CN116083300B - 一种防治犬腹泻的益生菌复合制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种防治犬腹泻的益生菌复合制剂及其应用，属于复合益生菌制剂技术领域。所述复合益生菌制剂包括犬源益生菌嗜酸乳杆菌TD4，其具有良好的耐酸耐胆盐能力和肠上皮细胞粘附性，对常见的导致犬腹泻的致病菌有抑菌效果，特别对大肠杆菌具有黏附抑制效果，并对多种抗生素敏感。该复合益生菌制剂还包括罗伊氏乳杆菌MD2、凝结芽孢杆菌TBC169和益生元菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶等成分。所复配的益生元菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶与益生菌组合存在协同作用，能选择性增殖嗜酸乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。犬动物实验表明：本发明中的益生菌复合制剂可以通过调节肠道菌群、激活免疫，从而显著降低由大肠杆菌感染导致的犬细菌性腹泻率。

Description

一种防治犬腹泻的益生菌复合制剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种防治犬腹泻的益生菌复合制剂及其应用，属于复合益生菌制剂技术领域，具体涉及一种嗜酸乳杆菌及其在制备防治犬腹泻制剂中的应用。
背景技术
犬腹泻病是临床疾病中常见的一种疾病，其发病原因多且复杂。其中，宠物大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌(Escherichia coli)引起的一种以侵害初生幼犬为主的急性肠道传染病，以腹泻、败血症为主要临床特征。此外，大肠杆菌还可以导致成年犬和猫的肾盂肾炎和尿道炎等。由于宠物临床对抗生素的不合理应用，导致大肠杆菌耐药性增强，宠物携带的耐药菌很可能通过接触传播给人类，从而威胁人类健康。因此，积极寻找抗生素替代疗法，去有效预防和治疗犬腹泻病迫在眉睫。
近年来，利用益生菌改善人类和动物的肠道健康已成为共识。益生菌在兽医临床上的研究和应用也越来越普遍，大量研究表明乳酸菌作为犬的正常菌群对其肠道微生态系统具有重要的作用。乳酸菌通过定植在肠道中成为肠道生理屏障的重要组成部分，维持肠道微生态系统的菌群平衡。并且，这些乳酸菌能够刺激巨噬细胞、诱导产生干扰素、促进细胞分裂、产生抗体，调节机体细胞免疫、体液免疫和肠黏膜局部免疫等，最终提高机体免疫能力。鉴于犬源乳酸杆菌对犬的有益作用，因此能够作为犬用益生菌制剂的潜在菌种。
目前宠物市场上的益生菌产品来源混杂，保健功能不明确，微生态产品质量良莠不齐。虽然目前已有一些宠物源益生菌的研究和专利申请，但仍缺乏针对大肠杆菌导致的细菌性腹泻的宠物源益生菌复合制剂。因此，从健康犬只的肠道中分离、鉴定和筛选宠物源益生菌，制备成对幼龄宠物犬胃肠道健康具保健作用的益生菌制剂，具有十分重要的应用价值和市场前景。
发明内容
本发明目的之一是提供一株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)TD4，已于2020年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.20369，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该嗜酸乳杆菌TD4益生菌具有良好的耐酸耐胆盐能力和肠上皮细胞粘附性，对常见的导致犬细菌性腹泻的致病菌有抑菌效果，可以有效抑制大肠杆菌黏附，对多种抗生素敏感。
在本发明的一种实施方式中，所述嗜酸乳杆菌TD4的16S rRNA基因序列如图2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述嗜酸乳杆菌TD4的形态学特征的扫描电子显微图(SEM)如图3所示。
