MX2012006198A - Agente para tratar enfermedad. - Google Patents

Agente para tratar enfermedad.

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Abstract

Se proporciona un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento, capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10), en donde el anticuerpo o su fragmento: (i) liga a la misma región de IL-10 que el receptor IL-10a (IL-10Ra) y no es capaz de ligar IL-10 cuando IL-10 se liga al receptor IL-10; y (ii) liga a IL-10 en forma homodimérica para enlazar un epítopo discontinuo que comprende residuos de ambos monómeros. Además se proporcionan productos relacionados y métodos que involucran el uso del anticuerpo o su fragmento.

Description

AGENTE PARA TRATAR ENFERMEDAD CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a interleucina-10 (IL-10) y agentes específicos de IL-10. En particular, la presente invención involucra anticuerpos IL-10 humanizados y sus usos. La invención además prevee un método de tratamiento de lupus sistémico eritematoso (SLE = Systemic Lupus Erythematosus ) .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El lupus sistémico eritematoso (SLE) se considera como una enfermedad autoinmune, en donde hiperactividad anormal de linfocitos B y producción anormal masiva de auto-anticuerpos de gamma inmunoglobulina (IgG) juega un papel clave. Este proceso patológico resulta en secuestro y destrucción de células revestidas con Ig, fijación y disociación de proteínas de complemento, y liberación de quimiotaxinas , péptidos vasoactivos y enzimas destructoras en tejidos (Hahn BH. Systemic Lupus Erythematosus. In: Kasper DL, Braunwald E, Fauci AS, Hauser SL, Longo DL, Jameson, JL, editors. In: Harrison' s Principies of Infernal Medicine (16a edición) . New York (US) : McGraw-Hill ; 2005. pp.1960-1967) .
SLE se caracteriza por diversas manifestaciones. En el curso de la enfermedad, un total de 95% de los pacientes se quejan de enfermedad de musculoesquelético, 80% muestran lesiones cutáneas, 85% de enfermedad hematológica, 60% de desórdenes neurológicos, 60% de enfermedad cardiopulmonar, 30% a 50% de enfermedad renal, 40% de enfermedad gastrointestinal, 15% de trombosis y 15% de enfermedad ocular. La vasta mayoría de los pacientes (95%) también sufren de síntomas sistémicos tales como fatiga, malestar, fiebre, anorexia, y pérdida de peso, que están presentes la mayoría del tiempo. Muchos de los pacientes experimentan periodos de enfermedad de erupciones que alternan con remisiones. Remisiones permanentes (ausencia de síntomas sin tratamiento) son muy raras. Hace más de 50 años la mayoría de los pacientes con diagnóstico de SLE vivían menos de 5 años. En la actualidad, más del 90% tienen 10 años de supervivencia, primordialmente con base en un temprano diagnóstico, tratamiento antiinflamatorio sintomático e inmuno-supresivo . La causa común de la muerte es infección como resultado de inmuno-supresión (Hahn 2005) .
Fármacos antimalaria, anti-inflamatorios e inmunosupresores , se han empleado rutinariamente en el tratamiento de SLE. Agentes anti-inflamatorios no-esteroidales se han suplementado con corticosteroides cuando los síntomas se vuelven difíciles de controlar. Además, SLE activo con mayor par icipación de órganos, requiere una terapia agresiva con ciclofosfamida .
Hasta ahora, no ha habido tratamiento causativo disponible para curar SLE y/o mejorar la calidad de vida de los pacientes en una base a largo plazo. Sin embargo, recientes avances en tecnología de anticuerpos y la identificación adicional de factores subyacentes a esta enfermedad autoinmune han abierto la posibilidad de utilizar anticuerpos monoclonales como una opción de tratamiento. En particular, un enfoque favorable para tratar SLE, sería un tratamiento específico que interactúa o corrige la respuesta inmune patológica que resulta en la sobre-producción masiva de auto-anticuerpos policlonales . Ya que la patogénesis de SLE primordialmente involucra células B desreguladas, anticuerpos monoclonales capaces de hacer blanco o diana en células B son de interés especial. Como se anotó por Robak and Robak (Current Drug Targets, 2009, No. 10, páginas 26-37) dianas de antígeno de superficie de células B potenciales son CD19, CD20, CD21 y CD22. Además, IL-10, IL-lra, IL-12 (Capper et al., Clin. Exp. Immunol. 2004 Nov; 138 (2) : 348-56) , y IL-6 (Chun et al., J. Clin. Immunol. 2007 Sep; 27(5):461-6) son citocinas importantes para regular inmuno respuesta y son desarrollados especialmente durante erupciones en pacientes con SLE. Niveles en plasma de IL-10 y auto-anticuerpos contra ADN de doble hebra (dsDNA) a menudo hacen espejo de la actividad de enfermedad en pacientes con SLE. Niveles elevados de IL-10 correlacionados con la actividad de la enfermedad en pacientes de SLE (Park et al., Clin. Exp. Rheumatol. 1998 May-Jun; 16 (3) : 283-8) . Sin embargo, IL-10 es una citocina con efectos pleiotrópicos en el sistema inmune y también se conoce que está involucrada en reducir respuestas pro inflamatorias.
Pruebas clínicas con anticuerpos monoclonales se han realizado en pacientes de SLE. En particular, varias pruebas se han involucrado en el anticuerpo Rituximab, un anticuerpo monoclonal anti-CD20 ratón quimérico empleado para el tratamiento de linfoma no-Hodgkin. Como se notó por Robak and Robak (2009) , los resultados de estas pruebas muestran alta actividad de este anticuerpo en pacientes SLE, y varios nuevos anticuerpos que hacen diana en CD20 se han desarrollado; Ofatumumab, IMMU-106 y GA-101. Además pruebas clínicas que reportan actividad de anticuerpos monoclonales en SLE se han completado con el anticuerpo anti-CD22, Epratuzumab, el anticuerpo anti-TNFa, Infliximab, el anticuerpo anti-IL-10, B-N10 (Llórente et al., Arthritis Rheum. 2000 Aug; 3 ( 8 ) : 1790-800 ) , los anticuerpos anti-CD40L, IDEC 131 y BG 9588, el inhibidor BLYS, Belimumab, el anticuerpo receptor de anti-IL6, Toclimumab, y el anticuerpo anti-C5 Eculizumab.
El objetivo de la presente invención es proporcionar adicionales agentes y en particular anticuerpos, que tienen utilidad en esta área.
De acuerdo con esto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento, capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10), en donde el anticuerpo o su fragmento: (i) liga a la misma región de IL-10 que el receptor IL-10 a (IL-lORa) y no es capaz de ligar IL-10 cuando IL-10 se liga al receptor IL-10; y (ii) liga a IL-10 en forma homodimérica al enlazar un epitopo discontinuo que comprende residuos de ambos monómeros.
Los presentes inventores han encontrado que los anticuerpos de la presente invención tienen un modo de enlace particularmente ventajoso, tal que son adecuados para tratar condiciones médicas mediadas por un nivel o actividad elevados de IL-10, y en particular enfermedades autoinmunes. Específicamente, los anticuerpos y sus fragmentos de la presente invención no son capaces de activar una respuesta ADCC o CDC, ya que no son capaces de ligar a IL-10 una vez que se ha ligado a IL-lORa. Esto es un modo particularmente ventajoso de ligar debido, a que como resultado, los anticuerpos de la presente invención no son capaces de ligar a células en las cuales IL-10 se enlaza a un receptor, y por lo tanto no pueden inducir una respuesta ADCC o CDC. De esta manera, el impacto del anticuerpo en otras partes del sistema inmune se controla.
Aún más, los anticuerpos y sus fragmentos de la presente invención son capaces de ligar al homodimero IL-10 con mucha mayor afinidad que el monómero IL-10. Como tal, el anticuerpo enlaza de preferencia con la forma funcionalmente activa de IL-10 en vez de al monómero o productos de degradación. Esto es particularmente ventajoso debido a que reduce la cantidad de anticuerpo IL-10 requerida para producir un efecto neutralizante y reduce el riesgo de efectos secundarios mediante enlace no-especifico a moléculas no-activas.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento, capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10), en donde el anticuerpo o su fragmento liga a la misma región de IL-10 que el receptor IL-10 a (IL-lORa) y no es capaz de ligar IL-10 cuando IL-10 se liga al receptor IL-10.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado quimérico o su fragmento, que es capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10) en forma homodimérica, en donde el anticuerpo o su fragmento liga a un epitopo discontinuo que comprende residuos de ambos monómeros.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento comprende secuencias de aminoácido al menos 80% idénticas a aquellas de CDR 1, CDR 2 y CDR3 de la cadena ligera variable del anticuerpo murino B-N10 y/o comprende secuencias de aminoácidos al menos 80% idénticas a las de CDR 1, CDR 2 y CDR3 de la cadena pesada variable del anticuerpo murino B-N10.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento, capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10), en donde el anticuerpo o su fragmento no inducen citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo y/o citotoxicidad dependiente de complemento.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10), en donde el anticuerpo o su fragmento es capaz de evitar señalización IL-10 a través del receptor IL-lOa.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo quimérico o humanizado o su fragmento, capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10) , en donde el anticuerpo o su fragmento no es capaz de ligar a células que expresan IL-10R.
La invención se ilustrará a manera de ejemplo solamente, con referencia a las siguientes Figuras, en donde: La Figura 1A muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo murino B-N10 (SEQ ID No: 2). Las regiones de determinación de cpmplementariedad hipervariable (CDRs) están subrayadas (en donde LCDR1 es SEQ ID No: 4; LCDR2 es SEQ ID No: 5; y LCDR3 es SEQ ID No: 6) .
La Figura IB muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo murino B-N10 (SEQ ID No: 3) . Las regiones de determinación de complementariedad hipervariable (CDRs) están subrayadas (en donde HCDR1 es SEQ ID No: 7; HCDR2 es SEQ ID No: 8; y HCDR3 es SEQ ID No:9).
La Figura 2A muestra la secuencia de nucleótidos que codifican la región variable de cadena ligera del anticuerpo murino B-N10 (SEQ ID No: 10) .
La Figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo murino B-N10 (SEQ ID No: 11) .
La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadenas ligeras y pesadas murinas B-N10 (SEQ ID Nos: 12 y 13, respectivamente) junto con las secuencias que se toman de A17 (SEQ ID No: 14), JK1 (SEQ ID No: 15), 3-66+04 (SEQ ID No: 16) y JH4 (SEQ ID No: 17) y las regiones variables hVLl a hVL12 (SEQ ID Nos: 18 a 29)' y las regiones variables hVHl a hVH29 (SEQ Id Nos: 30 a 58) generadas durante la humanización del anticuerpo murino B-N10.
La Figura 4 proporciona una comparación de las propiedades de enlace de antigeno de las variantes de anticuerpo humanizado, en comparación con un anticuerpo quimérico cB-N10 utilizando el antigeno hIL-10 ELISA.
La Figura 5 proporciona el resultado de la determinación de las propiedades de enlace de las tres variantes humanizadas, hVH20/hVL7, hVH20/hVL8 y hVH26/hVL7, en comparación con el anticuerpo quimérico B-N10 utilizando preparaciones de anticuerpo purificadas.
La Figura 6 muestra la tinción de linfocitos con BT061 y BT-063 etiquetados.
La Figura 7 muestra cromatografía de fusión de tamaño de BT-063 Fab (hilera superior) , monómero IL-10 y dímero (hilera media) y complejo de dímero IL-10 y BT-063 Fab (hilera inferior) .
