CN102811736A - 治疗系统性红斑狼疮(sle)的人源化抗il-10抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了能够结合白细胞介素-10(IL-10)的人源化或嵌合的抗体或其片段，其中能够将所述抗体或其片段施用于受试对象，而没有促炎性细胞因子水平的无法耐受的增加的情况。此外，本发明提供了涉及应用所述抗体或其片段的治疗方法。

Description

治疗系统性红斑狼疮(SLE)的人源化抗IL-10抗体

技术领域

本发明涉及白细胞介素-10(IL-10)和IL-10特异性试剂。特别地，本发明涉及人源化IL-10抗体及其应用。本发明还涉及治疗系统性红斑狼疮(SLE)的方法。

背景技术

系统性红斑狼疮(SLE)据认为是自体免疫疾病，其中B淋巴细胞的异常机能亢进和免疫球蛋白γ(IgG)自体抗体的大量异常产生起着关键作用。该病理学过程导致Ig包覆的细胞的隐没和破坏、补体蛋白的固定和切割以及化学吸引素(chemotaxin)、血管活性肽和破坏性酶在组织中的释放(Hahn BH.Systemic Lupus Erythematosus.In:Kasper DL,Braunwald E,Fauci AS,Hauser SL,Longo DL,Jameson,JL编著.In:Harrison’s Principles of Internal Medicine(第16版),New York(US):McGraw-Hill;2005，第1960-1967页)。

SLE的特征在于多样性表现形式。在疾病进程中，总共95%的患者诉有肌肉骨骼疾病，80%表现出皮肤损伤，85%有血液疾病，60%有神经紊乱，60%有心肺疾病，30%～50%有肾脏疾病，40%有胃肠道疾病，15%有血栓且15%有眼部疾病。大多数的患者(95%)还经受在大多数时候均存在的系统性症状，如疲倦、不适、发烧、厌食和体重减轻。多数患者经历突发与缓解交替的疾病期。永久性缓解(不治疗时没有症状)极为罕见。超过50年之前，多数诊断为SLE的患者存活少于5年。现在，10年存活超过90%，这主要是基于早诊断、对症抗炎和免疫抑制治疗。常见死因为免疫抑制造成的感染(Hahn 2005)。

在SLE治疗中常规使用抗疟疾药、抗炎药和免疫抑制药物。当症状难以控制时，对非甾体抗炎剂补充以皮质激素。此外，主要器官受累的活跃的SLE需要采用环磷酰胺的激进性疗法。

迄今为止，还没有可用于治愈SLE和/或在长期基础上改善患者的生活品质的病因性治疗。然而，近来在抗体技术中的发展和对引起该自体免疫疾病的因素的进一步鉴定已经开启了使用单克隆抗体作为治疗选择的可能性。特别地，治疗SLE的有利方法将是与导致多克隆自体抗体的大量过度产生的病理性免疫响应相互作用或将其纠正的特异性治疗。由于SLE的发病机理主要涉及失调的B细胞，特别受关注的是能够靶向B细胞的单克隆抗体。Robak和Robak(Current Drug Targets,2009,第10期,第26-37页)注意到，潜在的B细胞表面抗原靶标是CD19、CD20、CD21和CD22。此外，IL-10、IL-1ra、IL-12(Capper等，Clin.Exp.Immunol.2004Nov;138(2):348-56)和IL-6(Chun等，J.Clin.Immunol.2007 Sep;27(5):461-6)是调节免疫响应的重要细胞因子，且尤其在SLE患者的突发期间升高。IL-10和抗双链DNA (dsDNA)的自体抗体的血浆水平往往反映患SLE的患者的疾病活跃性。升高的IL-10水平与SLE患者的疾病活跃性相关(Park等，Clin.Exp.Rheumatol.1998年5月-6月;16(3):283-8)。然而，IL-10是对免疫系统具有多效性的细胞因子，且已知其还参与降低促炎性响应。

已对SLE患者进行了采用单克隆抗体的临床试验。特别地，几种试验涉及抗体利妥昔单抗(Rituximab)，一种用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的嵌合小鼠抗CD20单克隆抗体。Robak和Robak (2009)注意到，这些试验的结果显示出该抗体在SLE患者中较高的活性，且已开发了数种新的靶向CD20的抗体(Ofatumumab、IMMU-106和GA-101)。其它报道了单克隆抗体在SLE中的活性的临床试验采用抗CD22抗体、依帕珠单抗(Epratuzumab)、抗TNFα抗体、英夫利昔单抗(Infliximab)、抗IL-10抗体、B-N10(Llorente等，Arthritis Rheum.2000年8月;43(8):1790-800)、抗CD40L抗体、IDEC 131和BG 9588、BLYS抑制剂、贝利单抗(Belimumab)、抗IL6受体抗体、妥克利母单抗(Toclimumab)和抗C5抗体依库珠单抗(Eculizumab)完成。

本发明的目的在于提供在该领域具有功用的其他试剂、特别是抗体。

因此，本发明提供了能够结合白细胞介素-10(IL-10)的人源化的或嵌合的抗体或其片段，其中能够将所述抗体或其片段施用于受试对象，而没有促炎性细胞因子水平的无法耐受的增加的情况。

由于IL-10代表抗炎性细胞因子，因此预期的是阻断时细胞因子会显著增加。对于鼠IL-10抗体B-N10而言，施用时可以在未经刺激的细胞培养物(其反映了健康个体的体内状况)中观察到如IL-6或TNF-α等促炎性细胞因子的增加。然而，本发明人惊讶地发现当将本发明的抗体在体外被应用于细胞时和体内施用时，细胞因子的释放低得多。这种细胞因子释放的降低是有利的，因此本发明的抗体对于接受施用的个体而言更具可耐受性。

将参考以下附图仅通过示例的方式对本发明进行说明，其中：

图1A显示了鼠B-N10抗体的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID No:2)。高变互补决定区(CDR)以下划线标出(其中LCDR1为SEQ ID No:4；LCDR2为SEQ ID No:5；且LCDR3为SEQ ID No:6)。

图1B显示了鼠B-N10抗体的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID No:3)。高变互补决定区(CDR)以下划线标出(其中HCDR1为SEQ ID No:7；HCDR2为SEQ ID No:8；且HCDR3为SEQ ID No:9)。

图2A显示了编码鼠B-N10抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID No:10)。

图2B显示了编码鼠B-N10抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNo:11)。

图3显示了鼠B-N10轻链和重链可变区(分别为SEQ ID No:12和13)以及取自A17(SEQ ID No:14)、JK1(SEQ ID No:15)、3-66+04(SEQ ID No:16)和JH4(SEQ ID No:17)的序列和在鼠B-N10抗体的人源化过程中产生的可变区hVL1～hVL12(SEQ IDNo:18～29)和可变区hVH1～hVH29(SEQ ID No:30～58)的氨基酸序列。

