CN117467581B - 一种提高犬免疫力的乳酸片球菌King73及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高犬免疫力的乳酸片球菌King73及其应用，属于微生物技术领域；所述乳酸片球菌King73于2023年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28766，分类命名为乳酸片球菌Pediococcus acidilactici。本发明乳酸片球菌King73，其后生元制剂能够调节宠物犬肠道菌群，抑制致病菌生长，对宠物犬的腹泻、呕吐、消化不良、咳嗽等常见疾病有改善效果，总改善率为90‑100%。本发明乳酸片球菌King73，其后生元制剂能够减少宠物犬生病情况，改善精神状态、皮肤状态、毛发状态，减少掉毛。

Description

一种提高犬免疫力的乳酸片球菌King73及其应用

技术领域

本发明涉及一种提高犬免疫力的乳酸片球菌King73及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

提高宠物免疫力能够使宠物更好地抵御各种病原体，从而减少疾病发生几率，降低兽医治疗和医疗费用的支出，并且免疫力强的宠物通常更加健康和活跃，能够更好地享受生活，参与各种活动，与主人建立更好的互动关系，提高宠物和主人的生活质量。提高宠物免疫力不仅降低宠物本身患病风险，还能减少传染给其他宠物和人类的机会，这对多宠物家庭和人宠共处的家庭来说，是非常重要的。

疫苗接种、合理饮食、定期体检和驱虫、适度运动以及良好的生活环境，可以有效提高宠物的免疫力。具体的养护方法还需根据宠物的品种、年龄和健康状况等情况进行调整。

宠物疫苗接种可以有效预防多种疾病，提高免疫力。然而，疫苗并非对所有疾病都能提供100%的保护，而且接种后可能会发生局部不适反应或者过敏反应。

定期的适度锻炼可以增强宠物的免疫力和整体健康。然而，过度运动可能会导致肌肉或关节损伤，因此需要根据宠物的体质和能力进行适量的活动。

保持宠物生活环境的清洁和舒适可以减少病原体的传播，有助于提高免疫力。然而，过度消毒可能破坏宠物的自然免疫力。

定期带宠物去兽医院进行健康检查可以及早发现潜在健康问题并采取相应的预防措施。然而，兽医服务可能会带来一定的费用，并且宠物可能对兽医的访问感到压力。

益生菌能够与宿主动物的免疫系统相互作用，能够调节肠道菌群，改善肠道功能紊乱，抑制致病菌生长，增强机体免疫力。益生菌本身及其代谢产物制备为后生元后安全性更高更稳定，耐受更高温度，便于储存和运输，同时避免了活菌转移耐药基因的风险，适用范围广，对宠物品种、年龄等限制更小。而市面上现有的后生元制剂质量稂莠不齐，功效有待验证。

CN107034163A公开了一种新型乳酸片球菌及其应用，将乳酸片球菌的菌泥（活菌）与冻干保护剂（组成为海藻糖8％、脱脂乳16％、L-半胱氨酸1.5％、乳糖4％、谷氨酸钠1％、L-赖氨酸0.5％、糊精5％、甘油1％，其余为水）混合，乳化后进行冻干，得到乳酸片球菌的冻干制剂，以健康断奶仔猪为实验对象，结果显示该乳酸片球菌的冻干制剂可以降低健康断奶仔猪的腹泻率，提高血清中总蛋白和球蛋白的含量，促进动物的健康。但该专利应用对象为健康断奶仔猪，并未公开对身体状态以及常见疾病的改善的影响。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种提高犬免疫力的乳酸片球菌King73及其应用，实现以下发明目的：对空肠弯曲菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌有抑制作用；对宠物犬的腹泻、呕吐、消化不良、咳嗽等常见疾病有改善效果；改善宠物犬的身体状态，提高其免疫力。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种提高犬免疫力的乳酸片球菌King73，所述乳酸片球菌King73于2023年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28766，分类命名为乳酸片球菌Pediococcusacidilactici。

利用所述乳酸片球菌King73制备得到的后生元制剂。

所述后生元制剂中，菌体数量为0.8-1.2×10¹⁰cfu/g。

所述后生元制剂的制备方法为将乳酸片球菌King73经活化、培养得到活菌数为0.8-1.2×10¹⁰cfu/mL的菌液，在64-66℃下进行热灭活处理28-32分钟，经过浓缩冷冻干燥得到后生元粉，与葡萄糖混合，制得后生元制剂。

所述的乳酸片球菌King73在制备提高犬免疫力产品中的应用。

所述乳酸片球菌King73，分类命名为乳酸片球菌Pediococcusacidilactici，于2023年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.28766。

