CN114437993A - 罗伊氏乳杆菌及其在制备预防猫腹泻制剂中的应用 - Google Patents
罗伊氏乳杆菌及其在制备预防猫腹泻制剂中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114437993A CN114437993A CN202210240841.4A CN202210240841A CN114437993A CN 114437993 A CN114437993 A CN 114437993A CN 202210240841 A CN202210240841 A CN 202210240841A CN 114437993 A CN114437993 A CN 114437993A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactobacillus reuteri
- preparation
- diarrhea
- cat
- application
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 title claims abstract description 53
- 229940001882 lactobacillus reuteri Drugs 0.000 title claims abstract description 53
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 title claims abstract description 36
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 241000607768 Shigella Species 0.000 claims abstract description 12
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 claims abstract description 11
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims abstract description 11
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 abstract description 16
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 abstract description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 8
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 abstract description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 abstract description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 9
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 4
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 3
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 3
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N Baytril Chemical compound C1CN(CC)CCN1C(C(=C1)F)=CC2=C1C(=O)C(C(O)=O)=CN2C1CC1 SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000009635 antibiotic susceptibility testing Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229960000740 enrofloxacin Drugs 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O vancomycin(1+) Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C([O-])=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)[NH2+]C)[C@H]1C[C@](C)([NH3+])[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003239 susceptibility assay Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
- A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/40—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for carnivorous animals, e.g. cats or dogs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/12—Antidiarrhoeals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/11—Lactobacillus
- A23V2400/173—Reuteri
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Birds (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种罗伊氏乳杆菌，其保藏号：CGMCC NO：24339；具有良好的耐酸耐胆盐能力和肠上皮细胞粘附性，对多种抗生素敏感，在制备预防猫腹泻制剂对于沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和志贺氏菌等常见致猫腹泻的致病菌有抑菌效果，猫动物试验表明该菌对志贺氏菌导致的腹泻具有良好的预防作用，具有开发为预防猫腹泻的用途微生态制剂的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种罗伊氏乳杆菌及其在制备预防猫腹泻制剂中的应用。
