JP2013511995A - 全身性エリテマトーデス(sle)を治療するためのヒト化抗il−10抗体 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF
SRVKTFFQMK DQLDNLLLKE SLLEDFKGYL
GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA ENQDPDIKAH
VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA
VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI
EAYMTMKIRN (配列番号1)
(i)Ser32、Asn33、Asn35、Tyr37を含む軽鎖CDR1、
(ii)Lys55を含む軽鎖CDR2、
(iii)Phe27、Ser28、Ala30、Thr31、Tyr32を含む重鎖CDR1、
(iv)Trp52、Arg53、Gly54、Ser56を含む重鎖CDR2、
(v)Tyr100、Gly101、Tyr103を含む重鎖CDR3。
本発明は、更に、上記抗体又は抗体断片をコードする核酸配列を提供する。前記核酸配列は、DNAであってもRNAであってもよいが、DNAが好ましい。前記配列は、発現カセット又はベクター内で用いることができ、本明細書に開示される抗体及びその断片の産生において特に用いられる。
本明細書に記載される抗体又はその断片は、高レベル又は高活性のIL−10により媒介される疾患又は病状の治療において有用性を有する。結果として、被験体における病状を治療又は予防するための方法であって、前記病状が高レベル又は高活性のIL−10により媒介され、治療上有効な量の本明細書に記載される抗体又はその断片を投与することを含む方法を提供する。
更に、本明細書に記載される抗体又はその断片と標識とを含む、標識されているヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片を提供する。前記標識は、サンプル中の抗体の存在を検出するために当技術分野において公知である任意の好適な種類であってよい。具体的には、前記標識は、蛍光標識であってよい。
(a)以下のヒトIL10の領域:アミノ酸27〜53及びアミノ酸142〜155のうちの1以上を含むペプチドと前記1以上の分子とを接触させる工程と;
(b)前記1以上の分子が前記ペプチドの1以上の領域に結合するかどうかを検出する工程と
を含む方法を提供する。
(a)1以上の抗体又は抗体断片とIL−10とを接触させる工程と;
(b)IL−10とIL−10受容体α(IL−10Rα)との相互作用を阻害する前記抗体又は抗体断片の能力を評価する工程と;
(c)IL−10受容体α(IL−10Rα)が結合する領域と同じIL−10の領域に結合可能である抗体又は抗体断片を同定する工程と
を含み、
前記抗体又は抗体断片が、BT−063軽鎖のCDR1及びCDR2を含む可変領域及び/又はBT−063重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3を含む可変領域を含み、
前記CDRが、配列中に以下のアミノ酸置換を任意で含むCDRである方法を提供する:
(i)Ser32、Asn33、Asn35、Tyr37を含む軽鎖CDR1、
(ii)Lys55を含む軽鎖CDR2、
(iii)Phe27、Ser28、Ala30、Thr31、Tyr32を含む重鎖CDR1、
(iv)Trp52、Arg53、Gly54、Ser56を含む重鎖CDR2、
(v)Tyr100、Gly101、Tyr103を含む重鎖CDR3。
1.1 B−N10抗体の可変ドメインをコードするDNAの単離
マウスBN−10の可変配列を同定するために、細胞ペレットを用いた。−80℃で保存しておいたサンプル(3×B−N10、3代継代、1×107細胞)の細胞からmRNAを単離し、cDNAを合成した後、B−N10の可変配列をPCRにより増幅させ、次いで、クローニングした。
組換え抗体を発現させるために、実施例1で同定された抗体の重鎖及び軽鎖の可変配列をベクター系にクローニングした。第1の工程として、前記配列をBSリーダーにクローニングし、N末端に分泌シグナルを付加し、C末端にスプライスドナー配列を付加した。第2の工程として、それぞれ定常ヒトカッパ鎖及び定常ヒトガンマ−1鎖を含有する発現ベクターにこれら配列をクローニングした。軽鎖用ベクター及び重鎖用ベクターを調製し、次いで、リン酸カルシウム沈殿又はリポフェクションによってCOS−7細胞に一過的にコトランスフェクトした。2日間後、細胞培養上清を回収した。COS−7細胞中でキメラB−N10を発現させ、上清中の抗体の力価を検出した(サンドイッチELISA)後、ヒトインターロイキン−10(R&D Systems、カタログ番号217−IL/CF、ロット番号ET114021、−20℃で保存)に対する結合能をELISAで試験した。