La Figura 8 muestra la estructura total de fragmento Fab de BT-063 que enlaza a IL-10. IL-10 y el fragmento Fab se muestran como una representación de cintas .
La Figura 9 muestra el fragmento Fab de BT-063 dirige al mismo sitio de enlace en IL-10 que el receptor IL-10. IL-10, IL-10R1 y el fragmento Fab se ilustran como representación de cintas .
La Figura 10 muestra la dependencia de dosis calculada teórica de IL-10 ligado al incrementar dosis totales de BT-063 después de inyección intravenosa en voluntarios sanos.
La Figura 11 muestra la influencia teórica de diferentes concentraciones de IL-10 en la curva de dosis-respuesta ilustrada en la Figura 10. Curvas para 1000 concentraciones superiores e inferiores como se estima como normal (15 pg/ml) se ilustran. Solo diferencias menores entre las curvas pueden observarse.
La Figura 12 muestra la influencia teórica de diferentes afinidades de BT-063 a IL-10 en la curva de dosis-respuesta mostrada en la Figura 10. Las curvas para afinidades - 10 veces superiores, e inferiores, como se determina por BT-063 (3nM) se ilustran. La curva de dosis-respuesta substancialmente depende de la afinidad de BT-063 a IL-10.
La Figura 13 muestra una gráfica de cmax promedio de concentración de citocina en plasma contra dosis después de administración in vivo de BT-063 en voluntarios sanos.
La Figura 14 muestra una gráfica de concentración IL-10 promedio en plasma sobre el tiempo después de administración in vivo de BT-063 en voluntarios sanos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se indicó anteriormente, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento, capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10), y el uso de este anticuerpo o su fragmento en el tratamiento de condiciones médicas mediadas por un nivel o actividad elevados de IL-10.
IL-10 humano es un homodimero con una masa molecular de 37 kDa . Cada monómero consiste de 160 aminoácidos y tienen una masa molecular de 18.5 kDa. El dimero IL-10 interactúa con el receptor IL-10 alfa (IL-Ra o IL-10R1) y subsecuentemente recluta receptor IL-10 beta (IL-IOR O IL-10R2) en el complejo. El receptor se expresa en una variedad de células, en particular células inmune (Asadullah et al., Pharmacol. Rev. 2003 Jun; 55 (2) : 241-69) incluyendo la mayoría de las células hematopoyéticas tales como monocitos, macrófagos, y linfocitos T- y B-, pero también se expresa en células no-hemopoyéticas , tales como células epidérmicas o queratiocitos . queratinocitos . El enlace de receptor IL-10 alfa por IL-10 y el reclutamiento del receptor IL-10 beta lleva a transducción de señal mediante tirosina quinasa Jakl y Tyk2 y subsecuentemente a activación de factores de transcripción de la familia STAT. Diversas fuentes celulares de IL-10 se conocen, tales como células auxiliares T, células T reguladoras, monocitos, macrófagos, células B, eosinófilos, mastocitos, queratinocitos, células dendríticas e incluso células de cáncer. IL-10 funciona en el intervalo de células B desde prevención de apoptosis, mejora de proliferación, eventos de cambio de clase y diferenciación en células de plasma cells (Asadullah et al., Pharmacol. Rev. 2003 Jun; 55 (2 ) : 241-69 ) e inhibición de inflamación.
En el primer y segundo aspectos de la presente invención, y en modalidades preferidas de los otros aspectos de la invención, el anticuerpo o su fragmento liga a la misma región de IL-10 que el receptor IL-10 a (IL-10Ra) y no es capaz de ligar IL-10 cuando IL-10 se liga al receptor IL-10, es decir cuando IL-10 se liga al anticuerpo o fragmento no es capaz de ligar a IL-lORa.
Como se describió anteriormente, el dimero IL-10 funcionalmente activo, interactúa con IL-lORa y subsecuentemente recluta a IL-10RP en el complejo, que resulta en transducción de señal. Sin embargo, estos eventos de señalización sub-óptimos se espera que se lleven a cabo durante el enlace inicial de IL-10 con IL-lORa.
Anticuerpos capaces de neutralizar los efectos de IL-10 pueden operar mediante una cantidad de mecanismos. Pueden ligar a IL-10 y evitar el enlace de IL-10 con IL-10Ra mediante impedimento esférico. En particular, ya que el IL-10 funcionalmente activo es un homodímero, dos moléculas de anticuerpo pueden ligar al mismo dimero IL-10. En forma alterna, es posible que un anticuerpo neutralizante ligue a una región de IL-10 que no traslapa con el sitio de enlace IL-lORa y antagoniza el enlace IL-lORa por cambios conformacionales inducidos en IL-10 (Josephson et al. Structure (2002) 10; 981-987) En forma alterna, los anticuerpos pueden ligar a una región de IL-10 que evite interacción entre IL-10 y IL-10R . Además, también es posible que un anticuerpo ligue a un sitio de IL-10 que todavía esté expuesto después de ligar la citocina a la cadena receptora de alta afinidad e induce un cambio de conformación que estorba el reclutamiento de la segunda cadena receptora necesaria para señalización .
En contraste, los anticuerpos o sus fragmentos de la presente invención inhiben la interacción de IL-10 con IL-lORa al ligar a la misma región de IL-10 que IL-lORa. De acuerdo con esto, los anticuerpos de la presente invención evitan cualquier enlace entre IL-10 y IL-10Ra. Como tal, incluso los eventos de señalización sub-óptimos referidos previamente pueden ser evitados. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento, capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10), en donde el anticuerpo o su fragmento es capaz de evitar señalización IL-10 a través del receptor IL-lOa.
La frase "liga a la misma región" como se emplea aquí, se refiere a la capacidad del anticuerpo o su fragmento para competir con IL-lORa para enlace de IL-10. En efecto, el anticuerpo o su fragmento en la presente invención actúan como un inhibidor competitivo. Se conoce que IL-lORa liga a residuos entre 19 y 42 y entre 138 y 158 en el dimero IL-10. De acuerdo con esto, el anticuerpo, o fragmento de la presente invención también es capaz de ligar a cuando menos un residuo dentro de ambas de estas regiones para bloquear efectivamente el enlace a IL-lORa.
Además, la frase "cuando IL-10 se liga al receptor IL-10" se refiere a la situación en donde IL-10 se liga con ambos lados, es decir mediante ambos monómeros al receptor IL-10.
En una modalidad preferida, el anticuerpo o su fragmento no liga la misma región de IL-10 que el receptor IL-??ß (IL-10R ) .
Este aspecto y modalidades de la presente invención pueden definirse en forma alterna como el anticuerpo o su fragmento, capaces de evitar señalización IL-10 a través del receptor IL-??a, o que no son capaces de ligar a células que expresan IL-10R (es decir mediante el enlace IL-10 ) .
En el primer y tercer aspectos de la presente invención, y en modalidades preferidas de los otros aspectos de la invención, el anticuerpo o su fragmento liga a un epitopo discontinuo que comprende residuos de uno de los monómeros de homodimeros IL-10 y residuos del segundo monómero homodímero IL-10, es decir el anticuerpo o su fragmento liga a un epitopo discontinuo que comprende residuos del primer monómero y residuos del segundo monómero, en donde el primer monómero y el segundo monómero constituyen el homodímero.
El término "forma homodimérica" se refiere a IL-10 funcionalmente activo representado por un homodímero simétrico compuesto por dos dominios helicoidales alfa (dominio A y dominio B) orientados a 90 grados entre sí. La integridad estructural de cada dominio depende del entrelazamiento de hélices alfa de cada cadena péptido, de manera tal que las primeras cuatro hélices de una cadena se asocian- con las últimas dos hélices de la otra. Un solo monómero IL-10 no es capaz de ligar al receptor IL-10, ya que partes de ambas cadenas se requieren a fin de construir la interfase.
Los anticuerpos y sus fragmentos de la presente invención exhiben interacción concomitante con ambos monómeros del dímero IL-10 tipo silvestre. Como tales, ligan a un "epitopo discontinuo" es decir un epitopo en el que aminoácidos están en proximidad inmediata en la proteína plegada, pero distantes cuando está desplegada o desdoblada. En particular, el epitopo se representa por los aminoácidos presentes en ambas cadenas del dímero IL-10.
Como resultado de este modo de enlace, los anticuerpos y sus fragmentos ligan a IL-10 funcionalmente activo con mucha mayor afinidad que a los monómeros IL-10, en los que sólo una parte del epitopo discontinuo está presente.
En una modalidad preferida de la presente invención el anticuerpo o su fragmento liga a un epitopo discontinuo que comprende residuos de hélice A de un monómero IL-10 (es decir el primer monómero) y residuos de la hélice F' del otro monómero IL-10 (es decir el segundo monómero) .
En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, el anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento liga a un epitopo discontinuo que se proporciona por los primeros 55 aminoácidos de un monómero IL-10, más preferiblemente los aminoácidos 20 a 55, y los últimos 20 aminoácidos del segundo monómero y viceversa.
Formas mutantes artificiales de IL-10 que combinan las hélices A-D y las hélices E-F de un monómero en una forma reconocida por IL-10R1 o BT-063, se conocen de la literatura.
La IL-10 referida aquí es IL-10 humana, la secuencia de aminoácidos de la cual puede ser representada como : SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK DQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA ENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDI FINYI EAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 1) Puede determinarse si los anticuerpos anti-IL10 tienen la actividad deseada por técnicas de barrido de péptidos conocidas o por cromatografía de exclusión de tamaño .
Técnicas de criba de péptido pueden consistir de criba de enlazadores posibles a IL-10, todos o un fragmento de los cuales pueden ser inmovilizados sobre una membrana o en una superficie adecuada. En particular, la IL-10 o el fragmento IL-10 puede sintetizarse en forma sintética o la secuencia de nucleótidos de codificación puede ser sobre-expresada en un hospedero adecuado tal como por ejemplo E. coli o células de insecto. En particular, las regiones de IL-10 aquí identificadas que forman el epítopo para el anticuerpo de la presente invención pueden ser utilizadas.
Anticuerpos anti-IL-10 pueden ser identificados utilizando por ejemplo tecnología de expresión ribosomal o fago (o expresión ARNm, expresión polisomal, expresión de levadura) . Con estas tecnologías se pueden identificar también enlazadores que reconocen epítopos discontinuos. Ya sea la proteína o el ligando (es decir el anticuerpo que será elegido) puede ser inmovilizado e incubado con el socio de enlace potencial. Proteínas no ligadas se retiran y los ligandos enlazados se eluyen. Varias rondas de selección se llevarán a cabo para identificar enlazadores de alta afinidad.
Dentro de la presente solicitud, la expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos en donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con secuencias en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto del anticuerpo es idéntico con secuencias de anticuerpos derivadas' de una especie diferente, clase o subclase de anticuerpo. En particular se prefiere que las CDRs de un anticuerpo quimérico tengan un origen, mientras que el resto del anticuerpo tenga un origen diferente. En particular, en la presente invención, el anticuerpo quimérico puede ser un anticuerpo humanizado, en donde los dominios variables/secuencias de enlace de antigeno de un anticuerpo no humano se han injertado en regiones marco de anticuerpo humano .
