WO2020198831A1 - Peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de interleucina-10, composição farmacêutica e uso dos mesmos como imunomuduladores no tratamento de doenças autoimunes, inflamatórias ou alérgicas - Google Patents

Peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de interleucina-10, composição farmacêutica e uso dos mesmos como imunomuduladores no tratamento de doenças autoimunes, inflamatórias ou alérgicas Download PDF

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WO2020198831A1
WO2020198831A1 PCT/BR2020/050116 BR2020050116W WO2020198831A1 WO 2020198831 A1 WO2020198831 A1 WO 2020198831A1 BR 2020050116 W BR2020050116 W BR 2020050116W WO 2020198831 A1 WO2020198831 A1 WO 2020198831A1
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peptides
treatment
seq
cells
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PCT/BR2020/050116
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Luiz Ricardo Goulart Filho
Fatima D. FERREIRA-BRIZA
Emília Rezende VAZ
Galber Rodrigues ARAUJO
Carlos Ueira VIEIRA
Lorenz AGLAS
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Universidade Federal de Uberlândia
Cirino Alberto Goulart Eireli Epp (Biogenetics)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5428—IL-10
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the selection and characterization of synthetic peptides, which have affinity for receptors present in cells of the immune system, more particularly with affinity for the interleukin-10 receptor (IL-10). These receptors are known to play an important role in modulating the immune, inflammatory and allergic response.
  • the present invention also describes pharmaceutical compositions comprising at least one of these synthetic peptides and the use of these peptides to prepare drugs or immunogenic compositions for the treatment and / or prophylaxis of diseases where there is an immunological disorder, more particularly in which the diseases related to immunological disorder are: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune.
  • IL-10 is a pleiotropic regulatory cytokine produced by different types of cells: monocytes, T cells, macrophages, dendritic cells (CD), natural killer cells (NK) and B cells. Because it influences different cell types, IL -10 has been shown to be an important molecule associated with a wide range of diseases, disorders and conditions, including inflammatory and allergic conditions, disorders related to immunity and cancer, due to its ability to regulate the cellular and humoral immune response. So the understanding how IL-10 regulates different cell types is crucial for the development of new intervention strategies for the treatment of various pathologies.
  • patent application WO 2008/054585 describes the use of pegylated IL-10 to treat cancer.
  • Patent applications WO 2014/172392 and WO 2015/070060 also describe the use of modified, but particularly pegylated, IL-10 to treat cancer.
  • IL-10 binds to the IL-10 receptor (IL10R), thus activating the Jak1 / Tyk2 proteins.
  • STAT3 is the main protein expressed to negatively regulate the inflammatory response, leading to negative regulation of some cytokines, such as TNF-a and IL-6.
  • This regulatory process mediated by IL-10 is essential to understand how this cytokine controls the inflammatory response, activating one of the main molecular pathways for the resolution of inflammation and allergic response.
  • new strategies using the IL-10 molecule to modulate cytokine production have been used in humans to control inflammatory responses.
  • Recombinant IL-10 for example, has already been shown to be safe, well tolerated and effective in patients with Crohn's disease (Fedorak, R. N. et al. Gastroenterology 2000 Dec; 119 (6): 1473-82).
  • Patent application BR 102017010787-6 describes 101 synthetic peptides, selected by Phage Display, which have an affinity for the IL-10 receptor. Said patent application then describes the use of these synthesized peptide sequences in the treatment and monitoring of an inflammatory process, allergic diseases and autoimmune diseases.
  • Phage Display (PD) methodology may be a good option, as it allows us to select small molecules that can mimic specific amino acids of large proteins and induce the same or better response as expected with the natural molecule or in comparison with other recombinant molecules already described.
  • Peptides selected by PD have low toxicity and high receptor / protein affinity. This approach is used in order to obtain a specific immune response where the production of IL-10 is essential for the regulation of the inflammatory immune response.
  • this type of cell-specific immune modulation does not promote severe immune suppression as seen in commercially used anti-inflammatory drugs.
  • the present patent application aimed to select new peptides mimetic to IL-10, by PD technology, which had improved capacity to modulate the immune response, more particularly, to control inflammatory and allergic responses.
  • PD technology which had improved capacity to modulate the immune response, more particularly, to control inflammatory and allergic responses.
  • four (4) peptides were selected and their three-dimensional structures were predicted. The data obtained showed the ability of these synthesized peptides to decrease the allergic response and inhibit the inflammatory pathways in the tests performed, as well as their pharmaceutical potential in the control of inflammatory or autoimmune allergic diseases.
  • the present patent application describes synthetic peptides with affinity for the interleukin-10 receptor. These peptides were synthesized and their three-dimensional structures were predicted. They were all synthesized in in order to present Histidine as the first amino acid residue and a sequence of three Glycines and a Serine as the last four amino acid residues. Such peptides showed important activity on immunological modulatory and regulatory pathways. Therefore, they can be used in the treatment and / or prophylaxis of diseases related to immune disorders, such as: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune diseases.
  • One embodiment of the present application is the methods of treatment and / or prophylactic of diseases related to immunological disorder, in which the diseases related to immunological disorder are: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune, comprising administering in an individual a pharmaceutically effective dose of at least one of the synthetic peptides described
  • compositions comprising at least one of the synthetic peptides described herein, plus at least one pharmaceutically acceptable carrier, carrier and / or compound.
  • the Pharmaceutical Composition is for use in the treatment and / or prophylaxis of diseases related to immunological disorders, in which the diseases related to immunological disorders are: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune diseases.
  • Another embodiment of the present application is the use of synthetic peptides or pharmaceutical compositions described herein, for the preparation of a drug or immunogenic composition for use in the treatment and / or prophylaxis of diseases related to immunological disorder in which diseases related to immune disorders are: chronic inflammatory diseases or acute, allergic and / or autoimmune.
  • FIGURE 1A shows Pep's predicted three-dimensional structure
  • FIGURE 1 B shows Pep's predicted three-dimensional structure
  • FIGURE 1 C shows Pep's predicted three-dimensional structure
  • FIGURE 1 D shows Pep's predicted three-dimensional structure
  • FIGURE 1 E shows the aggregation behavior of Pep 1, Pep 2, Pep 3 and Pep 4 peptides in solution.
  • FIGURE 2A shows an analysis of NFkB expression after treatment with the synthesized peptides described here for 12 hours.
  • FIGURE 2B shows an analysis of NFkB expression after treatment with the synthesized peptides described here for 24 hours.
  • FIGURE 2C shows an analysis of NFkB expression after treatment with the synthesized peptides described here for 48 hours.
  • FIGURE 3A shows an analysis of NFkB expression, using an activation molecule, TNF-a, not only in the control, but after a pretreatment with the peptides synthesized for 12 hours.
  • FIGURE 3B shows an analysis of NFkB expression, using an activation molecule, TNF-a, not only in the control, but after a pretreatment with the peptides synthesized for 24 hours.
  • FIGURE 3C shows an analysis of NFkB expression, using an activation molecule, TNF-a, not only in the control, but after a pretreatment with the peptides synthesized for 48 hours.
  • FIGURE 4A shows an analysis of NFkB expression, when the cells were pretreated with TNF-a and the peptides were added later, after treating the cells for 12 hours.
  • FIGURE 4B shows an analysis of NFkB expression, when the cells were pretreated with TNF-a and the peptides were added later, after treatment of the cells for 24 hours.
  • FIGURE 4C shows an analysis of NFkB expression, when the cells were pretreated with TNF-a and the peptides were added later, after treatment of the cells for 48 hours.
  • FIGURE 5A shows an analysis of the IFN signaling pathway after treatment with the synthesized peptides described here for 12 hours.
  • FIGURE 5B shows an analysis of the IFN signaling pathway after treatment with the synthesized peptides described here for 24 hours.
  • FIGURE 5C shows an analysis of the IFN signaling pathway after treatment with the synthesized peptides described here for 48 hours.
  • FIGURE 6A shows an analysis of the IFN signaling pathway, when the cells were pretreated with IFN and the peptides were added later, after treating the cells for 12 hours.
