WO2021119868A1 - Cepas probióticas de lactobacillus sp. y de pediococcus sp. y su uso en la elaboración de una formulación probiótica para prevención de diarreas causadas por patógenos bacterianos que afectan a perros y gatos - Google Patents

Cepas probióticas de lactobacillus sp. y de pediococcus sp. y su uso en la elaboración de una formulación probiótica para prevención de diarreas causadas por patógenos bacterianos que afectan a perros y gatos Download PDF

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probiotic
cats
tuco
prevention
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PCT/CL2020/050128
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Sandra QUILODRAN VEGA
Jorge Toledo Alonso
Felipe SANDOVAL SANDOVAL
Alex AGUIRRE CALFANTE
Brigida PORTILLO HENRIQUEZ
Francisco RAMIREZ VALENZUELA
Ana PINO BINIMELIS
Katherina FERNANDEZ ELGUETA
Julio Cesar VILLENA
Leonardo ALBARRACIN
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Universidad de Concepción
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    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present technology is related to the veterinary industry, in particular a probiotic formulation for pets, mainly dogs and cats, is presented.
  • Diarrhea can be classified as primary and secondary.
  • pathologies such as luminal obstructions, intolerance to diet, drugs / toxins, inflammatory diseases of the gastrointestinal tract, neoplasms, infectious diseases (viral, bacterial and parasitic) can be found among others, while in the secondary ones there are kidney conditions, liver, pancreas, endocrine or central nervous system (Lappin, 2012).
  • These intestinal infections have a high incidence (between 20% and 50%), and generate alterations in intestinal homeostasis or dysbiosis, and at an early age they lead to the death of puppies (Minamoto et al., 2014; Heilmann et al. ., 2017; Grellet et al., 2014).
  • canine parvovirus type 2 (CPV-2), the etiological agent of canine parvovirus, is considered the most important cause of viral enteritis (Kapil et al, 2007).
  • the most frequent cause is food indiscretion defined as a pathology that has its etiology in abnormal behaviors such as ingestion of garbage, bulky rations, food for human consumption; sudden changes in diet; hypersensitivity and dietary intolerances; medications especially antibiotics intake of bones, herbs etc.
  • the causes of diarrhea remain unknown and the pet recovers (Herstad et al., 2010).
  • the most common diarrhea-causing bacterial pathogens are Escherichia coli, Salmonella spp., Qostridium perfringens, and toxigenic Qostridium diff ⁇ cile (Marks, 2003, Kelley et al, 2009, Suchodolski et al, 2012).
  • This pathology is also a public health problem, since it has been shown that there is oral and skin transfer of microorganisms between dogs and their owners (Song et al, 2013).
  • Potentially probiotic bacteria could be a useful tool to improve gastrointestinal health in pets because they participate in the recovery of the intestinal microbiota without the strict need to use antibiotics, thus avoiding the selection and spread of resistance to them.
  • Figure 1 Pediococcus sp. TUCO-3, arranged in memory.
  • Figure 2 Lactobacillus sp., TUCO-17, arranged in chains, bacilli.
  • Figure 3 Agarose gel to evaluate the integrity of the DNA of the TUCO-3 strain.
  • Figure 4 Determination of cell viability of the Lactobacillus sp. lyophilized.
  • Figure 5 Determination of the cell viability of the Pediococcus sp. lyophilized.
  • the present technology comprises the use of Lactobacillus sp. RGM 2852 and Pediococcus sp. RGM 2609 in the development of a probiotic formulation for the prevention of diarrhea caused by bacterial pathogens that affect dogs and cats.
  • the strains used are deposited in the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources, these correspond to the Pediococcus sp. TUCO-3, isolated from cat's milk, which is deposited under registration number RGM 2609 dated August 8, 2018; and the Lactobacillus sp. TUCO-17 isolated from bitch milk, which is deposited under registration number RGM 2852 dated October 21, 2019.
  • probiotic strains Two formulations containing probiotic strains are also presented, which allow their easy use, since they are soluble in water or other components such as liquid foods and jellies. It is presented in sachets dosed with a specific amount (grams), with a content of viable microorganisms defined to generate the desired probiotic effect. Each sachet will contain enough for 10 doses, which corresponds to 10 g of formulation, where each gram will contain a total of 5.5x10 9 CFU.
  • the first formulation corresponds to a whitish lyophilized granular powder, which comprises: a) 5 to 7g of biomass from the TUCO-3 strain; b) 5 to 7g of biomass from the TUCO-17 strain; c) Coating of whey corresponds to 8% of the total volume of lyophilization; d) Fructooligosaccharides (FOS), corresponds to 4% of the total volume of lyophilization; e e) Inulin, corresponds to 4% of the total volume of lyophilization.
