WO2020198833A1 - COMBINAÇÃO DE PEPTÍDEOS SINTÉTICOS COM AFINIDADE AO RECEPTOR DE TGF-β E COM AFINIDADE AO RECEPTOR DE IL-10, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DOS MESMOS COMO IMUNOMUDULADORES NO TRATAMENTO DE DOENÇAS AUTOIMUNES, INFLAMTÓRIAS OU ALÉRGICAS - Google Patents

COMBINAÇÃO DE PEPTÍDEOS SINTÉTICOS COM AFINIDADE AO RECEPTOR DE TGF-β E COM AFINIDADE AO RECEPTOR DE IL-10, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DOS MESMOS COMO IMUNOMUDULADORES NO TRATAMENTO DE DOENÇAS AUTOIMUNES, INFLAMTÓRIAS OU ALÉRGICAS Download PDF

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WO2020198833A1 PCT/BR2020/050118 BR2020050118W WO2020198833A1 WO 2020198833 A1 WO2020198833 A1 WO 2020198833A1 BR 2020050118 W BR2020050118 W BR 2020050118W WO 2020198833 A1 WO2020198833 A1 WO 2020198833A1
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tgf
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cells
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PCT/BR2020/050118
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Luiz Ricardo Goulart Filho
Fatima D Ferreira-Briza
EmíLia Rezende Vaz
Galber Rodrigues Araujo
Carlos Ueira Vieira
Lorenz Aglas
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Univ Federal De UberlâNdia
Cirino Alberto Goulart Eireli Epp Biogenetics
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Definitions

  • the present invention relates to the combination of synthetic peptides that have affinity for different receptors present in cells of the immune system, more particularly the combination of synthetic peptides with affinity to the Growth Transformation Factor receptor - beta (from the acronym in English: TGF-b), with synthetic peptides with affinity for the interleukin-10 receptor (IL-10). Both receptors are known to play an important role in modulating the immune, inflammatory and allergic response.
  • TGF-b Growth Transformation Factor receptor - beta
  • IL-10 interleukin-10 receptor
  • the present invention also describes pharmaceutical compositions comprising the combination of at least one of each of these synthesized peptides and the use of these peptides to prepare immunogenic drugs or compositions for the treatment and / or prophylaxis of diseases where there is an immunological disorder, more particularly in that diseases related to immunological disorder are: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune.
  • the growth transforming factor (TGF) -pi is a pleiotropic cytokine that acts on several biological processes, including embryonic development and cell proliferation, differentiation, adhesion, migration and apoptosis. Its signaling has been proposed for the control of self-reactive peripheral T cells, present in patients with autoimmune diseases. This cytokine also plays an important role in inducing helper T cells capable of regulating cytokine production and activation of the pathway in order to repair the immune response.
  • TGF-bI is produced by several cell types, such as platelets, neutrophils, malignant cells, dendritic cells and macrophages. Consequently, this cytokine has an important effect on inflammatory, allergic and autoimmune diseases. Due to the diversity of TGF-bI, many factors are responsible for activating canonical or non-canonical pathways to induce multiple biological effects and interfere with different pro-inflammatory pathways. This cytokine can modulate different pathways directly related to TGF-b receptors and also in response to crosstalk signaling.
  • TGF-bI is a cytokine that plays an important role in allergic inflammation. It can suppress effector T cells and is involved in the development of conventional, innate and regulatory (Treg) T cells. T cells play a key role in maintaining peripheral tolerance against commensal, autologous and environmental antigens. In mice with the interrupted TGF-bI gene, and in mice without the II receptor (TORbRII), severe inflammatory responses, tissue necrosis and early death were observed, confirming the regulatory role of T ⁇ Rb1 in peripheral tolerance.
  • TORbRII II receptor
  • IL-10 is a pleiotropic regulatory cytokine produced by different types of cells: monocytes, T cells, macrophages, dendritic cells (CD), natural killer cells (NK) and B cells. Because it influences different cell types, IL-10 has been shown to be an important molecule associated with a wide range of diseases, disorders and conditions, including inflammatory and allergic conditions, disorders related to immunity and cancer, due to its ability to regulate the humoral and cellular immune response. Thus, the understanding of how IL-10 regulates different cell types is crucial for the development of new intervention strategies for the treatment of various pathologies.
  • T lymphocytes are among the main factors involved in the regulation of the adaptive immune response in inflammatory diseases.
  • Type I (Th1) helper T cells are necessary for the elimination of many intracellular pathogens, while Th2 cells are necessary for the elimination of helminth infection.
  • Th1 / Th2 balance can lead to immune disorders with fatal outcomes.
  • Th1 cells are involved in delayed hypersensitivity immune reactions, while Th2 cells are involved in allergic diseases.
  • Th1 lymphocytes produce IFN-g and IL-2 to support cell-mediated immunity, while Th2 lymphocytes produce cytokines such as IL-4, IL-5 and IL-13, which play important roles in exacerbating the allergic response.
  • IL-4 is the main cytokine for the polarization of a Th2 response, which, together with IL-13, induces a class change in the production of immunoglobulins from B lymphocytes to IgE.
  • Allergic reactions are initiated after subsequent exposure to the allergen, where it binds to specific IgE together with the allergen bound to the high-affinity Fc RI receptor in mast cells or basophils, triggering cell degranulation. This event alerts the immune system to local infection and propagates inflammatory allergic response.
  • modulation of cytokines of cells found in a Th1 / Th2 profile is essential for the maintenance or restoration of immune homeostasis.
  • Birch pollen (Birch wart) is the main cause of pollinosis in the temperate zone of the northern hemisphere.
  • Allergen specific immunotherapy (ASIT) has been shown to modulate the natural course of allergies, leading to improvement or even complete remission of allergic symptoms (Mobs, C. et al Cellular and humoral mechanisms of immune tolerance in immediate-type allergy induced by specific Int Arch Allergy Immunol. 2008; 147 (3): 171-8).
  • ASIT is the treatment of choice for many patients, local and systemic allergic side effects have been reported.
  • Sublingual allergen immunotherapy has also been associated with side effects.
  • TGFpi Growth transforming factor b1
  • Foxp3 is a master regulator involved in the development and function of regulatory T cells (Treg). Treg cells are essential for the maintenance of immune homeostasis and the induction of immune tolerance. Its dysfunction can lead to the development of autoimmune diseases, immunopathology and allergy.
  • Interleukin 10 IL-10 is a cytokine associated with important immunoregulatory functions, including the survival and proliferation of various immune cells.
  • Phage Display (PD) methodology may be a good option, as it allows us to select small molecules that can mimic specific amino acids of large proteins and induce the same or better response as expected with the natural molecule or in comparison with other recombinant molecules already described.
  • Peptides selected by PD have low toxicity and high receptor / protein affinity.
  • Therapeutic mimetic peptides are potential drug candidates for many different diseases, as they have the potential to antagonize, stimulate, increase or modulate the activity of natural ligands, binding to specific receptors on the cell surface and triggering intracellular pathways.
  • the patent WO2012167143 A1 reports the use of the phage display technology in obtaining a specific antibody binding to the TGF-b molecule that can be used in patients who have a disorder related to the expression of TGF-b, such as cancer. These results show the efficiency of the technique in the development of recombinant antibodies in the treatment of diseases.
  • Patent application BR 102015003903-4 describes 27 synthetic peptides and their inverse sequences, selected by Phage Display, which have an affinity for the TGF-b receptor. The said patent application then describes the use of these peptide sequences synthesized in pharmaceutical compositions in the regulation of the immune system, in order to obtain control of inflammation or to allow the treatment of inflammatory and autoimmune diseases. Said patent application also describes the possibility of using such synthesized peptides in diagnostic or prognostic methods of related diseases.
  • Recombinant IL-10 for example, has already been shown to be safe, well tolerated and effective in patients with Crohn's disease (Fedorak, R. N. et al. Gastroenterology 2000 Dec; 119 (6): 1473-82).
  • Patent application BR 102017010787-6 describes 101 synthetic peptides, selected by Phage Display, which have an affinity for the IL-10 receptor. Said patent application then describes the use of these synthesized peptide sequences in the treatment and monitoring of an inflammatory process, allergic diseases and autoimmune diseases.
  • the present patent application aimed to select new peptides mimetic to TGF-bI and IL-10, by PD technology, which had an improved ability to modulate and attenuate the immune response, more particularly, to control inflammatory and allergic responses.
  • the present patent application describes synthetic peptides with affinity for the TGF-b receptor and synthetic peptides with affinity for the interleukin-10 receptor (IL-10). These peptides were synthesized and their three-dimensional structures were predicted. All of them were synthesized to present Histidine and Alanine as the first amino acid residue, in some cases, Alanine as the second amino acid residue and a sequence of three Glycines and a Serine as the last four amino acid residues. Such peptides showed important activity on immunological modulatory and regulatory pathways. Therefore, they can be used in the treatment and / or prophylaxis of diseases related to immune disorders, such as: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune diseases. Therefore, peptides mimetic to TGF-bI and IL10 can be promising candidates to mitigate inflammatory and allergic reactions when used in combination.
  • diseases related to immune disorders such as: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune diseases. Therefore, peptides mimetic to TGF-bI and
  • Another embodiment of the present application is the methods of treatment and / or prophylactic of diseases related to immunological disorder, in which the diseases related to immunological disorder are: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune, comprising administering to a subject a pharmaceutically effective dose of a combination of at least one of the synthetic peptides mimetic to TGF-bI and of at least one of the synthetic peptides mimetic to IL-10.
  • compositions comprising a combination of at least one of the synthetic peptides mimetics of TGF-bI and of at least one of the synthetic peptides mimetic of IL-10, plus at least one pharmaceutically acceptable vehicle or compound.
  • the Pharmaceutical Composition is for use in the treatment and / or prophylaxis of diseases related to immunological disorders, in which the diseases related to immunological disorders are: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune diseases.
  • Another embodiment of the present application is the use of the combination of synthetic peptides or the pharmaceutical compositions described herein, for the preparation of a drug or immunogenic composition for use in the treatment and / or prophylaxis of diseases related to immunological disorder, in which the diseases related to immunological disorder are: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune diseases.
  • FIGURE 1A shows the predicted three-dimensional structure of Pep
  • FIGURE 1 B shows Pep's predicted three-dimensional structure
  • FIGURE 1C shows the predicted three-dimensional structure of Pep 3 - TGF-bI.
  • FIGURE 1 D shows Pep's predicted three-dimensional structure
  • FIGURE 1 E shows Pep's predicted three-dimensional structure
  • FIGURE 1 F shows the predicted three-dimensional structure of Pep 6
  • FIGURE 1 G shows Pep's predicted three-dimensional structure
  • FIGURE 1 H shows the predicted three-dimensional structure of Pep 8 - TGF-bI.
  • FIGURE 2 shows an analysis of the aggregation behavior of peptides mimetic to TGF-bI synthesized in solution analyzed by DLS.
  • Figure 3 shows an analysis of recognition by the anti-TGF-bI antibody of the synthesized TGF-bI mimetic peptides, on the cell surface of the A549 strain.
  • Figure 4A shows the activation of the dependent TRObRII / eMA ⁇ pathway, by analyzing the production of SEAP (secreted alkaline phosphatase) after treatment with the T ⁇ Rb1 mimetic peptides synthesized here for 12 hours.
  • Figure 4B shows the activation of the dependent TRObRII / eMA ⁇ pathway, by analyzing the production of SEAP (secreted alkaline phosphatase) after treatment with the synthesized peptides described here for 24 hours.
  • SEAP secreted alkaline phosphatase
  • Figure 4C shows the activation of the dependent TRObRII / eMA ⁇ pathway, by analyzing the production of SEAP (secreted alkaline phosphatase) after treatment with the synthesized peptides described here for 48 hours.
  • Figure 5A shows an analysis of the effect of peptides synthesized in the NFkB pathway, after pre-treatment with the peptides for 1 hour, followed by TNF-a stimulation and analyzed after 12 hours.
  • Figure 5B shows an analysis of the effect of peptides synthesized in the NFkB pathway, after pre-treatment with the peptides for 1 hour, followed by TNF-a stimulation and analyzed after 24 hours.
  • Figure 5C shows an analysis of the effect of peptides synthesized in the NFkB pathway, after pre-treatment with the peptides for 1 hour, followed by TNF-a stimulation and analyzed after 48 hours.
  • Figure 5D shows an analysis of the effect of peptides synthesized in the NFkB pathway, after pre-stimulation with TNF-a for 1 hour, followed by the addition of the peptides and analyzed after 12 hours.
  • Figure 5E shows an analysis of the effect of peptides synthesized in the NFkB pathway, after pre-stimulation with TNF-a for 1 hour, followed by the addition of the peptides and analyzed after 24 hours.
  • Figure 5E shows an analysis of the effect of peptides synthesized in the NFkB pathway, after pre-stimulation with TNF-a for 1 hour, followed by the addition of the peptides and analyzed after 48 hours.
  • Figure 6A shows analysis to investigate the action of peptides in the TLR4 pathway, after pretreatment with the synthesized peptides, followed by LPS stimulation and analyzed after 12 hours.
  • Figure 6B shows analysis to investigate the action of peptides in the TLR4 pathway, after pre-stimulation with LPS, followed by the addition of the peptides and analyzed after 12 hours.
  • Figure 7A shows an ELISA assay to assess the binding of rTGF1 1 and Pep 2 to the Jurkat cell surface.
  • Figure 7B shows a luciferase reporter assay showing IL-8 gene expression in A549 cells stimulated with TNF-a and treated with Pep 2.
  • Figure 7C shows an IL-8 production / secretion assay in A549 cells stimulated by TNF-a and treated with Pep 2.
  • Figure 7D shows a test of the action of Pep 2 on the secretion of
  • Figure 7E shows a test of the action of Pep 2 on the secretion of
  • Figure 7F shows a mediator release assay based on rat basophilic leukemia (RBL) cells that have a humanized Fc RI receptor to investigate the effect of Pep 2 on IgE-mediated basophil degranulation.
  • RBL rat basophilic leukemia
  • Figure 8A shows an immunization schedule in animals.
  • Figure 8B shows an immunization assay with recombinant Phl p5, showing the action of Pep 2 on the degranulation of basophils.
  • Figure 8C shows an immunization assay with recombinant Phl p5, showing the action of Pep 2 on IgE levels.
  • Figure 8D shows an immunization assay with recombinant Phl p5, showing the action of Pep 2 on lgG1 levels.
  • Figure 8E shows a recombinant Phl p5 immunization assay, showing the action of Pep 2 on levels of lgG2a.
  • Figure 8F shows a recombinant Phl p5 immunization assay, showing the action of Pep 2 on IgA levels.
  • Figure 9A shows an immunization assay with recombinant Phl p5 in splenocytes, showing the action of Pep 2 on IFN-g levels.
  • Figure 9B shows an immunization assay with recombinant Phl p5 in splenocytes, showing the action of Pep 2 on the levels of IL-4.
  • Figure 9C shows an immunization assay with recombinant Phl p5 in splenocytes, showing the action of Pep 2 in inducing IL-10.
  • Figure 9D shows a re-immunization assay with recombinant Phl p5 in splenocyte supernatant, showing the action of Pep 2 on IFN-g levels.
  • Figure 9E shows a re-immunization assay with recombinant Phl p5 in splenocyte supernatant, showing the action of Pep 2 on IL-2 levels.
  • Figure 9F shows a re-immunization assay with recombinant Phl p5 in splenocyte supernatant, showing the action of Pep 2 on IL-4 levels.
  • Figure 9G shows a re-immunization assay with recombinant Phl p5 in splenocyte supernatant, showing the action of Pep 2 on IL-5 levels.
  • Figure 9H shows a re-immunization assay with recombinant Phl p5 in splenocyte supernatant, showing the action of Pep 2 on IL-13 levels.
  • Figure 9I shows a re-immunization assay with recombinant Phl p5 in splenocyte supernatant, showing the action of Pep 2 in inducing IL-10.
  • Figure 10A shows an assay to investigate CD4 cells + CD25 + Foxp3 + that express GATA3 in splenocytes, in mice sensitized with Phl p5 and treated with Pep 2.
  • Figure 10B shows an assay to investigate CD4 cells
  • Figure 10C shows an assay to investigate CD4 cells
  • Figure 10D shows an assay to investigate CD4 cells
  • Figure 10E shows an assay to investigate CD4 cells
  • Figure 10F shows an assay to investigate CD4 cells
  • Figure 11A shows the analysis of GFP + CD4 + lymphocytes isolated from 4get mice 5 days after immunization Mice.
  • Figure 11 B shows that the synthesized peptide administered throughout the grass pollen extract suppresses the polarization of TH2.
  • Figure 11 C shows that the synthesized peptide administered throughout the grass pollen extract suppresses the polarization of TH2.
  • FIGURE 12A shows the predicted three-dimensional structure of Pep
  • FIGURE 12B shows Pep's predicted three-dimensional structure
  • FIGURE 12C shows Pep's predicted three-dimensional structure
  • FIGURE 12D shows Pep's predicted three-dimensional structure
  • FIGURE 12E shows the aggregation behavior of Pep 1 - IL10, Pep 2 - IL10, Pep 3 - IL10 and Pep 4 - I L10 peptides in solution.
  • FIGURE 13A shows an analysis of NFkB expression after treatment with the synthesized peptides mimetic to IL-10 described here for 12 hours.
  • FIGURE 13B shows an analysis of NFkB expression after treatment with the synthesized IL-10 mimetic peptides described here by
  • FIGURE 13C shows an analysis of NFkB expression after treatment with the synthesized IL-10 mimetic peptides described here for 48 hours.
  • FIGURE 14A shows an analysis of NFkB expression, using an activation molecule, TNF-a, not only in the control, but after a pretreatment with the peptides synthesized mimetic to IL-10 for 12 hours.
  • FIGURE 14B shows an analysis of NFkB expression, using an activation molecule, TNF-a, not only in the control, but after a pretreatment with peptides synthesized mimetic to IL-10 for 24 hours.
  • FIGURE 14C shows an analysis of NFkB expression, using an activation molecule, TNF-a, not only in the control, but after a pretreatment with the synthesized peptides mimetic to IL-10 for 48 hours.
  • FIGURE 15A shows an analysis of NFkB expression, when the cells were pretreated with TNF-a and the synthesized peptides mimetic to IL-10 were added later, after treating the cells for 12 hours.