  • FIGURE 6B shows an analysis of the IFN signaling pathway, when the cells were pretreated with IFN and the peptides were added later, after treating the cells for 24 hours.
  • FIGURE 6C shows an analysis of the IFN signaling pathway, when the cells were pretreated with IFN and the peptides were added later, after treating the cells for 48 hours.
  • FIGURE 7A shows the peptides' ability to reduce activation of the TLR4 signaling pathway after 12 hours of treatment with the synthesized peptides.
  • FIGURE 7B shows the ability of the peptides to reduce activation of the TLR4 signaling pathway, when cells were pretreated with lipopolysaccharides (LPS) and the synthesized peptides were added later, after 12 hours of treatment with the peptides .
  • LPS lipopolysaccharides
  • FIGURE 8A shows the effect of treatment with the synthesized peptides on reducing cell activation in CD11c + CD86 cells, after 24 hours of treatment.
  • FIGURE 8B shows the effect of treatment with the synthesized peptides on reducing cell activation in CD11c + CD40 + cells, after 24 hours of treatment.
  • FIGURE 9 shows the ability of the peptide synthesized Pep 1 to decrease the activation of dendritic cells, after 24 hours of treatment.
  • FIGURE 10A shows the effect of the peptide synthesized Pep 1 on IgE-mediated release.
  • FIGURE 10B shows the effect of rlL10 on IgE-mediated release.
  • FIGURE 11A shows the reduction in IL-6 levels when the cells were treated with Pep 1 followed by incubation with LPS (1 mg / ml) for 24 hours.
  • FIGURE 11 B shows the reduction in MCP-1 levels when the cells were treated with Pep 1 followed by incubation with LPS (1 mg / ml) for 24 hours.
  • FIGURE 11C shows the reduction in TNF-a levels when the cells were treated with Pep 1 followed by incubation with LPS (1 mg / ml) for 24 hours.
  • peptide 1 SEQ ID NO 2 01
  • peptide 2 Pep 2
  • peptide 3 Pep 3
  • peptide 4 Pep 4
  • Such peptides showed important activity on immunological modulatory and regulatory pathways. Therefore, they can be used in the treatment and / or prophylaxis of diseases related to immune disorders, such as: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune diseases.
  • peptides described in the present patent application were selected using the Phage Display (PD) methodology. They were obtained randomly after three rounds of selection using a PhD-7mer and PhD12 random peptide library. The selection was carried out using the cell line J774; for this, a competitive elution with rlL-10 (11-10 recombinant) was adopted to select peptides with affinity to the IL-10 receptor.
  • PD Phage Display
  • Peptide 1 (Pep 1), SEQ ID NO 2 01, has its three-dimensional structure, with disulfide bridges, predicted in Figure 1A.
  • Peptide 2 (Pep 2), SEQ ID NO 2 02, has its three-dimensional structure, without disulfide bridge, predicted in Figure 1 B.
  • Peptide 3 (Pep 3), SEQ ID NO 2 03, has its three-dimensional structure predicted in Figure 1C.
  • Peptide 4 (Pep 4), SEQ ID NO 2 04, has its three-dimensional structure predicted in Figure 1 D.
  • Pep 1 and Pep 2 were synthesized with an identity or similarity of at least 85% between them.
  • the amino acid residues in positions three (3) and eleven (11) were replaced from Serine in Pep 2 to Cysteine in Pep 1. Therefore, Pep 1 is the only peptide that was synthesized with a disulfide bridge, its three-dimensional structure being distinct from the structure of Pep 2 and more compact compared to Pep 3 and Pep 4.
  • the black sphere is representative of the C-alpha atom of the first residue, just for guidance, while the hydrophilic residues are in blue and the hydrophobic residues are in red.
  • Example 1 Treatment of reporter cells.
  • the cells were treated for 12, 24 and 48 hours with the peptides synthesized Pep 1, Pep 2, Pep 3 and Pep 4, in different concentrations, without activation molecules. Luciferase was then measured after 12 hours of treatment (Figure 2A), 24 hours of treatment (Figure 2B) and 48 hours of treatment ( Figure 2C). All concentrations of tested peptides were not able to induce any response. TNF-a (200 ng / mL) was used as a positive control.
  • the assay was then performed using TNF-a as an activation molecule not only in the control, but after a pretreatment with the peptides synthesized Pep 1, Pep 2, Pep 3 and Pep 4, in different concentrations.
  • Pretreatment with Pep 1 at all concentrations tested was able to decrease NFKB activation after 12, 24 and 48 hours (P ⁇ 0.0005) of stimulation with TNF-a ( Figure 3A, B and C).
  • Pretreatment with Pep 2 had the most statistically significant results at 100 mM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 0.5 pM and 0.1 pM, also decreasing NFKB activation (P ⁇ 0.0005) after 12, 24 and 48 hours ( Figure 3A, B and C).
  • the pretreatment with Pep 3 had the most statistically significant results at 0.05 pM (P ⁇ 0.05) reducing the activation of the pathway after 12 hours of treatment ( Figure 3A) and at 0.01 pM (P ⁇ 0, 05) after 48 hours ( Figure 3C).
  • the pretreatment with Pep 4 had the most statistically significant results at 0.05 pM, 0.01 pM and 0.005 pM, reducing the activation of the pathway after 48 hours of treatment (Figure 3 C).
  • the analysis of NFkB expression was performed in Jurkart-Dual reporter cells. The cells were treated for 1 hour with peptides and TNF-a (200 ng / ml) was added. Luciferase was measured after 12 hours of treatment (Figure 3 A) 24 hours of treatment ( Figure 3 B) and 48 hours of treatment ( Figure 3 C).
  • TNF-a 200ng / ml_
  • rll_-10 recombinant interlayer-10
  • the cells were treated for 1 hour with IFN-a (104 EU / ml) with subsequent addition of the peptides.
  • SEAP production was measured after (D) 12 hours of treatment (E) 24 hours of treatment and (F) 48 hours of treatment.
  • IFN-a (104 EU / mL) was used as positive control and rlL-10 (0.4 ng / mL) as negative control. * P ⁇ 0.05.
  • HEK cells were used to investigate the ability of peptides to reduce activation of the TLR4 signaling pathway after 12 hours of treatment.
  • Pretreatment with the peptides demonstrated that Pep 1 at 0.005 mM (P ⁇ 0.05); Pep 2 at 100 pM (P ⁇ 0.05), 0.1 pM (P ⁇ 0.0005); Pep 3 at 100 pM (P ⁇ 0.05) and Pep 4 at 100 pM (P ⁇ 0.05), 10 pM (P ⁇ 0.005), 5 pM (p ⁇ 0.05) and 1 pM (P ⁇ 0 , 05) more significantly reduced the activation of the pathway (Figure 7A).
  • Example 2 Effect of peptides on dendritic and T cells in an inflammatory and alleric environment
  • Murine bone marrow dendritic cells were isolated from mice to analyze the effect of the peptides synthesized Pep 1, Pep 2, Pep 3 and Pep 4, in two concentrations, 1 mM and 10 pM, in the reduction of cellular activation. After 24 hours of treatment with a composition comprising at least one of the peptides in the desired concentration, cell analysis showed that all four synthesized peptides showed responses at different levels and were able to interfere with the co-stimulatory molecules present on the surface of dendritic cells, being Pep 1 and 2 peptides showed the best response.
  • Pep 1 at 1 pM decreased CD86 + expression (P ⁇ 0.005), and at 10 pM also decreased CD86 + expression (P ⁇ 0.05).
  • Pep 2 at 1 pM reduced the expression of CD86 + and CD40 + on the cell surface (P ⁇ 0.005; P ⁇ 0.05, respectively) ( Figure 8 A and B).
  • CD1 1c + CD86 cells Figures 8A
  • CD1 1c + CD40 + cells Figures 8B
  • LPS 100ng / mL
  • Pep1 (1 mM, 10 pM and 100 pM, 1 pM P ⁇ 0.05 and 10 pM and 100 pM P ⁇ 0.0005) significantly reduced IL-6 levels (1 pM and 10 pM, P ⁇ 0.05) ( Figure 11A); MCP-1 ( Figure 11 B) and TNF-a (1 pM, 10 pM and 100 pM, P ⁇ 0.005) ( Figure 11C). Each decrease was significant compared to cells treated with LPS only (positive control). * P ⁇ 0.05; ** P ⁇ 0.005; *** P ⁇ 0.0005
  • the cytokine IL-10 binds to IL-10R, thus activating the JAK / STAT20 signaling; this pathway has a major mechanism for the production of cytokines capable of controlling an inflammatory response.