げっ歯類抗体のヒトにおける免疫原性を低下させようとする最初の試みは、げっ歯類抗体の定常ドメインをヒト抗体の定常ドメインに置き換えることによりキメラ抗体を作製することであった。依然として可変ドメイン内のげっ歯類のフレームワーク領域が免疫反応を誘導する場合があったので、より進歩したCDRのグラフト方法、即ち、抗原結合配列(相補性決定領域、CDR)を完全にヒト抗体フレームワークに転移させる(ヒト化)方法が開発された。通常、マウスドナー抗体に最も類似するヒトアクセプターフレームワークを選択して、ヒト化プロセス中にオリジナル抗原の特異性及び親和性が回復される可能性を高める。ヒト抗体生殖細胞系配列、発現抗体のコンセンサス配列、CDRループ構造の分析、及び抗体/抗原複合体のX線構造を用いる異なるアプローチを用いてもよく、これらと組み合わせて前記プロセスを改善してもよい。通常、幾つかのヒト化抗体変異体は、この方法で作製され、後に、互いに異なる及びオリジナル抗体と異なる可能性のある生物学的作用に関して分析される。最後に、抗体の望ましい機能に従って、好適なヒト定常領域を選択することができる。
マウス抗IL−10抗体であるB−N10を選択した(Llorente et al.,Eur.Cytokine Netw.1993 Nov−Dec;4(6):421−7;及びLlorente et al.,Arthritis Rheum.2000 Aug;43(8):1790−80)。ヒト化抗体を得るための方法は、相補性決定領域(CDR)をヒトアクセプター領域に融合させるCDRグラフト手順に基づく。
1. 体細胞突然変異のリスクを最小化するための、マウス配列とヒト生殖細胞系配列との相同性、
2. 異常なアミノ酸残基を同定するための、マウス配列とヒトコンセンサス配列との比較、及び
3. 重要な構造フレームワークアミノ酸残基についての情報を得るための、CDR配列の基準となる構造クラスの同定。
hIL−10に結合する可能性のある抗体断片のライブラリを作製して最適なヒトIL−10結合抗体を得るために、真核細胞のコドン使用頻度を考慮した上で、図3に示す12個のhVL断片及び29個のhVH断片をコードするcDNA配列を作製した。
スクリーニングアプローチにより求められた統計値に基づいて、ベクター系にクローニングするためのBT−063のヒト化VL及びヒト化VHの変異体のセットを選択した。第1の工程では、分泌シグナル5’及びスプライスドナー配列3’をコードしている配列とクローニングしたcDNAとを融合させるために、ヒト化VL及びVHの変異体をコードするcDNAを適切なベクターに転移させた。第2の及び最後のサブクローニング工程で、それぞれ、ヒト定常カッパ鎖及びヒト定常ガンマ−1鎖をコードする発現ベクターにこれらcDNAコンストラクトを転移させた。内毒素を含まないQiagen Midi−prepキット(Qiagen,Germany)によって、独立に得られたhVL及びhVHを含有する発現ベクターのプラスミドを調製した。
COS−7細胞におけるヒト化抗体変異体を一過的に発現させるために、選択した各ヒト化VL変異体(hVL7及びhVL8)と、選択した各ヒト化VH変異体(hVH1、hVH9、hVH13、hVH18、hVH20、hVH26、hVH28)とを組み合わせて、14個の異なるヒト化抗体を得た。
選択されたヒト化BT−063変異体(hVH20/hVL7、hVH20/hVL8、hVH26/hVL7)及びキメラcB−N10(実施例2で論じた)をCOS−7細胞で産生させた。
BIACORE2000(Biacore AB,Uppsala,Sweden)を用いて、hIL−10に対する様々な抗体(マウス、キメラ、3つのヒト化変異体)の結合についての会合速度定数及び解離速度定数を測定するために表面プラズモン共鳴分析を用いた。製造業者の条件に従って、hIL−10をCM−5センサチップに固定化した。5μL/分の流速で20μg/mLのアリコート50μLを添加することによりhIL−10を固定化して、固定化密度320RUにした。50μL/分の流速で0.1Mの炭酸バッファ(pH9.2)及び0.01MのHCL/1MのNaClを各1分間用いることにより2段階サイクルで、固定化hIL−10表面を再生した。20μg/mL〜0.15μg/mLの抗体濃度範囲で少なくとも4回各抗体サンプルを分析した。BIA evaluationバージョン3(1999)ソフトウェアを用いることにより、センサグラムからの計算を実施した。
Biacore T100(Biacore AB,Uppsala,Sweden)を用いた更なる表面プラズモン共鳴実験により、BT−63変異体3(hVH26/hVL7)のカニクイザルIL−10に対する親和性を分析した。
BT−063(変異体hVH26/hVL7)の能力を確認するために、末梢血単核細胞(PBMC)におけるIL−6放出の遮断について調べた。PBMCは、リポ多糖類(LPS)で刺激されるとインターロイキン−6(IL−6)を放出する。インターロイキン−10(IL−10)の生理学的活性は、サイトカイン、例えば、IL−6の分泌阻害である。したがって、LPSで刺激された細胞にIL−10を添加すると、IL−6の分泌が阻害され、細胞培養培地中に存在するIL−6が著しく低下する。しかし、細胞培養物にBT−063を添加するとIL−10と結合するので、IL−10が細胞表面上の受容体に結合することができなくなる。IL−10の阻害作用は補償され、IL−6分泌は回復し、培地中にIL−6が放出される。