  • FIGURE 15B shows an analysis of NFkB expression, when cells were pretreated with TNF-a and synthesized peptides mimetic to IL-10 were added later, after treatment of the cells for 24 hours.
  • FIGURE 15C shows an analysis of NFkB expression, when cells were pretreated with TNF-a and synthesized peptides mimetic to IL-10 were added later, after treatment of the cells for 48 hours.
  • FIGURE 16A shows an analysis of the IFN signaling pathway after treatment with the synthesized IL-10 mimetic peptides described here for 12 hours.
  • FIGURE 16B shows an analysis of the IFN signaling pathway after treatment with the synthesized IL-10 mimetic peptides described here for 24 hours.
  • FIGURE 16C shows an analysis of the IFN signaling pathway after treatment with the synthesized IL-10 mimetic peptides described here for 48 hours.
  • FIGURE 17A shows an analysis of the IFN signaling pathway, when the cells were pretreated with IFN and the synthesized peptides mimetic to IL-10 were added later, after treating the cells for 12 hours.
  • FIGURE 17B shows an analysis of the IFN signaling pathway, when the cells were pretreated with IFN and the synthesized peptides mimetic to IL-10 were added later, after treating the cells for 24 hours.
  • FIGURE 17C shows an analysis of the IFN signaling pathway, when the cells were pretreated with IFN and the synthesized peptides mimetic to IL-10 were added later, after treating the cells for 48 hours.
  • FIGURE 18A shows the ability of the synthesized peptides mimicking IL-10 to reduce activation of the TLR4 signaling pathway after 12 hours of treatment with the synthesized peptides.
  • FIGURE 18B shows the ability of synthesized peptides mimicking IL-10 to reduce activation of the TLR4 signaling pathway, when cells were pretreated with lipopolysaccharides (LPS) and the synthesized peptides were added later, after 12 hours of treatment with the peptides.
  • LPS lipopolysaccharides
  • FIGURE 19A shows the effect of treatment with synthesized peptides mimicking IL-10 in reducing cell activation in CD11c + CD86 cells, after 24 hours of treatment.
  • FIGURE 19B shows the effect of treatment with synthesized peptides mimicking IL-10 on reducing cell activation in cells CD11c + CD40 +, after 24 hours of treatment.
  • FIGURE 20 shows the ability of peptides synthesized mimetic to IL-10 (Pep 1 - IL-10) to decrease the activation of dendritic cells, after 24 hours of treatment.
  • FIGURE 21 A shows the effect of synthesized peptides mimicking IL-10 (Pep 1 - IL-10) on IgE-mediated release.
  • FIGURE 21 B shows the effect of rlL10 on IgE-mediated release.
  • FIGURE 23A shows the immunization schedule of animals with peptide combination.
  • FIGURE 23B shows the titration curve for the mediator release assay performed with sera from all groups showing that mice treated with the combination of synthesized peptides had substantially lower levels of basophil degranulation.
  • FIGURE 23C shows the mediator release assay performed with individual sera reinforcing the action of the combination of peptides synthesized in the negative degranulation regulation of IgE-specific basophils.
  • FIGURE 24A shows the levels of IFN-g produced by splenocytes re-stimulated with Bet v 1 and the combination of synthesized peptides.
  • FIGURE 24B shows the levels of IL-4 produced by splenocytes re-stimulated with Bet v 1 and the combination of synthesized peptides.
  • FIGURE 24C shows the levels of IL-10 (C) produced by splenocytes re-stimulated with Bet v 1 and the combination of synthesized peptides.
  • FIGURE 25A shows the ability of combining the synthesized peptides to modulate the production of the cytokine IL-2 in explenocytes.
  • FIGURE 25B shows the ability of combining the synthesized peptides to modulate the production of the IL-4 cytokine in explenocytes.
  • FIGURE 25C shows the ability of combining the synthesized peptides to modulate the production of the cytokine IL-5 in explenocytes.
  • FIGURE 25D shows the ability of combining the synthesized peptides to modulate the production of the cytokine IL-13 in explenocytes.
  • FIGURE 26 shows the ability of the combination of the peptides synthesized to modulate the degranulation of basophils.
  • the present patent application describes 8 synthetic peptides with TGF-b receptor affinity, which comprise or consist of the amino acid sequences: peptide 1 - TGF-bI (Pep 1 - TGF-bI): SEQ ID N 2 01 ; peptide 2 - TGF-bis (2 Pep - TGF-BI): 02 SEQ ID NO : 2; peptide 3 - TGF-bI (Pep 3 - TGF-bI) SEQ ID NO 2 03; peptide 4 - TGF-bI (Pep 4 - TGF-bI) SEQ ID NO 2 04; peptide 5 - TGF-bI (Pep 5 - TGF-bI) SEQ ID NO 2 05; peptide 6 - TGF-bI (Pep 6 - TGF-bI) SEQ ID NO 2 06; peptide 7 - TGF-bI (Pep 7 - TGF-b1) SEQ ID NO 2 077; and
  • the peptides described in the present patent application were selected using the Phage Display (PD) methodology. The selection was carried out by evaluating the ability of said peptides to recognize the TGF-bI receptor in A549 cells, using an ELISA assay. 96-well MaxiSorp microtiter plates were coated with 1x10 6 cells diluted in PBS and incubated overnight at 4 ° C. The cells were blocked with 3% PBS-BSA for 1 h at 37 ° C, washed once with PBS and incubated with pg / ml of each TGF-bI mimetic peptide or 5 ng / ml of recombinant TGF-bI for 1 ha 37 ° C.
  • PD Phage Display
  • the plate was incubated for 1 h at 37 ° C with anti-TGF-bI antibody.
  • the plate was washed and incubated with HRP-labeled anti-human IgG antibody for 1 h at 37 ° C.
  • the TMB substrate solution was added to the plate; the reaction was stopped by heating the 2 N H2SO4 solution and read at 492 nm in a microplate reader.
  • Peptides with high affinity for cell receptors were then chemically synthesized following the phage selection manual (Barbas, CF et al. Phage Display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)), All of them were synthesized to present Histidine and Alanine as first and second amino acid residues, respectively, and a sequence of three Glycines and a Serine as the last four amino acid residues, as well as, some peptides were synthesized with an identity or similarity at least 85% among them, with the replacement, for example, of serine residues by cysteine. This substitution, specifically, modified the three-dimensional structure, inducing the formation and conformation of disulfide bridges or not. Their three-dimensional structures were predicted and shown here by the figures as follows.
  • Peptide 1 - TGF-bI (Pep 1 - TGF-bI), SEQ ID NO 2 01, was synthesized inducing the formation of disulfide bridges between cystine residues and has its three-dimensional structure predicted in Figure 1A.
  • Peptide 2 - TGF-bI (Pep 2 - TGF-bI), SEQ ID NO 2 02, was synthesized inducing the formation of disulfide bridges between cystine residues and has its three-dimensional structure predicted in Figure 1 B.
  • the peptide 3 - TGF-bI (Pep 3 - TGF-bI), SEQ ID NO 2 03, is free of disulfide bridges and has its three-dimensional structure predicted in Figure 1 C.
  • Peptide 4 - TGF-bI (Pep 4 - TGF-bI), SEQ ID NO 2 04, was synthesized inducing the formation of disulfide bridges between cystine residues and has its three-dimensional structure predicted in Figure 1 D.
  • Peptide 5 - TGF-bI (Pep 5 - TGF-bI), SEQ ID NO 2 05, is free of disulfide bridges and has its three-dimensional structure predicted in Figure 1 E.
  • Peptide 6 - TGF-bI (Pep 6 - TGF-bI), SEQ ID NO 2 06, is free of disulfide bridges and has its three-dimensional structure predicted in Figure 1 F.
  • Peptide 7 - TGF-bI (Pep 7 - TGF-bI), SEQ ID NO 2 07, is free of disulfide bridges and has its three-dimensional structure predicted in Figure 1 G.
  • Peptide 8 - TGF-bI (Pep 8 - TGF-bI), SEQ ID NO 2 08, is free of disulfide bridges and has its three-dimensional structure predicted in Figure 1 H.
  • the peptides synthesized comprising or consisting of one of SEQ IDs No. 01, 02 or 04 may present three-dimensional formation with disulfide bridges.
  • the peptides synthesized comprising or consisting of one of SEQ IDs No. 03, 05, 06, 07 and 08 presenting linearized three-dimensional shape, free of disulfide bridges. ( Figures 1A - H).
  • HEK-Nub-T ⁇ Rb cells were treated with peptides at 0.1 mM, 1 mM, 10 pM and 100 pM for 12 hours ( Figure 4A), 24 hours (Figure 4B) and 48 hours ( Figure 4C). After 12 hours of stimuli ( Figure 4A), all peptides were able to bind to the receptor.
  • Pep 1 (0.1 pM and 1 pM), Pep 2 (0.1 pM and 10 pM), Pep 3 (0.1 pM, 10 pM and 100 pM), Pep 4 (0.1 pM, 1 pM; 10 pM and 100 pM) Pep 5 (0.1 pM, 1 pM, 10 pM and 100 pM), Pep 6 (0.1 pM, 10 mM and 100 mM) and Pep 7 ((0.1 mM: 1 mM; 10 mM and 100 mM) and Pep 8 (1 mM).
  • the assay was performed so that approximately 2.5x10 4 cells / well (100 mI) were treated with 100 mI of all synthetic peptides in different concentrations (100 mM, 10 mM, 1 mM and 0.1 mM) , while rTGF-bI (recombinant antibody) at 100 ng / mL was used as a positive control.
  • rTGF-bI recombinant antibody
  • 20 mI of supernatant was transferred to a Greiner plate to which 80 mI of Quanti-blue solution was added. The plate was incubated for 1 hour at 37 ° C in 5% CO2 and the production of SEAP (secreted alkaline phosphatase) was detected at 655 nm. All tests were performed in triplicate.
  • the assay was performed so that a total of 3x10 5 cells / well (100 pl) was pretreated with 100 mI of a composition comprising one of the synthetic peptides at concentrations of 100 mM, 10 mM, 1 mM and 0 , 1 mM for 1 hour at 37 ° C in 5% CO 2 , followed by stimulation with TNF-a (200ng / mL) for 12, 24 and 48 hours.
  • TNF-a 200ng / mL
  • the same stimuli were applied to cells pretreated with TNF-a (200 ng / mL) for 1 hour at 37 ° C in 5% CO 2 followed by stimulation with 100 mM, 10 mM, 1 mM and 0 peptides, 1 mM for 12, 24 and 48 hours.
  • TNF-a 200ng / mL
  • rll_-10 0.4ng / mL
  • the assay was performed using HEK-Blue hTLR4 reporter cells (InvivoGen) to investigate the action of peptides on the TLR4 pathway.
  • a total of 2.3 x 10 4 cells / well (100 mI) was pretreated with 100 mI of composition comprising at least one of the synthetic peptides in concentrations of 100 mM, 10 mM, 1 mM and 0.1 mM for 1 hour at 37 ° C in 5% CO2 followed by LPS stimulation at 100 ng / mL for 12 hours.
  • the same stimuli were applied to cells pre-treated with LPS at 100 ng / mL for 1 hour at 37 ° C in 5% CO2, followed by stimuli with peptides at 100 mM, 10 mM, 1 mM and 0.1 mM during 12 hours.
  • the stimuli were added in Quanti-blue medium and the SEAP production was measured at 655nm.
  • peptides at the same concentrations were tested alone to investigate whether they could activate the TLR4 pathway and LPS was used as a positive control.
  • Example 5 Synthetic TGF-B1-mimetic peptides have anti-inflammatory properties and suppress IqE-mediated basophilic ananululation in vitro
  • a mediator release assay based on rat basophilic leukemia (RBL) cells that have a humanized Fc RI receptor was performed to investigate the effect of synthesized peptides on IgE-mediated basophil degranulation in an already sensitized system.
  • This assay based on sensitive cells can help to understand the action of the mimetic peptide in an already established allergic microenvironment.
  • Phl p 5 grass antigen
  • Example 6 Synthetic TGF-B1 mimetic peptides modulate the antibody response in a murine sensitization model
  • Example 7 Synthetic peptides mimetic to TGF-B1 modulate cytokine production in splenocytes re-stimulated with Phl p5
  • cytokine profile in the super-stimulated splenocyte supernatants, a multiplex cytokine analysis kit was used luminex.
  • the secretion of cytokines IFN-g (Fig 9D), IL-2 (Fig 9E), IL-4 (Fig. 9F), IL-5 (Fig. 9G) and IL-13 (Fig. 9H) was significantly lower, whereas the secretion of IL-10 (Fig. 9I) was higher in mice that received Pep 2 - TGF-bI than in untreated mice. Therefore, Pep 2 - TGF-bI negatively regulated the cytokines TH1 and TH2 involved in the immune response to Phl p5 in mice. In addition, an increase in IL-10 levels was observed. This result indicates that the peptides mimetic to TGF-bI synthesized in the present application are also capable of down-regulating the cytokines TH1 and TH2 involved in the immune response to Phl p5 in mice.
  • Example 8 The peptides synthesized mimetic to TGF-B1 modulate the production of Treq cells
  • mice treated with the Pep 2 - TGF-bI had 43.9% (Fig 10A-B).
  • the percentage of CD4 + CD25 + Foxp3 + T cells expressing the CTLA4 factor in mice without sensitization and sensitized with Phl p 5 was 5.62% and 9.46%, respectively, while mice treated with Pep 2 - TGF- bI this value was 12.5% (Fig 10C-D).
  • TH2 lymphocytes produce cytokines such as IL-4, IL-5 and IL-13 and lead to a class change in the production of B-cell immunoglobulins to IgE, which triggers the allergic reaction.
  • cytokines such as IL-4, IL-5 and IL-13
  • IgE B-cell immunoglobulins to IgE
  • IL-4 reporter mouse 4get mice express GFP as part of a IL-4-IRES-GFP bicistronic mRNA, allowing the identification of cells that express IL-4 in situ during an allergen-induced TH2 response.
  • the present patent application describes 4 synthetic peptides with affinity for the interleukin-10 receptor that comprise or consist of the amino acid sequences: peptide 1 - IL-10 (Pep 1 - IL-10): SEQ ID 09; peptide 2 - IL-10 (Pep 2 - IL-10): SEQ ID NO: 2 10; peptide 3 - IL-10 (Pep 3 - IL ⁇ 10) SEQ ID INI * 1 1; peptide 4 - IL-10 (Pep 4 - IL-10) SEQ ID NO 2 12.
  • Such peptides showed important activity on immunological modulatory and regulatory pathways. Therefore, they can be used in the treatment and / or prophylaxis of diseases related to immune disorders, such as: chronic or acute inflammatory diseases, allergic and / or autoimmune diseases.
  • peptides described in the present patent application were selected using the Phage Display (PD) methodology. They were obtained randomly after three rounds of selection using a PhD-7mer and PhD12 random peptide library. The selection was carried out using the cell line J774; for this, a competitive elution with rlL-10 (11-10 recombinant) was adopted to select peptides with affinity to the IL-10 receptor.
  • PD Phage Display
  • Pre-screening was performed on Peripheral Blood Mononuclear Cells (from the English PBMC - Peripheral Blood Mononuclear Cell) using phage supernatant to select phages from the PhD-7mer and
  • Peptides with high affinity for cell receptors were then chemically synthesized following the phage selection manual (Barbas, CF et al. Phage Display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)) and their three-dimensional structures were predicted. All of them were synthesized in order to present Histidine as the first amino acid residue and a sequence of three Glycines and a Serine as the last four amino acid residues.
  • Peptide 1 - IL-10 (Pep 1 - IL-10).
  • SEQ ID 09 has its three-dimensional structure, with disulfide bridges, predicted in Figure 12A.
  • Peptide 2 - IL-10 (Pep 2 - IL-10). SEQ ID N s 10, has its three-dimensional structure, without disulfide bridge, predicted in Figure 12B.
  • Peptide 3 - IL-10 (Pep 3 - IL-10). SEQ ID N s 11, has its three-dimensional structure predicted in Figure 12C.
  • Peptide 4 - IL-10 (Pep 4 - IL-10). SEQ ID N s 12, has its three-dimensional structure predicted in Figure 12D.
  • Pep 1 - IL-10 and Pep 2 - IL-10 were synthesized with an identity or similarity of at least 85% between them.
  • the amino acid residues in positions three (3) and eleven (11) were replaced from Serine in Pep 2 to Cysteine in Pep 1. Therefore, Pep 1 - IL-10 is the only peptide that was synthesized with a disulfide bridge, being its three-dimensional structure distinct from the structure of Pep 2 - IL-10 and more compact compared to Pep 3 - IL-10 and Pep 4 - IL ⁇ 10.
  • the black sphere is representative of the C-alpha atom of first residue, just for guidance, while hydrophilic residues are blue and hydrophobic residues are red.
  • Example 10 Treatment of reporter cells with IL-10 mimetic peptides.
  • reporter cell lines were used. To analyze whether isolated peptides (without activation molecules) could induce any type of activation, isolated peptides were tested in cell lines for 12, 24 and 48 hours of treatment. In all reporter cells and at all times tested, synthetic peptides with an affinity for the IL-10 receptor did not induce any type of activation when they were alone, with no inflammatory environment to induce activation of the NFKB, IFN OR TLR4 pathways.
  • Figures 13A, Figure 13B and Figure 13C show an analysis of NFkB expression after stimulation with the synthetic peptides with affinity to the synthesized IL-10 receptor described herein.
  • the cells were treated for 12, 24 and 48 hours with the peptides synthesized Pep 1 - IL10, Pep 2 - IL10, Pep 3 - IL10 and Pep 4 - IL10, in different concentrations, without activation molecules. Luciferase was then measured after 12 hours of treatment (Figure 13A), 24 hours of treatment (Figure 13B) and 48 hours of treatment (Figure
  • TNF-a 200 ng / mL was used as a positive control.
  • the assay was then performed using TNF-a as an activation molecule not only in the control, but after a pretreatment with the peptides synthesized Pep 1 - IL10, Pep 2 - IL10, Pep 3 - IL10 and Pep 4 - IL10, in different concentrations. All peptides were able to modulate NFKB activation after 12, 24 and 48 hours, with different results depending on the concentrations used. The most significant results will be described below. Pretreatment with Pep 1 - IL10 at all concentrations tested was, with statistical significance, able to decrease NFKB activation after 12, 24 and 48 hours (P ⁇ 0.0005) of stimulation with TNF-a ( Figure 14 A, B and C).