Dentro de la presente solicitud, el término "fragmento" se refiere a un fragmento o derivado de un anticuerpo que todavía retiene la actividad biológica deseada. El fragmento en general comprenderá la región de enlace de antígeno del anticuerpo y en particular los fragmentos Fab, Fab', F(ab) '2, Fv y scFv, así como derivados de anticuerpo multivalentes , en particular diacuerpos o diacuerpos en tándem. El fragmento de preferencia es de al menos 25, más preferiblemente 50 y todavía más preferiblemente 200 a 500 aminoácidos. En forma alterna, los fragmentos pueden ser definidos como aquellos que tienen tamaño entre 30 kDa y 150 kDa. Además, los fragmentos de anticuerpo pueden involucrar dos o más cadenas péptido/polipéptido. Por ejemplo un fragmento Fab que comprende dos cadenas de entre 200 y 300 aminoácidos de longitud, cada uno o TandAbs® (formatos de anticuerpo biespecífieos tetravalentes) que comprenden dos cadenas de entre 400 y 500 aminoácidos de longitud cada una.
En los cuartos aspectos de la presente invención, y en modalidades preferidas de los otros aspectos de la invención, el anticuerpo o su fragmento se deriva del anticuerpo murino B-N10 o de BT-063 (variante hVH26/hVL7) . En particular, tal anticuerpo o fragmento comprenderá CDRs que son al menos 80% idénticas a las de CDR 1, CDR 2 y CDR3 de la cadena ligera variable B-N10 o BT-063 y/o comprenden secuencias de aminoácidos al menos 80% idénticas a aquellos de CDR 1, CDR 2 y CDR3 de la cadena pesada variable B-N10 o BT-063. La secuencia de aminoácidos de las CDRs murinas se muestra en la Figura 1. La secuencia variable de la variante BT-063 se muestra en el Ejemplo 6. Más preferiblemente, las secuencias serán al menos 90%, o al menos 95% idénticas a aquellas de CDRs del anticuerpo B-N10 o BT-063.
En forma alterna, el anticuerpo o fragmento mientras que aún se deriva del anticuerpo B-N10 o BT-063, puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDR 1, CDR 2 y CDR3 de la cadena ligera variable B-N10/BT-063 y/o la secuencia de aminoácidos de CDR 1, CDR 2 y CDR3 de la cadena pesada variable B-N10/BT-063, opcionalmente con variación en estas secuencias que sustancialmente no alteran la afinidad y/o especificidad del anticuerpo o su fragmento. En particular, las variaciones en la secuencia no reducen la afinidad o especificidad del anticuerpo o fragmento para IL-10 en comparación con un anticuerpo o fragmento que comprende las CDRs del anticuerpo murino B-N10 o el anticuerpo BT-063 (variante hVH26/hVL7 ) .
En una modalidad especifica, el anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento comprende las secuencias de aminoácido de CDR 1, CDR 2 y CDR3 de la cadenas ligeras del anticuerpo murino B-N10, o las cadenas pesadas y/o ligeras variantes de BT-063. Más preferiblemente, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento que comprende secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, más preferible al menos 90%, más preferible al menos 100% de identidad de secuencia con los dominios variables del anticuerpo murino B-N10, como se muestra en la Figura 1, o con los dominios variables del anticuerpo BT-063 como se muestra en el Ejemplo 6.
Aún más, como resultado de los estudios de cristalografía de rayos X realizados por los presentes inventores, el anticuerpo o su fragmento de la presente invención también pueden definirse como un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento capaz de ligar a IL-10, en donde el anticuerpo o su fragmento comprende una región variable que comprende CDRl y CDR2 de cadena ligera BT-063 y/o una región variable que comprende CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada BT-063 opcionalmente con sustituciones de aminoácido en la secuencias de CDRs que se proporcionan: (i) la cadena ligera CDRl comprende: Ser32, Asn33, Asn35, Tyr37 (ii) la cadena ligera CDR2 comprende: Lys55 (iii) la cadena pesada CDRl comprende: Phe27, Ser28, Ala30, Thr31, Tyr32 (iv) la cadena pesada CDR2 comprende: Trp52, Arg53, Gly54, Ser56 (v) la cadena pesada CDR3 comprende: TyrlOO, GlylOl, Tyrl03.
Más preferiblemente, la región variable de cadena pesada además comprende Asn73 y Ser74. En particular se prefiere que con las substituciones dentro de las CDRs, su secuencia es al menos 80%, más preferible al menos 90% idéntica a la de las CDRs en BT-063.
El uso de un tipo y número de residuos se ha realizado con el propósito de identificar claramente el residuo aminoácido de la BT-063 CDR que es referida. Sin embargo, se apreciará que el número de residuos no se pretende que limite el residuo a estar en esa posición en el anticuerpo candidato o fragmento que se criba en el método. Por ejemplo, en un anticuerpo de esta modalidad Ser32 puede estar en la posición 31 con una cadena ligera CDR1 si un residuo aminoácido no esencial se ha eliminado de las secciones 1 a 30 de la cadena ligera.
Las secuencias de las cadenas pesadas y ligeras BT-063 y las posiciones de CDRs se muestran en el Ejemplo 6 a continuación.
En un quinto aspecto de la presente invención, y en modalidades preferidas de los aspectos restantes de la invención, el anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10) no induce citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC = Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC = Complement-Dependent Cytotoxicity) .
Como se indicó anteriormente, el anticuerpo o fragmento no es capaz de ligar a IL-10 cuando IL-10 se enlaza al receptor aIL-10. De acuerdo con esto, el anticuerpo o su fragmento sólo pueden ligar a IL-10 soluble y no es capaz de ligar a células que expresan IL-10R (por IL-10) . Como resultado, el anticuerpo o fragmento de la presente invención no es capaz de inducir ADCC o CDC, al menos parcialmente debido a su propiedad de ligar sólo a IL-10 soluble y no a células ligadas a IL-10.
Para probar si un anticuerpo induce CDC, células que transportan el antigeno de interés pueden incubarse con dosis crecientes del anticuerpo en la presencia de complemento (o suero que contiene complemento activo tal como Clq) . El grado de exterminio celular puede medirse como parámetro que describe la cantidad de CDC inducido.
Para pruebas si un anticuerpo induce ADCC, células que transportan el antigeno de interés (células diana) pueden ser incubadas con dosis crecientes del anticuerpo en la presencia de células que inducen ADCC (por ejemplo células destructoras naturales, células efectoras) . El grado de exterminio celular en las células diana puede medirse como parámetro que describe la cantidad de ADCC inducido .
Además, en un aspecto adicional de la presente invención y en modalidades preferidas de los aspectos restantes de la invención, el anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento es capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10) tal que cuando se administra a un paciente al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente cuando menos 75% de IL-10 en el plasma del paciente se compleja con el anticuerpo o su fragmento. En este contexto, la expresión "complejado con el anticuerpo o su fragmento" se refiere a la ocupación IL-10 por el anticuerpo o su fragmento después de que se ha administrado al paciente. La capacidad de ocupación IL-10 de un anticuerpo o fragmento puede estimarse in vitro con base en un volumen de sangre de 3.5 1, y con el conocimiento de la constante de disociación entre el anticuerpo o fragmento y IL-10 y además utilizando las consideraciones y métodos que se disponen en el Ejemplo 8, a continuación .
En general, el anticuerpo de la invención además comprende una región constante humana (Fe) . Esta puede seleccionarse entre dominios constantes de cualquier clase de inmunoglobulinas , incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA y IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgGl, IgG2, IgG3 y IgG . Regiones constantes preferidas se eligen entre los dominios constantes de IgG, en particular IgGl.
Otros productos La presente invención además proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo o fragmentos de anticuerpo descritos anteriormente. Las secuencias de ácido nucleico pueden ser ADN o ARN pero de preferencia ADN. Las secuencias pueden emplearse dentro de casetes o vectores de expresión, y son de uso particular para producir los anticuerpos y sus fragmentos aquí descritos.
La invención además proporciona células hospederas transformadas con estos polinucleótidos, casetes de expresión o vectores. Células hospederas convenientes pueden ser tanto procarióticas como eucarióticas .
En forma alterna, la célula hospedera puede ser un hibridoma que se obtiene por fusión de una célula que produce un anticuerpo de la presente invención con una célula de mieloma.
Las células hospederas descritas anteriormente pueden utilizarse en un método para la producción de un anticuerpo o su fragmento. En particular, este método puede comprender un método de cultivar la célula hospedera en un medio de cultivo conveniente, bajo condiciones que permiten la expresión del anticuerpo o su fragmento y separar el anticuerpo o fragmento del medio de cultivo. Métodos de este tipo son bien conocidos y descritos en la técnica.
La presente invención también proporciona un péptido aislado que comprende menos de 50 aminoácidos que comprende uno o ambos aminoácidos 27 a 53 y los aminoácidos 142 a 155 de IL-10 humana. Estos péptidos son de uso particular en los métodos de criba descritos a continuación .
Usos Médicos Los anticuerpos y sus fragmentos aquí descritos tienen utilidad en el tratamiento de enfermedades o condiciones médicas que son mediadas por un nivel o actividad elevados de IL-10. Como resultado, se proporciona un método para tratar o evitar una condición médica en un sujeto, en donde la condición médica está mediada por un nivel o actividad elevados de IL-10, que comprende administrar una cantidad terapéutica efectiva del anticuerpo o su fragmento aquí descritos.
En particular, la condición médica que es mediada por un nivel o actividad elevado de IL-10 es SLE. De acuerdo con esto, la presente invención también proporciona un anticuerpo o su fragmento como se describe aquí para uso en medicina y en particular en el tratamiento de SLE.
Ejemplos adicionales son púrpura trombocitopénica, lupus nefritis, VIH (HIV) , hCMV y hepatitis C. El tratamiento de células de tumor que dependen de IL-10 por soporte directo de proliferación o supresión de respuesta inmune es otro ejemplo.
Una modalidad adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o su fragmento descrito anteriormente con un portador o diluyente farmacéutico aceptable. En una modalidad, la composición comprende liposomas a los cuales el anticuerpo o su fragmento se acopla.
Estas composiciones pueden administrarse al paciente en forma parenteral, intravenosa o subcutánea. De preferencia en el tratamiento de SLE, el anticuerpo o su fragmento se administran en forma intravenosa o subcutánea.
Además, los anticuerpos y sus fragmentos aquí descritos tienen utilidad para diagnóstico de condiciones médicas que están mediadas por un nivel o actividad elevados de IL-10. En particular, los anticuerpos y sus fragmentos pueden utilizarse en ensayos in vitro para determinar la presencia de un nivel anormal de IL-10 en muestras que se toman de individuos.. Estos métodos de diagnóstico pueden comprender: (a) obtener o proporcionar una muestra que se toma de un individuo; (b) poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-IL-10 o su fragmento como se describe aquí; y (c) detectar la presencia de IL-10 (por ejemplo al detectar la presencia del anticuerpo o su fragmento) . En particular, la etapa (c) puede involucrar el determinar la cantidad de IL-10 presente en la muestra. Además, el método puede comprender la etapa (d) de comparar la cantidad de IL-10 presente con uno o más valores predeterminados, a fin de hacer una evaluación respecto al paciente y la condición médica. Los valores predeterminados pueden representar un valor estándar de la cantidad de IL-10 presente en una muestra equivalente que se toma de un individuo sano.
De preferencia la muestra es una muestra de plasma que se obtiene al tomar sangre del individuo. En particular, el método de diagnóstico puede emplearse cuando la condición médica es SLE.
Usos No Médicos Aún más, se proporciona un anticuerpo quimérico o humanizado etiquetado o su fragmento que comprende el anticuerpo o su fragmento aquí descrito y una etiqueta. La etiqueta puede ser de cualquier tipo conveniente conocida en la técnica para detectar la presencia de un anticuerpo en Una muestra. En particular, la etiqueta puede ser una etiqueta fluorescente.