  • Fructooligosaccharides Fructooligosaccharides
  • the second formulation is presented in the form of microcapsules, which comprise: a) 5 to 7g of biomass from the TUCO-3 strain; b) 5 to 7g of biomass from the TUCO-17 strain; c) 10% maltodextrin; and d) 10% whey dissolved in sterile water.
  • each formulation has been selected according to the properties they confer on the strains.
  • the selected components were chosen according to each formulation process, thus they confer protection to the strains against high temperatures during the microencapsulation process and at low temperatures during lyophilization, in order to ensure their stability and viability during these processes.
  • they confer stability in storage time (2 years) and temperature (25 ° C), ensuring that there will be no decrease in the viability of the strains and consequently keeping their activity intact.
  • This product will have beneficial effects in the treatment of acute diarrhea of bacterial or viral origin, and immune disorders in dogs and cats, allowing to complement the use of antibiotics in bacterial infections.
  • due to its immuno-potentiating properties it is also recommended for use in elderly animals, both prophylactically to improve nutritional condition, as a complement during therapeutic treatments, such as during anti-tumor treatment.
  • the strains used were isolated and selected among other strains, which shows that it is not common to find strains with these characteristics, mainly due to the poor microbiota found in the milk of these mammals, a product of their diet based on commercial pellets. the scarce quantity of milk that could be obtained in each case should be considered.
  • the TUCO-17 strain corresponds to bacilli ( Figure 1) and the TUCO-3 strain to coccoid morphology ( Figure 2).
  • strains TUCO-3 and TUCO-17 The two strains from milk were chosen in order to standardize the treatment of the different strains (Strains TUCO-3 and TUCO-17). The strains were also selected for their resistance to sodium chloride (2, 6 and 9% w / v of NaCl) and to bile salts (ox bile, Oxgall) in culture medium with up to 5% w / v; both strains had positive development at all concentrations of NaCl and bile salts used (table 1). Another selection test was the degradation of casein where both strains are capable of degrading it, tested by sowing on milk agar, this property is an industrial characteristic because it means that they have proteolytic activity (it can be used to make other edible products).
  • Biopower consists of a lyophilized probiotic complex intended for pets, however, its description does not specify the strains or their provenance. This complex is made up of bacteria of the genus Enterococcus, Bifidobacterium and LactobaciHus (acidophilus). The complex claims to be able to restore or reconstitute the intestinal microbiota and thus increase the absorption of nutrients.
  • the LactobaciHus casei SHIROTA strain is named after the scientist who discovered the strain. This strain is the one that is present in the Yakult product (food dairy and human probiotic) and has been studied extensively in this area of probiotics.
  • the strains seeded in blood agar did not generate beta-type hemolysis and, when seeded in gelatin, there were no liquefaction results, showing the presence of gelatinases (Table 2).
  • the TUCO-3 strain is resistant to ciprofloxacin, amikacin, gentamicin, tetracycline, and vancomycin.
  • the TUCO-17 strain presented resistance to amikacin, gentamicin and vancomycin (Table 3). When analyzing these results, the intrinsic resistance of this type of potentially probiotic strains of the genus LactobaciHus, resistance to vancomycin, was observed. From the literature, resistance to tetracyclines, gentamicin, amikacin, and ciprofloxacin are common and are not associated with mobile resistance genes.
  • R Resistant ( ⁇ 1.5cm), I: Intermediate (1.5-2.0cm), S: Susceptible (> 2, lcm).
  • strains were subjected to other tests to complement possible characteristics for their use in the industrial sector, where both strains easily comply with storage and recovery tests in the culture media and degradation of casein.
  • the action on pathogens was determined, where the inhibition halos were measured, those shown in table 4 and the action of the supernatants (table 5). These achieved halos indicate that all of our strains are capable of inhibiting the strains used in this study.
  • the inhibition halos produced by the spot soft agar technique are much greater than those produced by the supernatants of the respective strains, even those halos can be the same or greater than those produced by antibiotics.
  • Lala Salmonella sp., Pig; Salmonella: Salmonella enterica ATCC 13076; ETEC: enterotoxigenic Escherichia coli; EHEC: Enterohemorrhagic Escherichia coli; EC: Escherichia coli ATCC 25922; Listeria: Listeria monocytogenes ATCC 19115 and S. aureus: Staphylococcus aureus ATCC 29213. Sign ⁇ indicates standard deviation.