与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

本发明乳酸片球菌King73，其后生元制剂能够调节宠物犬肠道菌群，抑制致病菌生长，对空肠弯曲菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌3种致病菌均有较明显的的抑制效果。

本发明乳酸片球菌King73，其后生元制剂对宠物犬的腹泻、呕吐、消化不良、咳嗽等常见疾病有改善效果，总改善率为90-100%。

本发明乳酸片球菌King73，其后生元制剂能够减少宠物犬生病情况，改善精神状态、皮肤状态、毛发状态，减少掉毛。

本发明乳酸片球菌King73，其后生元制剂能够提高宠物犬血清中免疫球蛋白含量，提高宠物免疫力，减少宠物生病情况，使宠物身体状态更加健康，并且安全性更高且便于储存和运输，适用范围广，对宠物品种、年龄等限制更小。

具体实施方式

实施例1菌种的分离纯化

1、菌株的分离：2022年10月15日在山东省济宁市采集到健康犬粪便，取1g粪便加入到10mL无菌生理盐水中振荡混匀，然后用无菌生理盐水进行梯度稀释，从10^-1至10^-7共稀释7个梯度，分别取10^-5、10^-6、10^-7三个梯度的稀释液100μL涂布到MRS固体培养基平板上，置于厌氧培养箱中37℃恒温静置培养48h。

所述MRS固体培养基的制备方法为：取蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸三铵2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、吐温-80 1mL、琼脂粉15g，用去离子水溶解，定容至1L，调整pH为6.3，115℃高压蒸汽灭菌30min，倒入平皿中，冷却成固体。

2、菌株的纯化：根据菌落直径1~2mm、边缘整齐、白色不透明的菌落特征，挑取单菌落在MRS固体培养基平板上进行三区划线，划线后在37℃、厌氧条件下培养48h，重复上述操作，共经过3次划线，纯化得到16株纯菌株，将纯菌株加入到甘油管中于-80℃保藏。

实施例2后生元制剂的制备

将-80℃保藏的菌株在实施例1所述的MRS固体培养基平板上活化，挑取活化后的1个单菌落转接到100mL的MRS液体培养基中，37℃恒温静置培养12h制得种子液，将种子液按照1%（v/v）接种量接种于MRS液体培养基中，然后在厌氧条件下37℃恒温静置培养24h，获得活菌数为1.0×10¹⁰cfu/mL的菌液。

将菌液（含有菌体及其代谢产物）热灭活（65℃、30min）处理后，经过浓缩冷冻干燥得到后生元粉。将后生元粉与葡萄糖混合，制成含菌体数量为1.0×10¹⁰cfu/g的后生元制剂；葡萄糖购自山东西王糖业有限公司。

所述MRS液体培养基是在实施例1的MRS固体培养基的配方中省略琼脂的加入。

实施例3后生元制剂的筛选

采用牛津杯法测定后生元制剂对空肠弯曲菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌的抑制作用。

（1）致病菌菌悬液的制备：将空肠弯曲菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌分别于LB固体培养基上进行活化，用接种环挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃、180rpm恒温振荡培养12h；将菌液在8000rpm下离心2min，收集菌体，再用无菌水重悬，上述离心、重悬操作共重复两次，最后稀释至菌体浓度为1.0×10⁸cfu/mL，制得致病菌菌悬液。

（2）菌株后生元待测液的制备：取1g实施例2的后生元制剂与1mL无菌水混合，配制成后生元待测液。

（3）在培养皿中倒入10mL水琼脂，凝固后均匀放置4个牛津杯。随后将150μL的致病菌菌悬液和15mL融化后的LB固体培养基混匀后倒入平板内（加入菌液前培养基需冷却至50℃），培养基凝固后取出牛津杯。实验组每孔加入50μL后生元待测液，阳性对照孔加入50μL氨苄西林钠溶液（无菌水溶解为20mg/mL），阴性对照孔加入50μL葡萄糖溶液（无菌水溶解为500μg/mL），37℃恒温静置培养12h，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，结果如表1所示。

所述LB固体培养基的制备方法为：取氯化钠10g、胰蛋白胨膏10g、酵母提取物5g、琼脂粉15g，用去离子水溶解，定容至1L，调整pH为7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min。

所述LB液体培养基的制备方法为：取氯化钠10g、胰蛋白胨膏10g、酵母提取物5g，用去离子水溶解，定容至1L，调整pH为7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min。

所述水琼脂的制备方法为：称取1.5g琼脂粉，加去离子水定容至100mL，转移至锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。