图4提供了使用hIL-10抗原ELISA的人源化抗体变体与嵌合cB-N10抗体的抗原结合性质的比较。

图5提供了使用纯化抗体制备物，与嵌合cB-N10抗体相比，确定三种人源化变体hVH20/hVL7、hVH20/hVL8和hVH26/hVL7的结合性质的结果。

图6A显示与BT-063相比，以B-N10(50μg/ml)温育后的健康志愿者的全血培养物释放的TNF-α的水平。

图6B显示与BT-063相比，以B-N10(50μg/ml)温育后的SLE患者的全血培养物释放的TNF-α的水平。

图7A显示与BT-063相比，以B-N10(50μg/ml)温育后的健康志愿者的全血培养物释放的IL-6的水平。

图7B显示与BT-063相比，以B-N10(50μg/ml)温育后的SLE患者的全血培养物释放的IL-6的水平。

图8A显示与BT-063相比，以B-N10(50μg/ml)温育后的健康志愿者的全血培养物释放的IL-1β的水平。

图8B显示与BT-063相比，以B-N10(50μg/ml)温育后的SLE患者的全血培养物释放的IL-1β的水平。

图9A显示与BT-063相比，以B-N10(50μg/ml)温育后的健康志愿者的全血培养物释放的IFNγ的水平。

图9B显示与BT-063相比，以B-N10(50μg/ml)温育后的SLE患者的全血培养物释放的IFNγ的水平。

图10显示了与IL-10结合的BT-063的Fab片段的总体结构。IL-10和Fab片段以带状图显示。

图11显示了BT-063的Fab片段处于IL-10上的与IL-10受体相同的结合位点。IL-10、IL-10R1和Fab片段以带状图显示。

图12显示了在健康志愿者中进行BT-063体内施用后血浆中细胞因子浓度的平均cmax与剂量的关系图。

图13显示了在健康志愿者中进行BT-063体内施用后血浆中平均IL-10浓度随时间变化的图。

具体实施方式

本发明涉及能够结合白细胞介素10(IL-10)的人源化或嵌合抗体或其片段，以及该抗体或其片段在由IL-10水平或活性升高所介导的医学状况的治疗中的应用。

人IL-10是具有37kDa分子量的同源二聚体。每个单体均由160个氨基酸构成并且分子量为18.5kDa。IL-10二聚体与IL-10受体α(IL-Rα或IL-10R1)相互作用并随后将IL-10受体β(IL-10Rβ或IL-10R2)募集至复合物中。受体在多种细胞特别是免疫细胞上表达(Asadullah等，Pharmacol.Rev.2003 Jun;55(2):241-69)，包括大多数血源细胞，如单核细胞、巨噬细胞以及T淋巴细胞和B淋巴细胞，但也在非血源细胞上表达，例如表皮细胞或角质细胞。IL-10对IL-10受体α的结合和IL-10受体β的募集导致经由Jak1和Tyk2酪氨酸激酶的信号转导以及随后的对STAT家族的转录因子的活化。IL-10的各种细胞来源是已知的，如T辅助细胞、调节T细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、角质细胞、树突细胞，甚至癌细胞。B细胞上的IL-10功能包括避免凋亡、提高增殖、类别转换事件和分化为血浆细胞(Asadullah等，Pharmacol.Rev.2003 Jun;55(2):241-69)以及抑制炎症。

本发明提供了能够结合白细胞介素-10(IL-10)的人源化或嵌合的抗体或其片段，其中能够将所述抗体或其片段施用于受试对象，而没有促炎性细胞因子水平的无法耐受的增加的情况。

具体而言，已知治疗性抗体的施用能导致促炎性细胞因子水平的无法耐受的增加，从而在受试对象中引起副作用。具体而言，所述无法耐受的增加能导致皮肤变红并引起发烧或流感样症状，包括体温升高。于是，在本发明的优选方面，所述抗体或抗体片段是能够施用于受试对象而没有大于2℃的体温增加的情况的抗体或抗体片段。

此外，所述抗体或其片段不会导致施用后受试对象的血浆中促炎性细胞因子的量显著增加。所述细胞因子的无法耐受的水平通常比细胞因子正常上限高(ULN)出数倍，其中ULN被定义为在受试对象群体中测定的细胞因子平均水平加上2×标准偏差。

因此，在本发明的优选方面，所述抗体或其片段能能够施用于受试对象，而没有促炎性细胞因子的增加大于正常上限(ULN)的500%、更优选大于其300%的情况。换言之，所述抗体或其片段导致小于促炎性细胞因子ULN的500%、更优选小于300%的该细胞因子水平的增加。优选的是，所述促炎性细胞因子是TNF-α、IFN-γ、IL-1β中的至少一种，优选为全部。作为另一种选择，所述促炎性细胞因子不是IL-6或IL-8。

另外，特别优选的是，本发明的抗体或其片段能在受试对象中诱导IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)，后者导致抗炎性响应。

在本发明的优选方面，所述人源化抗体或其片段在与PBMC、更特别是免疫细胞在体外接触时不会引起释放自该细胞的促炎性细胞因子(尤其是TNF-α、IL-1β、IL-6)水平的大于500%的增加。

本发明人令人惊讶地发现，与鼠B-N10抗体相比，本发明的人源化抗体或其片段在体外测试中引起促炎性细胞因子的水平的更小的增加。

利用人全血培养物(例如下述实施例5中的那些研究)或分离的免疫细胞通过体外研究，可以确定促炎性细胞因子的释放水平。具体而言，所述方法包括以下步骤：(a)将细胞培养物与抗体或其片段温育；和(b)确定至少一种促炎性细胞因子的水平。

人全血培养物可以取自健康人或患者，如罹患SLE的那些患者。外周血单个核细胞(PBMC)可以为免疫细胞，特别选自巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T辅助细胞和B细胞。

所述至少一种促炎性细胞因子可以分别选自白细胞介素1β(IL-1β)、IL-1α、IL-6或肿瘤坏死因子α(TNF-α)或T辅助细胞因子(干扰素γ、IFN-γ、IL-4)、巨噬细胞因子(IL-12)、趋化因子(IL-8、MCP-1)。所释放的此类细胞因子的水平可以使用本领域公知的方法在细胞培养物上清液中测定。

更具体而言，这种体外方法可以包括以下步骤：

a)使50μg/ml所述抗体或片段与人全血培养物接触；

b)将所述抗体或片段与所述全血培养物在37℃温育48小时；

c)确定所述培养物中一种或多种促炎性细胞因子的量。

特别地，同时用未与所述抗体接触过的人全血培养物执行该方法。优选地，当与该对照比较时，本发明的抗体或抗体片段导致小于500%的细胞因子水平增加、更优选导致小于300%的细胞因子水平增加。优选的是，该方法中的细胞因子不是IL-6或IL-8。

可以采用Multiplex Bead免疫测试(在96孔过滤板中进行的固相蛋白测试)来在培养物中检测细胞因子。该方法依赖于珠的应用，所述珠首先与针对特定细胞因子的特定抗体连接，其次展示出明确的光谱特性。这使得所述珠能被特异性鉴别，并因此将它们导向已知的连接抗体。借助于检测抗体与所述细胞因子进一步结合，可以将与珠结合的细胞因子定量。这使得可以同时检测多达10种人细胞因子，包括GM-CSF、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ和TNF-α。过滤板用于该目的，在过滤板的湿润孔中移注样品、标准物和珠溶液。温育后，用真空泵抽吸液体，将留下的珠洗涤，并添加生物素化检测抗体的混合物。通过抽吸液体除去未结合的检测抗体，并洗涤遗留在孔中的珠，然后添加链霉亲和素缀合的R-藻红蛋白(链霉亲和素-RPE)。链霉亲和素-RPE在温育期间识别生物素化的检测抗体，在再次洗涤后，可以通过Bio-Plex 200系统分析所形成的免疫复合物。免疫测试利用Bio-Plex 200装置进行分析。该装置使用两种激光体系，其首先基于珠的光谱特性来识别珠，然后通过使用二抗的检测来确定结合的细胞因子的量。对结合量的定量借助采用已知量的细胞因子平行进行的标准物运行来实现。