勾配遠心分離を用いて様々な健常ボランティアから新たにヒト末梢血単核細胞(PBMC)を調製した。この目的のために、Hanks緩衝溶液で血液サンプルを1:1に希釈し、50mLの滅菌チューブ内のこの溶液20mL上にFicoll20mLをゆっくり重ねた。制動することなしに室温で25分間1,200×gにてこのチューブを遠心分離した。遠心分離後、曇った界面、即ちバッフィコートを50mLのチューブに移し、PBSで洗浄し、10分間260gで再度遠心分離した。製造業者のプロトコールに従って、BD Pharm Lyse(登録商標)を用いて残留赤血球を溶解させた。単離したPBMCをRPMI(10%FCS)に再懸濁させた。
6.1 ヒトIL−10との複合体におけるBT−063 Fabの結晶化
公開されている構造データに従って幾つかのIL−10コンストラクトを設計し(Zdanov et al.,Structure,Vol.3,1995,pp.591)、標準的な手順により大腸菌で異種発現させるためのベクターにクローニングした。クローニングしたコンストラクトを標準的なプロトコールに従って試験的に発現させたところ、約18kDaの予測範囲でバンドが増加したことにより示される通り、IL−10の高発現を示した。
結晶を急速冷凍させ、100Kの温度で測定した。低温条件を用いてSWISS LIGHT SOURCE(SLS,Villigen,Switzerland)でBT−063のFab断片と共にIL−10の共結晶からX線回折データを収集した。
分子置換により、構造を決定及び分析するのに必要な位相情報を得た。IL−10及びFab断片の公開モデルをサーチモデルとして用いた。次いで、ソフトウェアパッケージCCP4及びCOOTを用いて標準的なプロトコールに従って、モデルの構築及び構造の精密化を実施した。最終モデルの正確さを交差検定するための尺度であるフリーR因子を計算するために、構造の精密化手順から測定された反射の4.2%を除外した(表7を参照されたい)。
BT−063 Fab抗体断片が結合するヒトIL−10の複合体構造を3.48Åの解像度で分析し、Fab抗体断片の詳細な結合様式を明らかにする。
カニクイザルで、BT−063(変異体hVH26/hVL7)の単回静脈内注射後、安全性薬理学的パラメータを含む単回用量毒性試験を実施した。4匹/性別/群になるように動物を4群に分けた(プラセボ、1mg/kg、7mg/kg、及び50mg/kg)。1日目にBT−063を静脈内注射した。5日間後に動物の半数を剖検し、残りの動物は28日目に屠殺した。
mAb BT−063の単回静脈内注射後のヒト健常ボランティアにおけるIL−10の中和を推定するために、BT−063−IL−10複合体の解離定数、ヒト血液体積の標準的なパラメータ、及び血流内にはBT−063のみが分布しているという仮説に基づいて、健常ボランティアにおいて、BT−063(変異体hVH26/hVL7)によるIL−10の標的占有率を推定した。
検証されていないMicrosoft−Excelソフトウェアを用いて、BT−063によるIL−10の標的占有率を計算し、用量依存性を示した。
計算のための仮説:
− 血液体積(血清):3.5L
− 健常ボランティアの血清におけるIL−10の平均濃度:15pg/mL
− kD(解離定数、BT−063⇔IL−10):3nM(Biacore実験から得た)
− IL−10ダイマーの分子量:37,000g/mol
− BT−063の分子量:150,000g/mol
質量作用の法則:BT063+IL10⇔BT063/IL−10複合体
得られた解離定数は、BT063の定常状態濃度([BT063])、IL−10の定常状態濃度([IL−10])、及びBT063−IL−10複合体の定常状態濃度([複合体])により求められる:
kD=[BT063]*[IL−10]/[複合体]
[BT063]=[BT0630]−[複合体]
[IL−10]=[IL−100]−[複合体]
− BT063は、注射直後、血液中に等しく且つ排他的に分布する
− BT063分子は、血液体積中に留まる
− IL−10は、血液中に排他的に分布し、IL−10の他の起源は存在しない
− IL−10分子又はBT063−IL−10複合体は、血流中に留まり、Fc受容体の媒介する機序又は他の機序により循環から外れることもない
− 速やかに平衡に達する。
◆分子量(BT063):15,000g/mol
◆分子量(IL−10ダイマー):37,000g/mol
◆健常ボランティアの血清におけるIL−10の平均濃度:15pg/mL
◆血清体積:3.5L
健常ボランティアにおいて漸増用量の抗体を用いて、BT−063(変異体hVH26/hVL7)の安全性及び忍容性、並びにBT−063の投与の効果をモニターするために実験を行った。23人のボランティアを8用量群に分け、BT−063を単回静脈内投与した。用量群は、以下の通りであった:0.175mg、0.75mg、3.5mg、7mg、15mg、30mg、60mg、及び100mg。100mg用量群のボランティアが2人であったことを除いて、1群当たりのボランティアは3人であった。