背景技术
益生菌已被证实具有调节猫的肠道菌群、增强猫的机体免疫力、提高幼猫生长性能以及缓解猫的炎症反应等作用。
由于我国目前还缺乏猫用益生菌的系统研究，市场上的益生菌产品来源混杂，对宠物的益生保健功能并不明确，再加上我国对含益生菌的动物食品及兽用微生态制剂的监管较为宽松，导致市面上的微生态产品质量良莠不齐。因此，从健康猫肠道中分离、鉴定宠物源乳酸菌，对纯化的乳酸菌菌株进行益生功能评价，筛选具有益生潜力的乳酸菌，制备宠物用乳酸菌剂，具有十分重要的应用价值和市场前景。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种罗伊氏乳杆菌，又名罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)，该罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)AUc2201已于2022年 1月19日提交至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC NO：24339，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该罗伊氏乳杆菌用于预防沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和志贺氏菌导致的猫腹泻。
本发明另一个目的是提供一种罗伊氏乳杆菌在制备预防猫腹泻制剂中的应用，能够预防沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和志贺氏菌的生长。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)AUc2201的保藏号：CGMCC NO：24339。
优选的是，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)AUc2201的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
一种罗伊氏乳杆菌在制备预防猫腹泻制剂中的应用。
优选的是，所述罗伊氏乳杆菌用于预防空肠弯曲杆菌导致的猫腹泻。
优选的是，所述罗伊氏乳杆菌用于预防沙门氏菌导致的猫腹泻。
优选的是，所述罗伊氏乳杆菌用于预防志贺氏菌导致的猫腹泻。
一种罗伊氏乳杆菌在制备预防猫腹泻食品中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
罗伊氏乳杆菌对沙门氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲杆菌具有很强的抑菌效果，可作为微生态制剂开发的潜在益生菌使用。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的其中一种技术方案所述罗伊氏乳杆菌的形态图；
图2为本发明的其中一种技术方案所述罗伊氏乳杆菌对沙门氏菌的抑菌效果图；
图3为本发明的其中一种技术方案所述罗伊氏乳杆菌对空肠弯曲杆菌的抑菌效果图；
图4为本发明的其中一种技术方案所述罗伊氏乳杆菌对志贺氏菌的抑菌效果图；
图5为本发明的其中一种技术方案所述罗伊氏乳杆菌细胞黏附效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例
一、材料
健康猫的粪便24份；分别装入无菌取样管编号后，立即放入冷藏保温箱(温度低于4℃)，8小时内将样品转移至-80℃冰箱冷冻保存。
培养基：MRS及BHI培养基(购自奥博星生物有限公司)。
主要试剂：革兰氏染色试剂、细菌基因组DNA提取试剂盒(天根)、溶菌酶(天根)、溶菌酶缓冲液(生工)、通用引物27F(华大)、通用引物1492R(华大)、琼脂糖、药敏纸片(庆大霉素10μg/片、恩诺沙星10μg/片、氨苄西林10μg/片、青霉素10U/片、头孢噻吩30μg/片、万古霉素30μg/片、环丙沙星5μg/片，均购自杭州微生物试剂有限公司)。
指示菌株：志贺氏菌(ATCC25957)、沙门氏菌(CGMCC1.1869)和空肠弯曲杆菌(ATCC33291)(购自青岛海博生物科技有限公司)。
二、菌株的分离
将24份健康猫的粪便样品解冻后，每份样品均使用无菌生理盐水进行梯度稀释，分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍，将稀释后的样品涂布于对应的MRS固体培养皿上，培养皿置于37℃厌氧培养24-48h。培养后挑选具有乳杆菌典型形态且形态各异的单菌落，同时观察记录菌落特征并进行编号。经反复纯化后于显微镜下观察菌体形态，并进行革兰氏染色，挑选革兰氏染色呈蓝紫色且形态呈杆状的菌株作为后备菌株，待用。
三、菌种鉴定
1、形态特征的确定
对筛选出的菌株进行革兰氏染色，并在100×显微镜下观察。
2、16S rDNA序列分析
将初筛得到的菌株纯化培养，培养24h后提取菌株基因组DNA，利用细菌通用引物(上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物1492R： 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对菌株基因组进行PCR扩增，其中，PCR扩增体系如表1所示。扩增后，将扩增产物于1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳，确认目的条带后送测序公司测序并将测序结果在Genbank数据库进行BLAST比对。
表1 PCR扩增体系
四、抑菌能力检测
S1、将活化后的志贺氏菌、沙门氏菌和空肠弯曲杆菌菌液稀释至浓度为105cfu/mL，即得稀释液，使用无菌棉签将稀释液涂布于BHI固体培养基上，待BHI固体培养基上的稀释液干燥后，将牛津杯置于BHI固体培养基的平板上；
S2、将罗伊氏乳杆菌培养24h后，8000r/min离心10min后取上清液，加至BHI固体培养基上的牛津杯中；
S3、将步骤S2加入上清液后的BHI固体培养基于4℃下培养4-6h，待上清液完全扩散至BHI固体培养基中后，转移至37℃培养箱内进行培养，对照孔采加入等量MRS液体培养基；
S4、将步骤S3在37℃培养箱内培养12h后的BHI固体培养基取出，测量抑菌圈直径。
五、抗生素敏感性实验
将纯化培养后的菌株菌液浓度调整为108cfu/mL，混匀，将100μL菌液涂布在MRS固体培养基上，待菌液吸收后放置药敏纸片，37℃培养24h。每组重复3次，测量并记录抑菌圈直径。
六、耐酸耐胆盐能力测定