本发明还提供了能与白细胞介素10(IL-10)结合的人源化的或嵌合的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段能够在施用于受试对象时提高IL-10的血浆水平。

如下文实施例8所展示，可以施用本发明的抗体而没有促炎性细胞因子水平的无法耐受的增加的情况，同时施用以剂量依赖性方式增加了血浆样品中可检测的IL-10的量。对于IL-10水平会在应用中和抗体时增加的这一发现是出人意料的。通常预期的是，施用细胞因子中和剂会降低游离细胞因子的水平(Strand等，Nature ReviewsDrug Discovery，2007,第6卷，第75-92页)。虽然不希望受到理论束缚，但据信所述抗体对IL-10的结合阻止了IL-10与IL-10受体结合并触发了导致B细胞产生更多IL-10的负反馈环。尽管如此，这种上调不会阻止本发明的抗体的治疗性功用，因为也如实施例8所展示，所述抗体在以足以中和所有IL-10的高水平施用时仍是安全的。

在本申请中，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体：其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或子类别的抗体中的序列相同，同时该抗体的其余部分与源自另一物种、抗体类别或子类别的抗体中的序列相同。特别优选的是，嵌合抗体的CDR具有一个来源，而该抗体的其余部分具有不同的来源。特别地，在本发明中，嵌合抗体可以为其中已将非人类抗体的抗原结合序列/可变域移植到人类抗体框架区的人源化抗体。

在本申请中，术语“片段”是指仍然保留所需生物活性的抗体的片段或衍生物。所述片段通常包含抗体的抗原结合区，且特别地包含Fab、Fab′、F(ab)′₂、Fv和scFv片段，以及多价抗体衍生物、特别是双价抗体(diabody)或串联双价抗体。所述片段优选为至少25个、更优选50个且进而更优选200～500个氨基酸。作为另一种选择，所述片段可以被限定为具有30KDa～150kDa的尺寸的那些片段。此外，抗体片段可以涉及两个或多个肽/多肽链。例如，包含长度各自为200～300个氨基酸的两条链的Fab片段，或包含长度各自为400～500个氨基酸的两条链的(四价双特异性抗体形式)。

本发明的一个优选特征在于，所述抗体或其片段源自鼠B-N10抗体或本文所述的人源化BT-063(变体hVH26/hVL7)抗体。特别地，此类抗体或其片段包含与B-N10/BT-063可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3的同一性为至少80%的CDR，和/或包含与B-N10/BT-063可变重链的CDR1、CDR2和CDR3的同一性为至少80%的氨基酸序列。鼠CDR的氨基酸序列如图1所示。BT-063 CDR的氨基酸序列如实施例6所示。更优选的是，所述序列与B-N10/BT-063抗体的CDR的同一性为至少90%或至少95%。本文实施例6中所述的X射线晶体学研究表明了CDR内的哪些残基对于与IL-10的结合是重要的。

作为另一种选择，本发明的抗体或片段仍然源自B-N10/BT-063抗体，并且可以包含B-N10/BT-063可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列和/或B-N10/BT-063可变重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，且在这些序列中可选地具有不会显著改变所述抗体或其片段的亲和力和/或特异性的变异。特别地，与包含鼠B-N10抗体或BT-063(变体hVH26/hVL7)抗体的CDR的抗体或片段的亲和力或特异性相比，序列中的所述变异不会降低所述抗体或片段对IL-10的亲和力或特异性。

在具体实施方式中，本发明提供了包含B-N10/BT-063可变轻链和/或重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的人源化或嵌合的抗体或其片段。更优选地，本发明提供了人源化或嵌合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含鼠抗体B-N10的可变域的氨基酸序列，如图1所示。最优选地，所述抗体或片段包含BT-063的可变域的氨基酸序列(SEQ ID No:69和SEQ ID No:70)中的一个或两个。

通常，本发明的抗体还包含人恒定区(Fc)。这可以选自来自任何类型的免疫球蛋白(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE以及包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4在内的任何同种型)的恒定区。优选的恒定区选自IgG、特别是IgG1的恒定区。

其它产物

本发明还提供了编码上述抗体或抗体片段的核酸序列。所述核酸序列可以为DNA或RNA，但优选DNA。所述序列可以用在表达盒或载体中，且特别可用于制备本文所公开的抗体及其片段。

本发明还提供了用这些多核苷酸、表达盒或载体转化的宿主细胞。合适的宿主细胞可以为原核细胞和真核细胞。

作为另一种选择，所述宿主细胞可以为通过将产生本发明的抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合而获得的杂交瘤。

上述宿主细胞可以用于制备抗体或其片段的方法中。特别地，此类方法可以包括在允许抗体或其片段表达的条件下在合适的培养基中培养宿主细胞并从所述培养基中分离所述抗体或片段的步骤。这类型的方法在本领域中公知且有所描述。

医学用途

本文所述的抗体及其片段可应用于治疗由IL-10水平或活性升高所介导的疾病或医学状况。结果，本发明提供了一种治疗或预防受试对象中的医学状况的方法，其中所述医学状况由IL-10水平或活性升高所介导，所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的抗体或其片段。

特别地，由IL-10水平或活性升高所介导的所述医学状况是SLE。因此，本发明还提供了用于SLE的治疗的本文所述的抗体或其片段。

其它实例为血小板减少性紫癜、狼疮肾炎、HIV、hCMV和丙型肝炎。另一个实例是通过直接支持增殖或抑制免疫响应而对依赖于IL-10的肿瘤细胞的治疗。

本发明的另一个实施方式是包含上文所述的抗体或其片段以及药物可接受载剂或稀释剂的药物组合物。在一个实施方式中，所述组合物包含偶联有抗体或其片段的脂质体。

此类组合物可以通过胃肠外、静脉内或皮下对患者施用。优选地，在SLE治疗中，抗体或其片段通过静脉内或皮下施用。

所述抗体或其片段特别可用于治疗疾病，其原因在于，由于其不会导致促炎性细胞因子水平的显著增加，它们无需共施用皮质激素以避免对于患者将无法耐受的“细胞因子风暴(cytokine storm)”。

因此，在一个特定方面，本发明提供了用于治疗或预防受试对象中的医学状况的方法，其中所述医学状况由IL-10的水平或活性升高所介导，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的本文所述的抗体或其片段，其中所述受试对象未同时或另行接受皮质激素治疗，即所述患者是没有在同时接受皮质激素治疗的患者。在该优选方面的实施方式中，由IL-10水平或活性升高所介导的医学状况是SLE。

皮质激素目前在许多患者中被用来治疗SLE。然而，本发明的该方面在其中施用皮质激素不再理想的患者的治疗中具有特殊功用。

非医学用途

本发明还提供了经标记的人源化的或嵌合的抗体或其片段，其包含本文所述的抗体或其片段和标签。所述标签可以为本领域内已知的用于检测样品中抗体的存在的任何合适类型的标签。特别地，所述标签为荧光标签。

标记的或未经标记的抗体、特别是经标记的抗体在检测样品中是否存在抗体的体外方法中具有特定功用。所述方法可以包括以下步骤：使未经标记的或经标记的抗体或其片段与样品接触，洗涤样品以除去未与样品结合的抗体及其片段(即未结合的抗体或抗体片段)，和检测样品中是否存在所述抗体(或片段)(例如经由所述标签进行检测)。