本发明目的之二是提供一种包含嗜酸乳杆菌TD4的益生菌复合制剂。优选地，其组分还包括：罗伊氏乳杆菌MD2、凝结芽孢杆菌TBC169中的一种或两种益生菌。更为优选地，其还进一步包括：菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶中的一种或多种益生元。该制剂用于防治犬大肠杆菌感染的细菌性腹泻。主要变现为：犬急性腹泻严重指数评分和粪便评分显著改善，控制血液中的C反应蛋白(cCRP)，提升3种免疫因子：IL-10、髓过氧化物酶(MPO)，以及粪便中SIgA的含量，同时大肠杆菌数量降低和有益菌乳酸菌增加。
在本发明的一种实施方式中，所述益生菌复合制剂由益生菌嗜酸乳杆菌TD4、罗伊氏乳杆菌MD2、凝结芽孢杆菌TBC169和益生元菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶组成。
在本发明的一种实施方式中，所述嗜酸乳杆菌TD4活菌数量≥1×108CFU/g，罗伊氏乳杆菌MD2活菌数量≥1×108CFU/g，凝结芽孢杆菌活菌数量≥2×107CFU/g。优选地，所述嗜酸乳杆菌TD4活菌数量为1×108-1×1010CFU/g，罗伊氏乳杆菌MD2活菌数量为1×108-1×1010CFU/g，凝结芽孢杆菌活菌数量为2×77-2×710CFU/g。更为优选地，所述嗜酸乳杆菌TD4活菌数量为1×109CFU/g，罗伊氏乳杆菌MD2活菌数量为1×109CFU/g，凝结芽孢杆菌活菌数量为2×107CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶粉的质量比分别为2-4：1-2：2-4。优选地，所述菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶粉的质量比分别为3：2：3。
本发明目的之三是提供如上所述的嗜酸乳杆菌或如上所述的益生菌复合制剂在制备防治腹泻制剂中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述腹泻是细菌性腹泻。优选地，所述细菌为铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述腹泻是宠物腹泻。优选地，所述宠物腹泻是猫腹泻或犬腹泻。更优选地，所述宠物腹泻是犬腹泻。
在本发明的一种实施方式中，所述制剂为食品、药品或保健品。
附图说明
图1：利用体外肠道菌群模拟系统发酵益生元底物增殖潜在犬益生菌的结果，不同益生元底物发酵后肠道菌群在属水平的丰度(A)；被益生元增殖的细菌OTU(B)；细菌OTU序列在EzBioCloud数据库的比对结果(C)。
图2：嗜酸乳杆菌TD4的16s rRNA基因序列。
图3：嗜酸乳杆菌TD4的扫描电镜图。
图4：嗜酸乳杆菌TD4的胃酸和胆盐敏感性(A)、细胞黏附能力(B)、抑菌效果(C)和抗生素敏感性(D)。
图5：益生菌复合制剂对犬急性腹泻严重程度指数和Purina粪便评分的改善作用。
图6：益生菌复合制剂对免疫指标IL-6(A)、TNF-α(B)、IL-10(D)、cCRP(D)、MPO(E)和SIgA(F)的影响。
图7：益生菌复合制剂对粪便样本中大肠杆菌(A)、乳酸菌(B)和总细菌数(C)的影响。
图8：益生菌复合制剂在属水平对肠道菌群结构的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施方案中实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
以下实施例中使用的嗜酸乳杆菌TD4，已于2020年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.20369，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
以下实施例中使用的罗伊氏乳杆菌MD2，已于2020年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.20366，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，最新命名为罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillusreuteri)。
实施例1体外肠道菌群模拟系统发酵益生元，增殖益生菌