  • different cytokines can activate this pathway, so its activation is dependent on which JAK and STAT family is activated and, therefore, responsible for inducing the anti-inflammatory effect or not.
  • the production of SOCS 3 is mediated by IL-10R and can interfere with the release of IKB from the NFKB complex in intact cells and / or block the binding of NF-kB DNA already present in the nucleus and as a consequence block NFKB expression.
  • the production of SOCS 3 can also inhibit the LPS signaling pathway, activating the TLR4 pathway, although this mechanism is complex and not fully elucidated.
  • the reporter cells were treated with the peptides before or after the addition of activation molecules (TNF-a, IFN-a and LPS) in order to explore new treatment strategies .
  • Pep 1 After pretreatment with synthetic peptides, Pep 1 showed a better ability to interfere in the analyzed pathways, compared to Pep 2, Pep 3 and Pep 4. In all concentrations tested and at all times, Pep 1 was able to reduce the expression of NFKB; this response was maintained over 48 hours of treatment. Pep 2 also interfered in these pathways even after 48 hours, but with a greater significance only in some concentrations tested (100 mM, 10 mM, 5 pM, 1 pM, 0.5 pM and 0.1 pM).
  • IL-10 Another action of IL-10 in the allergic response is the inhibition of the high affinity IgE receptor (Fc RI) in human and murine mast cells, thus reducing the release of b-hexosaminidase.
  • cytokine interferes with regulatory molecules (Fyn, Syk, Akt and STAT5) found in activated mast cells. Since mast cells and basophils have a similar crosstalk between Fc RI and IgE31, we can assume that IL-10 has the same effect in decreasing the expression of Fc RI in the basophil as in mast cells, which may explain how Pep1 can decrease the degranulation of basophils observed in the RBL assay ( Figure 10).
  • Macrophages are important cells found in inflammatory responses. Treatment with LPS induces the transcription of NF-kB and MAPK32 and, subsequently, the production of IL-6, MCP-1 and TNF-ct33. However, the treatment of macrophages with the IL-10 molecule, in an inflammatory environment, is able to negatively regulate the production of TNF-a, MCP-1 and IL-634. This finding suggests that the peptides synthesized here have an activity similar to that of the native molecule, since the treatment with Pep 1 decreased these cytokines after the treatment of the cell line J447 with LPS ( Figure 1 1).
  • MPC-1 and IL-6 in an inflammatory environment allows the activation of monocytes, memory T lymphocytes, natural killer cells (NK) and macrophages. Therefore, a new strategy to block or decrease these cytokines should provide an interesting treatment against a specific target. Therefore, the peptides synthesized here, Pep 1, 2, 3 and 4, can be used alone or in any combination between them, in the treatment of diseases related to immunological disorder, such as: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune, given the ability of these peptides to modulate NFKB and TLR4 signaling, activation of dendritic cells, proliferation of T cells and degranulation of basophils.
  • diseases related to immunological disorder such as: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune, given the ability of these peptides to modulate NFKB and TLR4 signaling, activation of dendritic cells, proliferation of T cells and degranulation of basophils.
  • Pep 1 showed better ability to interact with cell receptors in reporter cells, BMDCs (murine bone marrow dendritic cells), basophils, T cells and J774 cell line, and was able to regulate an allergic inflammatory response better than when compared to Pep 2, Pep 3 and Pep 4.
  • BMDCs murine bone marrow dendritic cells
  • basophils T cells and J774 cell line
  • J774 cell line T cells
  • All of these synthetic peptides have demonstrated the ability to modulate an allergic inflammatory response at different levels and these can be used in the development of pharmaceutical compositions, alone or in any combination with other peptides or compounds , to develop new treatments or to prevent inflammatory and / or allergic diseases.
  • the present patent application describes synthetic peptides with affinity for the interleukin-10 receptor comprising or consisting of one of the amino acid sequences selected from the group comprising: SEQ ID N 2 01, SEQ ID N 2 02, SEQ ID N 2 03 and SEQ ID NO 2 04, or a sequence having at least 85% identity or similarity to one of the amino acid sequences selected from the group consisting of: SEQ IDN s 01, SEQ ID NO 2 02, SEQ ID NO 2 03 and SEQ ID NO 02 04.
  • the Peptide comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO 01 has three-dimensional conformation with disulfide bridges.
  • the peptide comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO 2 02, SEQ ID NO 2 03 or SEQ ID NO 2 04 has three-dimensional conformation free of disulfide bridges.
  • Synthetic peptides are to be used in pharmaceutical compositions for use in the treatment and / or prophylaxis of diseases related to immunological disorder, in which diseases related to immune disorders are: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune diseases.
  • the present application also describes methods of treatment and / or prophylactic of diseases related to immunological disorder in which it comprises administering to a subject a pharmaceutically effective dose of at least one of the described synthetic peptides, or administering a pharmaceutical or immunogenic composition comprising at least least one of the synthetic peptides described.
  • the present application also describes pharmaceutical or immunogenic compositions that comprise at least one of the synthetic peptides described herein, plus at least one pharmaceutically acceptable carrier or compound.
  • the pharmaceutical or immunogenic composition is for use in the treatment and / or prophylaxis of diseases related to immunological disorders, in which the diseases related to immunological disorders are: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune diseases.
  • the present application also describes the use of the synthetic peptides or pharmaceutical compositions described herein, for the preparation of a medicament or immunogenic composition for use in the treatment and / or prophylaxis of diseases related to immune disorder.

Abstract

A presente invenção refere-se à seleção e caracterização de peptídeos sintéticos, que possuem afinidade por receptores presentes em células do sistema imunológico, mais particularmente com afinidade ao receptor de Interleucina-10 (IL-10), bem como composições farmacêuticas e uso destes peptídeos para preparar medicamentos ou composições imunogências. Estes peptídeos sintéticos podem se ligar a receptores celulares e promover um perfil regulatório importante para o tratamento e/ou profilaxia de doenças aonde haja uma desordem imunológica, mais particularmente em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.

Description

PEPTÍDEOS SINTÉTICOS COM AFINIDADE AO RECEPTOR DE INTERLEUCINA-10, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DOS MESMOS COMO IMUNOMUDULADORES NO TRATAMENTO DE DOENÇAS AUTOIMUNES, INFLAMATÓRIAS OU ALÉRGICAS
Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se à seleção e caracterização de peptídeos sintéticos, que possuem afinidade por receptores presentes em células do sistema imunológico, mais particularmente com afinidade ao receptor de lnterleucina-10 (IL-10). Esses receptores são conhecidos por apresentarem papel importante na modulação da reposta imológica, inflamatória e alérgica Além disso a presente inveção também descreve composições farmacêuticas compreendendo ao menos um destes peptídeos sintéticos e o uso destes peptídeos para preparar medicamentos ou composições imunogências para o tratamento e/ou profilaxia de doenças aonde haja uma desordem imunológica, mais particularmente em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
Fundamentos da Invenção
[002] A IL-10 é uma citocina pleiotrópica reguladora produzida por diferentes tipos de células: monócitos, células T, macrófagos, células dendríticas (CD), células natural killer (NK) e células B. Por influenciar diferentes tipos celulares, a IL-10 tem se mostrado uma molécula importante associada a uma ampla gama de doenças, distúrbios e condições, incluindo condições inflamatórias e alérgicas, distúrbios relacionados a imunidade e câncer, devido à sua capacidade de regular a resposta imune humoral e celular. Assim, o entendimento de como a IL-10 regula diferentes tipos celulares, é crucial para o desenvolvimento de novas estratégias de intervenção para o tratamento de várias patologias.
