过滤离心柱以获得较小PEG化合物或通过Superdex 200Increase以获得超过1000道尔顿的PEG试剂来除去过量试剂。CM110或CM210在相同条件下用mal-PEG-TCO衍生化。

复合物形成–通过将修饰的FVIII与10倍过量的CM110或CM210在含有20mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl和4mM CaCl₂的缓冲液中在室温下孵育1小时来形成FVIII/CM110或CM210复合物。通过以0.5ml/分钟在相同缓冲液中在Superdex 200Increase或Superose6Increase上的色谱法来纯化复合物。

对于共价复合物形成，将用马来酰亚胺-PEG4-甲基四嗪修饰的FVIII与10倍过量的马来酰亚胺-PEG3-TCO修饰的CM110或CM210在含有20mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl和4mM CaCl2的缓冲液中在4℃下孵育过夜。经由通过Superose 6Increase分离复合物。

参考文献

Andersen，J.T.，Pehrson，R.，Tolmachev.V.，Daba，M.B.，Abrahmsén，L.，&Ekblad，C.(2011).Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fcreceptoo(FcRn)using a minimal albumin binding domain.The Journal ofBiological Chemistry，286(7)，5234-5241.Retrieved from http://www.jbc.org/content/286/7/5234.fullpdf+html

Bradbury，A.R.M.，Sidhu，S.，Dübbel，S.，&McCafferty，J.(2011).Beyondnatural antibodies：the power of in vitro display technologies.NaturePublishing Group，29(3)，245-254.http://doi.org/10.1038/nbt.1791

Buyue，Y.，Liu，T.，Kulman，J.D.，Toby，G.G.，Kamphaus，G.D.，Patarroyo-White，S.，et al.(2014).A Single Chain Variant of Factor VIII Fc Fusion ProteinRetains Normal In Vivo Efficacy but Exhibits Altered In Vitro Activity.PLoSONE，9(11)，el 13600.http://doi.org/10.137l/journal.pone.0113600

Ginn，C.，Khalili，H.，Lever，R.，&Brocchini.S.(2014).PEGylation and itsimpact on the design of new protein-based medicines.Future MedicinalChemistry，6(16)，1829-1846.http://doi.org/10.4155/fmc.14.125

Hoots，W.K.(2003).Comprehensive care for hemophilia and relatedinherited bleeding disorders：why it matters.Current Hematology Reports，2(5)，395-401.

Horisawa，K.(2014).Specific and quantitative labeling of biomoleculesusing click chemistry.Frontiers in Physiology 5，457.

Kelly，J.H.，&Sussman，N.L.(2000).A Fluorescent Cell-Based Assay forCytochrome P-450Isozyme 1A2 Induction and Inhibition.Journal of BiomolecularScreening，5(4)，249-253.http://doi.org/10.1177/108705710000500407

Kempton.C.L.，&Meeks，S.L.(2014).Toward optimal therapy for inhibitorsin hemophilia.Hematology/theEducation Program of the American Society ofHematology.American Society of Hebatology.Education Program，2014(1)，364-371.http://doi.org/10.1182/asheducation-2014.1.364

Kramer，R.H.，&Karpen，J.W.(1998).Spanning binding sites on allostericproteins with polymer-linked ligand dimers.Nature，395(6703)，710-713.http://doi.org/10.1038/27227

Lawson，J.H.，Butenas，S，，Ribarik，N.，&Mann，K.G.(1993).Complex-dependentinhibition of factor VIIa by antithrombin III and heparin.The Journal ofBiological Chemistry，268(2)，767-770.

Lenting，P.J.，Christophe，O.D.，&Denis，C.V.(2015).von Willebrand factorbiosynthesis，secretion，and clearance：connecting the far ends.Blood.125(13)，2019-2028.http://doi.org/10.1182/blood-2014-06-528406

Mannucci，P.M.，&Mancuso，M.E.(2014).Fc-fusion technology andrecombinant FVIII and FIX in the management of thehemophilias.Drug Design，Development and Therapy，365.http://doi.org/10.2147/DDDT.S47312

Mei，B.，Pan.C.，Jiang，H.，Tjandra，H.，Strauss，J.，Chen，Y.，et al.(2010).Rational design of a fully active，long-acting PEGylated factor VIII forhemophilia A treatment.Blood，116(2)，270-279.http://doi.org/10.1182/blood-2009-11-254755

Oldenburg，J.，&Albert，T(2014).Novel products for haemostasis-currentstatus.Haemophilia，20，23-28.http://doi.org/10.1111/hae.12428

Orlova，N.A.，Kovnir，S.V.，Vorobiev，I.I.，Gabibov，A.G.，&Vorobiev，A.I.(2013).Blood Clotung Factor VIII：From Evolution to Therapy.Acta Naturae，5(2)，19-39.