1.1粪便样本采集
收集杭州地区两家犬舍共计24只犬的粪便样本，所有提供粪便样本的犬只健康状况良好，无消化系统疾病，在样本采集前至少3个月未接受任何药物治疗，包括抗生素。经过浙江省农业科学院伦理委员会批准(伦理号2022ZAASLA46)，收集的新鲜粪便样本保存在无菌收集管中，3小时内运回实验室处理。
1.2批量发酵
将粪便样本的批量培养物在含有5mL基础培养基(YCFA)的10mL小瓶中发酵。为了评估壳聚糖(LCOS)、壳寡糖(COS)、阿拉伯胶(GUM)、低聚甘露糖(MOS)、果寡糖(FOS)、菊粉(INU)6种不同益生元对犬粪便菌群的影响，在发酵前向粪便样品中添加经过滤膜灭菌的益生元原液，最终浓度为8mg/mL。另制备不含益生元的对照培养基(CONT)以及原始粪便样本(ORI)作为对照。在115℃下对培养基进行15min的高压灭菌，将初始pH调整为6.5。取新鲜粪便样品，用全自动粪便匀浆机将其悬浮于8.0mL 0.1M厌氧磷酸盐-缓冲盐水(pH＝7.0)中，制成10％(w/v)粪便匀浆液，制备接种物。在37℃下，将1％的粪浆接种到每个小瓶中，进行批量发酵。24小时后，将培养物离心，收集沉淀，-80℃保存。
1.3肠道菌群16S rRNA高通量测序
使用QIAamp DNA Stool Mini Kit从培养液中提取微生物基因组DNA。使用NanoDrop 2000紫外分光光度计测定提取的DNA浓度，并通过琼脂凝胶电泳(1.0％)确认DNA的完整性和大小。采用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)分别扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区。二代测序(2×300对端)在IlluminaMiSeq平台上进行，按照美吉生物制药科技有限公司(上海，中国)的标准方案进行。测序后，通过QIIME软件包对原始fastq文件进行解复用和质量过滤。使用UPARSE将操作分类单元(Operational taxonomic units,OTU)聚类在97％的相似度，使用UCHIME识别并删除嵌合序列。使用RDP Classifier对SILVA数据库v.128进行OTU的分类注释，置信阈值为0.7。为了进一步计算alpha和beta多样性，我们删除了罕见的OTU(<0.001％)，以减少样本的异质性。生物信息学分析在美吉云平台上运行。
结果表明，相对于对照组(CONT)，益生元FOS、MOS及INU益生元底物发酵可以显著提高乳酸菌属(Lactobacillus)和链球菌(Streptococcus)的相对丰度(图1A)。其中OTU368、OTU74、OTU118、OTU377和OTU355是被显著增殖的微生物类别(图1B)。上传此5个OTU序列，通过EzBioCloud数据库中的16S rRNA基因序列比对发现，OTU368、OTU74、OTU118、OTU377和OTU355分别对应嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、鼠乳杆菌(L.murinus)/动物乳杆菌(L.animalis)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)，序列相似度菌大于99％(图1C)，说明以上几种微生物是可以被益生元FOS、MOS和INU增殖的潜在益生菌，益生菌与益生元复配之间具有协同效应。鉴于FOS和INU的功能类似，所以选择益生元复配的时候，只选择了INU和MOS复配，又考虑到阿拉伯胶可以显著增加群菌短链脂肪酸的生成，因此益生元复配中也加入了GUM。
实施例2健康犬粪便中潜在益生菌的分离培养和鉴定
2.1菌株的分离培养
将犬的新鲜粪便样本用无菌生理盐水连续梯度稀释后分别涂布于MRS、TPY、RCM 3种琼脂培养基(OXOID)，在超净台或厌氧手套箱的37℃条件下孵育48±3小时。在鉴定之前随机选择单菌落并重复在培养基上划线进行分离。
2.2菌株的鉴定