El anticuerpo o su fragmento de la presente invención, y en particular el anticuerpo etiquetado, tienen utilidad especifica en un método in vitro para detectar la presencia de IL-10 en una muestra. El método puede comprender una etapa de poner en contacto el anticuerpo no etiquetado o etiquetado o su fragmento con la muestra, lavar la muestra para retirar anticuerpo o fragmentos de anticuerpo que no se ligan a la muestra (anticuerpo o fragmento de anticuerpo no ligados) y detectar la presencia del anticuerpo, por ejemplo mediante la etiqueta, en la muestra .
En forma alterna, el anticuerpo no etiquetado o su fragmento pueden emplearse para un método in vitro para neutralizar IL-10 en una muestra. Este método comprende las etapas de poner en contacto una muestra con el anticuerpo o su fragmento para ligar el anticuerpo o su fragmento a IL-10.
Además, la presente invención también proporciona un método para cribar una o más moléculas capaces de ligar a la misma región de IL-10 que el receptor IL-??a (IL-lORa) que comprende: (a) poner en contacto una o más moléculas con un péptido que comprende uno o más de las siguientes regiones de IL10 humano: aminoácidos 27 a 53 y aminoácidos 142 a 155; y (b) detectar si la una o más moléculas ligan a la una o más regiones del péptido.
En particular la una o más moléculas de preferencia son péptidos, y más preferiblemente anticuerpos o fragmentos de anticuerpo. La criba puede completarse por métodos que se conocen en esta especialidad, tales como a través de la generación y criba de una biblioteca de expresión en fago.
Aún más, la presente invención proporciona un método para cribar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de ligar a la misma región de IL-10 que el receptor IL-??a (IL-10Ra) que comprende: poner en contacto uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con IL-10; estimar la capacidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para inhibir la interacción entre IL-10 como el receptor IL-??a (IL-10Ra) ; identificar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es capaz de ligar a la misma región de IL-10 como el receptor IL-??a (IL-10Ra), en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región variable que comprende CDR1 y CDR2 de cadena ligera BT-063 y/o una región variable que comprende CDR1, CDR2 y , CDR3 de cadena pesada BT-063, opcionalmente con substituciones de aminoácido en las secuencias de CDRs que se proporcionan: (i) la cadena ligera CDR1 comprende: Ser32, Asn33, Asn35, Tyr37 (ii) la cadena ligera CDR2 comprende: Lys55 (iii) la cadena pesada CDR1 comprende: Phe27, Ser28, Ala30, Thr31, Tyr32 (iv) la cadena pesada CDR2 comprende: Trp52, Arg53, Gly54, Ser56 (v) la cadena pesada CDR3 comprende: TyrlOO, GlylOl, Tyrl03.
En este aspecto el trabajo de los presentes inventores ha proporcionado detalles en los que las moléculas probablemente tendrán la capacidad de ligar a IL-10 y de acuerdo con esto un método de criba con moléculas candidato particulares, es posible. Las moléculas candidato pueden generarse a través de la mutagénesis dirigida de la secuencia nucleótido que codifican las regiones variables del anticuerpo BT-063.
La invención ahora se describirá además en relación a las siguientes modalidades especificas.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 - Caracterización de Anticuerpo Murino Anti-ILIO B-N10 1.1. Aislamiento de- ADN que codifica los dominios de anticuerpos variables de B-N10 Para identificación de las secuencias variables de células murinas BN-10 se emplearon gránulos o precipitados. Las muestras (3 x B-N10, Pasaje 3, 1 x 107 células) se almacenaron a -80°C hasta que mARN se aisló de las células y después de síntesis de cADN, las secuencias variables de B-N10 se amplificaron por PCR y después clonaron .
En total 14 clones se secuenciaron (SEQ Laboratories, Góttingen) y analizaron tanto para la cadena ligera variable como la cadena pesada variable. Las secuencias variables de B-N10 se determinaron en forma inequívoca. Ocurrieron desviaciones solo en las regiones cebadoras N-terminal (ver Tabla 1). En el caso de la cadena pesada variable, la variante de secuencia QVQLKQ (SEQ ID No: 59) ocurrió nueve veces en la región cebadora, pero otras variaciones ocurrieron solo una o dos veces. Esta variante se elige para sub-clonación . En el caso de la cadena ligera variable, estuvieron presentes dos variantes en proporciones iguales. Después de comparar las secuencias con las secuencias de linea germinal murina, la secuencia crl con solo 3 mutaciones, exhibió gran homología con la secuencia VL identificada. Esto significa que la secuencia DVLMTQ (SEQ ID No: 60) más probablemente es la secuencia correcta. ..La secuencia DIVMTQ (SEQ ID No: 61) es típica de otra clase de secuencia de línea germinal y por lo tanto se excluyó .
Tabla 1: Ocurrencia de las variantes de secuencia N-terminal de la cadena ligera y pesada variable secuenciada de B-N10. Las secuencias selectas se indican en tipo negritas.
Las secuencias de proteina de la cadena ligera variable VL y la cadena pesada variable VH se ilustran en las Figuras 1A y IB, respectivamente. Las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) hipervariables están subrayadas. Las secuencias de ADN correspondientes se muestran en las Figuras 2A y 2B, respectivamente.
EJEMPLO 2 - Generación de un Anticuerpo Quimérico B-N10 Las secuencias variables identificadas de la cadena de anticuerpo pesada y ligera del Ejemplo 1 se clonaron en un sistema de vector para la expresión de anticuerpos recombinantes . La primera etapa fue clonar las secuencias en un lider BS; la terminal N agrega una señal de secreción y la terminal C agrega una secuencia de donador de combinación. La segunda etapa fue clonar estas secuencias en los vectores de expresión que contienen la cadena kappa humana constante y la cadena gamma-1 humana constante respectivamente. El vector para la cadena ligera y el vector para la cadena pesada se prepararon y después co-transfectaron en forma transitoria en células COS-7 por precipitación con fosfato de calcio o por lipofección. El sobrenadante de cultivo celular se recolectó después de 2 días. Después de expresión de B-N10 quimérico en células COS-7 y detección de un titulo de anticuerpo en el sobrenadante (ELISA emparedado) , su capacidad de enlace especifico a interleucina humana 10 (R&D Systems, Cat . No. 217-IL/CF, Lote ET114021, almacenado a -20°C) se probó en el ELISA.
Para el ELISA emparedado, un anticuerpo de cadena kappa anti-humana ratón (Becton Dickinson) se liga a la superficie de placa como un anticuerpo atrapador, después se incuba con sobrenadante de cultivo celular y la presencia del anticuerpo quimérico se detecta con un anticuerpo IgG (H+L) anti-humano conejo conjugado POD (Dianova). Un anticuerpo de control quimérico en concentraciones definidas (0.125 a 12 /g/mL) se emplea como un control positivo.
Para ELISA de antigeno, IL-10 humana se liga a la superficie de placa en una concentración de 0.5 y 5 µ g por mL. Después de incubación con el sobrenadante de cultivo celular (sin diluir y diluido 1:5), el enlace de B-N10 quimérico se detecta con el anticuerpo IgG (H+L) anti-humano de conejo conjugado POD (Dianova) . El B-N10 murino se emplea como un control positivo. El anticuerpo se empleó en una concentración de 0.5 y 5 µ g por mL y el enlace se detectó con un anticuerpo IgG/IgM de anti-ratón conejo conjugado POD (Dako) .
Los resultados de ELISA se discuten en el Ejemplo 3.
EJEMPLO 3 - Humanización de Anticuerpos Anti-ILIO Esfuerzos iniciales para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos roedores en humanos involucran la generación de anticuerpos quiméricos al reemplazar dominios de anticuerpo constante roedor por humano. Como las regiones marco de roedor dentro de los dominios variables todavía pueden inducir una respuesta inmune del método más avanzado de injerto CDR se desarrolló, lo que significa la transferencia de las secuencias de enlace de antígeno (regiones de determinación de complementariedad, CDR) en marcos de anticuerpo humano completos (humanización) . Usualmente, marcos aceptores humanos se eligen que semejan más cercanamente el anticuerpo donador murino para incrementar la probabilidad de restaurar la especificidad de antígeno original y afinidad durante el proceso de humanización. Diferentes enfoques utilizando secuencias de línea germinal de anticuerpo humano, secuencias consenso de anticuerpos expresados, análisis de estructuras bucle CDR y estructuras de rayos X de complejos de anticuerpo/antigeno pueden emplearse o combinarse para mejorar el proceso. Usualmente diversas variantes de anticuerpo humanizadas se generan de esta manera y analizan posteriormente respecto a sus efectos biológicos que pueden diferir entre si y el anticuerpo original. Finalmente de acuerdo con la función deseada del anticuerpo, puede seleccionarse la región constante humana conveniente. 3.1 Comparaciones de secuencia entre las secuencias variables murinas de B-N10 y secuencias humanas, y diseño de un conj unto de secuencias humanizadas VL (hVL) y VH (hVH) El anticuerpo murino anti-IL10 B-N10 se seleccionó (Llórente et al., Eur. Cytokine Net . 1993 Nov-Dec; 4(6): 421-7; y Llórente et al., Arthritis Rheum. 2000 Aug; 43 (8) : 1790-80) . El método para obtener anticuerpos humanizados se basa en el procedimiento de injertos CDR en donde las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) se fusionan con regiones aceptoras humanas-.
La selección de marcos aceptores humanos se basa en un análisis combinado de tres juegos de datos: 1. La homología de las secuencias murinas a secuencias de línea germinal humana para reducir al mínimo el riesgo de mutaciones somáticas: 2. La comparación de las secuencias murinas con secuencias consenso humano para identificar residuos aminoácidos inusuales y 3. La identificación de las clases de estructuras canónicas de las secuencias CDR para obtener información respecto a residuos aminoácido marco, estructurales, importantes.
La cadena ligera variable murina de B-N10 muestra la más alta homología al segmento variable en línea germinal humana 2-30*01 (A17 (SEQ ID No: 14)) y al segmento de unión JK1 (SEQ ID No: 15) . La secuencia consenso humana con la más alta homología a B-N10 es HuKII. Regiones de determinación de complementariedad (CDRs) de la cadena ligera variable pueden ser clasificadas en caso de Ll a clase 4, y en casos de ~L2- y L3 a clase 1. Residuos aminoácidos críticos se identificaron.
Comparación de secuencia entre CDR de ratón y genes VL de línea germinal humana con la estructura canónica de clase 4-1-1, reveló la más alta homología con 2-30*01 (el número más bajo de aminoácidos con apareamiento incorrecto) .
La cadena pesada variable murina de B-N10 muestra la más alta homología al segmento variable en línea germinal humana VH3-33 y al segmento de unión JH4 (SEQ ID No: 17) . La secuencia consenso humana con la más alta homología a B-N10 es HuHIII. Regiones de determinación de complementariedad (CDRs) de la cadena pesada variable pueden ser clasificadas en caso de Hl y H2 a clase 1. Se identificaron residuos aminoácidos críticos. Comparación de secuencia entre CDR de ratón y genes VH de línea germinal humana con la estructura canónica de clase 1-1 reveló la más alta homología con 3-66*04 (SEQ ID No: 16) (el número más bajo de aminoácidos de apareamiento incorrecto) . Por lo tanto, la secuencia de línea germinal VH3-66 se tomó también en consideración, Todos los datos obtenidos se consideraron para diseñar un conjunto de secuencias variables diferentes de cadenas ligeras variables (12 variantes) y pesadas variables (29 variantes) humanizadas. 3.2 Construcción de una pequeña, biblioteca y selección de fragmentos de anticuerpo de enlace hIL-10 humanizados A fin de generar una biblioteca de fragmentos de anticuerpo de enlace hIL-10 potencialmente para lograr el anticuerpo de enlace IL-10 humano óptimo, las secuencias cDNA que codifican los fragmentos 12 hVL y 29 hVH, como se muestra en la Figura 3, se generaron bajo consideración del uso de codón de células eucarióticas .