  • Pretreatment with Pep 2 had the most statistically significant results at 100 mM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 0.5 pM and 0.1 pM also decreasing the activation of NFKB, with statistical significance (P ⁇ 0.0005), after 12, 24 and 48 hours ( Figure 14 A, B and C).
  • Pretreatment with Pep 3 had the most statistically significant results at 0.05 mM (P ⁇ 0.05) reducing the activation of the pathway after 12 hours of treatment ( Figure 14A) and at 0.01 pM (P ⁇ 0, 05) after 48 hours ( Figure 14C), although it has shown results in other concentrations and also with 24 hours of treatment, as can be seen in Figures 14 A, B and C, but with less significance.
  • Another assay was then carried out in which the cells were pretreated with TNF-a and the peptides synthesized Pep 1 - IL10, Pep 2 - IL10, Pep 3 - IL10 and Pep 4 - IL10, in different concentrations, were added posteriorly. All peptides were able to modulate NFKB activation after 12, 24 and 48 hours, with different results depending on the concentrations used. The most significant results will be described below.
  • Pep 1 in concentrations of 10 mM, 5 pM, 1 pM, 0.5 pM, 0.1 pM (P ⁇ 0.05), 0.05 pM and 0.001 pM (P ⁇ 0.0005) decreased activation of the analyzed pathway after 12 hours of treatment ( Figure 15A).
  • Pep 1 at 100 mM (P ⁇ 0.0005), 10 pM (P ⁇ 0.005), 1 pM (P ⁇ 0.0005), 0.1 pM (P ⁇ 0.05), 0.005 pM (P ⁇ 0.0005), 0.001 pM (P ⁇ 0.005) and 0.0001 pM (P ⁇ 0.0005);
  • Pep 2 at 100 pM and 10 pM (P ⁇ 0.0005), 5 pM (P ⁇ 0.005), 1 pM (0.0005) and 0.5 pM (P ⁇ 0.05);
  • Pep 3 at 10 pM (P ⁇ 0.05), 0.005 pM (P ⁇ 0.05) and 0.001 pM (P ⁇ 0.05), were able to decrease NFKB signaling after 24 hours of treatment (Figure 15B) .
  • TNF-a (200ng / ml) was used as a positive control and rlL-10 (recombinant interlayer-10) (0.4ng / ml) as a negative control.
  • pathway activation was decreased when Jurkat cells were pretreated with 10 mM Pep 1 (P ⁇ 0.005) for 12 hours ( Figure 16A); Pep 3 at 100 mM (P ⁇ 0.005) for 48 hours (Figure 16C); and Pep 4 at 100 pM (P ⁇ 0.005) and 0.05 pM (P ⁇ 0.05) for 48 hours ( Figure 16C).
  • the cells were pretreated with IFN, although the peptides, in some concentrations, have shown results, they were not statistically sufficient. Therefore, we cannot confirm whether they were able to interfere with the activation of the pathway (Figure 17 A, B and C) in the same or better way than the negative control (rll_-10).
  • HEK cells were used to investigate the ability of the peptides synthesized Pep 1 - IL10, Pep 2 - IL10, Pep 3 - IL10 and Pep 4 - IL10 to modulate the activation of the TLR4 signaling pathway after 12 hours of treatment. All peptides were able to modulate the activation of the TLR4 signaling pathway after 12 hours, with different results depending on the concentrations used. The most significant results will be described below.
  • Pep 1 at 0.005 mM (P ⁇ 0.05); Pep 2 at 100 pM (P ⁇ 0.05), 0.1 pM (P ⁇ 0.0005); Pep 3 at 100 pM (P ⁇ 0.05), 5 pM (P ⁇ 0.05), 1 pM (P ⁇ 0.005), 0.5 pM (P ⁇ 0.005), 0.1 pM (P ⁇ 0.005) and 0.005 mM (P ⁇ 0.05); and Pep 4 at 100 mM (P ⁇ 0.05), 10 mM (P ⁇ 0.005), 5 mM (p ⁇ 0.05) and 1 mM (P ⁇ 0.05) significantly reduced pathway activation (Figure 18A ).
  • Example 11 Effect of IL-10 mimetic peptides on dendritic and T cells in an inflammatory and allergic environment
  • Murine bone marrow dendritic cells were isolated from mice to analyze the effect of the peptides synthesized Pep 1 - IL-10, Pep 2 - IL-10, Pep 3 - IL-10 and Pep - 4 - IL-10, in two concentrations, 1 mM and 10 mM, in modulating cell activation. After 24 hours of treatment with a composition comprising at least one of the peptides in the concentration cell analysis showed that all four synthesized peptides showed responses at different levels and were able to interfere with the co-stimulatory molecules present on the surface of dendritic cells, with Pep 1 and 2 peptides having the most significant response.
  • Pep 1 at 1 mM decreased CD86 + expression (P ⁇ 0.005), and at 10 mM also decreased CD86 + expression (P ⁇ 0.05).
  • Pep 2 at 1 pM reduced the expression of CD86 + and CD40 + on the cell surface (P ⁇ 0.005; P ⁇ 0.05, respectively) ( Figure 19 A and B).
  • Example 12 Action of peptides mimicking IL-10 in the dephranulation of basophils
  • IL-10 mimetic peptides were examined using rat basophilic leukemia cells transfected with the human Fc RI IgE receptor (hRBL).
  • hRBL human Fc RI IgE receptor
  • Pep 1 - IL-10 was selected as an example to show the data obtained.
  • the hRBL cells were sensitized with serum from seven patients allergic to birch pollen. The cells were stimulated with the antigen and their interaction with immobilized IgEs caused a release of b-hexosaminidase.
  • Pep1 - IL-10 (1 mM, 10 pM and 100 pM, 1 pM P ⁇ 0.05 and 10 pM and 100 pM P ⁇ 0.0005) significantly reduced IL-6 levels (1 pM and 10 pM, P ⁇ 0.05) ( Figure 22A); MCP-1 ( Figure 22B) and TNF-a (1 pM, 10 pM and 100 pM, P ⁇ 0.005) ( Figure 22C).
  • the decreases were significant compared to cells treated with LPS only (positive control).
  • Example 14 Combination of peptides mimetic to TGFB1 and IL-10 suppresses dephranulation of basophils
  • mice immunized with birch pollen extract in combination with peptides mimetic to TGF-bI and IL-10 in the example presented here we use the combination of Pep 2 - TGF-bI with Pep 1 - IL-10, showed significantly lower levels of basophil degranulation compared to the control group (P ⁇ 0.01).
  • FIG. 23 A shows the animal immunization schedule.
  • Figure 23 B shows the titration curve for the mediator release assay performed with sera from all groups showing that mice treated with the synthesized peptides had substantially lower levels of basophil degranulation.
  • Figure 23 C shows the mediator release assay performed with individual sera reinforcing the action of peptides in the negative regulation of degranulation of IgE-specific basophils. ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001.
  • female BALB / c mice (6-10 weeks old) were used in this study.
  • the immunization schedule was carried out as described in Figure 23A.
  • Five mice were immunized intradermally (id) with 125 pg of birch pollen extract diluted in PBS.
  • Five mice were immunized (id) with 125 pg of birch pollen extract in combination with peptides mimetic to TGFpi and IL-10 diluted to 1 pM in PBS each.
  • Three mice constituted the control group. Immunizations were performed on days 1, 14, 28 and 42, and mice were sacrificed on day 56.
  • blood samples were taken from the saphenous vein on days 28 and 42 after the first immunization.
  • Example 15 The combination of TGFB1-mimetic oeotides and IL-10 modulates cytokine production
  • TGF-bI and IL-10 mimetic peptides were investigated by ELISPOT .
  • Immunization with birch pollen extract resulted in a high induction of IFN-g (P ⁇ 0.001) and IL-4 (P ⁇ 0.001) production after stimulation with Bet v 1.
  • the spleens were aseptically removed immediately after the mice were sacrificed, lysed and centrifuged for 5 min in 1 ml of minimal essential culture medium (MEM). Lysis of the erythrocytes was performed by adding 5 ml of lysis buffer (150 mM NH4CI, 10 mM KFIC03, 0.1 mM Na2EDTA in ddFI20, pH 7.2) for 5 min at room temperature. The white blood cells were separated by centrifugation at 300 x g for 5 min at room temperature.
  • MEM minimal essential culture medium
  • the cells were resuspended in culturan medium (MEM, 1% (v / v) of heat-inactivated fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 U / ml streptomycin, 20 mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate, 2 M 2-mercaptoethanol and 1 * non-essential amino acids) and used in subsequent experiments.
  • MEM 1% (v / v) of heat-inactivated fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 U / ml streptomycin, 20 mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate, 2 M 2-mercaptoethanol and 1 * non-essential amino acids
  • MultiScreen filtration plates were activated with 70% ethanol for 10 min, washed three times with PBS, and 2 pg / ml anti-mouse IFN-g, anti-mouse IL-4 or anti-mouse IL-10 was added during night at 4 ° C in a humid chamber. The plates were washed three times with PBS and incubated for 2 h with blocking solution (culture medium supplemented with 5% fetal bovine serum) in a humid chamber at RT.
  • blocking solution culture medium supplemented with 5% fetal bovine serum
  • the splenocytes were diluted to a density of 2x105 in culture medium, in the presence of Bet v 1 diluted to 20 pg / ml, and incubated for 48 hours at 37 ° C and 5% CO2. After three washes with PBS supplemented with 0.1% Tween-20; IFN-g, IL-4 and IL-10 detection antibodies were added to the plates and incubated for 2h at room temperature. After three washes, streptavidin conjugated to HRP was added to the plates and incubated for 1 h at room temperature. After four washes, the TMB substrate was added to each plate for 5 min before stopping by washing with ddhteO. Immunospots were counted using the ImageJ software.
  • Example 16 Analysis of splenocytes and the ability of peptides mimetic to TGFB1 and IL-10 to modulate cytokine production with pretreatment or together with allergen
  • TGFp and IL-10 mimetic peptides were identified in Figures 25A to 25D such as: BPE; pre-immunized for 24 hours with peptide mimetics to TGFp and IL-10 (1 pM / animal) followed by immunization with birch pollen extract (125pg) (results were identified in Figures 25A to 25D as: PRE); or immunized with the TGFp peptide mixture + IL-10 peptide + birch pollen extract (results were identified in Figures 25A to 25D as: CO).
  • Splenocytes were isolated from mice and the production of IL-4, IL-5, IL-2 and IL-13 was analyzed by multiplex after challenge with Bet v 1 (2 pg / mL).
  • mice in the CO group that is, those that were treated with the combination of peptides mimetic to TGF-bI and IL- 10, together with the allergen of interest (birch pollen extract), showed slightly better results compared to the group that was pretreated (PRE) with only the peptide combination.
  • PRE pretreated
  • Such a result indicates that, in vivo, the use of a composition comprising a combination of peptides mimetic to TGF-bI and IL-10, described in the present invention, is capable of acting synergistically in modulating an immune response. More than that, the results also indicate a synergistic effect not only between the mimetic peptides but also when the allergen was added to the treatment composition. The results were enhanced when adding the allergen of interest together with the combination of mimetic peptides.
  • Example 17 Analysis of the ability of peptides mimetic to TGFB1 and IL-10 to modulate basophilic ananululation with pretreatment or together with allergen
  • TGFp and IL-10 mimetic peptides were identified in Figures 26 as: BRE; pre-immunized for 24 hours with the combination of peptides mimetic to TGFp and IL-10 (1 pM / animal) followed by immunization with birch pollen extract (125pg) (results were identified in Figures 26 as: PRE); or immunized with the TGFp peptide + IL-10 peptide + birch pollen extract mixture (results were identified in Figures 26 as: CO).
  • Degranulation was induced by the addition of Bet v 1 (1000ng / mL, 100ng / mL, 10ng / mL and 1 ng / mL).
  • the mice in the CO group surprisingly, showed substantially lower levels of degranulation compared to the other two groups. Suggesting that, in vivo, the combination of the peptides, together with the allergen of interest, was able to reduce the production of allergen-specific IgE antibodies.
  • the present patent application demonstrates the ability of the new peptides synthesized TGF-bI mimetics and IL-10 mimetics to modulate the response of several important pathways in the regulation of an autoimmune and / or inflammatory process.
  • the immune modulation specific to allergens is an essential process to prevent the development of allergy, where IgE plays a fundamental role.
  • inhibition of IgE production is a crucial event to suppress allergic reactions.
  • peptides mimetic to TGFpi and IL-10 effectively inhibited basophil degranulation.
  • the ability of these two cytokines to modify the production of IgE antibodies in relation to non-inflammatory antibody isotypes has been reported.
  • the new synthesized peptides described in the present application which are small molecules and that can mimic the action of specific large proteins, are able to induce the same or better response as expected with the natural molecule or in comparison with other synthetic molecules already described .
  • IFN-g is a cytokine that contributes directly and indirectly to the differentiation of the Th1 profile
  • IL-4 is a cytokine that promotes the differentiation of the Th2 profile
  • the negative regulation of these two cytokines indicates a modulation of the Th1 polarization or Th2, an essential event to control the inflammatory / allergic response.
  • IL-4 is known to induce IgE class exchange in mice (27), therefore, it may help to explain our previous result, showing that the peptides suppressed IgE-mediated basophil degranulation. We hypothesized that inhibition of IL-4 consequently suppresses IgE production.
  • mice with the combination of peptides mimetic to TGFpi and IL-10 when performed together with the antigen of interest in example demonstrated here the birch pollen extract, have resulted in an improved effect both in the modulation of the allergic response (suppression of the degranulation of basophils), and in the modulation of the production of inflammatory cytokines.
  • the present patent application describes synthetic peptides with TGFp receptor affinity and synthetic peptides with IL-10 affinity, to be used in combination of at least one TGFpi-mimetic peptide with at least one IL-mimetic peptide. -10, in a pharmaceutical composition for use in the treatment and / or prophylaxis of diseases related to immunological disorder, more particularly, chronic or acute and / or allergic, and / or autoimmune inflammatory diseases.
  • compositions comprising at least one TGFpi mimetic peptide with at least one IL-10 mimetic peptide, plus at least one pharmaceutically acceptable carrier or compound. More particularly, the composition may further comprise an allergen of interest as a pharmaceutically acceptable compound.
  • the Pharmaceutical Composition is for use in the treatment and / or prophylaxis of diseases related to immune disorders, more particularly, chronic or acute and / or allergic, and / or autoimmune inflammatory diseases.
  • the present application also describes the use of synthetic peptides or of the pharmaceutical compositions described herein, for the preparation of a medicament or immunogenic composition for use in the treatment and / or prophylaxis of diseases related to immunological disorder, more particularly, chronic or acute and / or allergic, and / or autoimmune inflammatory diseases.
  • the present application also describes methods of treatment and / or prophylactic of diseases related to immunological disorder in which it comprises administering to a subject a pharmaceutically effective dose of at least one recombinant peptide with affinity for the TGF-b receptor and at at least one recombinant peptide with affinity for the interleukin-10 receptor, or a pharmaceutical composition comprises the combination thereof. More particularly in that fact that it still comprises administering an allergen of interest together.

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Abstract

A presente invenção refere-se à seleção e caracterização de peptídeos sintéticos, que possuem afinidade por receptores presentes em células do sistema imunológico, mais particularmente peptídeos com afinidade ao receptor de TGF-β e peptídeos com afinidade ao receptor de IL-10, bem como composições farmacêuticas e uso destes peptídeos combinados para preparar medicamentos ou composições imunogências. Estes peptídeos sintéticos podem se ligar a receptores celulares e promover um perfil regulatório importante para o tratamento e/ou profilaxia de doenças, mais particularmente doenças inflamatórias crônicas ou agudas e/ou alérgicas.

Description

COMBINAÇÃO DE PEPTÍDEOS SINTÉTICOS COM AFINIDADE AO RECEPTOR DE TGF-b e COM AFINIDADE AO RECEPTOR DE IL-10, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DOS MESMOS COMO IMUNOMUDULADORES NO TRATAMENTO DE DOENÇAS AUTOIMUNES, INFLAMTÓRIAS OU ALÉRGICAS Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se à combinação de peptídeos sintéticos que possuem afinidade por diferentes receptores presentes em células do sistema imunológico, mais particularmente a combinação de peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor do Fator de Transformação de Crescimento - beta (da sigla em inglês: TGF-b), com peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de lnterleucina-10 (IL-10). Ambos os receptores são conhecidos por apresentarem papel importante na modulação da reposta imunológica, inflamatória e alérgica. Além disso a presente inveção também descreve composições farmacêuticas compreendedo a combinação de ao menos um de cada destes peptídeos sintetizados e o uso destes peptídeos para preparar medicamentos ou composições imunogências para o tratamento e/ou profilaxia de doenças aonde haja uma desordem imunológica, mais particularmente em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
Fundamentos da Invenção
[002] O fator de transformação do crescimento (TGF)-pi é uma citocina pleiotrópica que atua em diversos processos biológicos, incluindo desenvolvimento embrionário e proliferação celular, diferenciação, adesão, migração e apoptose. Sua sinalização tem sido proposta para o controle de células T periféricas auto-reativas, presentes em pacientes portadores de doenças auto-imunes. Essa citocina também desempenha um papel importante na indução de células T auxiliares capazes de regular a produção de citocinas e a ativação da via a fim de reparar a resposta imunológica.
[003] O TGF-bI é produzido por vários tipos celulares, como plaquetas, neutrófilos, células malignas, células dendríticas e macrófagos. Consequentemente, essa citocina tem efeito importante nas doenças inflamatórias, alérgicas e autoimunes. Devido à diversidade do TGF-bI , muitos fatores são responsáveis por ativar vias canónicas ou não-canônicas para induzir múltiplos efeitos biológicos e interferir em diferentes vias pró-inflamatórias. Essa citocina pode modular diferentes vias diretamente relacionadas aos receptores do TGF-b e também em resposta à sinalização crosstalk.
[004] O TGF-bI é uma citocina que desempenha um papel importante na inflamação alérgica. Ele pode suprimir células T efetoras e está envolvido no desenvolvimento de células T convencionais, inatas e reguladoras (Treg). As células T desempenham um papel fundamental na manutenção da tolerância periférica contra antígenos comensais, autólogos e ambientais. Em camundongos com o gene do TGF-bI interrompido, e em camundongos sem o receptor II do (TORbRII), foram observadas respostas inflamatórias severas, necrose tecidual e morte precoce, confirmando o papel regulador do TΰRb1 na tolerância periférica.