作为另一种选择，未经标记的抗体或片段可以在中和样品中IL-10的体外方法中使用。此类方法包括使样品与抗体或其片段接触以使所述抗体或其片段与IL-10结合的步骤。

现在将结合以下具体实施方式对本发明进行描述。

实施例

实施例1.鼠抗IL-10抗体B-N10的表征

1.1编码B-N10可变抗体域的DNA的分离

为鉴定鼠BN-10的可变序列，使用了细胞沉淀。将样品(3×B-N10,传代3,1×10⁷个细胞)储存在-80℃，直至将mRNA从细胞中分离，并且在cDNA合成后，通过PCR扩增B-N10的可变序列，然后进行克隆。

对于可变轻链和可变重链，对总共14个克隆体进行测序(SEQ Laboratories,

)和分析。明确确定了B-N10的可变序列。偏差仅出现在N端引物区中(见表1)。在可变重链的情形中，序列变体QVQLKQ(SEQ ID No:59)在引物区出现9次，但其它变异仅出现一次或两次。选择该变体用于进行亚克隆。在可变轻链的情形中，两种变体以相等比例存在。在所述序列与鼠种系序列进行比较后，仅具有3个突变的cr1序列展示出与所鉴定的VL序列很大的同源性。这意味着DVLMTQ(SEQ ID No:60)序列最有可能是正确的序列。序列DIVMTQ(SEQ ID No:61)是典型的另一类种系序列并因此被排除。

表1.经测序的B-N10可变轻链和重链的N端序列变体的出现(所选序列以粗体表示)

可变轻链VL和可变重链VH的蛋白序列分别如图1A和1B中所示。超变互补决定区(CDR)经下划线示出。对应的DNA序列分别如图2A和2B所示。

实施例2.嵌合B-N10抗体的产生

将来自实施例1的经鉴定的抗体重链和轻链的可变序列克隆至用于表达重组抗体的载体系统中。第一步为将序列克隆至BS先导序列内；N端添加分泌信号并在C端添加剪接供体序列。第二步是将这些序列分别克隆至包含恒定人κ链和恒定人γ-1链的表达载体内。制备轻链用载体和重链用载体，然后通过磷酸钙沉积或通过脂质转染瞬时共转染至COS-7细胞内。2天后收集细胞培养上清液。在COS-7细胞中表达嵌合B-N10并检测上清液中的抗体滴度(夹心ELISA)后，在ELISA中测试其对人白细胞介素10的特异性结合能力(R&D Systems,目录号217-IL/CF,批号ET114021,储存于-20℃)。

关于夹心ELISA，将小鼠抗人κ链抗体(Becton Dickinson)作为捕捉抗体(catcherantibody)结合于板表面，然后与细胞培养物上清液温育，用POD缀合的兔抗人IgG(H+L)抗体(Dianova)检测嵌合抗体的存在。使用限定浓度的嵌合对照抗体(0.125μg/mL～12μg/mL)作为阳性对照。

对于抗原ELISA，将人IL-10以0.5μg/mL～5μg/mL的浓度结合在板表面。与细胞培养物上清液(未经稀释的和1:5稀释的)温育后，用POD缀合的兔抗人IgG(H+L)抗体(Dianova)检测嵌合B-N10的结合。使用鼠B-N10作为阳性对照。抗体以0.5μg/mL～5μg/mL的浓度使用并用POD缀合的兔抗小鼠IgG/IgM抗体(Dako)对结合进行检测。

ELISA的结果在实施例3中讨论。

实施例3.抗IL-10抗体的人源化

减少啮齿类抗体在人类中的免疫原性的初始工作涉及通过以人抗体恒定域替换啮齿类抗体恒定域而产生嵌合抗体。由于可变域内的啮齿类框架区可能仍旧会诱导免疫响应，因而开发了更为先进的CDR移植方法，这意味着将抗原结合序列(互补决定区，CDR)转移至完全是人类的抗体框架上(人源化)。通常，选择与鼠供体抗体最为近似的人类接受框架，以增加在人源化过程中恢复原始抗原特异性和亲和力的可能性。可以使用以下不同方法或将所述方法组合以改善上述过程：利用人抗体种系序列、所表达抗体的共有序列、分析CDR环结构和抗体/抗原复合物的X射线结构。通常，以这种方式产生数种人源化抗体变体，并随后就其生物学效应进行分析，所述生物学效应相互不同并且与原始抗体有差异。最后，根据所需的抗体功能，可选择合适的人恒定区。

3.1B-N10鼠可变序列与人序列之间的序列比较以及人源化VL(hVL)和VH(hVH)序列组的设计

选择鼠抗IL-10抗体B-N10(Llorente等，Eur.Cytokine Netw.1993年11月-12月;4(6):421-7；和Llorente等，Arthritis Rheum.2000年8月;43(8):1790-80)。获取人源化抗体的方法基于CDR移植程序，其中将互补决定区(CDR)与人接受区融合。

人接受框架的选择基于对三组数据的组合分析：

1.鼠序列与人类种系序列的同源性，以使体突变的风险最小化；

2.对鼠序列与人共有序列的比较，以鉴定非共有氨基酸残基；和

3.对CDR序列的标准结构类型的鉴定，以获得关于重要结构性框架氨基酸残基的信息。

B-N10的鼠可变轻链显示出与人类种系可变片段2-30*01(A17(SEQ ID No:14))以及与连接片段JK1(SEQ ID No:15)具有最高同源性。与B-N10具有最高同源性的人共有序列是HuKII。可变轻链的互补决定区(CDR)在L1的情形中可以被分为类别4，而在L2和L3的情形中可被分为类别1。鉴定了关键氨基酸残基。

对具有类别4-1-1的标准结构的小鼠CDR和人种系VL基因的序列比较揭示出与2-30*01具有最高同源性(最低数目的不匹配氨基酸)。

B-N10的鼠可变重链显示出与人类种系可变片段VH3-33以及与连接片段JH4(SEQ ID No:17)具有最高同源性。与B-N10具有最高同源性的人共有序列是HuHIII。可变重链的互补决定区(CDR)在H1和H2的情形中可以被分为类别1。鉴定了关键氨基酸残基。对具有类别1-1的标准结构的小鼠CDR和人种系VH基因的序列比较揭示出与3-66*04(SEQ ID No:16)具有最高同源性(最低数目的不匹配氨基酸)。因此，也将种系序列VH3-66考虑在内。

考虑到所有获得的数据以设计一组不同的人源化可变轻链(12个变体)和可变重链(29个变体)的可变序列。

3.2小文库的构建和人源化hIL-10结合抗体片段的选择

为了产生可能的hIL-10结合抗体片段文库以获得最佳的人IL-10结合抗体，在考虑到真核细胞的密码子使用的情况下，产生了编码12种hVL和29种hVH片段的cDNA序列，如图3所示。

随后，将所获的cDNA克隆至克隆载体并在SEQ实验室(德国)进行测序。以如下方式构建文库：将12种编码hVL片段的cDNA的每一种与29种编码hVH片段的cDNA组合，从而产生348种可能表达的抗体片段。

在细菌表达和以人IL-10(R&D Systems,目录号217-IL/CF)进行的两轮选择后，通过ELISA分析所述抗体片段对于hIL-10(与选择所用相同)的结合。简言之，将Maxisorb板(Nunc,德国)以1μg/ml hIL-10的PBS溶液在4℃包被过夜。在对板进行封闭和洗涤后，添加产生抗体片段的细菌的上清液。为检测结合的人源化抗体片段，使用POD缀合的二抗。