注入後24時間以内では、IL−6及びIL−8が非用量依存的に一過的に増加したが、3日間後には投与前のレベルに戻った。この作用は、抗体ではなく注入事象に関連すると考えられる。その理由は、用量との相関がなく、また最低用量でさえも前記事象が生じたためである。
薬物動態データは、BT−063のCmax、AUC、及び半減期が、予測される理論値の範囲内であることを示した。BT−063の終末半減期は、15日間〜30日間である。30mg以上の用量を投与した後、85日間後も依然としてBT−063を血漿中で検出することが可能である。
Claims (30)
- インターロイキン−10(IL−10)に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、
(i)IL−10受容体α(IL−10Rα)が結合する領域と同じIL−10の領域に結合し、IL−10がIL−10受容体に結合しているときにはIL−10に結合することができず、且つ
(ii)ホモダイマー型のIL−10に、両方のモノマーの残基を含む不連続なエピトープに結合することにより結合する
ことを特徴とするヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。 - マウス抗体B−N10の可変軽鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、
マウス抗体B−N10の可変重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、又は
マウス抗体B−N10の可変軽鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、且つマウス抗体B−N10の可変重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む請求項1に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。 - マウス抗体B−N10の可変軽鎖及び可変重鎖の少なくともいずれかのCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を含む請求項2に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
- マウス抗体B−N10の可変軽鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列のうちの少なくとも1つ、
マウス抗体B−N10の可変重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列のうちの少なくとも1つ、又は
マウス抗体B−N10の可変軽鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとマウス抗体B−N10の可変重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとを含み、
これら配列中に、親和性及び特異性の少なくともいずれかを実質的に変化させることのない変異が任意で存在する請求項1に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。 - マウス抗体B−N10の可変軽鎖のアミノ酸配列、及びマウス抗体B−N10の可変重鎖のアミノ酸配列の少なくともいずれかを含む請求項1から4のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
- 抗体BT−063の可変重鎖配列(配列番号70)及びBT−063の可変軽鎖配列(配列番号69)を含む請求項1から4のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
- IL−10受容体β(IL−10Rβ)が結合する領域と同じIL−10の領域には結合しない請求項1から6のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
- 一方のIL−10モノマーのへリックスAの残基と、他方のIL−10モノマーのへリックスF’の残基とを含む不連続なエピトープに結合する請求項1から7のいずれかに記載のヒト化抗体又はキメラ抗体。
- 不連続なエピトープの残基が、一方のモノマーの最初の55アミノ酸及び他方のモノマーの最後の20アミノ酸中に存在する請求項1から8のいずれかに記載のヒト化抗体又はキメラ抗体。
- 不連続なエピトープが、一方のモノマーのアミノ酸20〜55及び他方のモノマーの最後の20アミノ酸中に存在する請求項9に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
- 抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用及び補体依存性細胞傷害作用の少なくともいずれかを誘導しない請求項1から10のいずれかに記載のインターロイキン−10(IL−10)に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