表1后生元制剂的抑菌效果

注：“-”表示无明显抑菌效果，牛津杯外径为8mm。

如表1所示，菌株11的后生元制剂对空肠弯曲菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌3种致病菌均有较明显的的抑制效果，因此对菌株11进行鉴定。

实施例4菌株的鉴定

将纯化得到的菌株11送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行鉴定， 该菌株的16S rDNA核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示。

该菌株鉴定为乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici），命名为乳酸片球菌King73。

将上述乳酸片球菌King73送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏信息如下：

乳酸片球菌King73，分类命名为乳酸片球菌Pediococcusacidilactici，于2023年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.28766。

采取菌株11的后生元制剂进行下述实施例5-7的宠物实验。

实施例5乳酸片球菌King73后生元制剂对实验比格犬的性能实验

与山东潍坊某动物实验基地合作，选取患有腹泻、呕吐、消化不良、咳嗽等常见疾病的成年比格犬30只，随机分为3组，每组10只。对照组饲喂基础犬粮，实验组1和实验组2按照犬的体重分别添加乳酸片球菌King73后生元制剂100mg/kg/d、400mg/kg/d，与基础犬粮混匀饲喂，在相同环境下饲喂2周。实验期间，由专业人员对犬的患病情况进行检查，若发现症状加重及时进行药物治疗，实验结果如表2所示。

表2比格犬痊愈情况（只）

由表2可知，实验组2的10只比格犬中有8只免疫力增强自己痊愈，2只症状明显减轻，总改善率为100%；实验组1的10只比格犬中有6只痊愈，3只症状明显减轻， 1只症状无改善进行了药物治疗，总改善率为90%；对照组中仅有2只依靠自身免疫力痊愈，2只症状减轻，剩余6只接受了药物治疗。

实施例6乳酸片球菌King73后生元制剂对宠物犬身体状态的影响

与山东潍坊某宠物医院合作，在征得宠物主人同意的情况下，选择健康、体况相近的40只成年金毛，随机分为4组，每组10只。对照组1饲喂基础犬粮，对照组2饲喂基础犬粮和市售普通营养膏，实验组1和实验组2按照犬的体重分别添加乳酸片球菌King73后生元制剂100mg/kg/d、400mg/kg/d，与基础犬粮混匀饲喂。实验周期30天，期间记录犬的生病情况，第30天，对犬的精神状态、皮肤状态、毛发状态、掉毛量进行观察，其中精神状态、皮肤状态、毛发状态均以10分制计算，精神状态越好、皮肤滋润有弹性、毛发柔顺有光泽分数越高，掉毛量为用梳子在宠物背部梳理下来的毛发重量。

表3宠物犬的身体状态

由表3可知，与对照组相比，实验组宠物犬的生病情况、精神状态、皮肤状态、毛发状态及掉毛量都得到明显改善，实验组1相对于对照组1的掉毛量减少61.4%，实验组1相对于对照组2的掉毛量减少40.2%，实验组2相对于对照组1的掉毛量减少75.7%，实验组2相对于对照组2的掉毛量减少62.4%。说明本发明提供的乳酸片球菌King73后生元制剂能够改善宠物犬的身体状态，减少生病，减少掉毛量，提高宠物犬的免疫力。

实施例7乳酸片球菌King73后生元制剂对宠物犬血清免疫指标的影响

对实施例6中实验第30天的宠物犬进行静脉取血，3000rpm离心15min得到血清。用ELISA 试剂盒（购自武汉菲恩生物科技有限公司）对血清中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）进行检测，结果如表4所示。

表4宠物犬的血清免疫指标

注：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

由表4可知，实验组血清中免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M含量显著高于对照组（P＜0.001），说明乳酸片球菌King73后生元制剂能够提高宠物免疫球蛋白含量，增强免疫力。

Claims (5)

1.一种提高犬免疫力的乳酸片球菌King73，其特征在于：所述乳酸片球菌King73于2023年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28766，分类命名为乳酸片球菌Pediococcus acidilactici。

2.利用权利要求1所述乳酸片球菌King73制备得到的后生元制剂。

3.根据权利要求2所述的后生元制剂，其特征在于：所述后生元制剂中，菌体数量为0.8-1.2×10¹⁰cfu/g。

4.根据权利要求2所述的后生元制剂，其特征在于：所述后生元制剂的制备方法为将乳酸片球菌King73经活化、培养得到活菌数为0.8-1.2×10¹⁰cfu/mL的菌液，在64-66℃下进行热灭活处理28-32分钟，经过浓缩冷冻干燥得到后生元粉，与葡萄糖混合，制得后生元制剂。

5.权利要求1所述的乳酸片球菌King73在制备提高犬免疫力产品中的应用。