Los cDNAs obtenidos se clonaron subsecuentemente en vectores de clonación y secuenciaron en SEQ Laboratories (Góttingen, Alemania) . La biblioteca se construyó en una forma, tal que cada uno de los 12 cDNAs que codifican los fragmentos hVL se combinaron con los 29 cDNAs que codifican los fragmentos hVH, resultando en 348 fragmentos anticuerpo potencialmente expresados.
Siguiendo la expresión bacteriana y dos rondas de selección en IL-10 humano (R&D Systems, Cat.-N° 217-IL/CF) los fragmentos de anticuerpo se analizaron por ELISA para ligar a hIL-10 (igual que para selección) . En breve, placas Maxisorb (Nunc, Alemania) se revistieron con 1 g/ml de hIL-10 en PBS durante la noche a 4°C. Después de bloquear y lavar las placas, los sobrenadantes de las bacterias que producen fragmento de anticuerpo, se agregaron. Para detección de fragmentos de anticuerpo humanizados ligados, se empleó un anticuerpo secundario conjugado a POD. ' .
Las secuencias de codificación de buenos aglutinantes se analizaron y la ocurrencia de fragmentos hVL- y hVH- identificados (Tabla 2).
Tabla 2: Ocurrencia de fragmentos VL y VH presentes en fragmentos de anticuerpo que enlazan a hIL-10.
Secuencias marcadas con negritas se seleccionaron para subclonar en los vectores de expresión eucariótica apropiados para analizar las propiedades de enlace en el contexto de todo el anticuerpo. Las secuencias mostradas en (cuadrados) se seleccionaron para subclonar en los vectores de expresión pero el procedimiento solo resultó en construcciones defectuosas. 3.3 Generación de vectores de expresión para las variantes de cadena ligera y pesada humanizadas selectas de BT-063 Con base en las estadísticas determinadas por el enfoque de criba, un conjunto de variantes VL humanizadas y VH humanizadas de BT-063 se seleccionó para clonar en un sistema de vector. En una primera etapa, los cDNAs que codifican los variantes VL y VH humanizadas se transfirieron en un vector apropiado para fusionar una codificación de secuencia para una señal secretoria 5' y una secuencia de donador de combinación 3' al cDNA clonado. Estas construcciones cDNA en una sequnda y final etapa de sub-clonación, se transfirieron en los vectores de expresión que codifican la cadena kappa constante humana y gamma-1 constante humana, respectivamente. Plásmidos de vectores de expresión que contienen hVL y hVH independientemente obtenidos, se prepararon por el equipo Qiagen Midi-prep libre de endotoxina (Qiagen, Alemania) . 3.4 Expresión transitoria de las variantes BT-063 humanizadas selectas en células COS-7 y comparación de enlace de anticuerpo hacia hIL-10 Para la expresión transitoria de las variantes de anticuerpo humanizadas en células COS-7 cada una de las variantes VL humanizadas (hVL7 y hVL8) se combinaron con cada una de las variantes VH humanizadas selectas (hVHl, hVH9, hVH13, hVHl8, hVH20, hVH26, hVH28) resultando en 14 diferentes anticuerpos humanizados.
En breve, los vectores de expresión que codifican la cadena ligera y la cadena pesada, se cotransfectaron en forma transitoria en células COS-7 por precipitación con fosfato de calcio en DMEM que contiene FCS al 10% en un formato de 24-pozos. Después de transfeccion el medio se reemplazó por medio libre de suero CHO-S-SFM II (Invitrogen, Alemania) y los sobrenadantes de las células COS-7 se recolectaron 2-3 días después de transfeccion. El titulo de anticuerpo de los anticuerpos humanizados secretados en los sobrenadantes de células COS-7 transfectadas se analizó por un ELISA emparedado. Con base en las concentraciones de anticuerpo determinadas, sobrenadantes de todas las muestras se ajustaron a las mismas concentraciones de anticuerpo, y todas las muestras se emplearon para analizar enlace a IL-10 humano en un ELISA de antigeno, con lo que placas axisorb (Nunc, Alemania) se revistieron con 2 ug/ml de hIL-10 en PBS.
Como se muestra en la Figura 4, todas las variantes analizadas ligan a hIL-10, sin embargo con diferentes propiedades de enlace. De manera significativa, las señales más altas en el ELISA de antigeno, se obtuvieron con las variantes BT-063 hVH20/hVL7, hVH26/hVL7 y hVH20/hVL8 que muestran intensidades de señal comparables con las obtenidas con el anticuerpo quimérico B-N10. Dentro de estos tres anticuerpos, variaciones en intensidad de señal (señal más alta para hVH20/hVL8 y señales más bajas para hVH20/hVL7 y hVH26/hVL7) pudieron ser provocadas por concentraciones de anticuerpo divergente como resultado del ELISA emparedado cuantificante (ver anteriormente) . Todas las otras variantes investigadas resultaron en señales más bien débiles en comparación con el anticuerpo B-N10 quimérico. 3.5. Producción y purificación de afinidad de las variantes de anticuerpo quiméricas y humanizadas Las variantes BT-063 humanizadas selectas (hVH20/hVL7, hVH20/hVL8, hVH26/hVL7) y cB-N10 quimérico (discutido en el Ejemplo 2) se produjeron en células COS-7.
Expresión transitoria se realizó como se describe en la sección 3.4 con lo que 10 cm de placas de tejido se emplearon. Sobrenadantes libres de suero de aproximadamente 0.5 L de cada variante se recolectaron 5 días posteriores a transfección.
Purificación de los anticuerpos se realizó por cromatografía de afinidad de proteína A a partir de sobrenadante libres de suero. Los sobrenadantes se cargaron en la presencia de NaCl 2 . Anticuerpos se eluyeron por un amortiguador citrato 0.1 pH 4.0 y fraccionaron en tubos que contienen amortiguador fosfato 2M pH 7.2. Intercambio de amortiguador contra PBS asi como concentración de sondas de anticuerpo individuales se realizó por centrifugación utilizando membranas de un corte de 30 kDa . La calidad de materiales purificados se verificó por ELISA de antigeno, SDS-PAGE bajo condiciones sin reducción asi como con reducción y medición de UV a 260 nm y 280 nm.
El enlace hacia hIL-10 del B-N10 quimérico purificado y las variantes humanizadas se probaron por ELISA de acuerdo ¦ con- el método como se describe anteriormente en el Ejemplo 2. hILlO se revistió y el enlace de anticuerpo se midió para las variantes cB-N10, BT-063-1 (hVH20/hVL7) , BT-063-2 (hVH20/hVL8) y BT-063-3 (hVH26/hVL7) . Los resultados se muestran en la Figura 5.
Las intensidades de señal fueron comparables para el B-N10 quimérico y las variantes hVH20/hVL7, mientras que las intensidades de señal de las variantes hVH20/hVL8 y hVH26/hVL7 fueron ligeramente menores. 3.6 Determinación de afinidad por IL-10 Humana Biacore Análisis de resonancia plasmón de superficie se emplea para medir las constantes de velocidad de asociación y disociación para enlace de los diferentes anticuerpos (murino, quimérico, 3 variantes humanizadas) hacia hIL-10 utilizando BIACORE 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) . hIL-10 se inmovilizó en un chip sensor CM-5 de acuerdo con las condiciones del fabricante. hIL-10 se inmovilizó al agregar una alícuota de 50 µ? de 20 g/ml a un gasto de flujo de 5 µ?/minuto, resultando en una densidad de inmovilización de 320RU. La superficie hIL-10 inmovilizada se regeneró en un ciclo de dos etapas al utilizar amortiguador carbonato 0.1 M pH 9.2 y HC1 0.01 M/NaCl 1M a gastos de flujo de 50 µ?/minuto por un minuto cada uno. Cada muestra de anticuerpo se analizó al menos 4 veces en intervalos de concentración de anticuerpo de 20-0.15 µg/ml. Cálculos de los sensogramas se realizaron al utilizar el soporte lógico de evaluación BIA versión 3 (1999).
La Tabla 3 resume los resultados de todas las mediciones Biacore. Todas las variantes ligan en forma comparable a hIL-10. Sin embargo, ligeras diferencias son detectables. Como resultado, el anticuerpo monoclonal de ratón B-N10, el cB-N10 quimérico así como la variante humanizada BT-063-1 (hVH20/hVL7) ligan con afinidades comparables mientras que las otras dos variantes humanizadas BT-063-2 (hVH20/hVL8) y BT-063-3 (hVH26/hVL7) muestran afinidad reducidas (aproximadamente un factor 3 en comparación con B-N10 murino) . Ligeras diferencias en velocidades de asociación y disociación también son detectables .
Tabla 3: Resultados de mediciones Biacore n = número de mediciones individuales; ka = velocidad de asociación; kd = velocidad de disociación; KD = constante de disociación Macaco cangrejero IL-10 La afinidad de la variante BT-63 3 (hVH26/hVL7) a Macaco cangrejero (Cynomolgus) IL-10 se analizó por adicionales experimentos de resonancia plasmón de superficie utilizando Biacore T100 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) .
BT-063 se diluyó en acetato 10 mM de pH 5.5 a 5 µg/mL e inmovilizó utilizando procedimiento de acoplamiento amina para obtener un nivel final de aproximadamente 1000 RU. La regeneración de la superficie del chip sensor se obtuvo inyectando Glicina-HCl 10 mM pH 1.8 por 30 s. Se inyectaron muestras en diferentes concentraciones sobre la celda de flujo asi como sobre la celda de referencia. Señales que se obtienen por la celda de referencia se sustraen de las señales que se obtienen por la celda de flujo de detector y los perfiles de enlace resultantes se evaluaron utilizando un modelo de enlace Langmuir 1:1. Un perfil de enlace dependiente de concentración se obtiene de uña KD promedio de 194 pM se calcula para Cynomolgus IL-10. Como un control positivo rhIL-10 se analizó resultando en una KD de 4.6 nM. Los resultados se resumen en la Tabla 4.
Tabla 4: Resultados de mediciones Biacore con BT-063 rhIL-10: IL-10 humana recombinante ; rCIL-10: Cynomolgus IL-10 recombinante; ka = velocidad de asociación; kd = velocidad de disociación; KD = constante de disociación EJEMPLO 4 - Actividad de Anticuerpos Anti-ILIO In Vitro Para confirmar la potencia de BT-063 (variante hVH26/hVL7) el bloqueo de liberación de IL-6 en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs = Peripheral Blood ononuclear Cells) se examinó. PBMCs liberan Interleucina-6 (IL-6) ante estimulo con Lipopolisacárido (LPS). Una actividad fisiológica de Interleucina-10 (IL-10) es la inhibición de secreción de citocinas, por ejemplo IL-6. De esta manera, la adición de IL-10 a células estimuladas con LPS inhibe la secreción de IL-6, llevando a una reducción significante de IL-6 presente en el medio del cultivo celular. Sin embargo, como consecuencia de adición de BT-063 al cultivo celular, IL-10 se liga y de esta manera no es capaz de ligar al receptor en la superficie celular. El efecto inhibitorio IL-10 se compensa y se restaura la secreción de IL-6, llevando a IL-6 en el medio.