对良好结合物的编码序列进行分析，并列出经鉴定的hVL片段和hVH片段的出现情况(表2)。

表2.与hIL-10结合的抗体片段中存在的VL和VH片段的出现情况

以粗体标记的序列被选择用于亚克隆至适当的真核表达载体，以在整个抗体的情况下分析结合性质。括号中所示序列被选择用于亚克隆至表达载体，但该程序仅产生缺陷性构建体。

3.3用于所选的人源化BT-063轻链和重链变体的表达载体的产生

基于通过筛选方法确定的统计信息，选择了一组BT-063的人源化VL变体和人源化VH变体以克隆至表达载体中。在第一步中，将编码人源化VL和VH变体的cDNA转移至合适的表达载体内以便使编码分泌信号5’和剪接供体序列3’的序列与所克隆的cDNA融合。在第二和最终亚克隆步骤中，分别将这些cDNA构建体转移至编码人恒定κ链和人恒定γ-1链的表达载体内。通过无内毒素Qiagen Midi-prep试剂盒(Qiagen,德国)来制备独立获得的含hVL和hVH表达载体的质粒。

3.4选定的人源化BT-063变体在COS-7细胞中的瞬时表达以及结合hIL-10的抗体比较

为进行人源化抗体变体在COS-7细胞中的瞬时表达，将各个选定的人源化VL变体(hVL7和hVL8)与各个选定的人源化VH变体(hVH1、hVH9、hVH13、hVH18、hVH20、hVH26、hVH28)组合，从而产生14种不同的人源化抗体。

简言之，以24孔形式在含10% FCS的DMEM中通过磷酸钙沉积将编码轻链和编码重链的表达载体瞬时共转染至COS-7细胞内。转染后，将培养基用无血清培养基CHO-S-SFM II(Invitrogen,德国)替换，并在转染后2至3日收集COS-7细胞的上清液。通过夹心ELISA分析分泌至转染的COS-7细胞的上清液中的人源化抗体的抗体滴度。基于所确定的抗体浓度，将所有样品的上清液调节至相同的抗体浓度，并将所有样品用于分析在抗原ELISA中与人IL-10的结合，所述抗原ELISA用2μg/mlhIL-10的PBS溶液包被Maxisorb板(Nunc,德国)。

如图4所示，所有所分析的变体均与hIL-10结合，然而具有不同的结合性质。显著的是，采用BT-063变体hVH20/hVL7、hVH26/hVL7和hVH20/hVL8获得了在抗原ELISA中最高的信号，所述变体显示出与采用嵌合的B-N10抗体所获得的信号强度相当的信号强度。在这三种抗体中，作为定量夹心ELISA的结果，信号强度的变化(hVH20/hVL8具有更高的信号，而hVH20/hVL7和hVH26/hVL7具有较低的信号)可能是因不同的抗体浓度所致(见上)。所研究的所有其它变体产生与嵌合的B-N10抗体相比相当弱的信号。

3.5嵌合和人源化的抗体变体的制备和亲和纯化

在COS-7细胞中制备所选定的人源化BT-063变体(hVH20/hVL7、hVH20/hVL8、hVH26/hVL7)和嵌合的cB-N10(如实施例2中所讨论)。

如3.4节中所述进行瞬时表达，其中使用10cm组织板。在转染后5日收集各个变体的约0.5L无血清上清液。

通过蛋白A亲和色谱从无血清上清液中纯化抗体。在2M NaCl存在的情况下加载上清液。通过0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0)将抗体洗脱，并分级至含2M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)的试管中。通过使用30kDa截留的膜进行离心，进行了对PBS的缓冲液交换以及各个抗体探针的浓缩。通过在抗原ELISA、非还原性和还原性条件下的SDS-PAGE以及在260nm和280nm的UV测定来检验纯化材料的品质。

根据实施例2中的上述方法通过ELISA检测纯化的嵌合B-N10和人源化变体对hIL-10的结合。包被hIL10，并测定变体cB-N10、BT-063-1(hVH20/hVL7)、BT-063-2(hVH20/hVL8)和BT-063-3(hVH26/hVL7)的抗体结合。结果如图5所示。

对于嵌合B-N10和hVH20/hVL7变体而言信号强度相当，而变体hVH20/hVL8和hVH26/hVL7的信号强度略低。

3.6通过Biacore人IL-10进行的亲和力确定

使用BIACORE 2000(Biacore AB,Uppsala,瑞典)利用表面等离子共振分析来测定不同抗体(鼠抗体、嵌合抗体、3个人源化变体)对hIL-10的结合的结合速率常数和解离速率常数。根据制造商的条件将hIL-10固定在CM-5传感器芯片上。通过以5μl/分钟的流速添加50μl的20μg/ml等分试样来固定hIL-10，从而产生320RU的固定密度。通过以50μl/分钟的流速使用0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.2)和0.01M HCl/1M NaCl各1分钟，在两步循环中使固定的hIL-10表面再生。在20μg/ml～0.15μg/ml的抗体浓度范围内对每个抗体样品分析至少4次。使用BIA评估第3版(1999)软件从传感图谱(sensogram)进行计算。

表3总结了所有Biacore测量的结果。所有变体与hIL-10结合相当。然而，可以检测到细微差异。结果，小鼠单克隆抗体B-N10、嵌合cB-N10以及人源化变体BT-063-1(hVH20/hVL7)以相当的亲和力结合，而其它两种人源化变体BT-063-2(hVH20/hVL8)和BT-063-3(hVH26/hVL7)显示出降低的亲和力(与鼠B-N10相比约为三分之一)。还可以检测到在结合速率和解离速率的细微差异。

表3.Biacore测定结果

n=个体测量次数；ka=结合速率；kd=解离速率；KD=解离常数

抗体变体	n	ka[1/Ms]	kd[1/s]	KD[M]±SD
					B-N10	6	4.43 E6	2.05 E-3	1.07 E-9±3.11 E-10
cB-N10	4	6.23 E5	8.48 E-4	1.37 E-9±2.42 E-10
					BT-063-1	6	1.21 E6	1.03 E-3	1.22 E-9±1.44 E-10
BT-063-2	4	1.21 E6	1.64 E-3	2.81 E-9±1.03 E-9
					BT-063-3	5	1.07 E6	2.66 E-3	2.91 E-9±8.07 E-10

食蟹猴IL-10

使用Biacore T100(Biacore AB,Uppsala,瑞典)通过另外的表面等离子共振实验来分析BT-63变体3(hVH26/hVL7)与食蟹猴IL-10的亲和力。

将BT-063在10mM乙酸盐(pH5.5)中稀释至5μg/mL，并使用胺偶联程序将其固定化，以获得约1000RU的最终水平。通过注入10mM甘氨酸-HCl(pH 1.8)30秒来获得传感器芯片表面的再生。将样品以不同浓度注射在流动室以及参照室之上。从通过检测器流动室获得的信号中减去通过参照室获得的信号，并使用1:1的Langmuir结合模型来评估所得的结合曲线。获得浓度依赖性结合曲线，并对食蟹猴IL-10计算出194pM的平均KD。作为阳性对照，分析了rhIL-10并得到4.6nM的KD。结果总结在表4中。