通过MALDI Biotyper(Bruker,Germany)在种水平上鉴定所有分离株，当MALDI-TOF MS的分数≤2.0时，通过16S rDNA基因测序分析进行额外确认。提取菌株基因组DNA，利用细菌通用引物(上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对菌株的16S rRNA基因组进行PCR扩增。扩增后，将扩增产物于1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳，确认目的条带后送测序公司测序并将测序结果在Genbank数据库进行BLAST比对。本研究选择其中被益生元增殖的42株乳酸菌分离株，将每种分离株在20％(w/v)甘油管中于-80℃下保存，用于进一步筛选和评价研究。
2.3乳酸菌扫描电镜(SEM)
将对数生长期的乳酸菌离心后去上清，然后用2.5％戊二醛溶液中4℃固定过夜。在PBS中洗涤三次15分钟后，用1％的锇酸溶液固定样品1-2小时，用梯度浓度(包括50％，70％，80％，90％和95％五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100％乙醇处理两次，每次20min；最后，在真空冷冻干燥器中干燥到临界点，使用离子溅射涂层器用金溅射涂层。然后通过SEM(TM3000，Hitachi，日本)观察涂层样品。
我们利用MRS、TPY、RCM这3种琼脂培养基在厌氧或需氧条件下，总共从犬肠道菌群中分离到200株微生物。通过MALDI Biotyper和16S rRNA基因测序鉴定，共得到42株潜在益生菌进行体外益生功能筛选评价，其中有19株嗜酸乳杆菌、7株鼠乳杆菌/动物乳杆菌、8株约氏乳杆菌和8株罗伊氏乳杆菌，其中，嗜酸乳杆菌TD4的16S rRNA基因测序结果序列如图2所示，该序列经与EzBioCloud数据库比对后，发现该序列与L.acidophilus 16S rDNA序列同源性达100％。该菌株已于2020年7月16日提交至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC NO.20369。扫描电镜显示：嗜酸乳杆菌TD4的形态特征是一种末端呈圆形的长杆菌(图3)。
实施例3体外益生菌筛选
3.1胃酸和胆盐敏感性
根据Silva等人(2013)和Sandes等人(2017)的改进方法评估了人工胃液敏感性(GJS)和人工胆汁敏感性(BSS)。将乳酸菌克隆接种于pH 7.0的无菌生理盐水(对照)或人工胃液(NaCl2g/L，胃蛋白酶3.2g/L，pH 2.5)或人工小肠液(NaHCO3 150mM，胰蛋白酶1.9g/L，pH 8.0)中，并在37℃下孵育3小时。离心样品，将沉淀悬浮在1mL MRS肉汤中。对于GJS和BSS分析，将每种培养物转移到管中，在MRS肉汤或补充有0.3％胆汁酸的MRS肉汤中稀释2％(v/v)。然后，将200μL细菌悬浮液等分到无菌的96孔微孔板中，并在恒温分光光度计中孵育。在37℃下持续培养18小时。通过每30分钟测量的OD620吸光度确定生长曲线。使用程序Graphpad Prism 8.0通过以下公式计算生长抑制百分比：(1-AreaS/AreaCT)×100，其中AreaS和AreaCT分别对应菌株在人工胃液或胆汁盐压力下和对照的生长曲线下面积。菌株被分类为胃酸和胆盐抗性GJS/BSS<40％、中度抗性40≤GJS/BSS≤75％或敏感GJS/BSS>75％。结果基于三个独立测定的平均值。图4A显示了嗜酸乳杆菌TD4对胃酸抗性为-11.0％，对胆盐的抗性为71.8％，说明嗜酸乳杆菌TD4对胃酸具有良好的抗性(GJS<40％)，对胆盐具有中度抗性(40≤BSS≤75％)。
3.2细胞黏附实验
对于粘附测定，在6孔组织培养板中制备Caco-2细胞单层和极化细胞。将细胞以25,000个细胞/cm2的浓度接种到孔中，每两天更换培养基，持续两周，以获得分化的细胞。此后，为了确定粘附程度，使乳酸菌菌株在MRS肉汤中生长8-10小时，并通过在4℃下于6000g离心10min收获，将沉淀物用无菌PBS洗涤，并重新悬浮在DMEM中，调节OD600＝1。通过菌落计数法，计算OD600＝1时，益生菌菌株在MRS琼脂平板上的初始细胞的数目。清空Caco-2细胞培养孔中的旧DMEM培养基，并用无菌PBS洗涤孔以去除抗生素。随后，将菌株添加至Caco-2细胞。孵育1小时后，用无菌PBS轻轻洗涤未结合的细菌，并用Triton X-100(0.05％)分离剩余的细菌和Caco-2细胞，在MRS琼脂上进行细菌计数。此外，用SEM确认乳酸菌菌株对Caco-2细胞的粘附。所有步骤都在放置在6孔组织板上的无菌玻璃盖玻片上进行。使用2.5％w/v戊二醛进行固定。然后，用PBS洗涤样品，用2％w/v的四氧化锇进行固定。最终，将样品在一系列梯度的乙醇中脱水，先是30％，然后是50％，70％，80％和无水乙醇。细胞在临界点干燥器(英国E3100)中干燥，并涂金。使用SEM检查样品。