[005] A IL-10 é uma citocina pleiotrópica reguladora produzida por diferentes tipos de células: monócitos, células T, macrófagos, células dendríticas (CD), células natural killer (NK) e células B. Por influenciar diferentes tipos celulares, a IL-10 tem se mostrado uma molécula importante associada a uma ampla gama de doenças, distúrbios e condições, incluindo condições inflamatórias e alérgicas, distúrbios relacionados a imunidade e câncer, devido à sua capacidade de regular a resposta imune humoral e celular. Assim, o entendimento de como a IL-10 regula diferentes tipos celulares, é crucial para o desenvolvimento de novas estratégias de intervenção para o tratamento de várias patologias.
[006] Os linfócitos T estão entre os principais fatores envolvidos na regulação da resposta imune adaptativa nas doenças inflamatórias. Em um sistema imunológico saudável, células T helper Tipo I (Th1 ) são necessárias para a eliminação de muitos patogenos intracelulares, enquanto que as células Th2 são necessias para a eliminação da infecção por helmintos. Uma quebra no equilíbrio Th1/Th2 pode levar a distúrbios imunológicos com desfechos fatais. Em um sistema imunológico desequilibrado, as células Th1 estão envolvidas em reações imunes de hipersensibilidade tardia, enquanto as células Th2 estão envolvidas em doenças alérgicas. Os linfócitos Th1 produzem IFN-g e IL-2 para apoiar a imunidade mediada por células, enquanto os linfócitos Th2 produzem citocinas como IL-4, IL-5 e IL-13, que desempenham papéis importantes na exacerbação da resposta alérgica. A IL-4 é a principal citocina para a polarização de uma resposta Th2, que, juntamente com a IL-13, induz a mudança de classe da produção de imunoglobulinas de linfócitos B para IgE. As reações alérgicas são iniciadas após a exposição subsequente ao alérgeno, onde este se liga a IgE específica juntamente com o alérgeno ligado ao receptor Fc RI de alta afinidade nos mastócitos ou basófilos, desencadeando a degranulação celular. Este evento alerta o sistema imunológico para infecção local e propaga a resposta alérgica inflamatória. Assim, a modulação de citocinas de células encontradas em um perfil Th1/Th2 é essencial para a manutenção ou restauração da homeostase imunitária.
[007] O pólen de bétula (Bétula verrucosa) é a principal causa de polinose na zona de clima temperado do hemisfério norte. A grande maioria dos pacientes alérgicos à bétula (mais de 90%) reage ao seu principal alérgeno, o Bet v 1 , que tem capacidade de promover a indução de um perfil Th2, e é usado como marcador de alergia ao pólen de bétula. A imunoterapia específica para alérgenos (ASIT) tem demonstrado modular o curso natural das alergias, levando à melhora ou mesmo à completa remissão dos sintomas alérgicos (Mobs, C. et al Cellular and humoral mechanisms of immune tolerance in immediate-type allergy induced by specific immunotherapy. Int Arch Allergy Immunol. 2008;147(3):171-8). No entanto, embora a ASIT seja o tratamento de escolha para muitos pacientes, foram relatados efeitos colaterais locais e sistémicos alérgicos. A imunoterapia com alérgeno sublingual também tem sido associada a efeitos colaterais.
[008] O fator de transformação do crescimento b1 (TGFpi ) é uma citocina que desempenha importantes propriedades imunorreguladoras, como refletido por sua capacidade de suprimir as respostas Th1 e Th2 e por induzir a expressão da proteína 3 da caixa de forquilha do fator de transcrição (Foxp3). O Foxp3 é um regulador mestre envolvido no desenvolvimento e na função de células T reguladoras (Treg). As células Treg são indispensáveis para a manutenção da homeostase imunológica e a indução da tolerância imunológica. Sua disfunção pode levar ao desenvolvimento de doenças autoimunes, imunopatologia e alergia. Por outro lado, a Interleucina 10 (IL-10) é uma citocina associada a importantes funções imunorreguladoras, incluindo a sobrevivência e a proliferação de várias células do sistema imunológico. Assim, peptídeos que podem imitar o domínio de ativação do TGF-bI e da IL-10 podem ser candidatos promissores para a supressão da resposta Th2.
[009] Para desenvolver novas moléculas com abordagens farmacêuticas, a metodologia de Phage Display (PD) pode ser uma boa opção, uma vez que nos permite selecionar moléculas pequenas que podem imitar aminoácidos específicos de proteínas grandes e induzir a mesma ou melhor resposta conforme esperado com a molécula natural ou em comparação com outras moléculas recombinantes já descritas. Peptídeos selecionados pela PD apresentam baixa toxicidade e alta afinidade receptor/proteína.
[010] Os peptídeos miméticos terapêuticos são potenciais candidatos a drogas para muitas doenças diferentes, já que têm o potencial de antagonizar, estimular, aumentar ou modular a atividade de ligantes naturais, ligando-se a receptores específicos da superfície celular e desencadeando vias intracelulares.
[011] Na busca de estratégias terapêuticas a patente WO2012167143 A1 relata a utilização da tecnológica de phage display na obtenção de um anticorpo específico ligante a molécula de TGF-b que pode ser utilizado em pacientes que possuem desordem relacionados a expressão de TGF-b, tal como câncer. Esses resultados mostram a eficiência da técnica no desenvolvimento de anticorpos recombinantes no tratamento de doenças.
[012] O pedido de patente BR 102015003903-4 descreve 27 Peptídeos sintéticos e suas sequências inversas, selecionados por Phage Display, que possuem afinidade pelo receptor da TGF-b. O referido pedido de patente descreve então o uso dessas sequências peptídicas sintetizadas em composições farmacêuticas na regulação do sistema imunológico, a fim de obter o controle da infalmação ou permitir o tratamento de doenças inflamatórias e auto-imunes. O referido pedido de patente também descreve a possibilidade de usar tais peptídeos sintetizados em métodos de diagnóstico ou prognóstico de doenças relacionadas.
[013] A IL-10 recombinante, por exemplo, já demonstrou ser segura, bem tolerada e eficaz em pacientes com doença de Crohn (Fedorak, R. N. et al. Gastroenterology 2000 Dec; 119(6): 1473-82). O pedido de patente BR 102017010787-6 descreve 101 Peptídeos sintéticos, selecionados por Phage Display, que possuem afinidade pelo receptor da IL-10. O referido pedido de patente descreve então o uso dessas sequências peptídicas sintetizadas no tratamento e acompanhamento de um processo inflamatório, doenças alérgicas e doenças auto-imunes.
Objetivo da invenção
[014] O presente pedido de patente teve como objetivo selecionar novos peptídeos miméticos à TGF-bI e à IL-10, pela tecnologia PD, que tivessem capacidade melhorada de modular e atenuar resposta imunológica, mais particularmente, controlar respostas inflamatórias e alérgicas.
[015] Dos peptídeos estudados, oito (8) peptídeos com ação semelhante ao TGF-bI foram selecionados e sintetizados e quatro (4) peptídeos com ação semelhante ao IL-10 foram selecionados e sintetizados, tendo suas estruturas tridimensionais preditas.
[016] Os dados obtidos mostraram a capacidade da combinação de peptídeos miméticos ao TGF-bI com peptídeos miméticos ao IL-10 em dimunir a resposta alérgica e inibir as vias inflamatórias nos ensaios realizados. Tal resultado mostra o potencial de uso farmacêutico da combinação dos peptídeos sintéticos aqui apresentados na modulação de respostas alérgicas inflamatórias.
Breve descrição da invenção
[017] O presente pedido de patente descreve peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de TGF-b e peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de lnterleucina-10 (IL-10). Estes peptídeos foram sintetizados e suas estruturas tridimensionais foram preditas. Todos eles foram sintetizados de modo a apresentar a Histidina e a Alanina como primeiro resíduo de aminoácido, em alguns casos, a Alanina como segundo resíduo de aminoácido e uma sequência de três Glicinas e uma Serina como os últimos quatro resíduos de aminoácidos. Tais peptídeos apresentaram atividade importante sobre vias moduladoras e regulatórias imunológicas. Potanto, podem ser usados no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, como por exemplo: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes. Portanto, os peptídeos miméticos ao TGF-bI e a IL10 podem ser candidatos promissores para atenuar reações inflamatórias e alérgicas quando usados em combinação.
[018] Uma outra modalidade do presente pedido são os métodos de tratamento e/ou profilático de doenças relacionadas a desordem imunológica, em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes, compreendendo administrar em um indivíduo uma dose farmaceuticamente efetiva de uma combinação de pelo menos um dos peptídeos sintéticos miméticos ao TGF-bI e de pelo menos um dos peptídeos sintéticos miméticos ao IL-10.
[019] Outra modalidade do presente pedido são composições farmacêuticas que compreendem uma combinação de pelo menos um dos peptídeos sintéticos miméticos ao TGF-bI e de pelo menos um dos peptídeos sintéticos miméticos ao IL-10, mais, pelo menos, um veículo ou composto farmacêuticamente aceitável. A Composição farmacêutica é para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[020] Outra modalidade do presente pedido é o uso da combinação de peptídeos sintéticos ou das composições farmacêuticas aqui descritas, para a preparação de um medicamento ou composição imunogênica para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
Breve descrição das figuras
[021] A presente invenção será melhor compreendida com base na descrição, a seguir, tomada em conjunto com as figuras anexas, nas quais:
[022] A FIGURA 1A mostra a estrutura tridimensional predita do Pep
1 - TGF-bI .
[023] A FIGURA 1 B mostra a estrutura tridimensional predita do Pep
2 - TGF-bI .
[024] A FIGURA 1C mostra a estrutura tridimensional predita do Pep 3 - TGF-bI .
[025] A FIGURA 1 D mostra a estrutura tridimensional predita do Pep
4 - TGF-bI .
[026] A FIGURA 1 E mostra a estrutura tridimensional predita do Pep
5 - TGF-bI . [027] A FIGURA 1 F mostra a estrutura tridimensional predita do Pep 6
- TGF-bI .
[028] A FIGURA 1 G mostra a estrutura tridimensional predita do Pep
7 - TGF-bI .
[029] A FIGURA 1 H mostra a estrutura tridimensional predita do Pep 8 - TGF-bI .
[030] A FIGURA 2 mostra uma análise de comportamento de agregação dos peptídeos miméticos ao TGF-bI sintetizados em solução analisados por DLS.
[031 ] A Figura 3 mostra uma análise de reconhecimento pelo anticorpo anti-TGF-bI dos peptídeos miméticos ao TGF-bI sintetizados, na superfície celular da linhagem A549.
[032] A Figura 4A mostra a ativação da via TRObRII/eMAϋ dependente, através da análise da produção de SEAP (fosfatase alcalina secretada) após tratamento com os peptídeos miméticos ao TΰRb1 sintetizados aqui descritos por 12 horas.
[033] A Figura 4B mostra a ativação da via TRObRII/eMAϋ dependente, através da análise da produção de SEAP (fosfatase alcalina secretada) após tratamento com os peptídeos sintetizados aqui descritos por 24 horas.
[034] A Figura 4C mostra a ativação da via TRObRII/eMAϋ dependente, através da análise da produção de SEAP (fosfatase alcalina secretada) após tratamento com os peptídeos sintetizados aqui descritos por 48 horas.
[035] A Figura 5A mostra uma análise do efeito dos peptídeos sintetizados na via NFkB, após pré-tratamento com os peptídeos durante 1 hora, seguidas de estímulo com TNF-a e analisado após 12 horas.
[036] A Figura 5B mostra uma análise do efeito dos peptídeos sintetizados na via NFkB, após pré-tratamento com os peptídeos durante 1 hora, seguidas de estímulo com TNF-a e analisado após 24 horas.
[037] A Figura 5C mostra uma análise do efeito dos peptídeos sintetizados na via NFkB, após pré-tratamento com os peptídeos durante 1 hora, seguidas de estímulo com TNF-a e analisado após 48 horas.
[038] A Figura 5D mostra uma análise do efeito dos peptídeos sintetizados na via NFkB, após pré-estímulo com TNF-a durante 1 hora, seguido da adição dos peptídeos e analisado após 12 horas.
[039] A Figura 5E mostra uma análise do efeito dos peptídeos sintetizados na via NFkB, após pré-estímulo com TNF-a durante 1 hora, seguido da adição dos peptídeos e analisado após 24 horas.
[040] A Figura 5E mostra uma análise do efeito dos peptídeos sintetizados na via NFkB, após pré-estímulo com TNF-a durante 1 hora, seguido da adição dos peptídeos e analisado após 48 horas.
[041] A Figura 6A mostra análise para investigar a ação dos peptídeos na via TLR4, após pré-tratamento com os peptídeos sintetizados, seguido por estímulo de LPS e analizado após 12 horas.
[042] A Figura 6B mostra análise para investigar a ação dos peptídeos na via TLR4, após pré-estímulo com LPS, seguido da adição dos peptídeos e analisado após 12 horas.
[043] A Figura 7A mostra um ensaio ELISA para avaliar a ligação de rTGF1 1 e o Pep 2 na superfície celular de Jurkat. [044] A Figura 7B mostra um ensaio repórter da luciferase mostrando a expressão do gene da IL-8 em células A549 estimuladas com TNF-a e tratado com Pep 2.
[045] A Figura 7C mostra um ensaio de produção/secreção de IL-8 em células A549 estimuladas por TNF-a e tratado com Pep 2.
[046] A Figura 7D mostra um ensaio da ação do Pep 2 na secreção de
TNF-ct.
[047] A Figura 7E mostra um ensaio da ação do Pep 2 na secreção de
IL-10.
[048] A Figura 7F mostra um ensaio de liberação de mediador baseado em células de leucemia basófila de rato (RBL) que possuem receptor Fc RI humanizado para investigar o efeito do Pep 2 na degranulação de basófilos mediada por IgE.
[049] A Figura 8A mostra um esquema de imunização em aniumais.
[050] A Figura 8B mostra um ensaio de imunização com Phl p5 recombinante, mostrando a ação do Pep 2 na degranulação de basófilos.
[051]
[052] A Figura 8C mostra um ensaio de imunização com Phl p5 recombinante, mostrando a ação do Pep 2 nos níveis de IgE.
[053] A Figura 8D mostra um ensaio de imunização com Phl p5 recombinante, mostrando a ação do Pep 2 nos níveis de lgG1.
[054] A Figura 8E mostra um ensaio de imunização com Phl p5 recombinante, mostrando a ação do Pep 2 nos níveis de lgG2a.
[055] A Figura 8F mostra um ensaio de imunização com Phl p5 recombinante, mostrando a ação do Pep 2 nos níveis de IgA. [056] A Figura 9A mostra um ensaio de imunização com Phl p5 recombinante em esplenócitos, mostrando a ação do Pep 2 nos níveis de IFN-g.
[057] A Figura 9B mostra um ensaio de imunização com Phl p5 recombinante em esplenócitos, mostrando a ação do Pep 2 nos níveis de IL-4.e [058] A Figura 9C mostra um ensaio de imunização com Phl p5 recombinante em esplenócitos, mostrando a ação do Pep 2 na indução de IL-10.
[059] A Figura 9D mostra um ensaio de re-imunização com Phl p5 recombinante em sobrenadante de esplenócitos, mostrando a ação do Pep 2 nos níveis de IFN-g.
[060] A Figura 9E mostra um ensaio de re-imunização com Phl p5 recombinante em sobrenadante de esplenócitos, mostrando a ação do Pep 2 nos níveis de IL-2.
[061] A Figura 9F mostra um ensaio de re-imunização com Phl p5 recombinante em sobrenadante de esplenócitos, mostrando a ação do Pep 2 nos níveis de IL-4.
[062] A Figura 9G mostra um ensaio de re-imunização com Phl p5 recombinante em sobrenadante de esplenócitos, mostrando a ação do Pep 2 nos níveis de IL-5.
[063] A Figura 9H mostra um ensaio de re-imunização com Phl p5 recombinante em sobrenadante de esplenócitos, mostrando a ação do Pep 2 nos níveis de IL-13.
[064] A Figura 9I mostra um ensaio de re-imunização com Phl p5 recombinante em sobrenadante de esplenócitos, mostrando a ação do Pep 2 na indução de IL-10.
[065] A Figura 10A mostra um ensaio para investigar as células CD4 + CD25 + Foxp3 + que expressassam GATA3 em esplenócitos, em camundongos sensibilizados com Phl p5 e tratados com o Pep 2.
[066] A Figura 10B mostra um ensaio para investigar as células CD4
+ CD25 + Foxp3 + que expressassam GATA3 em esplenócitos, em camundongos sensibilizados com Phl p5 e tratados com o Pep 2.
[067] A Figura 10C mostra um ensaio para investigar as células CD4
+ CD25 + Foxp3 + que expressassam CTLA4 em esplenócitos, em camundongos sensibilizados com Phl p5 e tratados com o Pep 2.
[068] A Figura 10D mostra um ensaio para investigar as células CD4
+ CD25 + Foxp3 + que expressassam CTLA4 em esplenócitos, em camundongos sensibilizados com Phl p5 e tratados com o Pep 2.
[069] A Figura 10E mostra um ensaio para investigar as células CD4
+ CD25 + Foxp3 + que expressassam KI67 em esplenócitos, em camundongos sensibilizados com Phl p5 e tratados com o Pep 2.
[070] A Figura 10F mostra um ensaio para investigar as células CD4
+ CD25 + Foxp3 + que expressassam KI67 em esplenócitos, em camundongos sensibilizados com Phl p5 e tratados com o Pep 2.
[071] A Figura 11A mostra a analise de linfócitos GFP+ CD4+ isolados de camundongos 4get 5 dias após a imunizao Camundongos.
[072] A Figura 11 B mostra que o peptídeo sintetizado administrado ao longo do extrato de polens de gramíneas suprime a polarizão de TH2.
[073] A Figura 11 C mostra que o peptídeo sintetizado administrado ao longo do extrato de polens de gramíneas suprime a polarizão de TH2.
[074] A FIGURA 12A mostra a estrutura tridimensional predita do Pep
1 - IL10. [075] A FIGURA 12B mostra a estrutura tridimensional predita do Pep
2 - IL10.
[076] A FIGURA 12C mostra a estrutura tridimensional predita do Pep
3 - IL10.
[077] A FIGURA 12D mostra a estrutura tridimensional predita do Pep
4.