  • Lala Salmonella sp., Pig; Salmonella ⁇ . Salmonella enteric ATCC 13076; ETEC: Escherichia co / i enterotoxigenic; EHEC: Co / i e nterohemorrhagic Escherichia; EC: Escherichia coi i ATCC 25922; Listeria: Listeria monocytogenes ATCC 19115 and 5. aureus: Staphyiococcus aureus ATCC 29213. Sign ⁇ indicates standard deviation.
  • the supernatants of the potentially probiotic strains also have an effect on the strains used, but not on the Gram positive strains.
  • the potentially probiotic strains were also tested for their aggregation (autoaggregation and coaggregation, tables 6 and 7), since these characteristics are associated with the adherence capacity of the bacteria, both to themselves and to other strains.
  • the strains that have high autoaggregation are strains that act as protection of the epithelium or in an exclusive way.
  • the strains that have high coaggregation with pathogenic strains are associated with mechanisms of displacement and also of blocking the action of pathogens, because close contact is necessary for the bacteriocins to act, mainly, apart from the release of acids.
  • Lala Salmonella sp., Pig; Salmonella ⁇ . Salmonella enteric ATCC 13076; ETEC: Escherichia co / i enterotoxigenic; EHEC: Co / i e nterohemorrhagic Escherichia; EC: Escherichia coi i ATCC 25922; Listeria: Listeria monocytogenes ATCC 19115 and 5. aureus: Staphyiococcus aureus ATCC 29213. Sign ⁇ indicates standard deviation.
  • E enterotoxigenic pathogens
  • Enterohemorrhagic (0157)
  • Salmonella sp. Isolated from pig intestine
  • E coli ATCC 25922 E coli ATCC 25922
  • Salmonella enteric ATCC 13076 as reference strains.
  • Table 8 Strains resistant to pH 3.
  • the Lac set is genus specific and guides the identification of 5 species, (L brevis, L. casei, L rhamnosus, L. saliva wildebeest and L zeae) and the LbG set for 20 species (L brevis, L casei, L curvatus , L coryniformis, L. faraminis, L fermentum, L harbinensis, L hilgardii, L. kef ⁇ r ⁇ , L kunkeei, L parabrevis, L. parabuchneri, L paracasei, L parapiantarum, L. pentosus, L. piantarum, L rossiae, L sakei , L saiivar ⁇ us and L. sanfranciscensis).
  • Lac F 5 'ACA GAC TGA AAG TCT GAC GG Lac R: 5' GCG ATG CGA ATT TCT ATT ATT LbG F: 5 'AGA AGA GGA CAG TGG AAC LbG R: 5' TTA CAA ACT CTC ATG GTG TG
  • the TUCO-17 strain was positive for the Lactobaciiius genus, and the TUCO-3 strain did not undergo the PCR tests, because its morphology is coccoid and is arranged in sarcins, therefore, it does not belong to the Lactobacillus genus.
  • the TUCO-3 strain was sequenced and determined that its genus is Pediococcus. Aenomic DNA extraction
  • Chromosomal DNA extraction was performed according to the protocol described by Pospiech, 1995 (Pospiech and Neumann 1995).
  • Determination of DNA purity is established by the ratio of absorbance readings 260 and 280 nm. Pure DNA preparations have an OD 260/280 nm ratio of 1.8 to 2.0 (Puerta and Ure ⁇ a 2005), in our case a 260/280 radius of 1.75 was obtained. And a DNA concentration of 1563 pg / ml, this indicates that the sample has the required concentration and purity. Measurements were performed on the Nabi UV / VIs NANO SPECTROPHOTOMETER.
  • 16S rDNA amplification through polymerase chain reaction is performed in a TlOO TM Thermal Cycler - Bio-Rad thermal cycler with the following PCR profile: 94 ° C for 5 min, followed by 30 cycles of 94 ° C for 1 min, 68 ° C for 1 min, 72 ° C for 1 min, with a final extension at 72 ° C for 10 min.
  • the resulting reactions were sequenced by the Sequencing Service of the Lactobacillus Reference Center (CERELA-CONICET).
  • BLAST fhtPs //blast.ncb ⁇ .nlm.n ⁇ h.aov/Blast.caO (Johnson et al. 2008) and the database "16S ribosomal RNA sequences" were used to identify the species of each bacterium, the result obtained was: Pediococcus pentosaceus TUCO-
  • the TUCO-17 and TUCO-3 strains were characterized morphologically with a Scanning Electron Microscope.