PBMCs se aislaron de sangre humana por gradiente Ficoll. Las células aisladas se sembraron a lxlO6 células/ml y estimularon con LPS para secreción de IL-6, que se inhibe por la adición de IL-10. El efecto inhibitorio IL-10 se neutralizó por adición de BT-063, de esta manera reconstituyendo la secreción de IL-6. Dependiendo del propósito (muestras de referencia o de control de calidad bajo, alto) de BT-063 agregado, diferentes concentraciones de titulación de BT-063 se emplearon, llevado a secreción de IL-6 dependiente de concentración que se detecta en el sobrenadante del cultivo celular.
Tabla 5: valores promedio de niveles IL-6 de determinaciones dobles y reconstitución IL-6 respectivamente dependiendo de la titulación de la norma de referencia .
Como se muestra en la Tabla 5, la cantidad de IL-6 secretado se correlaciona directamente con la concentración de BT-063. Entre más alta sea la concentración de BT-063, más IL-6 se secreta de PBMCs y de esta manera está presente en el sobrenadante. Incubación de las células con 40 ,¿ g/mL BT-063 llevó a . reconstitución de secreción IL-6 de aproximadamente 73%, mientras que con 0.988 //g/mL de BT-063 (última etapa de titulación) solo 17.5% del nivel IL-6 fue detectable en el medio cuando se compara al control positivo (PBMCs estimulados sin incubación IL-10).
EJEMPLO 5 - Enlace de Anticuerpo a PBMC Humanas Células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se prepararon recientemente de diferentes voluntarios sanos utilizando centrifugación de gradiente. Para este propósito, muestras de sangre se diluyeron 1:1 con solución amortiguada de Hanks y 20 mi de Ficoll se revistió lentamente con 20 mi de esta solución en un tubo estéril de 50 mi. Los tubos se centrifugaron a temperatura ambiente por 25 mins a 1200xg sin freno. Después de centrifugación, la interfase turbia o revestimiento o capa leucocitaria se transfieren en un tubo de 50 mi, lavan con PBS y centrifugan de nuevo por 10 minutos a 260 g. Eritrocitos residuales se lisaron utilizando BD Pharm Lyse™ de acuerdo con el protocolo del fabricante. PBMCs aisladas se resuspendieron en RPMI (FCS al 10%) .
El enlace de BT-063 (variante hVH26/hVL7) en PBMC humanas se determinó por análisis FACS utilizando el Equipo de Etiquetado Zenon ( Invitrogen) . Los anticuerpos se etiquetaron utilizando el equipo AlexaFluor488-Zenon IgG anti-humano de acuerdo . con las instrucciones del fabricante. Los reactivos en el equipo etiquetan BT-063 por enlace de fragmentos Fab etiquetados en forma fluorescente sin afectar sus propiedades de reconocimiento de antigeno. Un anticuerpo anti-CD4 IgGl humano (BT061, Biotest), etiquetado en paralelo con el equipo Zenon, se empleó como control positivo.
Los fragmentos Fab fluorescentes se incuban en exceso con los anticuerpos y ligan a la parte Fe de mAb. Los fragmentos Fab libres restantes se bloquean en una segunda reacción con un IgG irrelevante para inhibir enlace falso positivo. La mezcla incluyendo BT-063 o BT061 etiquetados en forma fluorescente, después se emplea para experimentos de tinción. Como un control negativo la reacción se realiza sin anticuerpo. 1 µ? de anticuerpo primario (BT-063, «-CD4 o PBS como control negativo) se etiqueta con 5 µ 1 de reactivo Zenon-AF488 (fragmentos Fab IgG anti-humano etiquetados con AF-488) por 5 min en un volumen total de 6 µ 1. Después, una incubación con 5 µ 1 del reactivo de bloqueo (IgG humano irrelevante) se realiza por 20 min. Toda la mezcla se diluye en PBS para dar por resultado adecuadas concentraciones de anticuerpo y tinción de células se realizó inmediatamente.
Resultados ejemplares se muestran en la Figura 6. BT-063 etiquetados se emplea en concentraciones de 25, 2.5, 0.25 y 0.025 µq/ml sin mostrar enlace en PBMC humanas. Con el anticuerpo anti-CD4, el enlace esperado en PBMC humano se detectó, mientras que BT-063 no muestra ningún enlace en linfocitos o monocitos hasta concentraciones de 25 µ g/ml . Por lo tanto puede concluirse que BT-063 no exhibe reactividad cruzada detectable a células mononucleares de sangre periférica de origen humano.
Los resultados demuestran que el anticuerpo BT-063 no liga a PBMCs y por lo tanto BT-063 liga solo a IL-10 soluble .
EJEMPLO 6 - Cristalografía Rayos X 6.1 Cristalización de BT-063 Fab en complejo con IL-10 humana Varias construcciones de IL-10 se diseñaron de acuerdo con datos estructurales publicados (Zdanov et al., Structure, Vol.3, 1995, p. 591) y clonaron por procedimientos estándar en vectores para expresión heteróloga en E. coli. Expresiones de prueba de las construcciones clonadas se realizaron de acuerdo con protocolos estándar y mostraron una alta sobre-expresión por IL-10 como se indica por un aumento en una banda en el intervalo esperado de alrededor de 18 kDa.
Proteina IL-10 expresada bajo condiciones optimizadas dio por resultado cantidades viables para purificación de proteina subsecuente. Después de replegado, la proteína se purificó por cromatografía de afinidad inmovilizada, cromatografía de exclusión de tamaño y cromatografía de intercambio de iones para dar por resultado proteína con más de 95% de homogeneidad como se juzga por SDS-PAGE teñido con Coomasie. El rendimiento de proteína purificada fue aproximadamente 0.3 mg por litro de cultivo de expresión, que fue suficiente para pruebas de cristalización .
El fragmento Fab de BT-063 (variante hVH26/hVL7) se disoció del anticuerpo intacto utilizando la proteasa papaína y purificó por proteína A. Subsecuentemente, el fragmento Fab se purificó adicionalmente por cromatografía de exclusión de tamaño.
El complejo IL-10:BT-063 Fab se formó al mezclar las proteínas purificadas, con un exceso molar de IL-10 y mayor purificación por cromatografía de exclusión de tamaño. El volumen de retención fue consistente con el tamaño del complejo. La proteína se concentró subsecuentemente a concentraciones adecuadas para cristalización .
Cristales del complejo IL-10:BT-063 Fab se prepararon por el método de co-cristalización . 6.2 Recolección y Procesamiento de Datos Cristales se congelaron en forma instantánea y midieron a. una temperatura de .100 K. Los datos de difracción de rayos X se han recolectado de co-cristales de IL-10 con el fragmento Fab de BT-063 en S ISS LIGHT SOURCE (SLS, Villigen, Suiza) utilizando condiciones criogénicas.
Los cristales pertenecen al grupo de espacio P6 con dos complejos en la unidad asimétrica. Se procesaron datos utilizando los programas XDS y XSCALE . Estadísticas de recolección de datos se resumen en la Tabla 6.
Tabla 6 Estadísticas de recolección procesamiento de datos Complejo IL-10 :BT-063 Fuente de rayos X PX (SLS1) Longitud de onda [Á] 1.0007 Detector PILATUS Temperatura [K] 100 Grupo de espacio P 6 Celda: a; b; c [Á] 219.00; 219.00/ ; ß ; Y [°] 64.36 90.0; 90.0; 120.0 Resolución [Á] 2 3.48 (3.72-3.48) Reflexiones únicas 21124 (3817) 2 Multiplicidad 2 3.0 (2.9) Completo [%] 2 91.2 (92.3) D G 3· 1 2, 3 í^sym L ° J 10.5 (44.0) p G 2- 1 2' 4 lomeas L ° J 14.8 (62.2) I / s I 2 6.1 (1.7) Promedio (I)/sigma2,5 7.0 (1.7) SWISS LIGHT SOURCE (SLS, Villigen, Suiza) Números en paréntesis cuadrados corresponden a la tolva más alta resolución. en donde es el valor de intensidad para la medición i-ésima de h en donde ??/? es el valor de intensidad de la medición i-ésima de h 5 Calculado de reflexiones independientes 6.3 Modelado y Refinamiento de Estructura La información de fase necesaria para determinar y analizar la estructura, se obtiene por reemplazo molecular. Modelos publicados de IL-10 y un fragmento Fab se emplearon como un modelo de búsqueda. Construcción y refinamiento de modelos subsecuentes se realizan de acuerdo con protocolos estándar con los paquetes de soporte lógico CCP4 y COOT. Para los cálculos del factor R libre, una medida para validación cruzada de lo- correcto del modelo final, 4.2% de los reflejos medidos se excluyeron del proceso de refinamiento (ver Tabla 7).
La parametrización de nanocuerpo se lleva a cabo con el programa CHEMSKETCH. LIBCHECK (CCP4) se empleó para generación de los archivos de biblioteca correspondientes.
El modelo de agua se construye con el algoritmo "Find water..." de COOT al colocar moléculas de agua en picos del mapa Fo-Fc contorneado a 3.0 o REFMAC5 y verificación de todas las aguas con la herramienta de validación de COOT. Los criterios para la lista de aguas sospechosas fueron: factor B mayor a 80, mapa 2Fo-Fc menor que 1.2 s, distancia a contacto más cercano menor a 2.3 Á o más que 3.5 Á. Las moléculas de agua sospechosas y aquellas en el sitio activo (distancia a inhibidor menor a 10 Á) se verificaron manualmente. La ocupación de cadenas laterales, que estaban en picos negativos en el mapa Fo-Fc (contorneado a -3.0 o), se ajusta a cero y subsecuentemente a 0.5 si ocurre un pico positivo después del siguiente ciclo de refinamiento.
La gráfica Ramachandran del modelo final muestra 80.8% de todos los residuos en la región más favorecida, 17.9% en la región adicionalmente permitida, 0.7% de los residuos en la generosamente permitida. Residuos Val86(A), Hisl4(B), Asp86(B), Serl31(C), Val56(D) y Val56(F) se encuentran en la región no permitida de la gráfica Ramachandran (Tabla 7) . Ya se confirman por el mapa de densidad de electrones o pueden no ser modelados en otra conformación sensible. Estadísticas de la estructura y el proceso de refinamiento se citan en la Tabla 7.
Tabla 7 Estadísticas de Refinamiento 1 Complejo IL-10:BT-063 Resolución [Á] 20.0-3.48 Número de reflexiones 20199 / 889 (trabajo/prueba) Rcryst [%] 29.7 Rfree2 [ % ] 35.5 Número total de átomos: Proteína 8870 Agua Ligando Desviación de geometría ideal: 3 Longitudes de enlace 0.007 [A] Ángulos de enlace [°] 0.93 Bs ligado 4 [Á2] 0.0 Gráfica Ramachandran : 5 Regiones más 80.8 favorecidas Regiones permitidas 17.9 adicionales Regiones generosamente 0.7 permitidas Regiones no permitidas 0.6 1 Valores como se definen en REFMAC5, sin corte sigma 2 Auto prueba contiene 4.2% de los reflejos medidos 3 Desviaciones raíz cuadrática media o medida cuadrática de los valores objetivo geométricos Calculado con el programa MOLE AN 5 Calculado con el programa PROCHECK 6.4 Análisis de estructura rayos X La estructura compleja de IL-10 humano ligado por fragmento de anticuerpo BT-063 Fab se analiza a una resolución¦ de 3.48 Á y revela el modo de enlace detallado del fragmento de anticuerpo Fab.
La densidad de electrones resultante muestra un modo de enlace no ambiguo para el fragmento Fab, incluyendo la orientación y conformación del fragmento Fab. El cristal del grupo de espacio ?ß contiene dos complejos en la unidad asimétrica.