[003] Por exemplo, o pedido de patente WO 2008/054585 descreve o uso de IL-10 peguiladas para tratar câncer. Os pedidos de patente WO 2014/172392 e WO 2015/070060 também descrevem o uso de IL-10 modificadas, mas particularmente peguiladas, para tratar câncer.
[004] Já foi demonstrado que a IL-10 liga-se ao receptor da IL-10 (IL10R), ativando assim as proteínas Jak1 / Tyk2. A STAT3 é a principal proteína expressa para regular negativamente a resposta inflamatória, levando a uma regulação negativa de algumas citocinas, como o TNF-a e a IL-6. Esse processo regulatório mediado pela IL-10 é essencial para entender como essa citocina controla a resposta inflamatória, ativando uma das principais vias moleculares para a resolução da inflamação e resposta alérgica. Com isso, novas estratégias utilizando como base a molécula de IL-10 para modular a produção de citocinas têm sido utilizadas em humanos para controle de respostas inflamatórias.
[005] A IL-10 recombinante, por exemplo, já demonstrou ser segura, bem tolerada e eficaz em pacientes com doença de Crohn (Fedorak, R. N. et al. Gastroenterology 2000 Dec; 119(6): 1473-82). O pedido de patente BR 102017010787-6 descreve 101 Peptídeos sintéticos, selecionados por Phage Display, que possuem afinidade pelo receptor da IL-10. O referido pedido de patente descreve então o uso dessas sequências peptídicas sintetizadas no tratamento e acompanhamento de um processo inflamatório, doenças alérgicas e doenças auto-imunes.
[006] Para desenvolver novas moléculas com abordagens farmacêuticas, a metodologia de Phage Display (PD) pode ser uma boa opção, uma vez que nos permite selecionar moléculas pequenas que podem imitar aminoácidos específicos de proteínas grandes e induzir a mesma ou melhor resposta conforme esperado com a molécula natural ou em comparação com outras moléculas recombinantes já descritas. Peptídeos selecionados pela PD apresentam baixa toxicidade e alta afinidade receptor/proteína. Essa abordagem é utilizada a fim de se obter uma resposta imune específica aonde a produção da IL-10 é essencial para a regulação da resposta imune inflamatória. Além disso, esse tipo de modulação imunológica célula específica não promove uma imuno supressão severa como é observada nas drogas anti-inflamatórias comercialmente utilizadas.
Objetivo da invenção
[007] O presente pedido de patente teve como objetivo selecionar novos peptídeos miméticos à IL-10, pela tecnologia PD, que tivessem capacidade melhorada de modular a resposta imunológica, mais particularmente, controlar respostas inflamatórias e alérgicas. Dos peptídeos estudados, quatro (4) peptídeos foram selecionados e suas estruturas tridimentsionais foram preditas. Os dados obtidos mostraram a capacidade destes peptídeos sintetizados em dimunir a resposta alérgica e inibir as vias inflamatórias nos ensaios realizados, bem como seu potencial farmacêutico no controle de doenças alérgicas inflamatórias ou auto-imunes.
Breve descrição da invenção
[008] O presente pedido de patente descreve peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de lnterleucina-10. Estes peptídeos foram sintetizados e suas estruturas tridimensionais foram preditas. Todos eles foram sintetizados de modo a apresentar a Histidina como primeiro resíduo de aminoácido e uma sequência de três Glicinas e uma Serina como os últimos quatro resíduos de aminoácidos. Tais peptídeos apresentaram atividade importante sobre vias moduladoras e regulatórias imunológicas. Potanto, podem ser usados no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, como por exemplo: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[009] Uma modalidade do presente pedido são os métodos de tratamento e/ou profilático de doenças relacionadas a desordem imunológica, em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes, compreendendo administrar em um indivíduo uma dose farmaceuticamente efetiva de pelo menos um dos peptídeos sintéticos descritos
[010] Outra modalidade do presente pedido são composições farmacêuticas que compreendem pelo menos um dos peptídeos sintéticos aqui descritos, mais, pelo menos, um veículo, carreador e/ou composto farmacêuticamente aceitável. A Composição farmacêutica é para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[011] Outra modalidade do presente pedido é o uso dos peptídeos sintéticos ou das composições farmacêuticas aqui descritas, para a preparação de um medicamento ou composição imunogênica para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
Breve descrição das figuras
[012] A presente invenção será melhor compreendida com base na descrição, a seguir, tomada em conjunto com as figuras anexas, nas quais:
[013] A FIGURA 1A mostra a estrutura tridimensional predita do Pep
1 .
[014] A FIGURA 1 B mostra a estrutura tridimensional predita do Pep
2.
[015] A FIGURA 1 C mostra a estrutura tridimensional predita do Pep
3.
[016] A FIGURA 1 D mostra a estrutura tridimensional predita do Pep
4.
[017] A FIGURA 1 E mostra o comportamento de agregação dos peptídeos Pep 1 , Pep 2, Pep 3 e Pep 4 em solução.
[018] A FIGURA 2A mostra uma análise de expressão de NFkB após tratamento com os peptídeos sintetizados aqui descritos por 12 horas.
[019] A FIGURA 2B mostra uma análise de expressão de NFkB após tratamento com os peptídeos sintetizados aqui descritos por 24 horas.
[020] A FIGURA 2C mostra uma análise de expressão de NFkB após tratamento com os peptídeos sintetizados aqui descritos por 48 horas.
[021] A FIGURA 3A mostra uma análise de expressão de NFkB, usando uma molécula de ativação, o TNF-a, não somente no controle, mas após um pré-tratamento com os peptídios sintetizados por 12 horas.
[022] A FIGURA 3B mostra uma análise de expressão de NFkB, usando uma molécula de ativação, o TNF-a, não somente no controle, mas após um pré-tratamento com os peptídios sintetizados por 24 horas.
[023] A FIGURA 3C mostra uma análise de expressão de NFkB, usando uma molécula de ativação, o TNF-a, não somente no controle, mas após um pré-tratamento com os peptídios sintetizados por 48 horas.
[024] A FIGURA 4A mostra uma análise de expressão de NFkB, quando as células foram pré-tratadas com TNF-a e os peptídeos foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 12 horas.
[025] A FIGURA 4B mostra uma análise de expressão de NFkB, quando as células foram pré-tratadas com TNF-a e os peptídeos foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 24 horas.
[026] A FIGURA 4C mostra uma análise de expressão de NFkB, quando as células foram pré-tratadas com TNF-a e os peptídeos foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 48 horas.
[027] A FIGURA 5A mostra uma análise da via de sinalizao de IFN após tratamento com os peptídeos sintetizados aqui descritos por 12 horas.
[028] A FIGURA 5B mostra uma análise da via de sinalizao de IFN após tratamento com os peptídeos sintetizados aqui descritos por 24 horas.
[029] A FIGURA 5C mostra uma análise da via de sinalizao de IFN após tratamento com os peptídeos sintetizados aqui descritos por 48 horas.
[030] A FIGURA 6A mostra uma análise da via de sinalizao de IFN, quando as células foram pré-tratadas com IFN e os peptídeos foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 12 horas.
[031] A FIGURA 6B mostra uma análise da via de sinalizao de IFN, quando as células foram pré-tratadas com IFN e os peptídeos foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 24 horas. [032] A FIGURA 6C mostra uma análise da via de sinalizao de IFN, quando as células foram pré-tratadas com IFN e os peptídeos foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 48 horas.
[033] A FIGURA 7A mostra a capacidade dos peptídeos em reduzir a ativação da via de sinalização do TLR4 após 12 horas de tratamento com os peptídeos sintetizados.
[034] A FIGURA 7B mostra a capacidade dos peptídeos em reduzir a ativação da via de sinalização do TLR4, quando as células foram pré-tratadas com lipopolissacarídeos (LPS) e os peptídeos sintetizados foram adicionados posteriormente, após 12 horas de tratamento com os peptídeos.
[035] A FIGURA 8A mostra o efeito do tratamento com os peptídeos sintetizados na redução da ativação celular nas células CD11c+ CD86, após 24 horas de tratamento.
[036] A FIGURA 8B mostra o efeito do tratamento com os peptídeos sintetizados na redução da ativação celular nas células CD11c+ CD40+, após 24 horas de tratamento.