以Caco-2细胞为黏附模型，鼠李糖乳杆菌LGG为对照菌株，对嗜酸乳杆菌TD4的体外黏附能力进行评估。扫描电子显微镜(SEM)显示嗜酸乳杆菌TD4附着在Caco-2细胞上(图4B)，表示嗜酸乳杆菌TD4对Caco-2细胞具有一定黏附性，计数结果显示其平均黏附数为6.0±1.4CFU/细胞。
3.3抑菌试验
通过将24小时的乳酸菌MRS肉汤培养物在10000rpm，4℃下离心20分钟，然后使用0.22μm注射器过滤器过滤除菌，制备乳杆菌分离物的无细胞上清液。将8种测试病原体(铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌)的接种物(30μl-75μl)加入到BHI琼脂(琼脂浓度8％)上进行菌苔培养，将牛津杯置于BHI固体培养基的平板上。然后将无细胞上清液(50-100μl)的乳杆菌分离物加入到在BHI琼脂中制备的预密封孔(直径＝7mm)中，并在37℃需氧培养18-24小时。试验病原体的抑制程度：高(直径>15mm的抑菌圈，+++)；中等(10-15mm直径的抑菌圈，++)；低(<10mm直径的区抑菌圈，+)；无(-)。
抑菌试验表明：罗伊氏乳杆菌TD4对8种测试病原体(铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌均为中度抑菌，抑菌圈范围为10-15mm(图4C)。
3.4抗生素药物敏感性试验
通过琼脂盘扩散法进行抗生素微生物药敏试验。分离的乳酸菌在MRS琼脂(Oxoid)上，在需氧条件下，37℃培养24小时。然后，使用0.85％缓冲盐水制备浓度为108个细胞悬浮液(0.5McFarland标度)，并涂布于MRS琼脂(Oxoid)。抗生素圆盘(Oxoid)分布于琼脂表面，在37℃下培养24小时。然后，根据自动抑菌圈测量的菌落计数器(Shineso Science&Technology Co.,Ltd,杭州，中国)记录抑菌圈的直径(mm)。使用的15种抗生素圆盘分别是：阿莫西林-AMC(30μg)、红霉素-E(15μg)、克林霉素-DA(2μg)、氯霉素-C(30μg)、四环素-TE(30μg)、庆大霉素-CN(10μg)、氨苄青霉素-AMP(10μg)、磺胺甲恶唑-SXT(25μg)、头孢曲松-CRO(30μg)、卡那霉素-K(30μg)、链霉素-S(10μg)、恩诺沙星-ENR(5μg)、青霉素GP(10U)、头孢西丁-FOX(30μg)和奎奴普汀-QD(15μg)。使用大肠杆菌ATCC 25922对含有抗菌剂的圆盘进行质量控制。根据Charteris等人(1998年)提出的临界水平，将乳杆菌分离株分为耐药、中度敏感和敏感三类。
抗生素药敏试验结果发现：嗜酸乳杆菌TD4对阿莫西林、克林霉素、氯霉素、氨苄西林、磺胺甲恶唑、头孢曲松、盘尼西林和达福普以上抗生素敏感(图4D)，对头孢西丁中等敏感，而对红霉素、庆大霉素、四环素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素和恩诺沙星耐药。值得注意的是氨基糖苷类(庆大霉素、卡那霉素、链霉素和新霉素)、环丙沙星和甲氧苄啶的抗生素耐药性被认为是大多数乳酸菌种固有的。
3.5黏附抑制实验
分别采用竞争、排斥和替代实验研究益生菌菌株对致病菌(E.coli CAU15104)黏附caco-2细胞的抑制作用。
3.5.1竞争：乳酸菌和大肠杆菌同时加入
对于竞争测定，将等体积的具有相同浓度(108CFU/mL)的每种菌株(嗜酸乳杆菌TD4和大肠杆菌)添加到细胞培养孔中。将板在5％CO2存在下于37℃温育1小时。1小时后，洗涤未结合的细菌，并用0.05％Triton X-100分离剩余的细菌和Caco-2细胞。竞争指数计算方式为：与嗜酸乳杆菌TD4菌株同时添加的大肠杆菌的黏附量除以不添加植嗜酸乳杆菌TD4菌株时的大肠杆菌黏附量。