La estructura de IL-10 en complejo con Fab se representa en la Figura 7. Dos fragmentos Fab ligan con sus bucles CDR a cada homodimero de IL-10.
Los siguientes residuos de IL-10 (moléculas A y B) pueden encontrarse en la vecindad de los bucles CDR dentro de una distancia máxima de 3.9 Á: Arg27, Lys 34, Gln38, Met39, Asp41, Gln42, Asp44, Leu46, Glu50, Leu53, Glul42, Aspl44, Ilel45, Asnl48, Tyrl49, Glul51, y Thrl55.
Los siguientes residuos de los bucles CDR pueden encontrarse en la vecindad de IL-10 dentro de una distancia máxima de 3.9 Á: Phe27, Ser28, Ala30, Thr31, Tyr32, Trp52, Arg53, Gly54, Ser56, Asn73, Ser74, TyrlOO, GlylOl, Tyrl03 (moléculas C y E) , Ser32, Asn33, Asn35, Tyr37, Lys55 (moléculas D y F) .
El sitio de enlace de BT-063 coincide con el sitio de enlace del receptor IL-10 en la superficie de IL-10, como se muestra al superponer la estructura compleja de IL-10:BT-063 con una estructura publicada del complejo receptor IL-10 : IL-10R1 (Figura 8).
Los residuos aminoácido BT-063 en contacto con IL-10 humana como se identifica por análisis de rayos X se resaltan en la secuencia de aminoácidos lineal de los dominios de anticuerpo variable BT-063 mostrados a continuación .
BT-063 VL DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSQNIV HSNGNTYLEW YLQRPGQSPR LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCFQGSHVP WTFGQGTKVE IK (SEQ ID No: 69) BT-063 VH: EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFSFA TYGVHWVRQS PGKGLEWLGV IWRGGSTDYS AAFMSRLTIS KDNSKNTVYL QMNSLRAEDT AVYFCAKQAY GHYMDY GQG TSVTVSS (SEQ ID No: 70) Regiones CDR (Honegger y Plückthun (2001) J. Mol. Biol., 309, 657-670) están subrayadas (CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera son SEQ ID Nos: 71, 72 y 73, respectivamente; CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada son SEQ ID Nos: 74, 75 y 76, respectivamente). Residuos de contacto con IL-10 se muestran con negritas.
Dentro de la cadena ligera se encuentran residuos de contacto en CDR1 y CDR2 pero no en CDR3. Respecto a los residuos de cadena pesada de todas las tres CDRs están involucrados en enlace antigeno. Dos residuos de FR3 (Asn73 y Ser74) también contribuyen a enlace de antigeno.
Ser28 y Ala30 al inicio de CDR1 son parte de la secuencia predecesora de VH murina (BN-10) y no presentes en el marco humano selecto (3-66*04). Ambas posiciones están menos frecuentemente involucradas en enlace de antigeno y se introdujeron como aminoácidos alternos durante el proceso de humanización.
Los residuos Asn73 y Ser74 se encuentran en secuencias marco de anticuerpo murino y frecuentemente en humanas, pero usualmente no están involucradas en enlace antigeno. (www. bioc. uzh . ch/anticuerpo; Honegger y Plückthun, 2001). Su contribución a enlace de antigeno es inesperada.
Los residuos aminoácido IL-10 involucrados en enlace de BT-063 se muestran a continuación. También se indican residuos de IL-10 involucrados en enlace a la cadena receptora IL-10 de alta afinidad (IL-10R1) y la cadena receptora de baja afinidad (IL-10R2) . Ambas cadenas receptoras están involucradas en enlace de un homodimero IL-10 y necesarias para señalización. En la secuencia A los residuos que hacen contacto BT-063 se muestran en negritas y están subrayados. En la secuencia B los residuos de contacto a IL-10R1 están marcados en negritas y subrayados, los residuos de contacto IL-10R2 están marcados con itálicas y subrayados y los residuos de contacto compartidos por IL-10R1 y 2 están marcados en negritas, itálicas y subrayados (Pletnev et al 2005) .
A SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK DQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA ENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 1) B S PGQGTQS EN S CTH F PG JP WMLRDLRDAF SRVKTFFQMK DQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA ENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN (SEQ ID NO : 1) Puede verse que BT-063 liga a un epitopo discontinuo de IL-10 que comprende residuos de hélice A (Arg27, Lys34, Gln38, Met39, Asp41) y la parte N-terminal de la hélice B (Glu50 y Leu53) incluyendo la secuencia de bucle de conexión (Glu42, Asp44, Leu46) de un monómero IL-10 así como residuos de la hélice F' (Glul42, Aspl44, Ilel45, Asnl48, Tyrl49, Glul51, Thrl55) del segundo monómero IL-10.
Como tal, puede verse que BT-063 bloquea el sitio de enlace de la cadena receptora de alta afinidad IL-10R1.
EJEMPLO 7 - Estudio de Toxicidad de una Sola Dosis In Vivo en Monos Macaco Cangrejero Se realizó un estudio de toxicidad en una sola dosis incluyendo parámetros de farmacología de seguridad en monos macaco cangrejero siguiendo una inyección intravenosa sencilla de BT-063 (variante hVH26/hVL7). Los animales fueron distribuidos en cuatro grupos (placebo, 1 mg/kg, 7 mg/kg y 50 mg/kg) con 4 animales/sexo/grupo. BT-063 se inyectó en forma intravenosa el día 1. La mitad de los animales se sometieron a necropsia después de 5 días, mientras que los animales restantes fueron sacrificados el día 28.
El nivel de baja dosis de 1 mg/kg de este estudio corresponde a una dosis equivalente humana de -300 ug/kg, resultando en una dosis humana total de 18 mg (60 kg peso corporal) . Una dosis similar del anticuerpo predecesor BT-063 B-N10 se ha aplicado diariamente por 21 días en una pequeña prueba iniciada por investigador (Llórente, 2000). Esta cantidad de anticuerpo ha mostrado efectos farmacológicos y eficacia clínica. El nivel de baja dosis por lo tanto se seleccionó de conformidad. La alta dosis fue selecta como un múltiplo (50) de la dosis inicial. La dosis intermedia es el promedio geométrico de la dosis baja y alta.
Durante el estudio no se observaron cambios toxicológicos significantes o relevantes en parámetros fisiológicos o histopatológicos . Además, cambios en parámetros de química clínica se consideraron de poca o ninguna significancia toxicológica .
EJEMPLO 8 - Ocupación diana estimada por el anticuerpo BT-063 específico de IL-10 después de administración intravenosa .
A fin de estimar la neutralización de IL-10 en voluntarios sanos humanos después de una sola inyección intravenosa de mAb BT-063, la ocupación diana de IL-10 por BT-063 (variante hVH26/hVL7) en un voluntario sano se estimó con base en la constante de disociación del complejo BT-063-IL-10 y en los parámetros estándar para volúmenes de sangre humana y la consideración de que BT-063 se distribuye solamente dentro de la corriente sanguínea. 8.1 Método El Programa No Validado Microsoft-Excel se empleó para calcular y exhibir la ocupación diana dependiente de dosis de IL-10 por BT063.
Consideraciones para cálculo: - Volumen de sangre (suero) : 3.5 1 - Concentración promedio de IL-10 en suero de voluntarios sanos: 15 pg/ml kD (constante de disociación, BT063<->IL-10 ) : 3 nM (derivado de estudios Biacore) - peso molecular dimero IL-10: 37 000 g/moles - peso molecular de BT063: 150 000 g/moles Utilizando la ley de acción de masas, una ocupación objetivo de IL-10 en diferentes dosis del anticuerpo BT063 se calculó. Para los cálculos teóricos de IL-10 libre y complejado, se consideró que una molécula de un anticuerpo anti-ILlO liga a un dimero de IL-10. La siguiente ecuación en equilibrio se aplicó: Ley de acción de masas: BT063 + IL10 «? complejo BT063/IL-10 Una constante disociación resultante se determina por concentraciones de estado estable BT063 ([BT063]), IL-10 ([IL-10]) y el complejo BT063-IL-10 ([complejo]): kD = [BT063] * [IL-10] [ complejo] Las concentraciones de estado estable no están directamente disponibles, pero pueden calcularse a partir de concentraciones iniciales de [BT063o] y [IL-lOo] y la concentración de estado estable del complejo ([complejo]): [BT063] = [BT0630] - [complejo] [IL-10] = [IL-100] - [complejo] Para cálculo de ocupación IL-10 por BT063 después de inyección intravenosa de mAb, se realizaron las siguientes consideraciones: - BT063 se distribuye en forma igual y exclusiva en la sangre directamente después de inyección - moléculas BT063 no dejan el volumen sanguíneo - IL-10 se distribuye exclusivamente en la sangre y no hay otras fuentes de IL-10 - moléculas IL-10 o complejos BT063-IL-10 no dejan la corriente sanguínea y no se retiran de circulación por el receptor Fe mediado u otros mecanismos - el equilibrio se alcanza rápidamente Estas consideraciones se eligen artificialmente y no representan la situación relevante biológica probable in vivo. Puede considerarse que el volumen de distribución de BT063 es más grande que el estimado, ya que BT063 más probablemente se distribuye adicionalmente a compartimientos extravasales del cuerpo, llevando a concentraciones rápidamente disminuidas de mAb en la circulación. Además, puede esperarse que existen fuentes extravasales para IL-10 y la cantidad de IL-10 presente en el cuerpo es superior a la aquí estimada.
En forma concluyente, los cálculos hechos aquí sobreestiman el porcentaje de IL-10 complejado in vivo. El complejado estimado de IL-10 de esta manera no se alcanzará in vivo y existe un margen de seguridad para los valores calculados .
Como una base de cálculo, se emplean las siguientes constantes: ? peso molecular (BT063) : 150,000 g/moles ? peso molecular (dimero IL-10): 37,000 g/moles ? concentración promedio de IL-10 en suero de voluntarios sanos: 15 pg/ml ? volumen de suero de sangre: 3.5 1 En base a esto, el porcentaje dependiente de dosis de IL-10 que se compleja por BT063 bajo concentraciones de equilibrio puede calcularse. La Tabla 8 y la Figura 10 muestran la dependencia de dosis de bloqueo de IL-10 por BT063 después de inyección intravenosa de mAb. TABLA Tabla 8: Cálculo de ocupación de IL-10 por BT-063 con dosis total creciente de BT-063 inyectada en forma intravenosa. (*Dosis que se pretenden aplicadas en la prueba clínica de voluntarios sanos se marcan en gris) .
Para estimar en forma teórica las influencias de diferentes concentraciones de IL-10 o una afinidad diferente (constante de disociación) de BT-063 a IL-10, las curvas correspondientes se compararon con la dependencia de dosis-respuesta original ilustrada en la Figura 10.
La Figura 11 muestra que el por ciento de IL-10 complejado simplemente es independiente de niveles de IL-10 en la sangre. Incluso cambios de 1000 veces en niveles de IL-10 solo tienen impacto marginal en la curva de respuesta de dosis. Por lo tanto, fluctuaciones en concentraciones de IL-10 no alteran la ocupación de IL-10 por BT-063 en una base porcentual.
Aunque, la afinidad de BT-063 a IL-10 humano se conoce de los estudios Biacore, otros métodos pueden llevar a una constante, de disociación ligeramente diferente para el complejo (Waibler et al., J Allergy Clin Immunol., 2008 Nov; 122(5): 890-2, Epub 2008, Sep 20). Por lo tanto se analizó a que grado una afinidad diferente alterará la respuesta de dosis de la ocupación de IL-10.