[078] A FIGURA 12E mostra o comportamento de agregação dos peptídeos Pep 1 - IL10, Pep 2 - IL10, Pep 3 - IL10 e Pep 4— I L10 em solução.
[079] A FIGURA 13A mostra uma análise de expressão de NFkB após tratamento com os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 aqui descritos por 12 horas.
[080] A FIGURA 13B mostra uma análise de expressão de NFkB após tratamento com os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 aqui descritos por
24 horas.
[081] A FIGURA 13C mostra uma análise de expressão de NFkB após tratamento com os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 aqui descritos por 48 horas.
[082] A FIGURA 14A mostra uma análise de expressão de NFkB, usando uma molécula de ativação, o TNF-a, não somente no controle, mas após um pré-tratamento com os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 por 12 horas.
[083] A FIGURA 14B mostra uma análise de expressão de NFkB, usando uma molécula de ativação, o TNF-a, não somente no controle, mas após um pré-tratamento com os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 por 24 horas. [084] A FIGURA 14C mostra uma análise de expressão de NFkB, usando uma molécula de ativação, o TNF-a, não somente no controle, mas após um pré-tratamento com os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 por 48 horas.
[085] A FIGURA 15A mostra uma análise de expressão de NFkB, quando as células foram pré-tratadas com TNF-a e os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 12 horas.
[086] A FIGURA 15B mostra uma análise de expressão de NFkB, quando as células foram pré-tratadas com TNF-a e os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 24 horas.
[087] A FIGURA 15C mostra uma análise de expressão de NFkB, quando as células foram pré-tratadas com TNF-a e os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 48 horas.
[088] A FIGURA 16A mostra uma análise da via de sinalizao de IFN após tratamento com os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 aqui descritos por 12 horas.
[089] A FIGURA 16B mostra uma análise da via de sinalizao de IFN após tratamento com os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 aqui descritos por 24 horas.
[090] A FIGURA 16C mostra uma análise da via de sinalizao de IFN após tratamento com os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 aqui descritos por 48 horas. [091] A FIGURA 17A mostra uma análise da via de sinalizao de IFN, quando as células foram pré-tratadas com IFN e os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 12 horas.
[092] A FIGURA 17B mostra uma análise da via de sinalizao de IFN, quando as células foram pré-tratadas com IFN e os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 24 horas.
[093] A FIGURA 17C mostra uma análise da via de sinalizao de IFN, quando as células foram pré-tratadas com IFN e os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 48 horas.
[094] A FIGURA 18A mostra a capacidade dos peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 em reduzir a ativação da via de sinalização do TLR4 após 12 horas de tratamento com os peptídeos sintetizados.
[095] A FIGURA 18B mostra a capacidade dos peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 em reduzir a ativação da via de sinalização do TLR4, quando as células foram pré-tratadas com lipopolissacarídeos (LPS) e os peptídeos sintetizados foram adicionados posteriormente, após 12 horas de tratamento com os peptídeos.
[096] A FIGURA 19A mostra o efeito do tratamento com os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 na redução da ativação celular nas células CD11c+ CD86, após 24 horas de tratamento.
[097] A FIGURA 19B mostra o efeito do tratamento com os peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 na redução da ativação celular nas células CD11c+ CD40+, após 24 horas de tratamento.
[098] A FIGURA 20 mostra a capacidade dos peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 (Pep 1 - IL-10) em diminuir a ativação de células dendríticas, após 24 horas de tratamento.
[099] A FIGURA 21 A mostra o efeito dos peptídeos sintetizados miméticos à IL-10 (Pep 1 - IL-10) na liberação de IgE mediada.
[0100] A FIGURA 21 B mostra o efeito do rlL10 na liberação de IgE mediada.
[0101] A FIGURA 23A mostra o esquema de imunizações de animais com combinação de peptídeos.
[0102] A FIGURA 23B mostra a curva de titulação para o ensaio de liberação do mediador realizado com soros de todos os grupos mostrando que os camundongos tratados com a combinaçnao de peptídeos sinteizados apresentavam níveis substancialmente inferiores de degranulação de basófilos.
[0103] A FIGURA 23C mostra o ensaio de liberação de mediador realizado com soros individuais reforçando a ação da combinação de peptídeos sintetizados na regulação negativa de degranulação de basófilos especicos para IgE.
[0104] A FIGURA 24A mostra os níveis de IFN-g produzidos por esplenócitos re-estimulados com Bet v 1 e a combinação de peptídeos sintetizados.
[0105] A FIGURA 24B mostra os níveis de IL-4 produzidos por esplenócitos re-estimulados com Bet v 1 e a combinação de peptídeos sintetizados.
[0106] A FIGURA 24C mostra os níveis de IL-10 (C) produzidos por esplenócitos re-estimulados com Bet v 1 e a combinação de peptídeos sintetizados.
[0107] A FIGURA 25A mostra a capacidade da combinação dos peptídeos sintetizados em modular a produção da citocina IL-2 em explenócitos.
[0108] A FIGURA 25B mostra a capacidade da combinação dos peptídeos sintetizados em modular a produção da citocina IL-4 em explenócitos.
[0109] A FIGURA 25C mostra a capacidade da combinação dos peptídeos sintetizados em modular a produção da citocina IL-5 em explenócitos.
[0110] A FIGURA 25D mostra a capacidade da combinação dos peptídeos sintetizados em modular a produção da citocina IL-13 em explenócitos.
[0111] A FIGURA 26 mostra a capacidade da combinação dos peptídeos sintetizados em modular a degranulação de basófilos.
Descrição detalhada da invenção
Peptídeos sintéticos com afinidade ao receotor de TGF-B
[0112] O presente pedido de patente descreve 8 peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de TGF-b, que compreendem ou consistem das sequências de aminoácidos: peptídeo 1 - TGF-bI (Pep 1 - TGF-bI ): SEQ ID N2 01 ; peptídeo 2 - TGF-bI (Pep 2 - TGF-bI ): SEQ ID N202; peptídeo 3 - TGF-bI (Pep 3 - TGF-bI ) SEQ ID N2 03; peptídeo 4 - TGF-bI (Pep 4 - TGF-bI ) SEQ ID N2 04; peptídeo 5 - TGF-bI (Pep 5 - TGF-bI ) SEQ ID N2 05; peptídeo 6 - TGF-bI (Pep 6 - TGF-bI ) SEQ ID N2 06; peptídeo 7 - TGF-bI (Pep 7 - TGF- b1) SEQ ID N207; e peptídeo 8 - TGF-bI (Pep 8 - TGF-bI ) SEQ ID N208. Tais peptídeos apresentaram atividade importante sobre vias moduladoras e regulatórias imunológicas. Potanto, podem ser usados no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, como por exemplo: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[01 13] Os peptídeos descritos no presente pedido de patente foram selecionados utilizando a metodologia Phage Display (PD). A seleção foi realizada através da avaliação da capacidade dos referidos peptídeos em reconhecer o receptor de TGF-bI em células A549, utilizando um ensaio de ELISA. Placas de 96 poços de microtitulação MaxiSorp foram revestidas com 1x106 células diluídas em PBS e incubadas durante a noite a 4°C. As células foram bloqueadas com PBS-BSA a 3% durante 1 h a 37°C, lavadas uma vez com PBS e incubadas com pg/ml de cada peptídeo miméticos à TGF-bI ou 5 ng/mL de TGF-bI recombinante durante 1 h a 37°C. Após a lavagem, a placa foi incubada durante 1 h a 37°C com anticorpo anti-TGF-bI . A placa foi lavada e incubada com anticorpo IgG anti-humano marcado com HRP durante 1 h a 37°C. Após a lavagem, a solução de substrato TMB foi adicionada à placa; a reação foi parada arescentando a solução de H2SO4 2 N e lida a 492 nm num leitor de microplacas.
[01 14] Os peptídeos com alta afinidade com os receptores celulares foram então quimicamente sintetizados seguindo o manual de seleção de fagos (Barbas, C. F. et al. Phage Display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001 )), Todos eles foram sintetizados de modo a apresentar a Histidina e a Alanina como primeiro e segundo resíduos de aminoácido, respectivamente, e uma sequência de três Glicinas e uma Serina como os últimos quatro resíduos de aminoácidos, bem como, alguns peptídeos forma sintetizados com uma identidade ou similaridade de pelo menos 85% entre eles, com a substituição, por exemplo, de resíduos de serina por cisteína. Essa substituição, especificamente, modificou a estrutura tridimensional, induzindo a formação e conformação de pontes dissulfeto ou não. Suas estruturas tridimensionais foram preditas e aqui demonstradas pelas figuras como segue.
[01 15] O peptídeo 1 - TGF-bI (Pep 1 - TGF-bI ), SEQ ID N2 01 , foi sintetizado induzindo a formação de pontes dissulfeto entre os resíduos de cistina e tem sua estrutura tridimensional predita na Figura 1A.
[01 16] O peptídeo 2 - TGF-bI (Pep 2 - TGF-bI ), SEQ ID N2 02, foi sintetizado induzindo a formação de pontes dissulfeto entre os resíduos de cistina e tem sua estrutura tridimensional predita na Figura 1 B.
[01 17] O peptídeo 3 - TGF-bI (Pep 3 - TGF-bI ), SEQ ID N2 03, é isento de pontes dissulfeto e tem sua estrutura tridimensional predita na Figura 1 C.
[01 18] O peptídeo 4 - TGF-bI (Pep 4 - TGF-bI ), SEQ ID N2 04, foi sintetizado induzindo a formação de pontes dissulfeto entre os resíduos de cistina e tem sua estrutura tridimensional predita na Figura 1 D.
[01 19] O peptídeo 5 - TGF-bI (Pep 5 - TGF-bI ), SEQ ID N2 05, é isento de pontes dissulfeto e tem sua estrutura tridimensional predita na Figura 1 E.
[0120] O peptídeo 6 - TGF-bI (Pep 6 - TGF-bI ), SEQ ID N2 06, é isento de pontes dissulfeto e tem sua estrutura tridimensional predita na Figura 1 F.
[0121] O peptídeo 7 - TGF-bI (Pep 7 - TGF-bI ), SEQ ID N2 07, é isento de pontes dissulfeto e tem sua estrutura tridimensional predita na Figura 1 G.
[0122] O peptídeo 8 - TGF-bI (Pep 8 - TGF-bI ), SEQ ID N2 08, é isento de pontes dissulfeto e tem sua estrutura tridimensional predita na Figura 1 H.
[0123] Portanto, os peptídeos sintetizado compreendendo ou consistindo de uma das SEQ IDs N° 01 , 02 ou 04 podendo apresentar comformação tridimensional com pontes dissulfeto. Já os peptídeos sintetizados compreendendo ou consistindo de uma das SEQ IDs N° 03, 05, 06, 07 e 08 apresentando comformação tridimensional linearizada, isentas de pontes dissulfeto. (Figuras 1A - H).
[0124] Além disso, os peptídeos Pep 1 e Pep 5; Pep 2 e Pep 3; e Pep 4 e Pep 6; foram sintetizados com uma identidade ou similaridade de pelo menos 85% entre eles, respectivamente. Os resíduos de aminoácido nas posições três (3) e onze (11 ) foram substituídos de Serina nos peptídeos Pep 3, Pep 5 e Pep 6, para Cisteina nos papteídeos Pep 1 ,Pep 2 e Pep 4.
[0125] Estruturas peptídicas foram previstas de acordo com cada modificação feita (Figura 1A-H). A esfera preta representa o primeiro resíduo (átomo C-alfa) em cada peptídeo, enquanto os aglomerados azul e vermelho indicam as regiões hidrofílica e hidrofóbica, respectivamente.
[0126] Embora os peptídeos tenham estruturas diferentes, o resultado do DLS mostra que todos os peptídeos são encontrados como monômeros com raio hidrodinâmico entre 0,58nm (Pep1 ) e 2,94nm (Pep7) (Figura 2).
[0127] Uma vez que os peptídeos selecionados foram sintetizados, vários ensaios foram realizados a fim de determinar a atividade desses peptídeos. Vale aqui ressaltar que nos exemplos que demonstraremos abaixo e nas figuras aqui anexadas, todos os peptídeos de um modo geral e em diferentes concentrações mostraram resultados surpreendetes e positivos na modulação da resposta imológica, inflamatória e alérgica. No entanto, iremos ressaltar aqui ao longo da descrição, apenas a título de exemplo, aqueles resultados que foram estatisticamente mais significativos. Isso não exclui quaisquer outros resultados que não tenham sido expressamente citados nos exemplos ao longo do relatório descritivo, mas que podem ser verificados diretamente nas figuras.
Exemplo 1 - Reconhecimento do anticorpo anti-TGF-B1 na superfície celular da linhaqem A549
[0128] Para investigar se os peptídeos sintetizados podiam se ligar aos receptores celulares, realizou-se um ensaio de ELISA em células da linhagem A549 utilizando anticorpo comercial anti-TGF-bI .
[0129] Todos os oito peptídeos testados foram capazes de reconhecer e se ligar à receptores na superfície celular das células A549. Os peptídeos sintetizados Pep 1 - TGF-bI , Pep 2 - TGF-bI e Pep 3 - TGF-bI , ligados nos receptores celulares, foram reconhecidos pelo anticorpo anti-TGF-bI , da mesma forma que o anticorpo reconheceu a molécula de TGF-bI recombinante. No entanto, os peptídeos Pep 4 - TGF-bI , Pep 5 - TGF-bI , Pep 6 - TGF-bI , Pep 7 - TGF-bI e Pep 8 - TGF-bI , também ligados nos receptores celulares, foram reconhecidos estatisticamente diferentes pelo anticorpo, em comparação com o TGF-bI recombinante [Pep 4 (P <0,05), Pep 5 (P <0,005), Pep 6 (P <0,005), Pep 7 (P <0,005) ou Pep 8 (P <0,05)] (Figura 3).
Exemplo 2 - Capacidade dos peptídeos miméticos ao TGF-B1 em ativar a via dependente de SMAD
[0130] Para investigar a capacidade dos peptídeos se ligarem ao TRΰbRII e ativarem a via dependente de SMAD, as células HEK-Nub-TΰRb foram tratadas com peptídeos a 0,1 mM, 1 mM, 10 pM e 100 pM durante 12 horas (Figura 4A), 24 horas (Figura 4B) e 48 horas (Figura 4C). Após 12 horas de estímulos (Figura 4A), todos os peptídeos foram capazes de se se ligar ao receptor. Particularmente para alguns pepetídeos e em concentrações específicas obtivemos resultados estatisticamente significativos como: Pep 1 (0,1 pM e 1 pM), Pep 2 (0,1 pM e 10 pM), Pep 3 (0,1 pM, 10 pM e 100 pM), Pep 4 (0,1 pM, 1 pM; 10 pM e 100 pM) Pep 5 (0,1 pM, 1 pM, 10 pM e 100 pM), Pep 6 (0,1 pM, 10 mM e 100mM) e Pep 7 ((0,1 mM: 1 mM; 10 mM e 100 mM) e Pep 8 (1 mM). No entanto, quando as células foram analisadas após 24 horas (Figura 4B), a ativação foi mantida, com resultado significativo, pelo Pep 1 (1 mM e 10 mM), Pep 2 (1 mM e 100 pM)e Pep 6 (100 mM) e Pep 8 (1 mM). Após 48 horas (Figura 4B) a ativação foi mantida, com resultados significativos, pelo apenas pelo Pep 2 (0,1 mM e 1 mM), Pep 4 (0,1 mM e 1 mM) e Pep 6 (0,1 mM e 1 mM) e Pep 8 (0,1 mM, 1 mM e 10 mM).
[0131] O ensaio foi realizado de forma que aproximadamente 2,5x104 células/poço (100 mI) foram tratadas com 100 mI de todos os peptídeos sintéticos em diferentes concentrações (100 mM, 10 mM, 1 mM e 0,1 mM), enquanto foi utilizado rTGF-bI (anticoporpo recombinante) a 100 ng/mL como controle positivo. Após incubação das células durante 12, 24 e 48 horas a 37°C em CO2 a 5%, 20 mI de sobrenadante foram transferidos para uma placa Greiner à qual foi adicionado 80 mI de solução Quanti-blue. A placa foi incubada durante 1 hora a 37°C em 5% de CO2 e a produção de SEAP (fosfatase alcalina secretada) foi detectada a 655 nm. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
Exemplo 3 - Efeitos dos peptídeos miméticos ao TGF-B1 na via NFKB
[0132] Foram realizados dois tratamentos celulares diferentes utilizando células Jurkat para analisar a expressão de NFkB após 12, 24 e 48 horas. No primeiro teste, as células Jurkat foram tratadas apenas com os peptídeos (sem molécula de ativação da via) em diferentes concentrações, para analisar a capacidade de cada peptídeo para induzir a expressão de NFkB (Figura não mostrada). Nenhuma das concentrações testadas induziu qualquer tipo de ativação da via. De acordo com este resultado, as células foram pré-tratadas com os peptídeos durante 1 hora seguidas de estímulo com TNF-a (Figura 5A, B, C) e vice versa (pré-tratado com TNF-a durante 1 hora seguido da adição dos peptídeos) (Figura 5D, E , F).
[0133] O pré-tratamento com peptídeos não foi capaz de reduzir a ativação do NFKB após 12 horas de tratamento (Figura 5A); no entanto, quando as células foram analisadas após 24 horas (Figura 5B), os peptídeos foram capazes de diminuir a ativação da via NFKB em comparação com o controle de TNF-a, particularmente para alguns pepetídeos e em concentrações específicas obtivemos resultados estatisticamente significativos como: o Pep 3 (0,1 mM; 10 mM e 100 pM) (P <0,05; P <0,005 e P <0,05), Pep 4 (0,1 pM; 10 pM e 100 pM) (P <0,05; P <0,005 e P <0,05), Pep 5 (0,1 pM; 1 pM e 100 pM) (P <0,05), Pep 6 (0,1 pM) (P <0,005) e Pep 7 (1 pM e 100 pM) (P <0,05). Após 48 horas de tratamento (Figura 5C), os peptídeos foram capazes de diminuir a ativação da via NFKB em comparação com o controle de TNF-a, particularmente para alguns pepetídeos e em concentrações específicas obtivemos resultados estatisticamente significativos como: Pep 1 (0,1 pM e 1 pM) (P <0,05), Pep 2 (0,1 pM) (P <0,05), Pep 3 (0,1 pM; 1 pM; 10 pM e 100 pM) (P <0,05); P <0,05; P <0,005; P <0,05), Pep 4 (10 pM) (P <0,05), Pep 5 (0,1 pM; 1 pM e 10 pM) (P <0.05; P <0,005; P <0,005) e Pep 7 (1 pM) (P <0,05) diminuíram a expressão de NFKB, em comparação com o controle de TNF-a.