3.5.2抑制：先加入乳酸菌，后加入大肠杆菌
为了进行抑制测定，首先将嗜酸乳杆菌TD4菌株加入孔中，并孵育1小时。用无菌PBS轻轻洗涤未结合的细菌。之后，将大肠杆菌菌株添加到孔中，并将6孔板再孵育1小时。洗涤未结合的细菌，并用0.05％Triton X-100分离细菌和细胞。抑制程度计算如下：(A1-A2/A1)×100％，其中A2和A1分别是存在和不存在乳酸菌时大肠杆菌细胞粘附的百分比。
A1：不存在乳酸菌时，大肠杆菌细胞黏附数量
A2：存在乳酸菌时，大肠杆菌细胞黏附数量(添加数量-洗脱数量)
3.5.3替代：先加入大肠杆菌，后加乳酸菌
为了进行替代测定，首先将大肠杆菌菌株添加到孔中，并将板在37℃，5％CO2存在下孵育1h。洗涤未结合的细菌，并将嗜酸乳杆菌TD4菌株加入孔中。在37℃，5％CO2存在下孵育1小时后，用PBS轻轻洗涤未结合的细菌，并用Triton 0.05％X-100分离细菌和Caco-2细胞。进行了平板计数法，并且在存在和不存在乳杆菌的情况下，以附着的大肠杆菌的百分比计算取代度率。
细胞黏附抑制实验结果(表1)表明，嗜酸乳杆菌TD4对大肠杆菌黏附Caco-2细胞的竞争、排斥、替代抑制率分别为88.93％、90.83％和53.08％，说明嗜酸乳杆菌TD4能够一定程度上保护肠道上皮细胞免受大肠杆菌侵害。
表1嗜酸乳杆菌TD4对大肠杆菌黏附Caco-2细胞的抑制率
实施例4犬动物实验
4.1实验流程
选用3-6月龄的健康比格犬共32只，随机分为4组，每组8只，分别为对照组(CONT)、大肠杆菌(E.coli CAU15104)诱发的急性腹泻模型组(ETEC)、益生菌+E.coli腹泻模型组(PROB)和合生元+E.coli腹泻模型组(SYBR)，实验周期为21天。试验期间犬在室温单笼饲养，自由采食、饮水，每天对饲养环境及用具进行消毒，定期观察并记录犬的行为、饮食和腹泻情况。
第1-7天，CONT组和ETEC组分别灌服0.9％NaCl；PROB组灌服嗜酸乳杆菌TD4(1×109CFU/mL)；SYBR组灌服含嗜酸乳杆菌TD4的微生态制剂(配方如表2所示)，灌服量均为10mL/只/天。
表2犬微生态制剂配方
第8-10天连续3日，CONT组继续灌服0.9％NaCl，ETEC组、PROB组和SYBR组分别灌服大肠杆菌溶液10mL(剂量为1×109CFU/mL，早晚各一次)；间隔4个小时后，PROB组继续灌服嗜酸乳杆菌TD4；SYBR组灌服含嗜酸乳杆菌TD4的微生态制剂。
第11-21天，CONT组和ETEC组分别灌服0.9％NaCl；PROB组继续灌服嗜酸乳杆菌TD4；SYBR组灌服含嗜酸乳杆菌TD4的微生态制剂。
第8、11、22天采集血液，分离血清，送血常规检测，剩余血样保存于-20℃。粪便样本于第7、10、21天灌服完毕后开始收集，并放置-20℃保存。
4.2腹泻评估
通过犬急性腹泻严重程度指数的评分系统(Canine acute diarrhea severityindex，CADS；表3)、和Purina粪便评分表(表4)评估嗜酸乳杆菌TD4及其益生菌复合制剂的防治腹泻的作用。
表3犬急性腹泻严重程度指数的评分系统(CADS)
注：FeSc:根据布里斯托大便表的粪便评分系统
表4Purina粪便评分表
注：1-2分表示便秘；3-4分是理想粪便形状，4分是最容易排便的形状；5-7分代表轻度到重度腹泻。
CADS评分系统将活动评分、食欲评分、呕吐评分、排便频率和粪便水合程度这5方面的评分相加得到的CADS总分。图5结果显示：在造模期间(第8-10天)，大肠杆菌造模组(ETEC)的评分最高，并与CONT存在显著差异(p＜0.05)，并在造模期间的第二周一直维持在较高水平，在第三周后逐步恢复正常，说明大肠杆菌感染主要引起的是犬的急性腹泻，ETEC组的其中一只比格犬因为败血症而死亡。而受益生菌或合生元提前保护的益生菌组(PROB)和合生元组(SYNB组)CADS评分均低于ETEC组，与CONT组无显著差异，且没有犬只死亡。从CADS评分指标看，SYNB组在防治犬细菌性腹泻的效果略优于PROB组。