表4.采用BT-063的Biacore测定结果

(rhIL-10:重组人IL-10;rCIL-10:重组食蟹猴IL-10;

ka=结合速率；kd=解离速率；KD=解离常数)

分析物	测试编号	ka[1/Ms]	kd[1/s]	KD[M]
					rhIL-10	1	6.0 E5	0.3 E-2	4.6 E-9
rCIL-10	1	6.2 E7	1.2 E-2	0.196 E-9
					rCIL-10	2	8.6 E7	1.7 E-2	0.195 E-9
rCIL-10	3	9.7 E7	1.8 E-2	0.191 E-9

实施例4.在体外的抗IL10抗体的活性

为确认BT-063的效力，检验了对外周血单个核细胞(PBMC)中IL-6释放的阻断。PBMC在受到脂多糖(LPS)刺激时释放白细胞介素-6(IL-6)。白细胞介素-10(IL-10)的生理活性是抑制细胞因子(例如，IL-6)的分泌。因此，向经LPS刺激的细胞添加IL-10会抑制IL-6分泌，从而导致细胞培养基中存在的IL-6的显著减少。然而，作为向细胞培养物添加BT-063的后果，IL-10被结合并因此无法与细胞表面上的受体结合。IL-10的抑制效果得到补偿，并且IL-6分泌恢复，从而在培养基中产生IL-6。

通过Ficoll梯度从人血分离PBMC。分离的细胞以1×10⁶个细胞/ml接种并用LPS刺激以进行IL-6分泌，而IL-6分泌受到添加IL-10的抑制。IL-10的抑制效果被BT-063的添加中和，由此重新形成了IL-6的分泌。根据所添加BT-063的目的(参照或低、高品质对照样品)，使用了不同滴定浓度的BT-063，从而产生IL-6的浓度依赖性分泌，所述分泌在细胞培养物的上清液中检出。

表5.依赖于参照标准物的滴定而分别来自双重确定和IL-6重新形成的IL-6水平的平均值

如表5所示，分泌的IL-6的量与BT-063浓度直接相关。BT-063浓度越高，越多IL-6从PBMC分泌出并因此存在于上清液中。当与阳性对照(未与IL-10温育的受刺激的PBMC)比较时，将细胞与40μg/mL BT-063温育导致约73%的IL-6分泌的重新形成，而用0.988μg/mL BT-063(滴定的最后一步)仅在培养基中检测到17.5%的IL-6水平。

实施例5.B-N10和BT-063对人全血培养物中的细胞因子合成/水平的不同效果

通过对人全血培养物中实验诱导的细胞因子合成的药物依赖性调节来评估BT-063(变体hVH26/hVL7)的免疫药理学概况。采用这种方法可以确定BT-063对免疫细胞活性的直接和间接影响。将BT-063活性与B-N10的效果进行比较。

所述测试利用来自健康志愿者和SLE患者的全血培养物，在BT-063或B-N10存在下对全血培养物进行细胞因子释放的分析。在分别与抗体B-N10或BT-063温育后的静止状态(resting state)中，测定全血培养物中的免疫细胞的细胞因子释放。其中包括将来自健康志愿者的白细胞以及来自罹患系统性红斑狼疮(SLE)的患者的细胞。

下文所述实验所用细胞通过对志愿者或SLE患者的简单取血获得，而其分别与BT-063或B-N10在微培养板中温育2天。

这些实验中测定的介导物主要为与例如Th-1激活、Th-2激活或单核细胞/巨噬细胞激活相关的细胞因子和趋化因子，如干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-12、IL-4、IL-8或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。培养物上清液中的每个待测参数的浓度用基于多参数珠的读出系统(基于Luminex^TM的技术，称为多分析物图或MAP，基于测试规则类药物学(RBM)(Austin,Texas,USA))进行确定。这些测试由EDIGmbH(Reutlingen，德国)进行。Luminex^TM技术的工作方式类似于ELISA和流式细胞术的结合，对每种分析物进行100个珠的计数，从而由100个个体测试的平均荧光强度中反算个体的浓度。

仅在抗体浓度为50μg/ml时，观察到了对细胞因子释放的诱导。

在与B-N10或BT-063温育的来自健康供体和来自SLE患者的细胞培养物中测定的绝对细胞因子水平总结在下表6和7中。

健康志愿者

在未经刺激的培养物中以50μg/ml诱导

表6.健康供体的全血培养物中由B-N10或BT-063差异性调节的细胞因子的总结。在以50μg/ml抗体浓度温育后释放的细胞因子绝对值+/-SD(对IL1α和MMP-2以ng/ml计，对于所有其它细胞因子以pg/ml计)。

表7.SLE患者的全血培养物中由B-N10或BT-063差异性调节的细胞因子(绝对值)的总结。在以50μg/ml抗体浓度温育后释放的细胞因子绝对值(对IL1α和MMP-2以ng/ml计，对于所有其它细胞因子以pg/ml计)。

图6A和6B、7A和7B、8A和8B以及9A和9B显示了在非刺激条件下对来自健康志愿者和SLE患者的人全血培养物中的促炎性细胞因子的差异性调节。这些图显示，与BT-063相比，以B-N10(50μg/ml)温育后健康志愿者和SLE患者的全血培养物展示出更高的TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ释放。注意到IL-6除促炎性功能以外还额外充当使B细胞分化为血浆细胞的因子。

显然，从这些结果可以看出，与BT-063相比，B-N10与健康供体和SLE供体的培养物温育可以使IL-10和促炎性细胞因子以更高的程度上调，表明具有更好的安全性曲线。这作为人源化程序的结果出乎意料。

实施例6.X射线晶体学

6.1与人IL-10复合的BT-063 Fab的结晶

根据已公开的结构数据(Zdanov等，Structure，第3卷，1995，第591页)设计了数种IL-10构建体，并通过标准程序克隆至载体中以用于在大肠杆菌中异源表达。根据标准规程进行所克隆构建体的测试表达，且其显示出IL-10的高度过表达，这由在约18kDa的预期范围内的条带的增加所表明。

在优化条件下表达的IL-10蛋白产生了能够进行后续蛋白纯化的量。在重新折叠后，所述蛋白通过固定亲和色谱、尺寸排阻色谱和离子交换色谱纯化，以产生通过考马斯染色的SDS-PAGE判定具有超过95%均一性的蛋白。纯化蛋白的产量约为0.3mg/L表达培养物，这足以用于结晶试验。

使用木瓜蛋白酶从完整抗体上切下BT-063(变体hVH26/hVL7)的Fab片段，并通过蛋白A纯化。随后，将Fab片段进一步通过尺寸排阻色谱纯化。

通过将纯化蛋白与摩尔过量的IL-10混合来形成IL-10:BT-063 Fab复合物，进而通过尺寸排阻色谱纯化。保留体积与复合物的尺寸相一致。

随后将蛋白浓缩至适于结晶的浓度。

IL-10:BT-063 Fab复合物的晶体通过共结晶法制备。

6.2数据采集和处理

将晶体快速冷冻并在100K的温度进行测量。于SWISS LIGHT SOURCE(SLS,Villigen,瑞士)使用冷冻条件从IL-10与BT-063的Fab片段的共结晶晶体采集X射线衍射数据。

该晶体属于P6空间群，且在不对称单元中具有两个复合物。使用程序XDS和XSCALE处理数据。数据采集统计总结在表8中。

6.3结构建模和精细化

通过分子置换获得确定和分析结构所必需的相信息。将已发表的IL-10和Fab片段的模型用作搜索模型。随后的模型建立和精细化根据标准规程采用软件包CCP4和COOT进行。对于自由R因子(一种交叉验证最终模型的正确性的量度)的计算，从精细化步骤中排除了4.2%的测定反射(见表9)。