[037] A FIGURA 9 mostra a capacidade do peptídeo sintetizado Pep 1 em diminuir a ativaçãoo de células dendríticas, após 24 horas de tratamento.
[038] A FIGURA 10A mostra o efeito do peptídeo sintetizado Pep 1 na liberação de IgE mediada.
[039] A FIGURA 10B mostra o efeito do rlL10 na liberação de IgE mediada.
[040] A FIGURA 11A mostra a redução nos níveis de IL-6, quando as células foram tratadas com Pep 1 seguido de incubação com LPS (1 mg/mL) durante 24 horas. [041] A FIGURA 11 B mostra a redução nos níveis de MCP-1 , quando as células foram tratadas com Pep 1 seguido de incubação com LPS (1 mg/ml_) durante 24 horas.
[042] A FIGURA 11C mostra a redução nos níveis de TNF-a, quando as células foram tratadas com Pep 1 seguido de incubação com LPS (1 mg/mL) durante 24 horas.
Descrição detalhada da invenção
[043] O presente pedido de patente descreve 4 peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de lnterleucina-10 que compreendem ou consistem das sequências de aminoácidos: peptídeo 1 (Pep 1 ): SEQ ID N201 ; peptídeo 2 (Pep 2): SEQ ID N2 02; peptídeo 3 (Pep 3) SEQ ID N203; peptídeo 4 (Pep 4) SEQ ID
N2 04. Tais peptídeos apresentaram atividade importante sobre vias moduladoras e regulatórias imunológicas. Potanto, podem ser usados no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, como por exemplo: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[044] Os peptídeos descritos no presente pedido de patente foram selecionados utilizando a metodologia Phage Display (PD). Eles foram obtidos aleatoriamente após três ciclos de seleção utilizando uma biblioteca de peptídeos randômicos PhD-7mer e PhD12. A seleção foi realizada utilizando a linhagem celular J774; para isso, uma eluição competitiva com a rlL-10 (11-10 recombinante) foi adotada para selecionar peptídeos com afinidade ao receptor de IL-10.
[045] Uma pré-triagem foi realizada em Células Mononucleares de Sangue Periférico (do inglês PBMC - Peripheral Blood Mononuclear Cell) utilizando sobrenadante de fago para selecionar fagos das bibliotecas de PhD-7mer e PhD12.
[046] Os fagos mais reativos foram purificados e testados contra PBMC para confirmar a capacidade dos fagos selecionados em se ligar a receptores de células.
[047] Os peptídeos com alta afinidade com os receptores celulares foram então quimicamente sintetizados seguindo o manual de seleção de fagos (Barbas, C. F. et al. Phage Display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001 )) e suas estruturas tridimensionais foram preditas. Todos eles foram sintetizados de modo a apresentarem a Histidina como primeiro resíduo de aminoácido e uma sequência de três Glicinas e uma Serina como os últimos quatro resíduos de aminoácidos.
[048] O peptídeo 1 (Pep 1 ), SEQ ID N2 01 , tem sua estrutura tridimensional, com pontes dissulfeto, predita na Figura 1A.
[049] O peptídeo 2 (Pep 2), SEQ ID N2 02, tem sua estrutura tridimensional, sem ponte dissulfufeto, predita na Figura 1 B.
[050] O peptídeo 3 (Pep 3), SEQ ID N2 03, tem sua estrutura tridimensional predita na Figura 1C.
[051] O peptídeo 4 (Pep 4), SEQ ID N2 04, tem sua estrutura tridimensional predita na Figura 1 D.
[052] Os Pep 1 e Pep 2 foram sintetizados com uma identidade ou similaridade de cerca de pelo menos 85% entre eles. Os resíduos de aminoácido nas posições três (3) e onze (11 ) foram substituídos de Serina no Pep 2 para Cisteina no Pep 1. Portanto, o Pep 1 é o único peptídeo que foi sintetizado com ponte dissulfufeto, sendo sua estrutura tridimensional destinta da estrutura do Pep 2 e mais compacta em comparação com Pep 3 e Pep 4. Nas Figuras 1A a 1 D, a esfera preta é representativa do átomo C-alfa do primeiro resíduo, apenas para orientação, enquanto os resíduos hidrofílicos estão em azul e os hidrofóbicos em vermelho.
[053] O comportamento de agregação dos peptídeos Pep 1 , Pep 2, Pep 3 e Pep 4 em solução foi determinado por Dispersão de Luz Dinâmica (DLS), como pode ser visto na Figura 1 E. Todos os peptídeos sintéticos se mostraram aproximadamente 100% monoméricos em solução. O rádio hidrodinâmico medido dos peptídeos foi similar entre Pep 1 (0,82nm), Pep 2 (0,74m), Pep 3 (0,79nm) e Pep 4 (0,86nm).
[054] Uma vez que os peptídeos selecionados foram sintetizados, vários ensaios foram realizados a fim de determinar a atividade desses peptídeos. Vale aqui ressaltar que nos exemplos que demonstraremos abaixo e nas figuras aqui anexadas, todos os peptídeos de um modo geral e em diferentes concentrações mostraram resultados surpreendetes e positivos na modulação da resposta imunológica, inflamatória e alérgica. No entanto, iremos ressaltar aqui ao longo da descrição, apenas a título de exemplo, aqueles resultados que foram estatisticamente mais significativos. Isso não exclui quaisquer outros resultados que não tenham sido expressamente citados nos exemplos ao longo do relatório descritivo, mas que podem ser verificados diretamente nas figuras.
Exemplo 1 - Tratamento de células repórter.
[055] A fim de investigar a capacidade dos peptídeos em interferirem nas vias NFkB, IFN e TLR4, foram utilizadas linhagens celulares repórter. Para analisar se os peptídeos isolados (sem moléculas de ativação) poderiam induzir qualquer tipo de ativação, os peptídeos isolados foram testados nas linhagens celulares durante 12, 24 e 48 horas de tratamento. Em todas as células repórter e em todos os momentos testados, os peptídeos não induziram nenhum tipo de ativação quando estavam sozinhos, sem nenhum ambiente inflamatório para induzir a ativação das vias N FKB, IFN OU TLR4. Como exemplo, as Figura 2A, Figura 2B e Figura 2C mostram uma análise de expressão de NFkB após estímulo com os peptídeos sintetizados aqui descritos. As células foram tratadas durante 12, 24 e 48 horas com os peptídeos sintetizados Pep 1 , Pep 2, Pep 3 e Pep 4, em diferentes concentrações, sem moléculas de ativação. A luciferase foi então medida após 12 horas de tratamento (Figura 2A), 24 horas de tratamento (Figura 2B) e 48 horas de tratamento (Figura 2C). Todas as concentrações de peptídeos testadas não foram capazes de induzir qualquer resposta. O TNF-a (200 ng/mL) foi usado como controle positivo.
[056] O ensaio foi então realizado utilizando agora como molécula de ativação o TNF-a não somente no controle, mas após um pré-tratamento com os peptídios sintetizados Pep 1 , Pep 2, Pep 3 e Pep 4, em diferentes concentrações. O pré- tratamento com Pep 1 em todas as concentrações testadas foi capaz de diminuir a ativação de NFKB após 12, 24 e 48 horas (P <0,0005) de estímulo com o TNF- a (Figura 3A, B e C). O pré-tratamento com Pep 2 teve os resultados estatisticamente mais significativos a 100 mM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 0,5 pM e 0,1 pM, também diminuindo a ativação de NFKB (P <0,0005) após 12, 24 e 48 horas (Figura 3A, B e C). O pré-tratamento com Pep 3 teve os resultados estatisticamente mais significativos a 0,05 pM (P <0,05) reduzindo a ativação da via após 12 horas de tratamento (Figura 3A) e a 0,01 pM (P <0,05) após 48 horas (Figura 3C). Já o pré-tratamento com Pep 4 teve os resultados estatisticamente mais significativos a 0,05 pM, 0,01 pM e 0,005 pM, reduzindo a ativação da via após 48 horas de tratamento (Figura 3 C). Nos ensaios mostrados pelas Figuras 3 A, B e C, a análise da expressão de NFkB foi realizada em células repórter Jurkart-Dual. As células foram tratadas durante 1 hora com peptídeos e adicionado TNF-a (200 ng/mL). A luciferase foi medida após 12 horas de tratamento (Figura 3 A) 24 horas de tratamento (Figura 3 B) e 48 horas de tratamento (Figura 3 C).