Purina粪便评分显示，大肠杆菌造模后，从第9天开始，ETEC组的粪便评分大于4分，并在第9天(即造模第2天)时，粪便评分达到最高值，与CONT组、PROP组和SYNB组存在显著差异(p＜0.05)，在第10天，腹泻评分略有降低，但仍和CONT组存在显著差异。在恢复期间(第11-22天期间)，各组粪便分数继续维持在4分以下，表明大肠杆菌感染对肠道菌群紊乱和腹泻造成的影响是急性的。
4.3免疫指标评估
采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)对猫血清样品中的白细胞介素6(IL-6)、干扰素α(TNF-α)和白细胞介素10(IL-10)、髓过氧化物酶(MPO)共4种免疫因子的含量进行检测。进一步采用ELISA方法对粪便样品中的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量进行检测。基于荧光定量免疫层析技术采用犬C反应蛋白检测试剂盒定量检测犬血清中cCRP。
在服用嗜酸乳杆菌TD4一周后，SYNB组的粪便分泌型免疫球蛋白(SlgA)的含量相对于CONT组和PROB组均显著升高(图6F)，相应的其血清IL-10水平也显著提高(图6C)，且IL-10含量在整个试验周期一直维持在较高水平，说明SYNB组可以在服用一周后就可以通过激活免疫提供保护力。在大肠杆菌造模后，实验的第11天，ETEC组的cCRP含量显著升高，说明大肠杆菌感染使犬存在急性炎症。受益生菌和合生元保护的PROB组和SYNB组cCRP含量与CONT组无显著差异，且PROB组的cCRP含量显著低于ETEC组，同时，PROB组的粪便SlgA水平在第11天也是最高的，且显著高于其它三组。此外，在ETEC攻毒期间，SYNB组可以通过上调髓过氧化物酶(MPO)水平，激活中性粒细胞的功能保护机体免受细菌感染的侵害(图6E)，并略微上调IL-6和TNF-α水平(图6A-B)。
4.4细菌总数、乳酸杆菌和大肠杆菌的qPCR定量检测
采用蛋白酶K裂解法进行对猫粪便样本进行基因组DNA抽提，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，NanoDrop2000检测DNA纯度，Quantus Flourometer(Picogreen)检测DNA浓度。利用大肠埃希菌和嗜酸乳杆菌16S rRNA基因的PCR产物构建质粒，将质粒DNA进行10倍梯度系列稀释制作标准曲线。定量细菌总数、乳酸杆菌和大肠杆菌所用的引物如表5所示。使用诺唯赞的Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒扩增。qPCR扩增程序如下：预变性：95℃预变性30s，循环1次。循环反应：在95℃变性10s，60℃退火30S，循环40次。在熔解曲线阶段：95℃反应15S，60℃反应60S，95℃反应15S，循环1次。荧光数据采集在延伸时进行。实时定量PCR在Stratagene Mx3000p荧光定量PCR仪中进行。每次扩增最后一个循环后进行产物熔解曲线分析，以确定扩增的特异性。
表5引物列表
如图7所示，犬在灌服益生菌或合生元一周后，在第7天，乳酸菌的拷贝数在PROB组和SYNB组相对于CONT组显著升高，而大肠杆菌拷贝数在各组间没有显著差异，提示灌服益生菌或合生元增加了潜在益生菌的数量。在大肠杆菌造模3天后的第11天，ETEC组的大肠杆菌拷贝数相对于对照CONT组、PROB组和SYNB组有略上升趋势，但无显著差异，PROB组和SYNB组的乳酸菌数继续保持高位水平。第22天时，大肠杆菌数在各组间均无显著差异，PROB组和SYNB组的乳酸菌和总菌数显著高于CONT组和ETEC组。以上结果说明大肠杆菌的腹泻模型使粪便大肠杆菌的载量略有上升，而给予犬益生菌和合生元，可以提高其肠道内乳酸菌和总细菌的含量，让乳酸菌更持久地定植于肠道，纠正了肠道菌群紊乱，从而改善了细菌性腹泻。
4.5肠道菌群的宏基因组测序