[0134] Por fim, alguns peptídeos foram capazes de reduzir a via NFKB, quando as células foram pré-tratadas com TNF-a seguido pela adição do peptídeo, após 12, 24 e/ou 48 horas (Figuras 5D, 5E e 5F). O Pep 8 (0,1 pM) foi o único peptídeo a apresentar resultado estatisticamente significativo, sendo capaz de reduzir a via após 24 horas (P <0,005), quando as células foram pré-tratadas com TNF-a seguido pela adição do peptídeo (Figura 5E). [0135] O ensaio foi realizado de forma que um total de 3x105 células/poço (100 pl) foi pré-tratado com 100 mI de uma composição compreendendo um dos peptídeos sintéticos nas concentrações de 100 mM, 10 mM, 1 mM e 0,1 mM durante 1 hora a 37°C em 5% de CO2, seguido por estímulo com TNF-a (200ng/mL) durante 12, 24 e 48 horas. Os mesmos estímulos foram aplicados em células pré-tratadas com TNF-a (200 ng/mL) por 1 hora a 37°C em 5% de CO2 seguido por estímulo com peptídeos a 100 mM, 10 mM, 1 mM e 0,1 mM durante 12, 24 e 48 horas. Em seguida, 50mI de sobrenadante foram transferidos para uma placa branca e o reagente Quanti-Luc foi utilizado para medir o produto de luciferase. Como controle, os peptídeos foram testados nas mesmas concentrações, sem nenhuma molécula ativadora da via, para investigar se eles poderiam ativar a via NFkB. TNF-a (200ng / mL) foi utilizado como controle positivo e rll_-10 (0,4ng / mL) como controle negativo.
Exemplo 4 - Acão dos peptídeos miméticos ao TGF-B1 na via do TLR4
[0136] Similarmente ao tratamento feito usando células de Jurkart, os peptídeos em composições com diferentes concentrações também foram testados em células HEK para investigar sua capacidade de interferir na via do TLR4.
[0137] Para assegurar que os peptídeos não pudessem induzir qualquer ativação quando testados isoladamente (sem molécula de ativação da via) apenas os peptídeos foram adicionados na linha celular e a produção de SEAP foi medida após 12 horas de tratamento (Figura não mostrada). De fato, os peptídeos em todas as concentrações não ativaram a via de sinalização.
[0138] Todos os peptídeos foram capazes de reduzir a ativação da via de TLR4, particularmente para alguns pepetídeos em concentrações específicas obtivemos resultados estatisticamente significativos como: o Pep 1 (10 mM) (P <0,05), Pep 5 (1 mM e 10 mM) (P <0,05 e P <0,005), Pep 6 (1 mM) (P <0,005) e Pep 7 (0,1 mM; 1 mM e 10 mM) (P <0,005; P <0,05 e P <0,05)(Figura 6A). Quando as células foram pré-tratadas com LPS seguido da adição dos peptídeos, apesar de todos os peptídeos terem interferido na ativação da via, em comparação com o estímulo positivo, o Pep 1 (1 mM) (P <0,05) e Pep 2 (100 mM) (P <0,005) apresentaram resultado estatisticamente significativo(figura 6B).
[0139] O ensaio foi realizado utilizando células repórter HEK-Blue hTLR4 (InvivoGen) para investigar a ação dos peptídeos na via TLR4. Um total de 2,3x104 células/poço (100 mI) foi pré-tratado com 100 mI de composição compreendendo ao menos um dos peptídeos sintéticos nas concentrações de 100 mM, 10 mM, 1 mM e 0,1 mM durante 1 hora a 37°C em 5% de CO2 seguido por estímulo de LPS a 100 ng/mL, durante 12 horas. Os mesmos estímulos foram aplicados a células pré-tratadas com LPS a 100 ng/mL durante 1 hora a 37°C em 5% em CO2, seguido por estímulos com peptídeos a 100 mM, 10 mM, 1 mM e 0,1 mM durante 12 horas. Os estímulos foram adicionados em meio Quanti-blue e a produção de SEAP foi medida em 655nm. Como controle, os peptídeos nas mesmas concentrações foram testados sozinhos para investigar se eles poderiam ativar a via TLR4 e o LPS foi usado como um controle positivo.
[0140] Todos os peptídeos sintéticos descritos no presente pedido, com afinidade ao receptor de TGF-b, exibiram uma capacidade de modular a resposta autoimune e inflamatória, confirmando que os mesmos podem ser usados no tratamento doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto- imunes, Mais ainda, os resultados aqui apresentados demonstram o potencial de associação desses peptídeos, uma vez que eles apresentaram respostas distintas e em vários casos complementares no que diz respeito a concentração e tempo de exposição com melhor resposta. Portanto, fica claro que os mesmos podem ser usados sozinhos ou em quaisquer combinação ente eles, em composições para preparar medicamentos ou composições imunogências para o tratamento e/ou profilaxia de doenças aonde haja uma desordem imunológica, mais particularmente em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[0141] Uma vez que todos os peptídeos apresentaram resposta, selecionamos como exemplo o Pep 2 - TGF-bI para mostrar os dados adicionais que aprofundam o conhecimento. Tais resultados podem ser extrapolados para os demais peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de TGF-b sintetizados e demonstrados no presente pedido de patente.
Exemplo 5 - Os peptídeos miméticos ao TGF-B1 sintetizados tem propriedades anti-inflamatórias e suprime a dearanulacão de basófilos mediada por IqE in vitro
[0142] Testamos primeiro a capacidade dos peptídeos sintetizados em reconhecer o TGF^RII na superfície de células Jurkat, linfócitos T humanos imortalizados, utilizando ELISA. O TΰRb recombinante (PΌRb1 ) foi utilizado como um controle positivo. No exemplo aqui demonstrado, o Pep 2 teve níveis mais elevados de reatividade ao TGF^RII do que o rTGF-bI (Fig. 7A). Para investigar a produção de citocina IL-8, utilizamos uma linhagem celular epitelial pulmonar humana imortalizada (A549), que desempenha um papel importante na primeira linha de defesa para compostos externos. Em células A549 estimuladas com TNF-a, possuindo um gene repórter para luciferase sob o controle do promotor de IL-8, tanto o Pep 2 como tTΰRbI diminuíram a expressão gênica de IL-8 (Fig 7B), enquanto apenas o Pep 2 diminuiu a produção/secreção de IL-8 (Fig. 10). Em células Jurkat estimuladas com PMA, tanto o peptídeo mimético Pep 2 como o rTGFpi diminuíram significativamente a secreção de TNF-a (Fig. 7D) e aumentou a secreção de IL-10 (Fig. 7E). Foi realizado um ensaio de liberação de mediador baseado em células de leucemia basófila de rato (RBL) que possuem receptor Fc RI humanizado para investigar o efeito dos peptídeossintetizados na degranulação de basófilos mediada por IgE em um sistema já sensibilizado. Este ensaio baseado em células sensíveis pode ajudar a entender a ação do peptídeo mimético em um microambiente alérgico já estabelecido. Descobrimos que, a quantidade de Phl p 5 (antígeno de gramínea) necessária para induzir metade da liberação máxima em basófilos, que foram passivamente sensibilizados com soros de pacientes alérgicos a pólen de gramíneas, foi significativamente maior quando as células foram pré- tratadas com Pep 2 (Fig. 7F) indicando uma regulação negativa de degranulação. Este efeito também foi observado quando foi realizado o pré- tratamento com o controle rTGFpi .
[0143] Juntos, esses resultados indicam que o Pep 2 - TGF-bI , bem como os demais peptídeos sintetizados no presente pedido, são também capazes de modular o microambiente inflamatório alérgico in vitro.
Exemplo 6 - Os peptídeos miméticos ao TGF-B1 sintetizados modulam a resposta de anticorpos em um modelo de sensibilização murina
[0144] Em seguida, testamos a capacidade dos peptídeos miméticos ao TGF-bI sintetizados de modular a resposta imune in vivo durante a sensibilização alérgica a Phl p 5. Selecionamos como exemplo o Pep 2 - TGF-bI para mostrar os resultados. A imunização intradérmica com o alérgeno de Phl p5 recombinante durante 44 dias (Figura 8A) induziu significativamente a resposta de IgE total específica para o alérgeno, como observado a partir da capacidade dos soros para provocar degranulação de basófilos no ensaio de RBL (Figura 8E e Figura 8B). As células RBL sensibilizadas com soros de camundongos tratados com 1 mM de Pep 2 - TGF-P1 (nas Figura 8A-F representado como TGFpi -mim) apresentaram níveis significativamente mais baixos de degranulação do que o grupo imunizado com Phl p 5. A análise por ELISA mostrou que, no soro de camundongos sensibilizados por Phl p5, o Pep 2 - TGF-bI suprimiu os níveis de IgE (Fig. 8C), lgG1 (Fig. 8D) e lgG2a (Fig. 8E), embora este último não tenha sido estatisticamente significativo. Os camundongos tratados com Pep 2 - TGF- b1 também apresentaram níveis aumentados de IgA (Fig. 8F). Portanto, o Pep 2 - TGF-bI modulou as respostas de anticorpos específicos para Phl p5 em camundongos. Tal resultado indica que os peptídeos miméticos ao TGF-bI sintetizados no presente pedido são também capazes de modular tal resposta.
Exemplo 7 - Os peptídeos sintetizados miméticos à TGF-B1 modulam a produção de citocinas em esplenócitos re-estimulados com Phl p5
[0145] Para determinar o número de células esplénicas produtoras de IFN-g, IL- 4 e IL-10 em todos os grupos de camundongos, foi realizado um ensaio ELISPOT. A imunização com Phl p 5 resultou em alta indução de liberação de IFN-g e IL-4 na estimulação de alérgenos. Neste exemplo, em camundongos tratados com o Pep 2 - TGF-bI (nas Figura 9A-I representado como TΰRb1 - mim), os níveis de IFN-g (Fig 9A) e IL-4 (Fig 9B) segregados por esplenócitos estimulados com Phl p5 foram significativamente inferiores, enquanto os níveis de IL-10 foram significativamente superiores (Fig. 9C), do que em camundongos não tratados. Para investigar o perfil de citocinas nos sobrenadantes de esplenócitos re-estimulados, foi utilizado um kit de análise de citocinas multiplex luminex. A secreção das citocinas IFN-g (Fig 9D), IL-2 (Fig 9E), IL-4 (Fig. 9F), IL- 5 (Fig. 9G) e IL-13 (Fig. 9H) foi significativamente menor, enquanto que a secreção de IL-10 (Fig. 9I) foi superior, em camundongos que receberam o Pep 2 - TGF-bI do que em camundongos não tratados. Portanto, o Pep 2 - TGF-bI regulou negativamente as citocinas TH1 e TH2 envolvidas na resposta imune ao Phl p5 em camundongos. Além disso foi observado o aumento nos níveis de IL- 10. Tal resultado indica que os peptídeos miméticos ao TGF-bI sintetizados no presente pedido são também capazes de regular negativamente as citocinas TH1 e TH2 envolvidas na resposta imune ao Phl p5 em camundongos.
Exemplo 8 - Os peptídeos sintetizados miméticos ao TGF-B1 modulam a produção de células Treq
[0146] Para investigar a influência dos peptídeos miméticos ao TGF-bI sintetizados na indução de Treg específica ao Phl p5 durante a sensibilização alérgica, analisamos esplenócitos de camundongos BALB/c usando citometria de fluxo. Procuramos investigar as células CD4 + CD25 + Foxp3 + que expressassem GATA3, CTLA4 ou KI67, uma vez que esses fatores são necessários para a sobrevivência e função das células Treg. Os camundongos controle e sensibilizados e Phl p5 tinham compareis níveis de células Treg expressando o factor GATA3 (16,1 % e 16,2% do total de células T, respectivamente), enquanto que, no exemplo aqui mostrado, os camundongos tratados com o Pep 2 - TGF-bI (nas Figura 10A-F representado como TΰRb1- mim) tinham 43,9% (Fig 10A-B). A porcentagem de células T CD4 + CD25 + Foxp3 + expressando o fator CTLA4 em camundongos sem sensibilização e sensibilizados com Phl p 5 foi de 5,62% e 9,46%, respectivamente, enquanto que camundongos tratados com o Pep 2 - TGF-bI esse valor foi de 12,5% (Fig 10C-D ). Embora não seja significativamente diferente quando comparado com camundongos sensibilizados com Phl p5, a percentagem de células CD4 + CD25 + Foxp3 + expressando o factor KI67 foi enriquecida no grupo de camundongos tratados com o Pep 2 - TGF-bI (Fig 10E-F). Estes resultados mostraram que o Pep 2 promove a produção de células Treg durante a sensibilização com Phl p 5. Tal resultado indica que os peptídeos miméticos à TGF-bI sintetizados no presente pedido são também capazes de promover a produção de células Treg durante a sensibilização com Phl p 5.
Exemplo 9 - Os peptídeos sintetizados miméticos à TGF-bI suprimem a polarização TH2 in vivo
[0147] Os linfócitos TH2 produzem citocinas como IL-4, IL-5 e IL-13 e conduzem a mudança de classe da produção de imunoglobulinas de células B para IgE, o que desencadeia a reação alérgica. Para investigar se os peptídeos sintetizados miméticos à TGF-bI podem modular a polarização de TH2 na presença de extrato de pólen de gramíneas ou rPhl p 5, usamos um camundongo repórter de IL-4. Os camundongos 4get expressam GFP como parte de um mRNA bicistrônico IL-4-IRES-GFP, permitindo a identificação de células que expressam IL-4 in situ durante uma resposta TH2 induzida por alérgeno. Neste experimento, usamos células de linfonodos inguinais com drenagem da pele para monitorar a resposta TH2. No exemplo aqui descrito, a análise de citometria de fluxo de linfócitos GFP+ CD4+ isolados de camundongos 4get 5 dias após a imunizão (Fig 1 1 A) mostrou que o Pep 2 - TGF-bI (nas Figura 1 1 A-C representado como TORb1 -hiϊhi) administrado ao longo do extrato de polens de gramíneas suprimia a polarizão de TH2 (Fig 1 1 B-C). O Phl p 5 injetado sozinho não induziu a polarização de um perfil TH2 neste modelo de curto prazo. Em resumo, neste modelo de camundongos IL-4, o Pep 2 administrado em combinação com extrato de pólen de gramíneas foi capaz de inibir a polarização de TH2 em células de nódulos linfáticos inguinais que drenam a pele. Tal resultado indica que os peptídeos sintetizados no presente pedido são também capazes de inibir a polarização de TH2 em células de nódulos linfáticos inguinais que drenam a pele.
Peptídeos sibtéticos com afinidade ao receptor de IL-10
[0148] O presente pedido de patente descreve 4 peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de lnterleucina-10 que compreendem ou consistem das sequências de aminoácidos: peptídeo 1 - IL-10 (Pep 1 - IL-10): SEQ ID
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09; peptídeo 2 - IL-10 (Pep 2 - IL-10): SEQ ID N2 10; peptídeo 3 - IL-10 (Pep 3 - IL· 10) SEQ I D INI* 1 1 ; peptídeo 4 - IL-10 (Pep 4 - IL-10) SEQ ID N2 12. Tais peptídeos apresentaram atividade importante sobre vias moduladoras e regulatórias imunológicas. Potanto, podem ser usados no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, como por exemplo: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[0149] Os peptídeos descritos no presente pedido de patente foram selecionados utilizando a metodologia Phage Display (PD). Eles foram obtidos aleatoriamente após três ciclos de seleção utilizando uma biblioteca de peptídeos randômicos PhD-7mer e PhD12. A seleção foi realizada utilizando a linhagem celular J774; para isso, uma eluição competitiva com a rlL-10 (11-10 recombinante) foi adotada para selecionar peptídeos com afinidade ao receptor de IL-10.
[0150] Uma pré-triagem foi realizada em Células Mononucleares de Sangue Periférico (do inglês PBMC - Peripheral Blood Mononuclear Cell) utilizando sobrenadante de fago para selecionar fagos das bibliotecas de PhD-7mer e
PhD12. [0151] Os fagos mais reativos foram purificados e testados contra PBMC para confirmar a capacidade dos fagos selecionados em se ligar a receptores de células.
[0152] Os peptídeos com alta afinidade com os receptores celulares foram então quimicamente sintetizados seguindo o manual de seleção de fagos (Barbas, C. F. et al. Phage Display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001 )) e suas estruturas tridimensionais foram preditas. Todos eles foram sintetizados de modo a apresentarem a Histidina como primeiro resíduo de aminoácido e uma sequência de três Glicinas e uma Serina como os últimos quatro resíduos de aminoácidos.
[0153] O peptídeo 1 - IL-10 (Pep 1 - IL-10). SEQ ID
Figure imgf000035_0001
09, tem sua estrutura tridimensional, com pontes dissulfeto, predita na Figura 12A.
[0154] O peptídeo 2 - IL-10 (Pep 2 - IL-10). SEQ ID Ns 10, tem sua estrutura tridimensional, sem ponte dissulfufeto, predita na Figura 12B.
[0155] O peptídeo 3 - IL-10 (Pep 3 - IL-10). SEQ ID Ns 11 , tem sua estrutura tridimensional predita na Figura 12C.
[0156] O peptídeo 4 - IL-10 (Pep 4 - IL-10). SEQ ID Ns 12, tem sua estrutura tridimensional predita na Figura 12D.
[0157] Os Pep 1 - IL-10 e Pep 2 - IL-10 foram sintetizados com uma identidade ou similaridade de pelo menos 85% entre eles. Os resíduos de aminoácido nas posições três (3) e onze (11 ) foram substituídos de Serina no Pep 2 para Cisteina no Pep 1. Portanto, o Pep 1 - IL-10 é o único peptídeo que foi sintetizado com ponte dissulfufeto, sendo sua estrutura tridimensional destinta da estrutura do Pep 2 - IL-10 e mais compacta em comparação com Pep 3 - IL-10 e Pep 4 - IL· 10. Nas Figuras 12A a 12D, a esfera preta é representativa do átomo C-alfa do primeiro resíduo, apenas para orientação, enquanto os resíduos hidrofílicos estão em azul e os hidrofóbicos em vermelho.