Pasut，G.，&Veronnese，F.M.(2012).State of the art in PEGylation：Thegreat versatility achieved after forty years of research.Journal ofContrelledRelease，161(2)，461-472.

Peters，T.，Jr.(1995).Allabout albumin：biochemistry，genetics，andmedical applications.

Philips，J.-C.，&Scheen，A.(2006).Insulin detemir in the treatment oftype l and type 2 diabetes.Vascular Health and Risk Management，2(3)，277-283.

Pipe，S.W.(2010).Hemophilia：new protein therapeutics.Hematology/theEducation Program of the American Society of Hematology.American Societyof Hematology.Education Program，2010，203-209.http://doi.org/10.1182/asheducation-2010.1.203

Ran，F.A.，Hsu，P.D，Lin，C.-Y.，Gootenberg，J.S.，Konermann，S.，Trevino，A.E.，et al.(2013).Double NickingbyRNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced GenomeEditing Specificity.Cell，1-15.http://doi，org/10.1016/j.cell.2013.08.021

Schulte，S.(2008).Use of albumin fusion technology to prolong thehalf-life of recombinant factor VIIa.Thrombosis Research，122(S4)，S14-S19.http://doi.org/10.1016/S0049-3848(08)70029-X

Smith，S.A.，Travers，R.J.，&Morrissey，J.H.(2015).How it all starts：Initiation of the clotting cascade.Critical Reviews in Biochemistry andMolecular Biology，1-11.http://doi.org/10.3109/10409238.2015.1050550

Srivastava，A.，Brewer，A.K.，Mauser-Bunschoten，E.P.，Key，N.S.，Kitchen，S.，Llinas，A.，et al.(2012).Guidelines for the management ofhemophilia.Haemophilia，19(1)，el-e47.http://doi.org/10.1111/j.1365-2516.2012.02909.x

Stennicke，H.R.，Kjalke，M.，Karpf，D.M.，Balling，K.W.，Johansen，P.B.，Elm.T.，et al.(2013).A novel B-domain O-glycoPEGylated FVIII(N8-GP)demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic micemodels.Blood，121(11)，2108-2116，http://doi.org/10.1182/blood-2012-01-407494

Vadivel，K.，&Bajaj，S.P.(2012).Structural biology of factor VIIa/tissuefactor initiated coagulation，Frontiers in Biosciennce：a Journal and VirtualLibrary，17，2476-2494.

van der Flier，A.，Liu，Z.，Tan，S.，Chen.K.，Drager，D.，Liu，T.，et al.(2015).FcRn Rescues Recombinant Factor VIII Fc Fusion Protein from a VWFIndependent FVIII Clearance Pathway in Mouse Hepatocytes.PLoS ONE，10(4)，e0124930-23.http://doi.org/10.1371/journal.pone.0124930

Wakabayashi，H.，&Fay，P.J.(2013).Molecular orienntation of Factor VIIIaon the phospholipid membrane surface determined by fluorescence resonanceenergy transfer.The Biochemical Journal，452(2)，293-301.http://doi.org/10.1042/BJ20130025

Wakabayashi，H.，Koszelak，M.E.，Mastri，M.，&Fay，P.J.(200)1).Metal lon-independent Association of Factor VIII Subunits and the Roles of Calcium andCopper Ions for Cofactor Activity and Inter-Subunit Affinity.Biochemistry，40(34)，10293-10300.http://doi.org/10.1021/bi010353q

Yee，A.，Gildersleeve，R.D.，Gu，S.，Kretz，C.A.，McGee，B.M.，Carr，K.M.，et al.(2014).A von Willebrand factor fragment containing the D′D3domains issuficient tostabilize coagulation factor VIII in mice.Blood，124(3)，445-452.http://doi.org/10.1182/blood-2013-11-540534