[057] Outro ensaio foi então realizado em que as células foram pré-tratadas com TNF-a e os peptídeos foram adicionados posteriormente. Por exemplo, os resultados com maior significância estatística foram: o Pep 1 nas concetrações de 10 mM, 5 pM, 1 pM, 0,5 pM, 0,1 pM (P <0,05), 0,05 pM e 0,001 pM (P < 0,0005) diminui a ativação da via analisada após 12 horas de tratamento (Figura 4A); O Pep 2 nas concetrações de 100 pM (P <0,0005), 10 pM (P <0,005), 5 pM (P <0,05) e 1 pM (P <0,005); o Pep 3 na concetração de 0,005 pM (P <0,005) e o Pep 4 na concetração de 0,5 pM (P <0,05) também foram capazes de diminuir a sinalização de NFKB após 12 horas de tratamento (Figura 4A). Já após 24 horas de tratamento com os peptídeos, os resultados com maior significância estatística foram: o Pep 1 a 100 pM (P <0,0005), 10 pM (P <0,005), 1 pM (P <0,0005), 0,1 pM (P <0,05), 0,005 pM (P <0,0005), 0,001 pM (P <0,005) e 0,0001 pM (P <0,0005); Pep 2 a 100 pM (P <0,0005), 5 pM (P <0,005), 1 pM (0,0005) e 0,5 pM (P <0,05); Pep 3 a 10 pM (P <0,05), 0,005 pM (P <0,05) e 0,001 pM (P <0,05), onde a via de sinalização analisada obteve menor ativação (Figura 4B). Após 48 horas de tratamento, o Pep 1 na concentração de 0,001 pM (P <0,05) foi o que obteve resultado com maior significância estatística na diminuição da sinalização de NFKB (Figura 4C). Nos ensaios mostrados pelas Figuras 4 A, B e C, a análise da expressão de NFkB foi realizada em células repórter Jurkart- Dual. As células foram tratadas durante 1 hora com TNF-a (200 ng/mL) e os peptídeos foram adicionados. A luciferase foi medida após 12 horas de tratamento (Figura 4A) 24 horas de tratamento (Figura 4B) e 48 horas de tratamento (Figura 4C). Utilizou-se TNF-a (200ng/ml_) como controle positivo e rll_-10 (lnterleuciona-10 recombinante) (0,4ng/ml_) como controle negativo. * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005.
[058] A análise da via de sinalização de IFN demonstrou que a ativação da via foi diminuída quando as células Jurkat foram pré-tratadas com Pep 1 a 10 mM (P <0,005) durante 12 horas (Figura 5A); Pep 3 a 100 mM (0,005) durante 48 horas (Figura 5C); e Pep 4 a 100 pM (P <0,005) e 0,05 pM (P <0,05) durante 48 horas (Figura 5C). Quando as células foram pré-tratadas com IFN, embora os peptídeos, em algumas concentrações, tenham indicado resultado, os mesmos não tiveram suficiência estatística. Por tanto, não podemos confirmar se os mesmos foram capazes de interferir na ativação da via (Figura 6A, B e C) de forma igual ou melhor do que o controle negativo (rll_-10). Nos ensaios mostrados pelas Figuras 5 (A, B e C) e Figuras 6 (A, B e C), a análise da expressão de IFN foi realizada em células repórter Jurkart-Dual. Nos ensaios mostrados pelas Figuras 5 A, B e C, as células foram tratadas durante 1 hora com peptídeos com posterior adição de IFN-a (104 EU/mL). A produção de fosfatase alcalina embrionária secretada (do inglês - Secreted Embryonic Alcaline Phosphatase - SEAP) foi medida após 12 horas de tratamento (Figura 5A) 24 horas de tratamento (Figura 5B) e 48 horas de tratamento (Figura 5C).
Nos ensaios mostrados pelas Figuras 6 A, B e C, as células foram tratadas durante 1 hora com IFN-a (104 EU/mL) com posterior adição dos peptídeos. A produção de SEAP foi medida após (D) 12 horas de tratamento (E) 24 horas de tratamento e (F) 48 horas de tratamento. Utilizou-se IFN-a (104 EU/mL) como controle positivo e rlL-10 (0,4 ng/mL) como controle negativo. * P <0,05.
[059] As células HEK foram utilizadas para investigar a capacidade dos peptídeos em reduzir a ativação da via de sinalização do TLR4 após 12 horas de tratamento. O pré-tratamento com os peptídeos demonstrou que Pep 1 a 0,005 mM (P <0,05); Pep 2 a 100 pM (P <0,05), 0,1 pM (P <0,0005); Pep 3 a 100 pM (P <0,05) e Pep 4 a 100 pM (P <0,05), 10 pM (P <0,005), 5 pM (p <0,05) e 1 pM (P <0,05) reduziram mais significativamente a ativação da via (Figura 7A). Por outro lado, quando as células foram pré-tratadas com lipopolissacarídeos (LPS) e os peptídeos foram adicionados, a ativação da via de TLR4 foi reduzida mais significativamente quando adicionado Pep 1 a 0,1 pM (P <0,05), 0,05 pM (P <0,05), 0,01 pM (P <0,005), 0,005 pM (P <0,005) e 0,001 pM (P <0,005); Pep2 a 100 pM (P <0,05), 1 pM (P <0,005), 0,5 pM (P <0,05), 0,1 pM (P <0,05), 0,05 pM (P <0,05) e 0,01 pM (P <0,005); Pep 3 a 100 pM (P <0,0005), 10 pM (P <0,005), 0,5 pM (P <0,05) e 0,1 pM (P <0,05); Pep 4 a 100 pM (P <0,0005), 10 pM (P <0,05), 5 pM (P <0,005), 1 pM (P <0,05) e 0,5 pM (P <0,005) (Figura 7B).
[060] No ensaio mostrado pela Figuras 7 A as células foram tratadas 1 hora com peptídeos e LPS (100ng/mL) foi adicionado. A produção de SEAP foi medida após 12 horas de tratamento. No ensaio mostrado pela Figuras 7B as células foram tratadas com LPS (100ng/mL) por 1 hora e os peptídeos foram adicionados. A produção de SEAP foi medida após 12 horas de tratamento. LPS (100 ng/mL) foi usado como controle positivo e IL-10 (0,4ng/mL) como controle negativo. * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005.
Exemplo 2 - Efeito dos peptídeos sobre células dendríticas e T em ambiente inflamatório e aléraico
[061] Células dendríticas murinas da medula óssea foram isoladas de camundongos para analisar o efeito dos peptídeos sintetizados Pep 1 , Pep 2, Pep 3 e Pep 4, em duas concentrações, 1 mM e 10 pM, na redução da ativação celular. Após 24 horas de tratamento com composição compreendendo ao menos um dos peptídeos na concentração desejada, a análise celular mostrou que todos os quatro peptídeos sintetizados apresentaram respostas em diferentes níveis e foram capazes de interferir nas moléculas co-estimulatórias presentes na superfície das células dendríticas, sendo os peptídeos Pep 1 e 2 os que apresentaram melhor resposta. Por exemplo, o Pep 1 a 1 pM diminuiu a expressação de CD86+ (P<0.005), e a 10 pM também diminuiu a expressação de CD86+ (P<0.05). O Pep 2 a 1 pM reduziu a expressão de CD86+ e de CD40+ na superfície celular (P <0,005; P <0,05, respectivamente) (Figura 8 A e B).
[062] Nos ensaios foram usadas células CD1 1c+ CD86 (Figuras 8A) e células CD1 1 c+ CD40+ (Figuras 8B) após 24 horas de tratamento. LPS (100ng/mL) foi usado como controle positivo. * P <0,05; ** P <0,005.
[063] A fim de confirmar a capacidade dos peptídeos sintetizados em diminuir a ativação de células dendríticas, uma composição compreendendo o Pep 1 a 10 pM de concentração foi escolhida e a proliferação de células T, de pacientes alérgicos, foi mensurado após 24 horas de tratamento. O Pep 1 nesta concentração diminuiu a proliferação de células T (P <0,005) (Figura 9). As células foram tratadas com Bet v 1 , como controle positivo e um peptídeo irrelevante (IR) foi usado como um controle negativo.
[064] Todos os quatro peptídeos sintetizados apresentaram efeito sob células imunológicas em ambientes inflamatório e alérgico, confirmando a capacidade dos mesmos em modular a reposta imológica. Mais ainda, os resultados aqui apresentados demonstram o potencial de associação desses peptídeos, uma vez que eles apresentaram respostas distintas e em vários casos complementares no que diz respeito a concentração e tempo de exposição com melhor resposta. Portanto, fica claro que os mesmos podem ser usados sozinhos ou em quaisquer combinação ente eles, em composições para preparar medicamentos ou composições imunogências para o tratamento e/ou profilaxia de doenças aonde haja uma desordem imunológica, mais particularmente em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[065] Uma vez que todos os peptídeos apresentaram resposta, selecionamos o Pep 1 para aprofundar ainda mais com os estudos. Tais resultados podem ser extrapolados para os demais peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de IL-10 sintetizados e demonstrados no presente pedido de patente.
Exemplo 3 - Acão do Pep 1 na deqranulacão de basófilos
[066] O efeito do Pep 1 na liberação de IgE mediada foi examinado utilizando células de leucemia basofílica de rato transfectadas com o receptor Fc RI IgE humano (hRBL). As células hRBL foram sensibilizadas com soro de sete pacientes alérgicos ao pólen de bétula. As células foram estimuladas com o antígeno e a sua interação com IgEs imobilizadas causou uma liberação de b- hexosaminidase.
[067] Quando as células foram tratadas com uma composição compreendendo o Pep 1 a 1 mM (Figura 10A) ou rl L10 (Figura 10B), a quantidade de Bet v 1 necessária para induzir a mesma quantidade de degranulação foi superior quando comparada com as células tratadas apenas com Bet v1 ( P <0,05). Quantidade de rBet v 1 (ng/mL) necessária para induzir metade da liberação de b-hexosaminidase usando soro de sete doadores alérgicos a pólen de bétula após o tratamento com Pep 1 (A) (P <0,05) e rlL10 (B) * P <0,05.
Exemplo 4 - Produção de citocinas após o tratamento da linhagem celular J774 com Pep 1
[068] Após 24 horas de tratamento, os níveis de IL-6, MCP-1 e TNF-a produzidos foram mensurados. Não foi observada interferência na produção de IL-10, IFN-g ou IL12p70 (dados não mostrados). As células tratadas apenas com o peptídeo sintético Pep 1 , sem estímulo de LPS para induzir uma resposta inflamatória, foi incapazes de induzir qualquer resposta (dados não mostrados). Por outro lado, quando as células foram tratadas com um composição compreendendo o Pep 1 seguido de incubação com LPS (1 mg/mL) durante 24 horas para induzir uma resposta inflamatória, o peptídeo foi capaz de diminuir a produção de IL-6, MCP-1 e TNF-a.
[069] O Pep1 (1 mM, 10 pM e 100 pM, 1 pM P <0,05 e 10 pM e 100 pM P < 0,0005) reduziu significativamente os níveis de IL-6 (1 pM e 10 pM, P <0,05) (Figura 11A); MCP-1 (Figura 11 B) e TNF-a (1 pM, 10 pM e 100 pM, P <0,005) (Figura 11C). Cada diminuição foi significativa em comparação com células tratadas apenas com LPS (controle positivo). * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005
Análise dos resultados apresentados nos exemplos e modalidades da invenção
[070] Para analisar se a estrutura é determinante para a ativação da ligação e uma resposta celular ou se apenas a seqúência é suficiente para induzir este efeito, como explicamos acima, decidimos sintetizar um único peptídeo conformacional, o Pep 1 , com ponte dissulfeto e uma identidade ou similaridade de pelo menos 85% com o Pep 2, e os demais com cadeia linear (sem ponte dissulfeto). As estruturas de todos os 4 peptídeos foram preditas para investigar suas diferenças de conformação. O Pep 1 apresentou estrutura mais compacta em comparação aos peptídeos 2, 3 e 4 (Figura 1 A, B, C e D). Todos os peptídeos sintéticos apresentaram resposta, sendo que os compactos mostraram-se melhores para induzir uma resposta, uma vez que a conformação é muito importante para a ativação de receptores. Todos os peptídeos sintéticos se apresentam como monómero conforme mostrado nos resultados de DLS (Figura 1 E).
[071] A citocina IL-10 se liga ao IL-10R, ativando assim a sinalização JAK/STAT20; essa via possui um mecanismo principal para a produção de citocinas capaz de controlar uma resposta inflamatória. Entretanto, diferentes citocinas podem ativar essa via, então, a sua ativação é dependente de qual família JAK e STAT é ativada e, portanto, responsável por induzir o efeito anti- inflamatório ou não. A produção de SOCS 3 é mediada por IL-10R e pode interferir na liberação de IKB do complexo NFKB em células intactas e/ou bloqueia a ligação de DNA de NF-kB já presente no núcleo e como conseqúência bloqueia a expressão de NFKB. A produção de SOCS 3 também pode inibir a via de sinalização do LPS, ativando a via de TLR4, embora esse mecanismo seja complexo e não totalmente elucidado. Para investigar a capacidade dos peptídeos bloquearem a ativação de vias inflamatórias, as células repórter foram tratadas com os peptídeos antes ou após a adição de moléculas de ativação (TNF-a, IFN-a e LPS), a fim de explorar novas estratégias de tratamento.
[072] Após o pré-tratamento com os peptídeos sintéticos, o Pep 1 apresentou melhor capacidade de interferir nas vias analisadas, comparado com Pep 2, Pep 3 e Pep 4. Em todas as concentrações testadas e em todos os momentos, Pep 1 foi capaz de reduzir a expressão de NFKB; esta resposta foi mantida ao longo de 48 horas de tratamento. O Pep 2 também interferiu nestas vias mesmo após 48 horas, mas com uma significância maior apenas em algumas concentrações testadas (100 mM, 10 mM, 5 pM, 1 pM, 0,5 pM e 0,1 pM). A mesma ação não ocorreu de forma tão significativa quando as células foram tratadas com Pep 3 ou Pep 4, então, concluímos que esses dois peptídeos muito embora tenham produzido resposta e, portanto, apresentam potencial de uso, essa resposta não foi tão estável como observado no tratamento com o Pep 1 e 2. Ao mesmo tempo, quando as células foram pré-tratadas com TNF-a (para ativar a via de NFKB), confirmamos a melhor ação de Pep 1 mesmo quando as células já haviam sido ativadas; todas as concentrações testadas diminuíram a ativação do NFKB após 12 e 24 horas. Ação semelhante foi encontrada na via do TLR4 onde Pep 1 apresentou estabilidade (em diferentes concentrações) quando a via foi ativada antes do tratamento com o peptídeo. Essa melhor ação observada após o tratamento com Pep 1 pode ser explicada pela ponte dissulfeto presente no peptídeo levando a uma melhor conformação necessária para ativar o receptor e induzir a diminuição das vias investigadas. Por outro lado, essa diferença de ação dos peptídeos sintetizados indica a possibilidade de usá-los em combinação, seja ela qualquer combinação de dois ou mais dentre eles, a fim de se obter um resultado sinérgico, melhorado e/ou por tempo prolongado, dependendo do objetivo, uma vez que os mesmos demonstraram ação diferente dependendo da concentração e do tempo de exposição.
[073] Quando as células Jurkat foram utilizadas para investigar a capacidade dos peptídeos inibirem a via do IFN-a, os peptídeos produziram uma diminuição estatística em concentrações específicas, esta resposta pode não ser estável porque, embora o IFN-ab também induza a sinalização JAK-STAT, a ativação é desencadeada, preferencialmente, por STAT4, 1 e 2 em vez de STAT3, como ocorre após a ligação de IL-10 ao IL-10R. Além disso, o rll_-10 também pode induzir a produção de IFN, sugerindo que a citocina é capaz de interagir com ambas as vias de sinalização.