应用Illumina Hiseq测序平台对上述细菌基因组DNA进行鸟枪法高通量测序。利用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit试剂盒共建PE文库，采用HiSeq 3000/4000PE Cluster试剂盒进行桥试PCR并上机测序。测序reads上传至MG-RAST，利用在线服务质量控制平台进行数据质控，去除低质量reads。通过BWA软件去除宿主基因组DNA的reads。使用SOAPdenovov1.06和GeneMark v2.7对优化序列进行拼接组装和ORF功能预测，并将核酸长度≥100bp的基因翻译成氨基酸序列。使用CD-HIT软件进行聚类(参数为:95％identity、90％overlap)构建非冗余基因集(non-redundant gene catalogue)。物种分类学注释：使用BLASTP(e值≤1e-5)将基因集与NR数据库进行比对获得物种注释，并使用对应基因丰度总和计算该物种的丰度。使用默认参数，将clean reads与mOTU中的序列进行比对，确定微生物物种。
如图8所示，比格犬的肠道菌群存在个体差异性。犬只在灌服益生菌或合生元一周后，在第7天，PROB组和SYNB组的乳杆菌属(包括Ligilactobacillus和Limosilactobacillus)的丰度显著升高，宏基因组测序结果与qPCR的结果相一致，说明灌服益生菌或合生元增加了乳酸菌的数量。在大肠杆菌造模3天后的第11天，没有益生菌/合生元保护的ETEC组的个别犬只(B1和B3)其大肠杆菌属(Escherichia)的丰度显著增加，且B1犬只因为急性腹泻和败血症而死亡。而PROB组和SYNB组的Escherichia丰度则和CONT组则无显著差异，且这两组大部分犬只的Ligilactobacillus和Limosilactobacillu丰度较高，说明服用益生菌或合生元避免了犬只肠道中大肠杆菌的急剧增长，从而保护犬只免于急性死亡。第22天，由于持续的灌服益生菌和合生元，PROB组和SYNB组的乳杆菌属(Lactobacillus)的丰度维持在高位水平。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一株嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）TD4，已于2020年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.20369，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.一种包含如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌TD4的益生菌复合制剂。
3.根据权利要求2所述的益生菌复合制剂，其特征在于，所述益生菌复合制剂由益生菌嗜酸乳杆菌TD4、罗伊氏乳杆菌MD2、凝结芽孢杆菌TBC169和益生元菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶组成；所述罗伊氏乳杆菌MD2的保藏编号为CGMCC No.20366。
4.根据权利要求3所述的益生菌复合制剂，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌TD4活菌数量≥1×108CFU/g，罗伊氏乳杆菌MD2活菌数量≥1×108CFU/g，凝结芽孢杆菌活菌数量≥2×107CFU/g。
5.根据权利要求3所述的益生菌复合制剂，其特征在于，所述菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶粉的质量比分别为2-4：1-2：2-4。
6.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌或权利要求2-5任一项所述的益生菌复合制剂在制备防治犬腹泻制剂中的应用；所述腹泻是细菌性腹泻。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细菌为铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述腹泻制剂为食品、药品或保健品。
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