Zhou，H.-X.(2006).Quantitative Relation between Intermolecular andIntramolecular Binding of Pro-Rich Peptides to SH3Domains.BiophysicalJournal，91(9)，3170-3181.http://doi.org/10，1529/biophysj.106.090258

Claims

1.一种凝血因子复合物，其包含：

a.凝血因子；

b.融合蛋白，所述融合蛋白包含与白蛋白或白蛋白片段融合的第一蛋白质；以及

c.修饰分子，其中所述修饰分子以允许被所述融合蛋白结合的这样一种方式与所述凝血因子偶联，由此产生修饰的凝血因子；

其中所述修饰的凝血因子和所述融合蛋白在至少两个独立的位点中相互作用。

2.如权利要求1所述的凝血因子复合物，其中所述修饰的凝血因子的至少一个结合位点是天然结合位点。

3.如权利要求1或2所述的凝血因子复合物，其中所述融合蛋白的至少一个结合位点是由所述修饰分子提供。

4.如权利要求1至3中任一项所述的凝血因子复合物，其中所述凝血因子是因子VIII。

5.如权利要求1至3中任一项所述的凝血因子复合物，其中所述修饰的凝血因子是修饰的因子VIIa。

6.如权利要求1至5中任一项所述的凝血因子复合物，其中所述融合蛋白的所述第一蛋白质是冯威勒布兰德因子的片段。

7.如权利要求6所述的凝血因子复合物，其中冯威勒布兰德因子的所述片段是D'D3片段。

8.如权利要求6所述的凝血因子复合物，所述融合蛋白的所述第一蛋白质是组织因子(TF)。

9.如权利要求1至8中任一项所述的凝血因子复合物，其中所述修饰的凝血因子和所述融合蛋白形成非共价键。

10.如权利要求1至8中任一项所述的凝血因子复合物，其中所述修饰的凝血因子和所述融合蛋白共价地相互作用。

11.如权利要求10所述的凝血因子复合物，其中所述共价键不是肽键。

12.如权利要求10所述的凝血因子复合物，其中所述共价键不是通过核酸的翻译产生的肽键。

13.如权利要求1至12中任一项所述的凝血因子复合物，其中所述修饰分子包含脂肪酸。

14.如权利要求1至13中任一项所述的凝血因子复合物，其中所述修饰分子是通过点击化学产生。

15.如权利要求1至14中任一项所述的凝血因子复合物，其中所述凝血因子通过点击化学偶联至所述融合蛋白。

16.如权利要求1至15中任一项所述的凝血因子复合物，其中所述修饰分子通过聚乙二醇链连接至所述凝血因子。

17.如权利要求16所述的凝血因子复合物，其中所述聚乙二醇链连接至所述凝血因子上的马来酰亚胺。

18.如权利要求17所述的凝血因子复合物，其中所述聚乙二醇链以包含马来酰亚胺-PEG_N-X的结构连接至马来酰亚胺，其中所述X是甲基四嗪。

19.如权利要求1至18中任一项所述的凝血因子复合物，其中所述融合蛋白的所述第一蛋白质是经由接头与白蛋白连接在一起。

20.如权利要求1至19中任一项所述的凝血因子复合物，其中所述凝血因子包含修饰的氨基酸。

21.如权利要求1至20中任一项所述的凝血因子复合物，其中所述融合蛋白包含修饰的氨基酸。

22.如权利要求1至21中任一项所述的凝血因子复合物，其中所述凝血因子复合物的半衰期与单独凝血因子相比高至少20％。

23.一种试剂盒，其包括如权利要求1至22中任一项所述的组合物。

24.一种治疗患有需要凝血因子输注的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1所述的凝血因子复合物。

25.如权利要求24所述的方法，其中向所述受试者施用所述凝血因子复合物使得所述凝血因子复合物的血液水平半衰期大于在单独施用所述凝血因子时获得的血液水平半衰期。

26.如权利要求24或25所述的方法，其中经由注射、吸入、鼻内或口服向所述受试者施用所述凝血因子复合物。

27.如权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述疾病是血友病。