取三个MRS肉汤培养基，pH值分别为2.0、2.5和3.0；再取另外三个MRS肉汤培养基，胆盐浓度分别为0.05％、0.08％和0.1％，121℃温度下灭菌20min，在无菌条件下接种罗伊氏乳杆菌，初始罗伊氏乳杆菌活菌数为1×108cfu/mL，37℃培养。于0h和2h取样涂布平板统计活菌数，计算存活率。
七、细胞黏附实验
在培养板上接种浓度为2×104cells/mL的Caco-2细胞，使Caco-2细胞预先置入22mm 板中，预先置入无菌盖玻片，使细胞贴附盖玻片生长，将培养板放置在温度为37℃，CO2含量为5％的培养箱中。使用PBS冲洗并调整培养后的罗伊氏乳杆菌，使罗伊氏乳杆菌的浓度为1×108CFU/mL。待Caco-2细胞长成致密单层后，用PBS缓冲液漂洗细胞2次，每孔加入不含抗生素的1mL DMEM培养液和1mL上述制备好的罗伊氏乳杆菌悬液，轻轻摇匀，置于CO2培养箱继续孵育，每株菌重复3孔。培养120min后，用PBS缓冲液洗涤Caco-2细胞5次，除去未黏附的罗伊氏乳杆菌，然后加入无水甲醇固定20min，对Caco-2 细胞进行革兰氏染色，显微镜下随机选取20个视野，计算100个Caco-2细胞上黏附的菌株个数，以平均每个Caco-2细胞所黏附的菌株个数表示黏附能力。
八、动物实验
选用1-2月龄的幼龄雌猫共20只，随机分为2组，每组10只，分别为对照组及益生菌组。其中，对照组正常饲喂饲料，益生菌组饲喂饲料加上罗伊氏乳杆菌(106CFU/mL)，饲喂量为10mL/kg，连续饲喂21天，然后进行攻毒：采用志贺氏菌(1010CFU/mL)以10mL/kg 饲喂7天。记录每日每组幼龄雌猫腹泻情况。分别于实验前和实验后对实验动物进行采血测定IGG/IGM含量。
九、结果
1、菌株鉴定结果
经革兰氏染色显示为革兰氏阳性菌，菌形状为蓝紫色短杆菌，如图1所示。
测序结果所得的序列如SEQ ID No.1所示，该序列经与GenBank数据库比对后，发现该序列与罗伊氏乳杆菌16S rDNA序列同源性达到100％。该菌株已于2022年1月19 日提交至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC NO：24339。
2、抑菌能力结果
结果如图2-4所示，肠道感染的主要致病菌是沙门氏菌、空肠弯曲杆菌以及志贺氏菌，因此本实验考察了罗伊氏乳杆菌对三种致病菌的预防能力，结果显示罗伊氏乳杆菌对三种致病菌均有抑菌能力(抑菌圈直径≥13mm)，通过测量如图2-4所示的抑菌圈大小可以得出罗伊氏乳杆菌对志贺氏菌(ATCC25957)、沙门氏菌(CGMCC 1.1869)和空肠弯曲杆菌(ATCC33291)的抑菌直径分别为21.16mm、13.18mm、27.13mm。
3、抗生素敏感性结果
筛选益生菌的先决条件即为分离株的抗生素敏感性。将抑菌试验筛选后得到的分离株进行了对7种常用抗生素的敏感性测定实验，参照《CLSI抗菌药物敏感性试验实施标准(2018)》中的规定，结果如表2显示，分离株对青霉素、氨苄西林、头孢噻吩以及环丙沙星四种抗生素普遍高度敏感，除上述以外，菌株均表现抗性。
表2
| 菌株 | 青霉素 | 氨苄西林 | 头孢噻吩 | 恩诺沙星 | 万古霉素 | 庆大霉素 | 环丙沙星 |
| 罗伊氏乳杆菌 | S | S | S | R | R | R | S |
注：S为高度敏感；I为中度敏感；R为抗性。
4、耐酸耐胆盐能力结果
罗伊氏乳杆菌的耐酸耐胆盐能力良好，在pH值为2(猫胃液内pH)时，罗伊氏乳杆菌培养2h后存活率为60±2.95％；在胆盐浓度为0.1％的条件下，罗伊氏乳杆菌培养2h 后存活率为50.02±2.36％。
5、细胞黏结果
细胞黏附试验显示对Caco-2细胞粘附个数为14.57±3.38，黏附效果图如图5所示。
6、动物实验结果
对各组腹泻幼龄雌猫进行攻毒后腹泻率如表3。各处理组前3天的腹泻率没有差异，幼龄雌猫攻毒后腹泻率均为0，第四天起，各组腹泻率逐渐升高，其中，对照组幼龄雌猫在第7天攻毒后腹泻率达到90％，而益生菌组幼龄雌猫在第7天的攻毒后腹泻率仅为20％。表明罗伊氏乳杆菌可降低攻毒后幼龄雌猫的腹泻率。
对益生菌组实验前和实验后的实验动物进行采血测定IGG/IGM含量，结果如表4所示，结果显示实验后IGG/IGM浓度显著高于实验前(P＜0.05)。表明罗伊氏乳杆菌可以降低肠道反应性，调节机体免疫功能。
表3各处理组攻毒后腹泻率
| 分组 | 1d | 2d | 3d | 4d | 5d | 6d | 7d |
| 对照组 | 0 | 0 | 30％ | 40％ | 60％ | 60％ | 90％ |
| 益生菌组 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10％ | 10％ | 20％ |
表4幼龄雌猫实验前后血液中IGG/IGM浓度
注：同行数据中肩标字母不同者表示差异显著(P＜0.05)。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农产品加工研究所
<120> 罗伊氏乳杆菌及其在制备治疗猫腹泻制剂中的应用
<130> 2022.2.9
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1286
<212> DNA
<213> 猫粪便
<400> 1
gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccgact tcgtgtaggc 60
gagttgcagc ctacagtccg aactgagaac ggctttaaga gattagctta ctctcgcgag 120
cttgcgactc gttgtaccgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg 180
atgatctgac gtcgtcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtctca ctagagtgcc 240
caacttaatg ctggcaacta gtaacaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat 300
ctcacgacac gagctgacga cgaccatgca ccacctgtca ttgcgtcccc gaagggaacg 360
ccttatctct aaggttagcg caagatgtca agacctggta aggttcttcg cgtagcttcg 420
aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg agtttcaacc 480
ttgcggtcgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttag ctccggcact gaagggcgga 540
aaccctccaa cacctagcac tcatcgttta cggcatggac taccagggta tctaatcctg 600
ttcgctaccc atgctttcga gcctcagcgt cagttgcaga ccagacagcc gccttcgcca 660
ctggtgttct tccatatatc tacgcattcc accgctacac atggagttcc actgtcctct 720
tctgcactca agtcgcccgg tttccgatgc acttcttcgg ttaagccgaa ggctttcaca 780
tcagacctaa gcaaccgcct gcgctcgctt tacgcccaat aaatccggat aacgcttgcc 840
acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt gactttctgg ttggataccg 900
tcactgcgtg aacagttact ctcacgcacg ttcttctcca acaacagagc tttacgagcc 960
gaaacccttc ttcactcacg cggtgttgct ccatcaggct tgcgcccatt gtggaagatt 1020
ccctactgct gcctcccgta ggagtatgga ccgtgtctca gttccattgt ggccgatcag 1080
tctctcaact cggctatgca tcatcgcctt ggtaagccgt taccttacca actagctaat 1140
gcaccgcagg tccatcccag agtgatagcc aaagccatct ttcaaacaaa agccatgtgg 1200
cttttgttgt tatgcggtat tagcatctgt ttccaaatgt tatcccccgc tccggggcag 1260
gttacctacg tgttactcac ccgtcc 1286
Claims (7)
1.罗伊氏乳杆菌，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)AUc2201的保藏号：CGMCC NO：24339。
2.如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌，其特征在于，罗伊氏乳杆菌AUc2201的16SrDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌在制备预防猫腹泻制剂中的应用。
4.如权利要求3所述的罗伊氏乳杆菌在制备预防猫腹泻制剂中的应用，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌用于预防空肠弯曲杆菌导致的猫腹泻。
5.如权利要求3所述的罗伊氏乳杆菌在制备预防猫腹泻制剂中的应用，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌用于预防沙门氏菌导致的猫腹泻。
6.如权利要求3所述的罗伊氏乳杆菌在制备预防猫腹泻制剂中的应用，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌用于预防志贺氏菌导致的猫腹泻。
7.如权利要求1所示的罗伊氏乳杆菌在制备预防猫腹泻食品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210240841.4A CN114437993B (zh) | 2022-03-10 | 2022-03-10 | 罗伊氏乳杆菌及其在制备预防猫腹泻制剂中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210240841.4A CN114437993B (zh) | 2022-03-10 | 2022-03-10 | 罗伊氏乳杆菌及其在制备预防猫腹泻制剂中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114437993A true CN114437993A (zh) | 2022-05-06 |
| CN114437993B CN114437993B (zh) | 2023-07-18 |
Family
ID=81358512
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210240841.4A Active CN114437993B (zh) | 2022-03-10 | 2022-03-10 | 罗伊氏乳杆菌及其在制备预防猫腹泻制剂中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114437993B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116083300A (zh) * | 2022-12-08 | 2023-05-09 | 玫斯江苏宠物食品科技有限公司 | 一种防治犬腹泻的益生菌复合制剂及其应用 |
| CN116121122A (zh) * | 2022-12-08 | 2023-05-16 | 玫斯江苏宠物食品科技有限公司 | 一种防治猫腹泻的益生菌复合制剂及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104206706A (zh) * | 2007-03-02 | 2014-12-17 | 生命大地女神有限公司 | 乳酸杆菌改善玩赏动物食物中赖氨酸的吸收的用途 |
| WO2016154503A1 (en) * | 2015-03-26 | 2016-09-29 | Banner Life Sciences Llc | Liquisoft capsules |
| CN109744376A (zh) * | 2019-02-28 | 2019-05-14 | 玫斯江苏宠物食品科技有限公司 | 一种含复合益生菌高鲜肉比例幼年期猫专用粮及其制备方法 |
| CN112011481A (zh) * | 2020-08-11 | 2020-12-01 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 一株防治畜禽细菌性腹泻的罗伊氏乳杆菌及其应用 |