纳米抗体(nanobody)参数化采用程序CHEMSKETCH进行。LIBCHECK(CCP4)被用于产生对应的文库文件。

采用COOT的“Find water…”算法，通过将水分子置于3.0σ等高的Fo-Fc图谱的波峰中随后用REFMAC5精细化并用COOT检验工具检查所有的水，从而建立水模型。疑似水列表的标准为：B因子大于80、2Fo-Fc图谱小于1.2σ、与最近的接触点的距离小于或大于

手动检查疑似水分子和活性位点中的水分子(与抑制剂的距离小于)。将处于Fo-Fc图谱(于-3.0σ处等高)中的负峰处的侧链的占据设定为0，并随后如果在下一次精细化循环后出现正峰时则设定为0.5。

最终模型的Ramachandran图显示，所有残基中的80.8%处在最有利区域，17.9%处于额外容许区，0.7%的残基处于宽泛容许区。残基Val86(A)、His14(B)、Asp86(B)、Ser131(C)、Val56(D)和Val56(F)见于Ramachandran图的非容许区(表9)。其由电子密度图谱所证实，或无法在另一个合理构象中建模。最终结构和精细化过程的统计列于表9中。

6.4X射线结构分析

在

的分辨率分析由BT-063 Fab抗体片段结合的人IL-10的复合物结构，且揭示出所述Fab抗体片段的详细结合模式。

所获得的电子密度显示出Fab片段的清楚的结合模式，包括Fab片段的方向和构象。空间群P6的晶体在不对称单元中含有两个复合物。

与Fab复合的人IL-10的结构如图6所示。两个Fab片段以其CDR环与各个IL-10同源二聚体结合。

在CDR环附近最大距离

以内，可以发现IL-10(分子A和B)的以下残基：Arg27、Lys34、Gln38、Met39、Asp41、Gln42、Asp44、Leu46、Glu50、Leu53、Glu142、Asp144、Ile145、Asn148、Tyr149、Glu151和Thr155。

在IL-10附近最大距离

以内，可以发现CDR环的以下残基：Phe27、Ser28、Ala30、Thr31、Tyr32、Trp52、Arg53、Gly54、Ser56、Asn73、Ser74、Tyr100、Gly101、Tyr103(分子C和E)、Ser32、Asn33、Asn35、Tyr37、Lys55(分子D和F)。

通过将IL-10:BT-063的复合结构与公开的IL-10:IL-10R1受体复合物的结构重叠显示，在IL-10表面上BT-063的结合位点与IL-10受体的结合位点重合(图7)。

由X射线分析所鉴定出的与人IL-10接触的BT-063氨基酸残基在如下所示的BT-063抗体可变域的线性氨基酸序列上突出显示。

BT-063 VL

DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSQNIV H LEW YLQRPGQSPR

LLIY

VSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCFQGSHVP

WTFGQGTKVE IK(SEQ ID No:69)

BT-063 VH:

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASG

VHWVRQS PGKGLEWLGV

I

TDYS AAFMSRLTIS KD

KNTVYL QMNSLRAEDT AVYFCAKQA

YWGQG TSVTVSS(SEQ ID No:70)

CDR区域(Honegger和Plückthun(2001)J.Mol.Biol.,309,657-670)由下划线示出(轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别为SEQ ID No:71、72和73；重链的CDR1、CDR2和CDR3分别为SEQ ID No:74、75和76)。与IL-10接触的残基以粗体示出。

在轻链内，接触残基见于CDR1和CDR2中但未见于CDR3中。至于重链，所有三个CDR的残基均参与抗原结合。FR3的两个残基(Asn73和Ser74)也有助于抗原结合。

CDR1开端处的Ser28和Ala30是鼠VH前驱序列(BN-10)的一部分且未出现在所选的人类框架中(3-66*04)。这两个位置较少参与抗原结合，且在人源化过程中作为替代性氨基酸引入。

残基Asn73和Ser74见于鼠中，且频繁见于人抗体框架序列中，但其通常不参与抗原结合(www.bioc.uzh.ch/antibody;Honegger和Plückthun，2001)。其对抗原结合的贡献令人意外。

参与BT-063结合的IL-10氨基酸残基如下所示。此外还示出了参与结合高亲和力IL-10受体链(IL-10R1)和低亲和力受体链(IL-10R2)的的IL-10残基。两个受体链均参与IL-10同源二聚体的结合，且是信号转导所必需的。在序列A中，与BT-063接触的残基以粗体显示。在序列B中，与IL-10R1接触的残基以粗体标出，与IL-10R2接触的残基以斜体和下划线标出，而IL-10R1和IL-10R2共有的接触残基以粗体、斜体和下划线标出(Pletnev等，2005)。

A

SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLDAF SRV

TFF

KL

N

LLK

SL

EDFKGYL

GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA ENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA

VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM S

F

FI

I

AYM

MKIRN(SEQ ID NO：1)

B

SPGQGTQSEN SCTHF

G

L

ML

DLAFS

VKTFF

MK D

LDNLLLKE SLLEDFKGYL

GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA

NQDPDIK

VSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA

VEQVKNAFNK LQEKGIYAM

EF

IFINYI

AYMTMK

RN(SEQ ID NO：1)

可以看出，BT-063与IL-10的不连续表位结合，所述不连续表位包含螺旋A的残基(Arg27、Lys34、Gln38、Met39、Asp41)和螺旋B的N端部分(Glu50和Leu53)，所述螺旋B的N端部分包括一个IL单体的连接环序列(Glu42、Asp44、Leu46)以及第二IL-10单体的螺旋F’的残基(Glu142、Asp144、Ile145、Asn148、Tyr149、Glu151、Thr155)。

实施例7.在食蟹猴中的体内单剂量毒性研究

在食蟹猴中于单次静脉注射BT-063(变体hVH26/hVL7)后进行包括安全药理学参数在内的单剂量毒性研究。以4只动物/性别/组将动物分为4组(安慰剂组、1mg/kg组、7mg/kg组和50mg/kg组)。于第1日静脉注射BT-063。5日后对一半动物进行尸检，而剩余动物于第28日处死。

该研究中的低剂量水平1mg/kg对应于约300μg/kg的人等效剂量，从而对应于18mg的总人体剂量(60kg体重)。在研究者启动的小型试验中(Llorente,2000)，将类似剂量的BT-063前体抗体B-N10应用21天。该抗体量已显示出药理学效果和临床效力。因此相应地选择低剂量水平。高剂量作为起始剂量的倍数(50μg)来选择。中间剂量是低剂量和高剂量的几何平均值。

在研究期间，没有观察到生理学或组织病理学参数的毒理性显著的或相关的变化。另外，据认为临床化学参数没有或几乎没有毒理学显著性。

实施例8.健康志愿者中的体内单剂量毒性研究

通过在健康志愿者中使用渐增剂量的抗体，进行研究以监测BT-063(变体hVH26/hVL7)的安全性和可耐受性以及BT-063施用的效果。在8个剂量组中，23个志愿者接受单次BT-063静脉施用。剂量组如下：0.175mg、0.75mg、3.5mg、7mg、15mg、30mg、60mg和100mg。每组3个志愿者，例外的是100mg剂量组有2个志愿者。