- IL−10α受容体を介するIL−10シグナル伝達を妨げることができる請求項1から11のいずれかに記載のインターロイキン−10(IL−10)に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
- IL−10R発現細胞に結合することができないことを特徴とするインターロイキン−10(IL−10)に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
- 請求項1から13のいずれかに記載の抗体又はその断片をコードすることを特徴とする核酸。
- 請求項14に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
- 請求項14に記載の核酸又は請求項15に記載のベクターを含むことを特徴とするホスト細胞。
- 請求項1から13のいずれかに記載の抗体又はその断片を産生する方法であって、前記抗体又はその断片を発現させる条件下で培養培地中にて請求項16に記載のホスト細胞を培養し、前記培養培地から前記抗体又はその断片を分離する工程を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1から13のいずれかに記載の抗体又はその断片を含み、且つ薬学的に許容し得る担体又は希釈剤を更に含むことを特徴とする医薬組成物。
- 被験体における、高レベル又は高活性のIL−10により媒介される病状を治療又は予防する方法であって、治療上有効な量の請求項1から13のいずれかに記載の抗体又はその断片を前記被験体に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
- 病状が、全身性エリテマトーデス(SLE)である請求項19に記載の被験体における病状を治療又は予防する方法。
- 医療において使用するための請求項1から13のいずれかに記載の抗体又はその断片。
- SLEの治療において使用するための請求項1から13のいずれかに記載の抗体又はその断片。
- SLEを治療する医薬の製造における請求項1から13のいずれかに記載の抗体又はその断片の使用。
- 標識と請求項1から13のいずれかに記載の抗体又はその断片とを含むことを特徴とする標識されているヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
- サンプル中のIL−10を中和するためのインビトロにおける方法であって、前記サンプルと請求項1から13のいずれかに記載の抗体又はその断片とを接触させて、前記抗体又はその断片をIL−10に結合させる工程を含むことを特徴とする方法。
- サンプル中のIL−10の存在を検出するためのインビトロにおける方法であって、前記サンプルと、請求項1から13のいずれかに記載の標識されていない抗体若しくはその断片又は請求項24に記載の標識されている抗体若しくはその断片とを接触させる工程と、前記サンプルに結合していない抗体又は抗体断片を除去するために洗浄する工程と、前記サンプル中の前記抗体若しくはその断片又は前記標識の存在を検出する工程とを含むことを特徴とする方法。
- 個体においてSLEを診断する方法であって、(a)前記個体から採取した血漿サンプルを提供する工程と、(b)前記サンプルと請求項1から13のいずれかに記載の抗体又はその断片とを接触させる工程と、(c)IL−10の存在を検出する工程とを含むことを特徴とする方法。
- 工程(c)が、サンプル中に存在するIL−10の量を測定することを含む請求項27に記載の方法。
- 請求項1から5のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、
BT−063の軽鎖のCDR1及びCDR2を含む可変領域、
BT−063の重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3を含む可変領域、又は
BT−063の軽鎖のCDR1及びCDR2を含む可変領域とBT−063の重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3を含む可変領域とを含み、
前記CDRが、配列中に以下のアミノ酸置換を任意で含むCDRであるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片:
(i)Ser32、Asn33、Asn35、Tyr37を含む軽鎖CDR1、
(ii)Lys55を含む軽鎖CDR2、
(iii)Phe27、Ser28、Ala30、Thr31、Tyr32を含む重鎖CDR1、
(iv)Trp52、Arg53、Gly54、Ser56を含む重鎖CDR2、
(v)Tyr100、Gly101、Tyr103を含む重鎖CDR3。 - 重鎖可変領域がAsn73及びSer74を更に含む請求項29に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
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