En contraste, para niveles IL-10 alterados diferentes afinidades de BT-063 a IL-10 cambian las curvas a una ocupación superior de BT-063 para el caso de una afinidad superior (10 veces superior) o vice versa para menores afinidades (Figura 12) .
De los datos, puede concluirse que 175 µg de BT-063 (la dosis inicial pretendida de la primera prueba clínica con humano voluntario sano) , es capaz de neutralizar aproximadamente 10% de todo IL-10 presente en la sangre de un voluntario sano. Hasta una dosis de 10 mg de BT-063 hay una relación lineal log entre la dosis de BT- 063 y el porcentaje de IL-10 complejado. Con 10 mg de BT- 063, aproximadamente 85% de todo IL-10 se neutralizará.
El curso de la curva calculada substancialmente depende de la concentración IL-10 en la sangre, lo que significa que la capacidad de neutralización de BT-063 (en una base porcentual) será influenciada por diferentes niveles de IL-10 solo en una proporción menor.
Por lo tanto, puede considerarse que la curva presentada para voluntarios sanos aplicará adicionalmente • para pacientes .de lupus sistémico eritematoso (SLE) quienes tienen incrementados niveles de IL-10 en la sangre. De estos datos puede concluirse que las dosis sobre 175 g total de dosis de BT-063 en voluntarios sanos neutralizarán más de 10% de la citocina. Sobre esta dosis y hasta 10 mg de dosis total, el complejado de IL-10 por mAb dará por resultado una relación lineal log de hasta 85%. Sobre 10 mg de BT-063, la curva corre en niveles de saturación. Casi 100% de neutralización se alcanza a 100 mg de dosis total .
EJEMPLO 8 - Estudio de Toxicidad de Una Sola Dosis In Vivo en Voluntarios Sanos Se realizó un estudio para supervisar la seguridad y tolerabilidad de BT-063 (variante hVH26/hVL7), y el efecto de administración de BT-063, utilizando dosis escaladas del anticuerpo en voluntarios sanos. Veintitrés voluntarios recibieron una sola administración intravenosa de BT-063, en 8 grupos de dosis. Los grupos de dosis fueron como sigue: 0.175 mg, 0.75 mg, 3.5 mg, 7 mg, 15 mg, 30 mg, 60 mg y 100 mg. Hubo tres voluntarios por grupo, excepto por el grupo de dosis de 100 mg en donde hubo dos voluntarios .
Cada dosis se diluye con inyección de cloruro de sodio al 0.9% hasta un volumen total de 20 mi. La dosis se administra como una sola infusión intravenosa continua utilizando una bomba de infusión durante 2 horas.
Los voluntarios se estimaron sobre un periodo de 85 días después de la inyección y se tomó sangre en múltiples puntos en tiempo sobre este periodo.
De la sangre tomada, se hicieron evaluaciones en los niveles de citocinas IFNy, IL-?ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 y TNFOÍ .
Resultados Un aumento transitorio no dependiente de dosis de L-6 y IL-8 estuvo presente dentro de 24 horas posteriores a infusión, regresando a los niveles pre-dosis después de 3 días. Este efecto se considera asociado con el evento de infusión en vez de con el anticuerpo ya que no hubo relación de dosis y el efecto ocurrió incluso a la más baja dosis .
De manera sorprendente, dado que IL-10 es una citosina regulatoria importante, no se detectaron aumentos en niveles de IFNy, IL-?ß, IL-2, IL-4, IL-5, y TNFa, como se muestra en la Figura 13. La falta de elevación en niveles de IL-4, IL-5 IFN-?, IL-2 también confirma que no hay activación de células T-auxiliares resultante de la administración de BT-063. Además, ya que la temperatura del cuerpo también es una indicación de un desprendimiento a gran escala de citocinas pro-inflamatorias, este parámetro también se midió en los voluntarios tratados. Sin embargo, no se detectó después de administración aumento en la temperatura del cuerpo.
Como se muestra en la Figura 14, la concentración en plasma de IL-10 se influencia por la administración de BT-063, con IL-10 en plasma detectado que aumenta conforme se aumenta la dosis de BT-063. Se nota que el ensayo empleado detecta tanto como IL-10 libre como IL-10 ligado a BT-063. Hay dos explicaciones posibles para el aumento: (1) una vida media prolongada de IL-10, con enlace de IL-10 a BT-063 evitando internalización de IL-10, y de manera concomitante sin eliminación de IL-10 de la sangre (normalmente hay una generación o recambio rápido de IL-10, con la vida media de IL-10 secretado que es aproximadamente 2.3-3.5 horas (Huhn et al., Blood (1996) Jan 15: 87(2): 699-705)); y/o (2) inducción de un bucle de retro-alimentación negativa - con BT-063 que bloquea el enlace de IL-10 a su receptor no es posible regeneración celular de IL-10, activando a las células B para producir más IL-10. Consideramos que el escenario (2) es más probable ya que se confirma por datos in vitro que se toman de experimentos de cultivo en sangre entera con BT-063 y células con genes inoperativos IL-10R murinas (Mahnke et al., datos sin publicar) .
Farmacocinética Los datos farmacocinéticos mostraron que Cmax, AUC y la vida media de BT-063 están en el intervalo de los valores teóricos esperados. La vida media terminal de BT-063 está entre 15 y 30 días. Después de administración de dosis de 30 mg o superiores, BT-063 todavía es detectable en el plasma después de 85 días.
No se observaron anticuerpos anti-humanos humanos (HAHA = Human Anti-Human Antibodies) en los voluntarios tratados, a pesar del hecho de que las respuestas de HAHA se han observado con otros anticuerpos de neutralización de citocina (por ejemplo con Adalimumab, un anti-TNF alfa humanizado) .
A pesar del aumento en cantidades detectadas de IL-10 después de administración de BT-063, se nota que este estudio demuestra la seguridad y tolerabilidad, de incluso grandes dosis de BT-063 y de esta manera puede concluirse que dosis suficientes de BT-063 pueden administrarse en forma segura a pacientes de SLE para contrarestar los efectos de exceso de IL-10.

Claims (30)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10), en donde el anticuerpo o su fragmento: (i) liga a la misma región de IL-10 que el receptor IL-10 a (IL-lORa) y no es capaz de ligar IL-10, cuando el IL-10 se liga al receptor IL-10; y (ii) liga a IL-10 en forma homodimérica al ligar un epitopo discontinuo que comprende residuos de ambos monómeros .
2. Un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento comprende secuencias de aminoácidos al menos 80% idénticas a aquellas de CDR 1, CDR 2 y CDR3 de la cadena ligera variable de B-N10 del anticuerpo murino y/o comprenden secuencias aminoácidos de al menos 80% idénticas a aquellas de CDR 1, CDR 2 y CDR3 de la cadena pesada variable B-N10 de anticuerpo murino.
3. Un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento comprende las secuencias de aminoácidos de CDR 1, CDR 2 y CDR3 de las cadenas ligeras y/o pesadas variables B-N10 de anticuerpo murino .
4. Un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos de CDR 1, CDR 2 y CDR3 de la cadena ligera variable B-N10 del anticuerpo murino y/o al menos una de las secuencias de aminoácidos de CDR 1, CDR 2 y CDR3 de la cadena pesada variable B-N10 de anticuerpo murino, opcionalmente con variación en estas secuencias que substancialmente no altera la afinidad y/o especificidad del anticuerpo humanizado o su fragmento.
5. Un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable B-N10 de anticuerpo murino y/o la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable B-N10 de anticuerpo murino.
6. Un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento comprende una secuencia de cadena pesada variable del anticuerpo BT-063 (SEQ ID No:70) y una secuencia de cadena ligera variable de BT-063 (SEQ ID No: 69) .
7. Un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento no liga a la misma región de IL-10 que el receptor IL-10 ß (IL-10RP) .
8. Un anticuerpo humanizado o quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento liga a un epitopo discontinuo que comprende residuos de hélice A de un monómero IL-10 y residuos de hélice F' del otro monómero IL-10.
9. Un anticuerpo humanizado o quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los residuos del epitopo discontinuo están dentro de los primeros 55 aminoácidos de un monómero y dentro de los últimos 20 aminoácidos del otro monómero.
10. Un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque los residuos del epitopo discontinuo están dentro de los aminoácidos 20 a 55 de un monómero y dentro de los últimos 20 aminoácidos del otro monómero.
11. Un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10), en donde el anticuerpo o su fragmento no induce citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo y/o citotoxicidad dependiente de complemento.
12. Un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10), en donde el anticuerpo o su fragmento son capaces de evitar señalización IL-10 a través del receptor IL-lOa.
13. Un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento capaz de ligar a interleucina-10 (IL-10), en donde el anticuerpo o su fragmento no es capaz de ligar a células que expresan IL-10R.
14. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o su fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Un vector que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14.
16. Una célula hospedera que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14 o un vector de acuerdo con la reivindicación 15.
17. Un método para la producción de un anticuerpo o su fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque comprende una etapa de cultivar la célula hospedera de acuerdo con la reivindicación 16 en un medio de cultivo bajo condiciones que permiten la expresión del anticuerpo o su fragmento y separar el anticuerpo o fragmento del medio de cultivo.
18. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o su fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y que además comprende un portador o diluyente farmacéutico aceptable.
19. Un método para tratar o evitar una condición médica en un sujeto, caracterizado porque la condición médica está mediada por un nivel o actividad elevados de IL-10, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéutica efectiva de un anticuerpo o su fragmento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
20. Un método para tratar o evitar una condición médica en un sujeto de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la condición médica es lupus sistémico eritematoso (SLE) .
21. Un anticuerpo o su fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para utilizar en medicina.
22. Un anticuerpo o su fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para utilizar en el tratamiento de SLE.
23. El uso de un anticuerpo o su fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de SLE.
24. Un anticuerpo humanizado o quimérico etiquetado o su fragmento, que comprende el anticuerpo o su fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y una etiqueta.
25. Un método in vitro para neutralizar IL-10 en una muestra, que comprende una etapa de poner en contacto la muestra con un anticuerpo o su fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para ligar el anticuerpo o su fragmento con IL-10.
26. Un método in vitro para detectar la presencia de IL-10 en una muestra que comprende una etapa de poner en contacto con la muestra un anticuerpo no etiquetado o etiquetado o su fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o la reivindicación' 24, lavar para retirar anticuerpo o fragmentos de anticuerpo que no están ligados a la muestra, y detectar la presencia del anticuerpo o su fragmento o la etiqueta en la muestra.
27. Un método para diagnosticas SLE en un individuo, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una muestra de plasma que se toma de un individuo; (b) poner en contacto la muestra con el anticuerpo o su fragmento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13; y (c) detectar la presencia de IL-10.
28. Un método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la etapa (c) comprende determinar la cantidad de IL-10 presente en la muestra .
29. Un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento comprende una región variable que comprende CDRl y CDR2 de cadena ligera BT-063 y/o una región variable que comprende CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada BT-063 opcionalmente con substituciones de aminoácido en la secuencia de CDRs siempre que: (i) la cadena ligera CDRl comprende: Ser32, Asn33, Asn35, Tyr37; (ii) la cadena ligera comprende CDR2 : Lys55; (iii) la cadena pesada comprende CDRl: Phe27, Ser28, Ala30, Thr31, Tyr32; (iv) la cadena pesada, comprende CDR2: Trp52, Arg53, Gly54, Ser56; (v) la cadena pesada comprende CDR3: TyrlOO, GlylOl, Tyrl03.
30. Un anticuerpo humanizado o quimérico o su fragmento de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la región variable de cadena pesada además comprende Asn73 y Ser74.
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