每个剂量用0.9%氯化钠注射液稀释至20ml的总体积。将剂量作为单次连续静脉输注液在2小时中施用。

在注射后85天的时段内对志愿者进行评估，并在该时段内的多个时间点取血。

细胞因子

在输注BT-063之前和之后，由取得的血浆对细胞因子IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10和TNFα的水平进行评估。

表10显示了从预计量和筛选值计算的IL-6、IL-8和IL-10正常值上限。

表10.健康志愿者中的细胞因子浓度

来自细胞因子测定的进一步的结果如图12和13所示。

在输注后24小时内出现了IL-6和IL-8的非剂量依赖性瞬时增加，在3日后返回给药前水平。这一效应据认为与输注事件而非抗体有关，这是因为不存在剂量关系且该效应已经在最低剂量发生。

令人惊讶的是，既然IL-10是重要的调节性细胞因子，但没有检测到IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5和TNFα水平的增加，如图12所示。IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-2水平没有上升也证实，没有由BT-063施用所致的T辅助细胞活化。此外，由于体温也是促炎性细胞因子大规模释放的指示，在受治疗志愿者中也测量了这一参数。然而，在施用后没有检测到体温的增加。

如图13所示，仅IL-10血浆浓度受BT-063施用的影响，且所检测到的血浆IL-10随着BT-063剂量的增加而增加。注意到所用测试检测到了游离IL-10和与BT-063结合的IL-10。对于该增加有两种可能解释：(1)IL-10的半衰期延长，且IL-10与BT-063的结合阻止了IL-10的内化，且同时IL-10没有从血液中清除(通常存在快速IL-10周转，分泌的IL-10的半衰期为约2.3小时～3.5小时(Huhn等，Blood(1996)1月15日:87(2):699-705))；和/或(2)负反馈环的诱导-由于BT-063对IL-10与其受体的结合的阻断，不可能存在IL-10的细胞摄取，从而触发B细胞产生更多的IL-10。本发明人认为情形(2)可能性更大，因为这经取自采用BT-063和鼠IL-10R敲除细胞的全血培养物实验的体外数据所证实。

药代动力学

药代动力学显示，BT-063的Cmax、AUC和半衰期处于预期理论值的范围内。BT-063的终末半衰期为15至30天。施用30mg以上的剂量后，在85天后仍可在血浆中检测到BT-063。

在受治疗的志愿者中没有观察到人抗人抗体(HAHA)，即使事实上采用其它细胞因子中和抗体(例如，采用阿达木单抗，一种人源化抗TNFα抗体)已观察到HAHA响应。

虽然在施用BT-063后所检测到的IL-10量增加，但是注意到本研究证明了即使大剂量的BT-063也具有安全性和可耐受性，因此可以得出：可以将足够剂量的BT-063(特别是在没有促炎性细胞因子水平的无法耐受性增加的情况下)安全施用于SLE患者以抵消过量IL-10的效应。

Claims (28)

1.一种人源化的或嵌合的抗体或其片段，所述抗体或其片段能够结合白细胞介素-10(IL-10)，其中能够将所述抗体或其片段施用于受试对象，而没有促炎性细胞因子水平的无法耐受的增加的情况。

2.如权利要求1所述的人源化的或嵌合的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段能够施用于受试对象，而没有大于2℃的体温增加的情况。

3.如权利要求1或权利要求2所述的人源化的或嵌合的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段能够施用于受试对象，而没有促炎性细胞因子增加大于正常上限(ULN)的500%的情况，其中所述促炎性细胞因子选自TNF-α、IFN-γ、IL-1β。

4.如权利要求3所述的人源化的或嵌合的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段能够施用于受试对象，而没有促炎性细胞因子增加大于正常上限(ULN)的300%的情况。

5.如前述权利要求中任一项所述的人源化的或嵌合的抗体或其片段，所述抗体或其片段能够在所述受试对象中诱导IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)。

6.如权利要求1所述的人源化的或嵌合的抗体或其片段，其中，所述抗体在与外周血单个核细胞(PBMC)在体外接触时不会引起释放自所述细胞的促炎性细胞因子水平的大于500%的增加。

7.如前述权利要求中任一项所述的人源化的或嵌合的抗体或其片段，其中，所述促炎性细胞因子是TNF-α、IFN-γ、IL-1β中的至少一种。

8.如权利要求1～7中任一项所述的人源化的或嵌合的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段源自鼠B-N10抗体。

9.如前述权利要求中任一项所述的人源化的或嵌合的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段包含与鼠抗体B-N10可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，和/或包含与鼠抗体B-N10可变重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。

10.如权利要求9所述的人源化的或嵌合的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段包含鼠抗体B-N10可变轻链和可变重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

11.如权利要求1～7中任一项所述的人源化的或嵌合的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段包含鼠抗体B-N10可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列和/或鼠抗体B-N10可变重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，并且在这些序列中可选地具有基本上不会改变所述人源化抗体或其片段的亲和力和/或特异性的变异。

12.如前述权利要求中任一项所述的人源化的或嵌合的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段包含鼠抗体B-N10可变轻链的氨基酸序列和/或鼠抗体B-N10可变重链的氨基酸序列。

13.一种核酸，所述核酸编码权利要求1～12中任一项所述的抗体或其片段。

14.一种载体，所述载体包含权利要求13所述的核酸。

15.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求13所述的核酸或权利要求14所述的载体。

16.一种制备权利要求1～12中任一项所述的抗体或其片段的方法，所述方法包括以下步骤：在允许所述抗体或其片段表达的条件下在培养基中培养权利要求15所述的宿主细胞，和从所述培养基中分离所述抗体或其片段。

17.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1～12中任一项所述的抗体或其片段，并且还包含药物可接受载剂。

18.一种治疗或预防受试对象中的医学状况的方法，其中，所述医学状况由IL-10的水平或活性升高而介导，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1～12中任一项所述的抗体或其片段。

19.一种治疗或预防受试对象中的医学状况的方法，其中，所述医学状况由IL-10的水平或活性升高而介导，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1～12中任一项所述的抗体或其片段，其中所述受试对象未同时或另行接受皮质激素治疗。

20.如权利要求18或权利要求19所述的治疗或预防受试对象中的医学状况的方法，其中，所述医学状况是系统性红斑狼疮(SLE)。

21.用于医学应用的权利要求1～12中任一项所述的抗体或其片段。

22.用于治疗患者的SLE应用的权利要求1～12中任一项所述的抗体或其片段。

23.如权利要求22所述的应用的抗体或其片段，其中，所述患者未同时或另行接受皮质激素治疗。

24.权利要求1～12中任一项所述的抗体或其片段在制备用于治疗患者的SLE的药物中的应用。

25.如权利要求24所述的应用，其中，所述患者未同时或另行接受皮质激素治疗。

26.一种经标记的抗体或其片段，其包含权利要求1～12中任一项所述的抗体或其片段以及标签。

27.一种中和样品中的IL-10的体外方法，所述方法包括下述步骤：使所述样品与权利要求1～12中任一项所述的抗体或其片段接触，以便将所述抗体或其片段与IL-10结合。

28.一种用于检测样品中是否存在IL-10的体外方法，所述方法包括以下步骤：使权利要求1～12中任一项或权利要求26所述的未经标记的或经标记的抗体或其片段与所述样品接触，洗涤以除去未与所述样品结合的抗体或抗体片段，和检测所述样品中是否存在所述抗体或其片段或者所述标签。

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