[0158] O comportamento de agregação dos peptídeos Pep 1 - IL-10, Pep 2 - IL· 10, Pep 3 - IL-10 e Pep 4 - IL-10 em solução foi determinado por Dispersão de Luz Dinâmica (DLS), como pode ser visto na Figura 12E. Todos os peptídeos sintéticos se mostraram aproximadamente 100% monoméricos em solução. O rádio hidrodinâmico medido dos peptídeos foi similar entre Pep 1 - IL-10 (0,82nm), Pep 2 - IL-10 (0,74m), Pep 3 - IL-10 (0,79nm) e Pep 4 - IL-10 (0,86nm).
[0159] Uma vez que os peptídeos selecionados foram sintetizados, vários ensaios foram realizados a fim de determinar a atividade desses peptídeos. Vale aqui ressaltar que nos exemplos que demonstraremos abaixo e nas figuras aqui anexadas, todos os peptídeos de um modo geral e em diferentes concentrações mostraram resultados surpreendetes e positivos na modulação da resposta imológica, inflamatória e alérgica. No entanto, iremos ressaltar aqui, ao longo da descrição, apenas a título de exemplo, aqueles resultados que foram estatisticamente mais significativos. Isso não exclui quaisquer outros resultados que não tenham sido expressamente citados nos exemplos ao longo do relatório descritivo, mas que podem ser verificados diretamente nas figuras.
Exemplo 10 - Tratamento de células repórter com os peptídeos miméticos à IL-10.
[0160] A fim de investigar a capacidade dos peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de lnterleucina-10 em interferirem nas vias NFkB, IFN e TLR4, foram utilizadas linhagens celulares repórter. Para analisar se os peptídeos isolados (sem moléculas de ativação) poderiam induzir qualquer tipo de ativação, os peptídeos isolados foram testados nas linhagens celulares durante 12, 24 e 48 horas de tratamento. Em todas as células repórter e em todos os momentos testados, os peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de IL-10 não induziram nenhum tipo de ativação quando estavam sozinhos, sem nenhum ambiente inflamatório para induzir a ativação das vias NFKB, IFN OU TLR4. Como exemplo, as Figura 13A, Figura 13B e Figura 13C mostram uma análise de expressão de NFkB após estímulo com os peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de IL-10 sintetizados aqui descritos. As células foram tratadas durante 12, 24 e 48 horas com os peptídeos sintetizados Pep 1 - IL10, Pep 2 - IL10, Pep 3 - IL10 e Pep 4 - IL10, em diferentes concentrações, sem moléculas de ativação. A luciferase foi então medida após 12 horas de tratamento (Figura 13A), 24 horas de tratamento (Figura 13B) e 48 horas de tratamento (Figura
13C). Todas as concentrações de peptídeos testadas não foram capazes de induzir qualquer resposta. O TNF-a (200 ng/mL) foi usado como controle positivo.
[0161] O ensaio foi então realizado utilizando agora como molécula de ativação o TNF-a não somente no controle, mas após um pré-tratamento com os peptídios sintetizados Pep 1 - IL10, Pep 2 - IL10, Pep 3 - IL10 e Pep 4 - IL10, em diferentes concentrações. Todos os peptídeos foram capazes de modular a ativação de NFKB após 12, 24 e 48 horas, com resultados diferentes dependendo das concentrações utilizadas. Os resultados mais significativos serão descritos a seguir. O pré-tratamento com Pep 1 - IL10 em todas as concentrações testadas foi, com significância estatística, capaz de diminuir a ativação de NFKB após 12, 24 e 48 horas (P <0,0005) de estímulo com o TNF-a (Figura 14 A, B e C). O pré-tratamento com Pep 2 teve os resultados estatisticamente mais significativos a 100 mM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 0,5 pM e 0,1 pM também diminuindo a ativação de NFKB, com significância estatística (P <0,0005), após 12, 24 e 48 horas (Figura 14 A, B e C). O pré-tratamento com Pep 3 teve os resultados estatisticamente mais significativos a 0,05 mM (P <0,05) reduzindo a ativação da via após 12 horas de tratamento (Figura 14A) e a 0,01 pM (P <0,05) após 48 horas (Figura 14C), muito embora tenha apresentado resultados em outras concentrações e também com 24 horas de tratamento, como pode ser visto nas Figura 14 A, B e C, mas com menor siginificância. Já O pré-tratamento com Pep 4 teve os resultados estatisticamente mais significativos a 0,05 pM, 0,01 pM e 0,005 pM, reduzindo a ativação da via após 48 horas de tratamento (Figura 14C). Nos ensaios mostrados pelas Figuras 14 A, B e C, a análise da expressão de NFkB foi realizada em células repórter Jurkart-Dual. As células foram tratadas durante 1 hora com peptídeos e adicionado TNF-a (200 ng/mL). A luciferase foi medida após 12 horas de tratamento (Figura 14A) 24 horas de tratamento (Figura 14B) e 48 horas de tratamento (Figura 14C).
[0162] Outro ensaio foi então realizado em que as células foram pré-tratadas com TNF-a e os peptídios sintetizados Pep 1 - IL10, Pep 2 - IL10, Pep 3 - IL10 e Pep 4 - IL10, em diferentes concentrações, foram adicionados posteriormente. Todos os peptídeos foram capazes de modular a ativação de NFKB após 12, 24 e 48 horas, com resultados diferentes dependendo das concentrações utilizadas. Os resultados mais significativos serão descritos a seguir. Por exemplo: o Pep 1 nas concetrações de 10 mM, 5 pM, 1 pM, 0,5 pM, 0,1 pM (P <0,05), 0,05 pM e 0,001 pM (P < 0,0005) diminuíram a ativação da via analisada após 12 horas de tratamento (Figura 15A). O Pep 2 a 100 pM (P <0,0005), 10 pM (P <0,005), 5 pM (P <0,05), 1 pM (P <0,005) e 0,5 pM (P <0,05); Pep 3 a 0,005 pM (P <0,005) e Pep 4 a 0,5 pM (P <0,05) também foram capazes de diminuir a sinalização de NFKB após 12 horas de tratamento (Figura 15A). Após 24 horas de tratamento com o Pep 1 a 100 mM (P <0,0005), 10 pM (P <0,005), 1 pM (P <0,0005), 0,1 pM (P <0,05), 0,005 pM (P <0,0005), 0,001 pM (P <0,005) e 0,0001 pM (P <0,0005); Pep 2 a 100 pM e 10 pM (P <0,0005), 5 pM (P <0,005), 1 pM (0,0005) e 0,5 pM (P <0,05); Pep 3 a 10 pM (P <0,05), 0,005 pM (P <0,05) e 0,001 pM (P <0,05), foram capazes de diminuir a sinalização de NFKB após 24 horas de tratamento (Figura 15B). Após 48 horas de tratamento o Pep 1 - IL-10 na concentração de 0,001 pM (P <0,05) foi o que obteve resultado com maior significância estatística na diminuição da sinalização de NFKB (Figura 15C). Nos ensaios mostrados pelas Figuras 15 A, B e C, a análise da expressão de NFkB foi realizada em células repórter Jurkart-Dual. As células foram tratadas durante 1 hora com TNF- a (200 ng/mL) e os peptídeos foram adicionados. A luciferase foi medida após 12 horas de tratamento (Figura 15A) 24 horas de tratamento (Figura 15B) e 48 horas de tratamento (Figura 15C). Utilizou-se TNF-a (200ng/mL) como controle positivo e rlL-10 (lnterleuciona-10 recombinante) (0,4ng/mL) como controle negativo. * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005.
[0163] A análise da via de sinalização de IFN demonstrou que os peptídeos sintetizados Pep 1 - IL10, Pep 2 - IL10, Pep 3 - IL10 e Pep 4 - IL10 foram capazes de modular a ativação da via de sinalização de IFN após 12, 24 e 48 horas, com resultados diferentes dependendo das concentrações utilizadas. Os resultados mais significativos serão descritos a seguir. Por exemplo, a ativação da via foi diminuída quando as células Jurkat foram pré-tratadas com Pep 1 a 10 mM (P <0,005) durante 12 horas (Figura 16A); Pep 3 a 100 mM (P <0,005) durante 48 horas (Figura 16C); e Pep 4 a 100 pM (P <0,005) e 0,05 pM (P <0,05) durante 48 horas (Figura 16C). Quando as células foram pré-tratadas com IFN, embora os peptídeos, em algumas concentrações, tenham indicado resultado, os mesmos não tiveram suficiência estatística. Por tanto, não podemos confirmar se os mesmos foram capazes de interferir na ativação da via (Figura 17 A, B e C) de forma igual ou melhor do que o controle negativo (rll_-10). Nos ensaios mostrados pelas Figuras 16 (A, B e C) e Figuras 17 (A, B e C), a análise da expressão de IFN foi realizada em células repórter Jurkart-Dual. Nos ensaios mostrados pelas Figuras 16 A, B e C, as células foram tratadas durante 1 hora com peptídeos com posterior adição de IFN-a (104 EU/mL). A produção de fosfatase alcalina embrionária secretada (do inglês - Secreted Embryonic Alcaline Phosphatase - SEAP) foi medida após 12 horas de tratamento (Figura 16A) 24 horas de tratamento (Figura 16 B) e 48 horas de tratamento (Figura 16 C). Nos ensaios mostrados pelas Figuras 17A, B e C, as células foram tratadas durante 1 hora com IFN-a (104 EU/mL) com posterior adição dos peptídeos. A produção de SEAP foi medida após (A) 12 horas de tratamento (B) 24 horas de tratamento e (C) 48 horas de tratamento. Utilizou-se IFN-a (104 EU/mL) como controle positivo e rlL-10 (0,4 ng/mL) como controle negativo. * P <0,05.
[0164] As células HEK foram utilizadas para investigar a capacidade dos peptídeos sintetizados Pep 1 - IL10, Pep 2 - IL10, Pep 3 - IL10 e Pep 4 - IL10 em modular a ativação da via de sinalização do TLR4 após 12 horas de tratamento. Todos os peptídeos foram capazes de modular a ativação da via de sinalização do TLR4 após 12 horas, com resultados diferentes dependendo das concentrações utilizadas. Os resultados mais significativos serão descritos a seguir. Por exemplo, o pré-tratamento com os peptídeos demonstrou que Pep 1 a 0,005 mM (P <0,05); Pep 2 a 100 pM (P <0,05), 0,1 pM (P <0,0005); Pep 3 a 100 pM (P <0,05), 5 pM (P <0,05), 1 pM (P <0,005), 0,5 pM (P <0,005), 0,1 pM (P <0,005) e 0,005 mM (P <0,05); e Pep 4 a 100 mM (P <0,05), 10 mM (P <0,005), 5 mM (p <0,05) e 1 mM (P <0,05) reduziram significativamente a ativação da via (Figura 18A). Por outro lado, quando as células foram pré-tratadas com lipopolissacarídeos (LPS) e os peptídeos foram adicionados, a ativação da via de TLR4 foi significativamente reduzida quando adicionado Pep 1 a 0,1 mM (P <0,05), 0,05 mM (P <0,05), 0,01 mM (P <0,005), 0,005 mM (P <0,005) e 0,001 mM (P <0,005); Pep2 a 100 mM (P <0,05), 1 mM (P <0,005), 0,5 mM (P <0,05), 0,1 mM (P <0,05), 0,05 mM (P <0,05) e 0,01 mM (P <0,005); Pep 3 a 100 mM (P <0,0005), 10 mM (P <0,005), 0,5 mM (P <0,05) e 0,1 mM (P <0,05); Pep 4 a 100 mM (P <0,0005), 10 mM (P <0,05), 5 mM (P <0,005), 1 mM (P <0,05) e 0,5 mM (P <0,005) (Figura 18B).
[0165] No ensaio mostrado pela Figuras 14A as células foram tratadas 1 hora com peptídeos e LPS (100ng/mL) foi adicionado. A produção de SEAP foi medida após 12 horas de tratamento. No ensaio mostrado pela Figuras 14B as células foram tratadas com LPS (100ng/mL) por 1 hora e os peptídeos foram adicionados. A produção de SEAP foi medida após 12 horas de tratamento. LPS (100 ng/mL) foi usado como controle positivo e IL-10 (0,4ng/mL) como controle negativo. * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005.
Exemplo 11 - Efeito dos peptídeos miméticos à IL-10 sobre células dendríticas e T em ambiente inflamatório e alérgico
[0166] Células dendríticas murinas da medula óssea foram isoladas de camundongos para analisar o efeito dos peptídeos sintetizados Pep 1 - IL-10, Pep 2 - IL-10, Pep 3 - IL-10 e Pep - 4 - IL-10, em duas concentrações, 1 mM e 10 mM, na modulação da ativação celular. Após 24 horas de tratamento com composição compreendendo ao menos um dos peptídeos na concentração desejada, a análise celular mostrou que todos os quatro peptídeos sintetizados apresentaram respostas em diferentes níveis e foram capazes de interferir nas moléculas co-estimulatórias presentes na superfície das células dendríticas, sendo os peptídeos Pep 1 e 2 os que apresentaram resposta mais significativas. Por exemplo, o Pep 1 a 1 mM diminuiu a expressação de CD86+ (P<0.005), e a 10 mM também diminuiu a expressação de CD86+ (P<0.05). O Pep 2 a 1 pM reduziu a expressão de CD86+ e de CD40+ na superfície celular (P <0,005; P <0,05, respectivamente) (Figura 19 A e B).
[0167] Nos ensaios foram usadas células CD1 1 c+ CD86 (Figuras 19A) e células CD1 1 c+ CD40+ (Figuras 19B) após 24 horas de tratamento. LPS (1 OOng/mL) foi usado como controle positivo. * P <0,05; ** P <0,005.
[0168] Uma vez que todos os quatro peptídeos sintéticos descritos no presente pedido, com afinidade ao receptor de IL-10, exibiram uma capacidade de modular a resposta autoimune e inflamatória, sugerindo que os mesmos podem ser usados no tratamento doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes, selecionamos como exemplo o Pep 1 - IL-10 para mostrar os dados adicionais que aprofundam o conhecimento. Mais ainda, os resultados aqui apresentados demonstram o potencial de associação desses peptídeos, uma vez que eles apresentaram respostas distintas e em vários casos complementares no que diz respeito a concentração e tempo de exposição com melhor resposta. Portanto, fica claro que os mesmos podem ser usados sozinhos ou em quaisquer combinação ente eles, em composições para preparar medicamentos ou composições imunogências para o tratamento e/ou profilaxia de doenças aonde haja uma desordem imunológica, mais particularmente em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[0169] Tais resultados podem ser extrapolados para os demais peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de IL-10 sintetizados e demonstrados no presente pedido de patente.
[0170] A fim de mostrar a capacidade dos peptídeos sintetizados em modular a ativação de células dendríticas, o Pep 1 a 10 mM foi escolhido e a proliferação de células T, de pacientes alérgicos, foi mensurado após 24 horas de tratamento. O Pep 1 nesta concentração diminuiu a proliferação de células T (P <0,005) (Figura 20). As células foram tratadas com Bet v 1 , como controle positivo e um peptídeo irrelevante (IR) foi usado como um controle negativo.
Exemplo 12 - Acão dos peptídeos miméticos à IL-10 na deqranulacão de basófilos
[0171] O efeito dos peptídeos miméticos à IL-10 na liberação de IgE mediada foi examinado utilizando células de leucemia basofílica de rato transfectadas com o receptor Fc RI IgE humano (hRBL). Como exemplo, selecionamos como exemplo o Pep 1 - IL-10 para mostrar os dados obtidos. As células hRBL foram sensibilizadas com soro de sete pacientes alérgicos ao pólen de bétula. As células foram estimuladas com o antígeno e a sua interação com IgEs imobilizadas causou uma liberação de b-hexosaminidase.
[0172] Quando as células foram tratadas com uma composição compreendendo o Pep 1 - IL-10 a 1 mM (Figura 21A) ou rlL10 (Figura 21 B), a quantidade de Bet v 1 necessária para induzir a mesma quantidade de degranulação foi superior quando comparada com as células tratadas apenas com Bet v1 ( P <0,05). Quantidade de rBet v 1 (ng/mL) necessária para induzir metade da liberação de b-hexosaminidase usando soro de sete doadores alérgicos a pólen de bétula após o tratamento com Pep 1 - IL-10 (A) (P <0,05) e rl L10 (B) * P <0,05.
Exemplo 13 - Produção de citocinas após o tratamento da linhagem celular J774 com os peptídeos miméticos à IL-10
[0173] Após 24 horas de tratamento, os níveis de IL-6, MCP-1 e TNF-a produzidos foram mensurados. Não foi observada interferência na produção de IL-10, IFN-g ou IL12p70 (dados não mostrados). No exemplo aqui mostrado, as células tratadas apenas com o peptídeo sintético Pep 1 - IL-10, sem estímulo de LPS para induzir uma resposta inflamatória, foi incapaz de induzir qualquer resposta (dados não mostrados). Por outro lado, quando as células foram tratadas com uma composição compreendendo o Pep 1 - IL-10 seguido de incubação com LPS (1 mg/mL) durante 24 horas para induzir uma resposta inflamatória, o peptídeo foi capaz de diminuir a produção de IL-6, MCP-1 e TNF- a.
[0174] O Pep1 - IL-10 (1 mM, 10 pM e 100 pM, 1 pM P <0,05 e 10 pM e 100 pM P < 0,0005) reduziu significativamente os níveis de IL-6 (1 pM e 10 pM, P <0,05) (Figura 22A); MCP-1 (Figura 22B) e TNF-a (1 pM, 10 pM e 100 pM, P <0,005) (Figura 22C). As diminuições foram significativas em comparação com células tratadas apenas com LPS (controle positivo). * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005
[0175] Os estudos mostram ações imunorreguladoras consistentes dos peptídeos miméticos ao TGFpi e miméticos à IL-10 sintetizados e aqui descritos. Em um ambiente inflamatório, estes peptídeos foram capazes de modular várias vias importantes nas ações regulatórias para supressão de uma resposta inflamatória. No caso dos peptídeos miméticos ao TGFpi ele modulou positivamente a IL-10. Investigamos portanto a combinação de peptídeos miméticos ao TGFpi e a IL-10.