| US20210148921A1 (en) * | 2019-10-28 | 2021-05-20 | Quantum-Si Incorporated | Methods of preparing an enriched sample for polypeptide sequencing |
-
2022
- 2022-03-10 CN CN202210240841.4A patent/CN114437993B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104206706A (zh) * | 2007-03-02 | 2014-12-17 | 生命大地女神有限公司 | 乳酸杆菌改善玩赏动物食物中赖氨酸的吸收的用途 |
| WO2016154503A1 (en) * | 2015-03-26 | 2016-09-29 | Banner Life Sciences Llc | Liquisoft capsules |
| CN109744376A (zh) * | 2019-02-28 | 2019-05-14 | 玫斯江苏宠物食品科技有限公司 | 一种含复合益生菌高鲜肉比例幼年期猫专用粮及其制备方法 |
| US20210148921A1 (en) * | 2019-10-28 | 2021-05-20 | Quantum-Si Incorporated | Methods of preparing an enriched sample for polypeptide sequencing |
| CN112011481A (zh) * | 2020-08-11 | 2020-12-01 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 一株防治畜禽细菌性腹泻的罗伊氏乳杆菌及其应用 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116083300A (zh) * | 2022-12-08 | 2023-05-09 | 玫斯江苏宠物食品科技有限公司 | 一种防治犬腹泻的益生菌复合制剂及其应用 |
| CN116121122A (zh) * | 2022-12-08 | 2023-05-16 | 玫斯江苏宠物食品科技有限公司 | 一种防治猫腹泻的益生菌复合制剂及其应用 |
| CN116121122B (zh) * | 2022-12-08 | 2023-10-03 | 玫斯江苏宠物食品科技有限公司 | 一种防治猫腹泻的益生菌复合制剂及其应用 |
| CN116083300B (zh) * | 2022-12-08 | 2023-10-17 | 玫斯江苏宠物食品科技有限公司 | 一种防治犬腹泻的益生菌复合制剂及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114437993B (zh) | 2023-07-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106282072B (zh) | 一种复合乳酸菌微生态制剂及其制备方法与应用 | |
| CN112011481B (zh) | 一株防治畜禽细菌性腹泻的罗伊氏乳杆菌及其应用 | |
| CN113088463B (zh) | 一种具有益生特性的嗜酸乳杆菌及其应用 | |
| CN116083300B (zh) | 一种防治犬腹泻的益生菌复合制剂及其应用 | |
| CN112852679A (zh) | 一株益生凝结芽孢杆菌及其应用 | |
| CN114806978B (zh) | 约氏乳杆菌sxdt-23及其应用 | |
| CN103060222A (zh) | 具有益生作用的枯草芽孢杆菌b27及其应用 | |
| CN111534447A (zh) | 约氏乳杆菌及其应用 | |
| CN114437993B (zh) | 罗伊氏乳杆菌及其在制备预防猫腹泻制剂中的应用 | |
| CN113122466B (zh) | 粪肠球菌及其应用 | |
| CN116121122B (zh) | 一种防治猫腹泻的益生菌复合制剂及其应用 | |
| CN105062914B (zh) | 一株调节畜禽肠道菌群平衡的丁酸梭菌的筛选及应用 | |
| CN110028560B (zh) | 一种凝结芽孢杆菌产的细菌素及其应用 | |
| CN117904007B (zh) | 枯草芽孢杆菌菌株sklan202311d及其应用 | |
| KR101098946B1 (ko) | 신규한 락토바실러스 살리바리우스 균주 및 이를 함유하는 사료첨가제 조성물 | |
| CN112063566B (zh) | 一株屎肠球菌及其应用 | |
| CN114437967B (zh) | 乳酸片球菌AUd2101及在制备治疗犬腹泻制剂中的应用 | |
| WO2021248440A1 (zh) | 一种母乳源植物乳杆菌及其应用 | |
| CN114717150B (zh) | 一种植物乳杆菌crs33及其应用 | |
| CN113151113B (zh) | 一株抑菌能力强的丁酸梭菌及其应用 | |
| CN114908009B (zh) | 一株口粘液乳杆菌pr63及其应用 | |
| CN117801981A (zh) | 一株促进肉鸡生长的益生乳酸菌的筛选及应用 | |
| CN117327626A (zh) | 一种植物乳杆菌ts1及其培养方法与应用 | |
| CN115873081A (zh) | 一种乳酸菌素及其在防控宠物细菌感染的应用 | |
| CN113061550A (zh) | 一株乳杆菌新菌株z6及其在食品中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20220506 Assignee: ANHUI JINLAC BIOTECH LTD. Assignor: AUSNUTRIA DAIRY (CHINA) Co.,Ltd.|INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Contract record no.: X2023980043948 Denomination of invention: Lactobacillus reuteri and its application in the preparation of preparations for preventing cat diarrhea Granted publication date: 20230718 License type: Common License Record date: 20231019 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |