CN114437967A - 乳酸片球菌AUd2101及在制备治疗犬腹泻制剂中的应用 - Google Patents

乳酸片球菌AUd2101及在制备治疗犬腹泻制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳酸片球菌AUd2101，其保藏号：CGMCC NO：23382；该菌在制备治疗犬腹泻制剂中对于大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和志贺氏菌等常见致犬腹泻的致病菌有抑菌效果，具有治疗犬腹泻的用途。

Description

乳酸片球菌AUd2101及在制备治疗犬腹泻制剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种乳酸片球菌AUd2101及在制备治疗犬腹泻制剂中的应用。
背景技术
宠物用益生菌近年来发展迅速，但是这些宠物用益生菌来源广泛，核心菌株模糊不清， 且大都未经过益生功能评价，作为宠物用肠道菌群调节剂使用效果良莠不齐、远远满足不 了快速发展的宠物市场的需求。由于我国目前还缺乏犬用益生菌的系统研究，市场上的益 生菌产品来源混杂，对犬的益生保健功能并不明确。因此从健康犬肠道中分离、鉴定，对 纯化的菌株进行益生功能评价，筛选具有益生潜力的，制备犬用微生态制剂，具有十分重 要的应用价值和市场前景。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种乳酸片球菌AUd2101，其分类命名为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，已于2021年9月10日提交至中国普通微生物菌种保藏中心，保藏 编号：CGMCC NO：23382，保藏中心的具体地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏结果为存活，该乳酸片球菌AUd2101在制备治疗犬腹泻制剂中具有抑制大肠杆菌、 沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和志贺氏菌的生长的特性。
本发明另一个目的是提供一种乳酸片球菌AUd2101在制备治疗犬腹泻制剂中的应用， 能够用于抑制大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和志贺氏菌的生长。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种乳酸片球菌AUd2101，乳酸 片球菌AUd2101的保藏号：CGMCC NO：23382。
优选的是，所述乳酸片球菌AUd2101的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
一种乳酸片球菌AUd2101在制备治疗犬腹泻制剂中的应用，所述乳酸片球菌AUd2101用于抑制大肠杆菌的生长。
一种乳酸片球菌AUd2101在制备治疗犬腹泻制剂中的应用，所述乳酸片球菌AUd2101用于抑制沙门氏菌的生长。
一种乳酸片球菌AUd2101在制备治疗犬腹泻制剂中的应用，所述乳酸片球菌AUd2101用于抑制空肠弯曲杆菌的生长。
一种乳酸片球菌AUd2101在制备治疗犬腹泻制剂中的应用，所述乳酸片球菌AUd2101用于抑制志贺氏菌的生长。
本发明至少包括以下有益效果：
乳酸片球菌AUd2101对大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲杆菌具有很强的抑菌效应，可作为微生态制剂开发的潜在益生菌使用。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明 的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的其中一种技术方案所述乳酸片球菌AUd2101的形态图；
图2为本发明的其中一种技术方案所述乳酸片球菌AUd2101 16S rDNA PCR产物的琼 脂糖凝胶电泳图；
图3为本发明的其中一种技术方案所述乳酸片球菌AUd2101的抑菌效果图；
图4为本发明的其中一种技术方案所述细胞黏附效果图。
注：图2中1-8均代表菌株AUd2101，M代表DL5000 DNA Marker；图3中A：代 表指示菌空肠弯曲杆菌；B：代表指示菌志贺氏菌；C：代表指示菌大肠杆菌；D：代表指 示菌沙门氏菌；对：指阴性对照，即空白MRS培养基；AU：代表分离菌株AUd2101； 阳：指阳性对照，即市面所售益生菌制剂中所分出菌株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字 能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，试剂和材 料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例
一、材料
健康犬只粪便32份；分别装入无菌取样管编号后，立即放入冷藏保温箱(温度低于4℃)，8小时内将样品转移至-80℃冰箱冷冻保存。
培养基：MRS及BHI培养基(购自奥博星生物有限公司)。
主要试剂：革兰氏染色试剂、细菌基因组DNA提取试剂盒(天根)、溶菌酶(天根)、溶菌酶缓冲液(生工)、通用引物27F(华大)、通用引物1492R(华大)、琼脂糖、药敏纸 片(恩诺沙星、万古霉素、庆大霉素、青霉素、环丙沙星、氨苄西林、头孢噻吩)。
指示菌株：大肠杆菌(ATCC33760)、志贺氏菌(ATCC25957)、沙门氏菌(CGMCC1.1869) 和空肠弯曲杆菌(ATCC33291)(购自青岛海博生物科技有限公司)。
二、菌株的分离
将32份健康犬只粪便样品缓冻后，每份样品均使用无菌生理盐水进行梯度稀释，分 别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍，将稀释后的样品涂布于对应的MRS固体培 养皿上，培养皿置于37℃厌氧培养24-48h。培养后挑选具有乳酸菌典型形态且形态各异 的单菌落，同时观察记录菌落特征并进行编号。经反复纯化后于显微镜下观察菌体形态， 并进行革兰氏染色，挑选革兰氏染色呈蓝紫色且形态呈球状或杆状的菌株作为后备菌株， 待用。
三、菌株鉴定
1、形态特征的确定
对筛选出的菌株进行革兰氏染色，并在100×显微镜下观察。
2、16S rDNA序列分析
将初筛得到的菌株纯化培养，培养24h后提取菌株基因组DNA，以菌株DNA为模板，利用细菌通用引物(上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物1492R： 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对菌株基因组进行PCR扩增，其中，PCR扩增扩增体 系如表1所示。扩增后，将扩增产物进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳图如图2所 示(M为DL5000DNA Marker；2为AUd2101的扩增产物)，确认目的条带后送测序公司 测序并将测序结果在Genbank数据库进行BLAST比对。
表1 PCR扩增体系
Figure BDA0003458670460000031
Figure BDA0003458670460000041
四、抑菌能力检测
S1、将活化后的大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌和空肠弯曲杆菌菌液稀释至浓度为10-5cfu/ml，即得稀释液，使用无菌棉签将稀释液涂布于BHI固体培养基上，待BHI固体 培养基上的稀释液干燥后，将牛津杯置于BHI固体培养基的平板上；
S2、将乳酸片球菌AUd2101的菌液培养24h后，使用离心机转速8000r离心10min 后取上清液，加至BHI固体培养基上的牛津杯中；
S3、将步骤S2加入上清液后的BHI固体培养基在4℃的温度下培养4-6h，待上清液完全扩散至BHI固体培养基中的琼脂内后，将其移至37℃培养箱内进行培养，对照孔采 用等量MRS液体空白培养基；
S4、将步骤S3在37℃培养箱内培养12h后的BHI固体培养基取出，测量BHI固体 培养基上的抑菌圈的直径大小。
五、抗生素敏感性实验
将纯化培养后的菌株菌液浓度调整为108cfu/ml，使用涡旋混匀器混匀，再将菌液涂布 在MRS固体培养基上，待菌液吸收后放置药敏纸片，37℃培养24h。每组重复3次，测 量记录抑菌直径。
六、耐酸耐胆盐能力测定
取三个MRS肉汤培养基，使用0.1moI/L的HCl分别调节三个MRS肉汤培养基至pH 值分别为2.0、2.5和3.0；再取另外三个MRS肉汤培养基，使用牛胆盐将其胆盐浓度分别 调整为0.05％、0.08％和0.1％，调节好后将此六个MRS肉汤培养基在121℃温度下灭菌 20min，然后再在无菌条件下接种乳酸片球菌AUd2101，初始乳酸片球菌AUd2101活菌数 为1×108cfu/ml，37℃培养箱中恒温培养。于0h和2h取样涂布平板统计活菌数，计算存 活率。
七、细胞黏附实验
在培养板上接种浓度为2×104cells/mL的Caco-2细胞，使Caco-2细胞预先置入22mm 板中，预先置入无菌盖玻片，使细胞贴附盖玻片生长，将培养板放置在温度为37℃，CO2含量为5％的培养箱中。使用PBS冲洗并调整培养后的乳酸片球菌AUd2101，使乳酸片球菌AUd2101的浓度为1×108CFU/mL。待Caco-2细胞长成致密单层后，用PBS缓冲液漂 洗细胞2次，每孔加入不含抗生素的1mLDMEM培养液和1mL上述制备好的乳酸片球菌 AUd2101悬液，轻轻摇匀，置于CO2培养箱继续孵育，每株菌重复3孔。培养120min后， 用PBS缓冲液洗涤Caco-2细胞5次，除去未黏附的乳酸片球菌AUd2101，然后加入无水 甲醇固定20min，对Caco-2细胞进行革兰氏染色，显微镜下随机选取20个视野，计算100 个Caco-2细胞上黏附的菌株个数，以平均每个Caco-2细胞所黏附的菌株个数表示黏附能 力。
八、动物实验
选用2月龄的幼龄中华田园犬共20只，随机分为2组，每组10只，分别为对照组及AUd2101治疗组。攻毒：采用志贺氏菌(1010CFU/mL)以10mL/kg饲喂四次(8h/次)。 其中对照组攻毒成功后正常饲喂狗粮，治疗组攻毒成功后除饲喂狗粮还需每日饲喂菌株 AUd2101(1010CFU/mL)，饲喂量为10mL/kg，连续饲喂七天，记录每日每组犬只腹泻情 况。分别于攻毒成功后以及治疗成功后对实验动物进行采血测定血清免疫因子含量。
九、结果
1、菌株鉴定结果
经革兰氏染色显示为革兰氏阳性菌，菌形状为圆形或椭圆形，大多数成双或短链状排 列。
BLAST比对结果如表2所示，测序结果所得的序列如SEQ ID No.1所示。如序列表所示的SEQ ID No.1是乳酸片球菌AUd2101的16S rDNA基因序列，该菌株已于2021年 9月提交至中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC NO：23382。
表2比对结果
分离株 菌株 相似度 登录号
乳酸片球菌AUd2101 乳酸片球菌 99％ NR_042057.1
2、抑菌能力结果
结果如图3所示，肠道感染的主要致病菌是大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌以及空肠 弯曲杆菌，因此本实验考察了乳酸片球菌AUd2101对四种致病菌的抑制能力，结果显示乳酸片球菌AUd2101的抑菌能力强于阳性对照组(即市售宠物活性益生菌粉中所分离菌株)，对四种致病菌均有抑菌能力(抑菌圈直径≥13mm)，通过测量如图3所示的抑菌圈大 小可以得出乳酸片球菌AUd2101对大肠杆菌(ATCC33760)、志贺氏菌(ATCC25957)、 沙门氏菌(CGMCC 1.1869)和空肠弯曲杆菌(ATCC33291)的抑菌直径分别为 16.41±0.25mm、21.12±0.51mm、15.03±0.37mm、24.83±0.29mm，而阳性对照组菌株对大 肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌及空肠弯曲杆菌抑菌直径分别为12.71±0.65mm、 13.32±0.33mm、15.04±0.49mm、18.13±0.22mm。
3、抗生素敏感性结果
筛选益生菌的先决条件即为分离株的抗生素敏感性。将抑菌试验筛选后得到的分离株 进行了对7种常用抗生素的敏感性测定实验，参照《CLSI抗菌药物敏感性试验实施标准 (2018)》中的规定，结果如表3显示，分离株对青霉素、氨苄西林及头孢噻吩三种抗生 素普遍高度敏感，对恩诺沙星中度敏感。除上述以外，菌株均表现抗性。
表3
菌株 青霉素 氨苄西林 头孢噻吩 恩诺沙星 万古霉素 庆大霉素 环丙沙星
AUd2101 S S S I R R R
注：S为高度敏感；I为中度敏感；R为抗性。
4、耐酸耐胆盐能力结果
乳酸片球菌AUd2101的耐酸耐胆盐能力良好，在pH值为2(犬胃液内pH)时，乳 酸片球菌AUd2101培养2h后存活率为68.97±3.67％；在胆盐浓度为0.1％的条件下，乳 酸片球菌AUd2101培养2h后存活率为50.37±3.98％。
5、细胞黏结果
细胞黏附试验显示对Caco-2细胞粘附个数为20.15±3.24，黏附效果图如图4所示。
6、动物实验结果
对各组腹泻幼犬进行不同处理后腹泻率如表4。各处理组前3天的腹泻率没有差异， 幼犬腹泻率均为100％，第四天起，各组腹泻率逐渐降低，其中对照组幼犬在第九天全部 停止腹泻，而Aud2101组幼犬则在第七天全部停止腹泻。表明菌株Aud2101可降低攻毒幼犬的腹泻率。
对Aud2101组攻毒幼犬治疗前后血清IgA浓度测定如表5，结果显示经菌株治疗后IgA 浓度显著低于治疗前(P＜0.05)。表明菌株Aud2101可以降低肠道反应性，调节机体免疫 功能。
表4各处理组腹泻率
分组 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d
对照组 100％ 100％ 100％ 90％ 80％ 50％ 30％ 10％ 0
Aud2101 100％ 100％ 100％ 80％ 50％ 20％ 0 0 0
表5 Aud2101组治疗前后IgA浓度
免疫因子(g/L) 治疗前 治疗后
IgA 1.57±0.07<sup>A</sup> 1.27±0.08<sup>B</sup>
注：同行数据中肩标字母不同者表示差异显著(P＜0.05)。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用， 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现 另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特 定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农产品加工研究所 澳优乳业（中国）有限公司
<120> 乳酸片球菌AUd2101及在制备治疗犬腹泻制剂中的应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1439
<212> DNA
<213> Pediococcus acidilactici
<400> 1
ctagctccta aaaggttacc ccaccggctt tgggtgttac aaactctcat ggtgtgacgg 60
gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc 120
gattccgact tcgtgtaggc gagttgcagc ctacagtccg aactgagaat ggttttaaga 180
gattagctaa acctcgcggt ttcgcaactc gttgtaccat ccattgtagc acgtgtgtag 240
cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcgtcccca ccttcctccg gtttgtcacc 300
ggcagtctca ctagagtgcc caactgaatg ctggcaacta gtaataaggg ttgcgctcgt 360
tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca 420
ttctgtcccc gaagggaacg cctaatctct taggttggca gaagatgtca agacctggta 480
aggttcttcg cgtagcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc 540
aattcttttg agtttcaacc ttgcggtcgt actccccagg cggattactt aatgcgttag 600
ctgcagcact gaagggcgga aaccctccaa cacttagtaa tcatcgttta cggcatggac 660
taccagggta tctaatcctg ttcgctaccc atgctttcga gcctcagcgt cagttacaga 720
ccagacagcc gccttcgcca ctggtgttct tccatatatc tacgcatttc accgctacac 780
atggagttcc actatcctct tctgcactca agtctcccag tttccaatgc acttcttcgg 840
ttgagccgaa ggctttcaca ttagacttaa aagaccgcct gcgctcgctt tacgcccaat 900
aaatccggat aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt 960
ggctttctgg ttaaataccg tcactgggtg aacagttact ctcacccacg ttcttcttta 1020
acaacagagc tttacgagcc gaaacccttc ttcactcacg cggcgttgct ccatcagact 1080
tgcgtccatt gtggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca 1140
gtcccaatgt ggccgattac cctctcaggt cggctacgca tcatcgcctt ggtgagccgt 1200
tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatccaga agtgatagca gagccatctt 1260
ttaaaagaaa accaggcggt tttctctgtt atacggtatt agcatctgtt tccaggtgtt 1320
atcccctgct tctgggcagg ttacccacgt gttactcacc cgtccgccac tcacttcgtg 1380
ttaaaatctc attcagtgca agcacgtcat aatcaattaa cggaagttcg ttcgactgc 1439

Claims (6)

1.乳酸片球菌AUd2101，其特征在于，乳酸片球菌AUd2101的保藏号：CGMCC NO：23382。
2.如权利要求1所述的乳酸片球菌AUd2101，其特征在于，所述乳酸片球菌AUd2101的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的乳酸片球菌AUd2101在制备治疗犬腹泻制剂中的应用，其特征在于，所述乳酸片球菌AUd2101用于抑制大肠杆菌的生长。
4.如权利要求1所述的乳酸片球菌AUd2101在制备治疗犬腹泻制剂中的应用，其特征在于，所述乳酸片球菌AUd2101用于抑制沙门氏菌的生长。
5.如权利要求1所述的乳酸片球菌AUd2101在制备治疗犬腹泻制剂中的应用，其特征在于，所述乳酸片球菌AUd2101用于抑制空肠弯曲杆菌的生长。
6.如权利要求1所述的乳酸片球菌AUd2101在制备治疗犬腹泻制剂中的应用，其特征在于，所述乳酸片球菌AUd2101用于抑制志贺氏菌的生长。
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Application publication date: 20220506

Assignee: ANHUI JINLAC BIOTECH LTD.

Assignor: AUSNUTRIA DAIRY (CHINA) Co.,Ltd.|INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Contract record no.: X2023980043948

Denomination of invention: Lactobacillus AUd2101 and its application in the preparation of preparations for treating canine diarrhea

Granted publication date: 20230718

License type: Common License

Record date: 20231019