A combinação de peptídeos miméticos ao TGFB1 e a IL-10
Exemplo 14 - Combinação de peptídeos miméticos ao TGFB1 e à IL-10 suprime a deqranulacão de basófilos
[0176] A capacidade dos peptídeos miméticos ao TGF-bI e a IL-10 sinteizados na modulação da resposta imunológica específica de IgE para Bet v 1 foi investigada por ensaios de liberação de mediadores utilizando células RBL-2H3 passivamente sensibilizadas com anticorpos IgE de camundongos imunizados com extrato de pólen de bétula. Bet v 1 foi capaz de induzir a produção de IgE, como observado nos altos níveis de degranulação de basófilos no grupo de camundongos imunizados com extrato de pólen de bétula (Figura 23B-C). Por outro lado, camundongos imunizados com extrato de pólen de bétula em combinação com peptídeos miméticos ao TGF-bI e a IL-10, no exemplo aqui apresentado usamos a combinação do Pep 2 - TGF-bI com o Pep 1 - IL-10, apresentaram níveis significativamente menores de degranulação de basófilos em comparação ao grupo controle (P <0,01 ).
[0177] A combinação de peptídeos miméticos ao TGF-bI e à IL-10 suprime a degranulação de basófilos específica para IgE. Figura 23 A mostra o esquema de imunizações de animais. Figura 23 B, mostra a curva de titulação para o ensaio de liberação do mediador realizado com soros de todos os grupos mostrando que os camundongos tratados com os peptídeos sinteizados apresentavam níveis substancialmente inferiores de degranulação de basófilos. Figura 23 C, mostra o ensaio de liberação de mediador realizado com soros individuais reforçando a ação dos peptídeos na regulação negativa de degranulação de basófilos especicos para IgE. ** P <0,01 , *** P <0,001. Para a imunização, camundongos BALB/c fêmeas (6-10 semanas de idade) foram usados nesse estudo. O esquema de imunização foi realizado conforme descrito na Figura 23A. Para induzir resposta de IgE específica ao alérgeno, cinco camundongos foram imunizados intradermicamente (i.d.) com 125 pg de extrato de pólen de bétula diluído em PBS. Cinco camundongos foram imunizados (i.d.) com 125 pg de extrato de pólen de bétula em combinação com peptídeos miméticos ao TGFpi e à IL-10 diluídos a 1 pM em PBS cada. No exemplo aqui mostrado, usamos a combinação do Pep 2 - TGF-bI com o Pep 1 - IL-10. Três camundongos constituíram o grupo controle. As imunizações foram realizadas nos dias 1 , 14, 28 e 42, e os camundongos foram sacrificados no dia 56. Para investigar a indução da resposta IgE específica ao Bet v 1 , foram colhidas amostras de sangue da veia safena nos dias 28 e 42 após a primeira imunização.
Exemplo 15 - A combinação de oeotídeos miméticos ao TGFB1 e a IL-10 modula a produção de citocinas
[0178] A capacidade dos peptídeos miméticos ao TGF-bI e à IL-10 de interefir na modulação do número de células de baço produtoras de IFN-g, IL-4 e IL-10 em todos os grupos de camundongos foi investigada por ELISPOT. A imunização com extrato de pólen de bétula resultou na alta indução de produção de IFN-g (P <0,001 ) e IL-4 (P <0,001 ) após estimulação com Bet v 1. Camundongos tratados com peptídeos, nesse exemplo com a combinação do Pep 2 - TGF-bI com o Pep 1 - IL-10, apresentaram níveis significativamente mais baixos de IFN-g (P <0,001 ; Figura 24A) e IL-4 (P <0,001 ; Figura 24B) secretados por esplenócitos reestimulados por Bet v 1 , enquanto os níveis de IL-10 foram significativamente maiores (P <0,05; Fig 24C) quando comparados com camundongos não tratados.
[0179] Os esplenócitos re-estimulados com Bet v 1 e peptídeos produziram níveis significativamente menores de IFN-g (Figura 24A) e IL-4 (Figura 24B) e níveis significativamente mais altos de produção de IL-10 (Figura 24C) em comparação com o grupo não tratado. * P <0,05; ** P <0,01 ; *** P <0,001 .
[0180] Para esse experimento, os baços foram removidos de forma asséptica imediatamente após os camundongos serem sacrificados, lisados e centrifugados por 5 min em 1 ml de meio de cultura essencial mínimo (MEM). A lise dos eritrócitos foi realizada adicionando 5 ml de tampão de lise (NH4CI 150 mM, KFIC03 10 mM, Na2EDTA 0,1 mM em ddFI20, pH 7,2) durante 5 min à temperatura ambiente. Os glóbulos brancos foram separados por centrifugação a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente. As células foram ressuspensas em meio de culturan(MEM, 1 % (v / v) de Soro fetal bovino inativado pelo calor, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 U/ml de estreptomicina, 20 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sódio, 2 M de 2-mercaptoetanol e 1 * aminoácidos não essenciais) e utilizados nos experimentos subsequentes.
[0181] Para detecção de IFN-g, IL-4 e IL-10 após estímulo de esplenócitos com Bet v 1 ; placas de filtração MultiScreen foram ativadas com etanol 70% por 10 min, lavadas três vezes com PBS, e foi adicionado 2 pg/ml de IFN-g anti-mouse, IL-4 anti-mouse ou IL-10 anti-mouse durante a noite a 4°C em câmara úmida. As placas foram lavadas três vezes com PBS e incubadas durante 2 h com solução de bloqueio (meio de cultura suplementado com 5% de soro bovino fetal) em câmera úmida a TA. Os esplenócitos foram diluídos a uma densidade de 2x105 em meio de cultura, na presença de Bet v 1 diluído a 20 pg/ml, e incubados por 48 horas a 37°C e 5% de CO2. Após três lavagens com PBS suplementado com 0,1 % de Tween-20; anticorpos de detecção IFN-g, IL-4 e IL-10 foram adicionados nas placas e incubado durante 2h à temperatura ambiente. Após três lavagens, adicionou-se estreptavidina conjugada com HRP às placas e incubou-se durante 1 h à temperatura ambiente. Após quatro lavagens, o substrato TMB foi adicionado a cada placa durante 5 min antes de parar por lavagem com ddhteO. Os imunospots foram contados usando o software ImageJ.
Exemplo 16 - Análise de esplenócitos e a capacidade dos peptídeos miméticos ao TGFB1 e a IL-10 modularem a produção de citocinas com o pré tratamento ou em conjunto com alérqeno
[0182] A capacidade dos peptídeos miméticos ao TGFp e a IL-10 em modular a produção de citocinas foi investigada utilizando esplenócitos e soro de camundongos imunizados apenas com o extrato de pólen de bétula (125pg) (resultados foram identificados nas Figuras 25A a 25D como: BPE); pré- imunizados por 24 horas com o peptideo miméticos ao TGFp e à IL-10 (1 pM/animal) seguido de imunização com o extrato de pólen de bétula (125pg) (resultados foram identificados nas Figuras 25A a 25D como: PRE); ou imunizados com a mistura peptideo TGFp + peptideo IL-10 + extrato de pólen de bétula (resultados foram identificados nas Figuras 25A a 25D como: CO). Os esplenócitos foram isolados dos camundongos e a produção de IL-4, IL-5, IL-2 e IL-13 foi analisada por multiplex após desafio com Bet v 1 (2 pg/mL). Os camundongos que foram pré-tratados (PRE) com a combinação de peptídeos miméticos ao TGF-bI e à IL-10 (Pep 2 - TGF-bI + Pep 1 - IL-10), apresentaram uma diminuição significativa na produção de todas as citocinas analisadas. No entanto, surpreendetemente, os camundongos do grupo CO, ou seja, os que foram tratados com a combinação de peptídeos miméticos ao TGF-bI e à IL- 10, juntamente com o alérgeno de interesse (extrato de pólen de bétula), apresentaram resultado ligeiramente melhor em comparação ao grupo que foi prétratado (PRE) somente com a combinação de peptídeos. Tal resultado indica que, in vivo, o uso de uma composição compreendendo uma combinação dos peptídeos miméticos ao TGF-bI e à IL-10, descritos na presente invenção, é capaz de agir sinergicamente na modulação de uma resposta imunológica. Mais do que isso, os resultados indicam ainda um efeito sinérgico não somente entre os peptídeos miméticos mas também quando se adicionaou o alérgeno na composição de tratamento. Os resultados foram potencializados quando da adição do alérgeno de interesse juntamente com a combinação de peptídeos miméticos.
Exemplo 17 - Análise da capacidade dos peptídeos miméticos ao TGFB1 e à IL-10 modularem a dearanulacão de basófilos com o pré tratamento ou em conjunto com alérgeno
[0183] A capacidade dos peptídeos miméticos ao TGFp e à IL-10 em modular a degranulação de basófilos foi investigada utilizando células RBL-2H3 sensibilizadas com soro de camundongos imunizados apenas com o extrato de pólen de bétula (125pg) (resultados foram identificados nas Figuras 26 como: BRE); pré-imunizados por 24 horas com a combinação de peptídeos miméticos ao TGFp e à IL-10 (1 pM/animal) seguido de imunização com o extrato de pólen de bétula (125pg) (resultados foram identificados nas Figuras 26 como: PRE); ou imunizados com a mistura peptídeo TGFp + peptideo IL-10 + extrato de pólen de bétula (resultados foram identificados nas Figuras 26 como: CO). A degranulação foi induzida pela adição de Bet v 1 (1000ng/mL, 100ng/mL, 10ng/mL e 1 ng/mL). Os camundongos do grupo CO, surpreendentemente, apresentaram níveis de degranulação substancialmente menores em comparação aos outros dois grupos. Sugerindo que, in vivo, a combinação dos peptídeos, juntamente com o alérgeno de interesse, foi capaz de reduzir a produção de anticorpos IgE alérgeno-específicos.
Análise dos resultados e modalidades da invenção
[0184] O presente pedido de patente demonstra a capacidade dos novos peptídeos sintetizados miméticos ao TGF-bI e miméticos à IL-10 modularem a reposta de várias vias importantes na regulação de um processo autoimune e/ou inflamatório.
[0185] Além disso, embora já tenha ficado claro o potencial dos novos peptídeos sintetizados descritos no presente pedido de patente, na modulação de uma resposta inflamatória alérgica ou imune, aprofundamos os estudos e mostramos o papel regulador dos peptídeos sintetizados, na modulação de uma resposta alérgica inflamatória. Os peptídios foram capazes de modular a degranulação de basófilos após estímulo com antígeno, de modular as respostas de perfil TH1 e TH2 através da modulação de citocinas e anticorpos, atuou na diferenciação de células Treg induzidas e afetou outros eventos celulares importantes que promovem a exacerbação do microambiente alérgico ou inflamatório.
[0186] A modulação imune específica para alérgenos é um processo essencial para prevenir o desenvolvimento de alergia, onde a IgE desempenha um papel fundamental. Assim, a inibição da produção de IgE é um evento crucial para suprimir reações alérgicas. Em nosso estudo, os peptídeos miméticos ao TGFpi e à IL-10 inibiram eficientemente a degranulação de basófilos. A capacidade dessas duas citocinas de modificar a produção de anticorpos tipo IgE em relação a isotipos de anticorpos não inflamatórios já foi relatada. No entanto, demonstramos que os novos peptídeos sintetizados descritos no presente pedido, que são moléculas pequenas e que podem imitar a ação de proteínas grandes específicas, são capazes de induzir a mesma ou melhor resposta conforme esperado com a molécula natural ou em comparação com outras moléculas sintéticas já descritas. Além disso, concluímos que existe um efeito sinérgico sureprendente com a combinação dos peptídeos miméticos ao TGFpi e à IL-10 descritos na presente invenção. Além disso, mais surepreendente ainda foi o efeito sinérgico quando da associação da combinação de peptídeos com o alérgeno de interesse. Portanto, concluímos que o tratamento com a combinação de peptídeos miméticos ao TGFpi e a IL-10 apresentou um efeito sinérgico na modulação de uma resposta inflamatória alérgica ou imune, bem como foi capaz de quando em associação com um alérgeno de interesse, reduzir significativamente a degranulação de basófilos.
[0187] Como o IFN-g é uma citocina que contribui direta e indiretamente para a diferenciação do perfil Th1 enquanto a IL-4 é uma citocina que promove a diferenciação do perfil Th2, a regulação negativa dessas duas citocinas indica uma modulação da polarização Th1 ou Th2, evento essencial para controle da resposta inflamatória/alérgica. A IL-4 é conhecida por induzir a troca de classe IgE em camundongos (27), portanto, pode ajudar a explicar nosso resultado anterior, mostrando que os peptídeos suprimiram a degranulação de basófilos mediada por IgE. Nós hipotetizamos que a inibição da IL-4 suprime consequientemente a produção de IgE. Por outro lado, a regulação positiva da IL-10 indica que os peptídeos tiveram uma ação antiinflamatória, uma vez que essa citocina desempenha um papel crucial e muitas vezes essencial na prevenção de patologias inflamatórias. Concluímos, portanto, que o tratamento com os peptídeos miméticos ao TGFpi e a IL-10 modulou a produção de citocinas que desempenham papel crítico no controle da resposta imune.
[0188] Alem disso, o que foi observado nesse estudo, e que é inesperado, foi o fato de a imunização dos camundongo com a combinação de peptídeos miméticos ao TGFpi e a IL-10 quando realizada em conjunto com o antígeno de interesse, no exemplo aqui demonstrado o extrato de pólen de bétula, ter resultado em um efeito melhorado tanto na modulação da resposta alérgica (supressão da degranulação de basófilos), quanto na modulação da produção de citocinas inflamatórias.
[0189] Portanto, o presente pedido de patente descreve Peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de TGFp e peptídeos sintéticos com afinidade ao IL-10, para serem usados em combinação de ao menos um peptídeo mimético ao TGFpi com ao menos um peptídeo mimético à IL-10, em uma composição farmacêutica para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, mais particularmente, doenças inflamatórias crónicas ou agudas e/ou alérgicas, e/ou auto-imunes.
[0190] O presente pedido também descreve composições farmacêuticas que compreendem pelo menos um peptídeo mimético ao TGFpi com ao menos um peptídeos mimético à IL-10, mais, pelo menos, um veículo ou composto farmacêuticamente aceito. Mais particularmente a composição pode ainda compreender como composto farmacêuticamente aceito um alérgeno de interesse. A Composição farmacêutica é para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, mais particularmente, doenças inflamatórias crónicas ou agudas e/ou alérgicas, e/ou auto-imunes.
[0191] O presente pedido também descreve o uso dos peptídeos sintéticos ou das composições farmacêuticas aqui descritas, para a preparação de um medicamento ou composição imunogênica para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, mais particularmente, doenças inflamatórias crónicas ou agudas e/ou alérgicas, e/ou auto-imunes.
[0192] Adicionalmente, o presente pedido também descreve métodos de tratamento e/ou profilático de doenças relacionadas a desordem imunológica em que compreende administrar em um indivíduo uma dose farmaceuticamente efetiva de pelo menos um peptídeo recombinante com afinidade ao receptor de TGF-b e pelo menos um peptídeo recombinante com afinidade ao receptor de lnterleucina-10, ou de uma composição farmacêutica compreende a combinação dos mesmos. Mais particularmente em que fato de que compreende ainda administrar conjuntamente um alérgeno de interesse.
[0193] Embora o presente pedido de patente tenha descrito a matéria objeto da presente invenção com um certo grau de detalhamento a título de ilustração e exemplificação para fins de clareza e compreensão, será evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas no escopo das reivindicações em anexo.
[0194] Os exemplos descritos neste relatório não são limitativos, permitindo que um técnico no assunto altere alguns aspectos ou componentes da presente ivenção, equivalentes aos peptídeos sintéticos, composições ou usos aqui descritos, sem se distanciar do escopo da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1- Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende:
- pelo menos um peptídeo recombinante com afinidade ao receptor de
TGF-b;
- pelo menos um peptídeo recombinante com afinidade ao receptor de lnterleucina-10; e
- pelo menos um veículo, carreador ou composto farmacêuticamente aceitável.
2- Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelo fato de que o peptídeo recombinante com afinidade ao receptor de TGF-b compreende ou consiste da sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N201 , SEQ ID N202, SEQ ID N2 03, SEQ ID N2 04, SEQ ID N205, SEQ ID N206, SEQ ID N207 e SEQ ID N208, ou de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade ou similaridade com uma das sequências selecionadas do grupo que consite de: SEQ ID No 01 , SEQ ID No 02, SEQ ID No 03, SEQ ID No 04, SEQ ID No 05, SEQ ID No 06, SEQ ID No 07 e SEQ ID No 08.
3- Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelo fato de que o peptídeo recombinante com afinidade ao receptor de lnterleucina-10 compreende ou consiste da sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N2 01 , SEQ ID N2 02, SEQ ID N2 03 e SEQ ID N204 ou de uma sequência tendo pelo menos 85% de identidade ou similaridade com umas das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que consite de: SEQ ID N2 01 , SEQ ID N2 02, SEQ ID N2 03 e SEQ ID N2 04.
4- Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o composto farmacêuticamente aceitável é selecionado de um alérgeno de interesse. 5 - Composição farmacêutica de acordo com qualquer um das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica.
6 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto- imunes.
7- Uso de pelo menos um peptídeo recombinante com afinidade ao receptor de TGF-b e pelo menos um peptídeo recombinante com afinidade ao receptor de lnterleucina-10, ou da compsição farmacêutica tal como descrito em qualquer um das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que é para a preparação de um medicamento ou composição imunogênica para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica.
8 Uso de pelo menos um peptídeo recombinante com afinidade ao receptor de TGF-b, de pelo menos um peptídeo recombinante com afinidade ao receptor de lnterleucina-10 e de pelo menos um alérgeno de interesse, caracterizada pelo fato de que é para a preparação de um medicamento ou composição imunogênica para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica. 9- Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crónicas ou agudas, alérgicas e/ou auto- imunes.
10- Método de tratamento e/ou profilático de doenças relacionadas a desordem imunológica, caracterizada pelo fato de que compreende administrar em um indivíduo uma dose farmaceuticamente efetiva de pelo menos um peptídeo recombinante com afinidade ao receptor de TGF-b e pelo menos um peptídeo recombinante com afinidade ao receptor de lnterleucina-10, ou de uma composição farmacêutica tal como descrita em qualquer um das reivindicações 1 a 4.
11- Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende ainda administrar conjuntamente um alérgeno de interesse.
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