[074] Em estudos do mecanismo de tolerância imune aos alérgenos, a investigação tem demonstrado o papel da IL-10 na redução da expressão de moléculas co-estimuladoras em células apresentadoras de antígenos (do inglês: Antígen Presenting Celles - APCs) e, consequentemente, as células T não serão ativadas e não proliferaram, suprimindo assim a exacerbação da inflamação, considerada a via crítica para prevenir uma resposta inflamatória alérgica grave. Corroborando com essa ideia, os peptídeos sintetizados reduziram as moléculas co-estimulatórias nas células dendríticas (Figura 8 A e B), demonstrando capacidade e ação estáveis. Embora todos os peptídeos sintetizados tenham apresentado resultados com potencial de uso, principalente os Pep 1 e 2, escolhemos o Pep 1 para utilização em alguns experimentos para investigar a sua ação regulatória, um efeito confirmado pela diminuição da proliferação de células T em pacientes alérgicos (Figura 9). No entanto, TLR4 foi mostrado presente em células dendríticas, uma vez que o Pep 1 e 2 diminuíram estatisticamente esta via de ativação, em células repórter, e também as moléculas co-estimulatórias em células dendríticas. Podemos aceitar a hipótese de que os peptídeos aqui sintetizados podem então atuar em ambos os casos: diretamente na via TLR4 para diminuir a produção de citocinas pró-inflamatórias e também reduzir a apresentação do antígeno às células T e conseqijentemente diminuir a sua proliferação. [075] Outra ação da IL-10 na resposta alérgica é a inibição do receptor de alta afinidade para IgE (Fc RI) em mastócitos humanos e murinos, reduzindo assim a liberação de b-hexosaminidase. Além disso, a citocina interfere nas moléculas reguladoras (Fyn, Syk, Akt e STAT5) encontradas em mastócitos ativados. Como os mastócitos e basófilos apresentam crosstalk semelhante entre o Fc RI e lgE31 , podemos supor que a IL-10 tenha o mesmo efeito em diminuir a expressão de Fc RI no basófilo como nos mastócitos, o que pode explicar como Pep1 pode diminuir a degranulação de basófilos observada no ensaio RBL (Figura 10).
[076] Os macrófagos são células importantes encontradas nas respostas inflamatórias. O tratamento com LPS induz a transcrição de NF-kB e MAPK32 e, posteriormente, a produção de IL-6, MCP-1 e TNF-ct33. Entretanto, o tratamento de macrófagos com a molécula IL-10, em ambiente inflamatório, é capaz de regular negativamente a produção de TNF-a, MCP-1 e IL-634. Este achado sugere que os peptídeos aqui sintetizados apresentam uma atividade similar à da molécula nativa, uma vez que o tratamento com Pep 1 diminuiu essas citocinas após o tratamento da linhagem celular J447 com o LPS (Figura 1 1 ). A produção de MPC-1 e IL-6 em ambiente inflamatório possibilita a ativação de monócitos, linfócitos T de memória, células natural killer (NK) e macrófagos. Por isso, uma nova estratégia para bloquear ou diminuir essas citocinas deve constituir um tratamento interessante contra um alvo específico. Portanto, os peptídeos aqui sintetizados, Pep 1 , 2, 3 e 4, podem ser usados sozinhos ou em qualquer combinação entre eles, no tratamento de doenças relacionadas a desordem imunológica, como por exemplo: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes, dada a capacidade destes peptídeos de modular a sinalização de NFKB e TLR4, ativação de célelas dendríticas, proliferação de células T e degranulação de basófilos.
[077] Pep 1 apresentou melhor capacidade de interagir com receptores celulares em células repórter, BMDCs (Células dendríticas murinas da medula óssea), basófilos, células T e linhagem celular J774, e se mostrou capaz de regular uma resposta inflamatória alérgica melhor do que quando comparado a Pep 2, Pep 3 e Pep 4. No entanto, todos estes peptídeos sintéticos demonstraram capacidade de modular uma resposta inflamatória alérgica em níveis diferentes e estes podem ser usados no desenvolvimento de composições farmacêuticas, sozinhos ou em qualquer combinação com outros peptídeos ou compostos, para desenvolver novos tratamentos ou na prevenção de doenças inflamatórias e/ou alérgicas.
[078] Portanto, o presente pedido de patente descreve Peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de lnterleucina-10 compreendendo ou consistindo uma das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que compreende: SEQ ID N2 01 , SEQ ID N2 02, SEQ ID N203 e SEQ ID N204, ou uma sequência tendo pelo menos 85% de identidade ou similaridade com umas das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que consite de: SEQ I D Ns 01 , SEQ ID N202, SEQ ID N2 03 e SEQ ID N2 04. O Peptídeo compreendendo ou consistindo da sequência SEQ ID N° 01 apresenta conformação tridimensional com pontes dissulfeto. O peptídeo compreendendo ou consistindo da sequência SEQ ID N2 02, SEQ ID N203 ou SEQ ID N204 apresenta conformação tridimensional isenta de pontes dissulfeto. Os Peptídeos sintéticos são para serem utilizados em composições farmacêuticas para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[079] O presente pedido também descreve métodos de tratamento e/ou profilático de doenças relacionadas a desordem imunológica em que compreende administrar em um indivíduo uma dose farmaceuticamente efetiva de pelo menos um dos peptídeos sintéticos descritos, ou administrar uma composição farmacêutica ou imunogênica compreendo pelo menos um dos peptídeos sintéticos descritos.
[080] O presente pedido também descreve composições farmacêuticas ou imunogênicas que compreendem pelo menos um dos peptídeos sintéticos aqui descritos, mais, pelo menos, um veículo ou composto farmacêuticamente aceito. A Composição farmacêutica ou imunogênica é para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[081] Adicionalmente, o presente pedido também descreve o uso dos peptídeos sintéticos ou das composições farmacêuticas aqui descritas, para a preparação de um medicamento ou composição imunogênica para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica.
[082] Embora o presente pedido de patente tenha descrito a matéria objeto da presente invenção com um certo grau de detalhamento a título de ilustração e exemplificação para fins de clareza e compreensão, será evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas no escopo das reivindicações em anexo.
[083] Os exemplos descritos neste relatório não são limitativos, permitindo que um técnico no assunto altere alguns aspectos ou componentes da presente ivenção, equivalentes aos peptídeos sintéticos, composições ou usos aqui descritos, sem se distanciar do escopo da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Peptídeo sintético com afinidade ao receptor de lnterleucina-10 caracterizado pelo fato de que compreende uma das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N- 01 , SEQ ID N- 02, SEQ ID N203 e SEQ ID N204, ou uma sequência tendo pelo menos 85% de identidade ou similaridade com uma das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N- 01 , SEQ ID N- 02, SEQ ID N- 03 e SEQ ID N2 04 .
2. Peptídeo sintético de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreendendo a SEQ ID N° 01 apresenta comformação tridimensional com pontes dissulfeto.
3. Peptídeo sintético de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreendendo a SEQ ID N° 02, SEQ ID N° 03 ou SEQ ID N° 04, apresenta conformação tridimensional isenta de pontes dissulfeto.
4. Peptídeo sintético de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para ser utilizado em composições farmacêuticas para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica.
5. Peptídeo sintético de acordo areivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
6. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um dos peptídeos sintéticos tal como descritos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e pelo menos um veículo, carreador ou composto farmacêuticamente aceitável.
7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica.
8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto- imunes.
9. Uso de ao menos um peptídeo sintético tal como descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou da composição farmacêutica tal como descrito na reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que é para a preparação de um medicamento ou composição imunogênica para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica.
10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
11. Método de tratamento e/ou profilático de doenças relacionadas a desordem imunológica, caracterizada pelo fato de que compreende administrar em um indivíduo uma dose farmaceuticamente efetiva de pelo menos um dos peptídeos recombinantes tal como descritos em qualquer um das reivindicações 1 a 5 ou uma composição farmacêutica tal como descrita na reivindicação 6.
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