  • the methodology consisted of preparing 24-h cultures in MRS broth, then without shaking, a drop of the sample is taken and deposited on small platforms called stubs with a carbon band and alused paper in one half. The preparation was dried in an oven to later be verified in the scanning electron microscope.
  • Figures 1 and 2 show the morphologies of these strains.
  • the soft spot agar technique was used, a technique that allows testing strains with probiotic potential "live” and in their medium and related conditions in the first stage.
  • the pathogens develop in their environments and related conditions, in this way, the strains in confrontation act with a natural development.
  • the diameters of the halos produced were measured.
  • the inhibitory effect of the supernatant of the TUCO-3 and TUCO-17 strains was also evaluated, for this, each culture was centrifuged for 24 h at 10,000 rpm for 10 min. The supernatant obtained was filtered (0.22 m ⁇ ti) and inoculated into holes made on BHI agar previously seeded in grass with the pathogenic or reference strain.
  • the diameter of the inhibition halos produced was measured, which can be seen in Table 3. Both strains showed inhibition on strains of the following bacteria: E coli, EHEC (E a? // enterohemorrhagic), ETEC ( E coH enterotoxigenic), Salmonella, Oostridium perfringens, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa.
  • emulsions were prepared with a concentration of 0.5 McFarland of the potentially probiotic strains and of the pathogenic or control strains. Equal volumes were mixed in kann tubes. The tubes were placed in the oven at 37 ° C and remained without shaking in incubation. At 0, 3, 6 and 24 h, the McFarland concentration of each tube was read on a Densichek TM Plus. The percentage of coaggregation was calculated from the equation used by L ⁇ et al, (2015).
  • Mcfmix Mcfarland of the mixture of the strains in equal volumes
  • Mcfpat Mcfarland of the pathogenic strain
  • Mcfprob Mcfarland of the potentially probiotic strain
  • Example 2 Formulation production process. Freeze-dried probiotic formulation.
  • the values indicated are based on a fermentation of 1.8 liters of the strains.
  • the formulation comprises: a) Biomass of the TUCO-3 strain; 5 to 7g b) Biomass of the TUCO-17 strain; 5 to 7g c) Whey coating corresponds to 8% of the total volume of lyophilization d) Fructooligosaccharides (FOS); corresponds to 4% of the total volume of lyophilization e) Inulin; corresponds to 4% of the total volume of lyophilization
  • the culture medium obtained from the fermentation was centrifuged at 5000 rpm for 5 min at room temperature.
  • the lyophilization mixture was prepared by dissolving 83.2 g of whey, 41.6 g of inulin and 41.6 g of FOS in 180 ml of sterile water.
  • the biomass obtained was re-suspended in the lyophilization mixture and stored at -20 ° C for 4 h. Subsequently, the mixture was transferred to flat-bottomed containers, so that a thin layer of mixture remained in each one (between 150 to 200 ml).
  • the containers were stored at -20 ° C for 4 h and later they were transferred to a refrigerator at -80 ° C for 16 h. After the freezing time, the samples were lyophilized and subsequently the cell viability of the product obtained was analyzed.
  • the formulation is presented as an off-white granulated powder, which is soluble in water or other components such as liquid foods and jellies. It is presented in sachets dosed with a specific amount (grams), with a content of viable microorganisms defined to generate the desired probiotic effect.
  • This product will have beneficial effects in the treatment of acute diarrhea of bacterial origin and immune disorders in dogs and cats, complementing and / or reducing the use of antibiotics.
  • the formulation of the strains maintaining a viability of lxlO 12 CFU / g, for at least 24 months, with a yield of 25-30 g of product per liter of fermentation.
  • the viability of the Lactobacillus sp. Lyophilized was determined by cell counting on an MRS agar plate, dissolving one gram of the formulation in 10mL of Butterfield phosphate buffer and using the technique of surface seeding of different dilutions of the samples at the established times. After 3 months to At room temperature, the sample maintains the same order of viability as at the beginning, setting the result in 90 days at I, dcIO 13 CFU / g, demonstrating the stability of the formulation (Figure 4).
  • the viability of the pediococcus sp. Lyophilized was determined by cell counting on an MRS agar plate, dissolving one gram of the formulation in 10mL of Butterfield phosphate buffer and using the technique of surface seeding of different dilutions of the samples at the established times. After 3 months at room temperature, the sample maintains the same order of viability as at the beginning, setting the result at 90 days at 9.9x10 13 CFU / g, demonstrating the stability of the formulation (Figure 5).
  • Microencapsulated probiotic formulation is Microencapsulated probiotic formulation.
  • the microencapsulated formulation comprises: a) 5 to 7g of biomass from the TUCO-3 strain; b) 5 to 7g of biomass from the TUCO-17 strain; c) 10% maltodextrin; and d) 10% whey dissolved in sterile water.
  • the volume of culture medium with the probiotic strains is centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes.
  • the precipitate containing the bacterial cells is re-suspended in encapsulation medium, which contains 10% maltodextrin and 10% whey dissolved in sterile water.
  • the spray-dryer atomization drying equipment is adjusted with the following working parameters, air flow (35-45%), 50% aspiration, 10% sample flow and 170 ° C inlet temperature.
  • the sample volume in constant agitation, passes through the system and the solid product formed is received in a glass container. Once the process is finished, the quantity of solid obtained is weighed, which is stored at 4 ° C, in a sterile glass container.
  • the microencapsulated product obtained is counted by plating in a solid culture medium plate to determine the viability of the probiotic strain at the end of the microencapsulation process.
  • microencapsulated formulation of the strains will maintain a viability of 10 10 CFU / g for at least 24 months, with a yield of approximately 40 g of product per liter of fermentation.

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Abstract

Se presenta la cepa probiótica de Lactobacillus sp. RGM 2852 y la cepa probiótica de Pediococcus sp. RGM 2609, y el uso de ambas en la elaboración de una formulación probiótica para la prevención de diarreas causadas por patógenos bacterianos que afectan a perros y gatos. Esta formulación puede presentarse como un polvo granulado liofilizado o en forma de microcápsulas, los que al ser soluble en agua u otros líquidos permite disponer de las cepas probioticas en alimentos para mascotas, ya sean líquidos o jaleas.

Description

Cepas probióticas de Lactobacillus sp. y de Pediococcus sp. y su uso en la elaboración de una formulación probiótica para prevención de diarreas causadas por patógenos bacterianos que afectan a perros y gatos.
SECTOR TECNICO
La presente tecnología está relacionada con la industria veterinaria, en particular se presenta una formulación probiótica para mascotas, principalmente perros y gatos.
ESTADO DEL ARTE
Las diarreas pueden clasificarse como primarias y secundarias. Entre las primarias se pueden encontrar patologías como obstrucciones luminales, intolerancia a la dieta, drogas/toxinas, enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal, neoplasias, enfermedades infecciosas (virales, bacterianas y parasitarias) entre otras, mientras que en las secundarias se encuentran afecciones renales, hepáticas, páncreas, del sistema endocrino o del sistema nervioso central (Lappin, 2012). Estas infecciones intestinales tienen una incidencia elevada (entre un 20% hasta un 50%), y genera alteraciones en la homeostasis intestinal o disbiosis, y en edades tempranas conducen a la muerte de los cachorros (Minamoto et al., 2014; Heilmann et al., 2017; Grellet et al., 2014). El uso generalizado de antimicrobianos en medicina humana y veterinaria, ha condicionado la selección y propagación de bacterias resistentes a antibióticos y genes de resistencia a antibióticos (Meek et al., 2015; O'Neill, 2015). Por tanto, desarrollar nuevas soluciones que apunten a la reducción del uso de antibióticos son valoradas en la actualidad por las agencias reguladoras y la industria. Ante este problema vigente, surge la oportunidad de desarrollar nuevas formulaciones basadas en cepas probióticas aisladas de la leche de diferentes especies, con el fin de prevenir y/o tratar las infecciones gastrointestinales en mascotas y disminuir la aplicación de antibióticos. Específicamente, el uso de probióticos ha tenido una importancia creciente en la clínica, humana y veterinaria, debido a que pueden reducir e incluso sustituir la administración de antibióticos. Estos han tenido resultados exitosos en la reconstitución de floras intestinales y en la reducción de sintomatología, además de estimular el sistema inmune (Bybee et al., 2011; Nami et al., 2015; Coman et al., 2019).
En cachorros, el parvovirus canino tipo 2 (CPV-2) el agente etiológico de la parvovirosis canina, es considerada la causa más importante de enteritis viral (Kapil et ai, 2007). En perros jóvenes la causa más frecuente es la indiscreción alimentaria definida como una patología que tiene su etiología en comportamientos anormales como ingesta de basura, raciones voluminosas, comida de consumo humano; cambios bruscos en la dieta; hipersensibilidad e intolerancias dietéticas; medicamentos especialmente antibióticos ingesta de huesos, hierbas etc. En la mayoría de los casos, las causas de diarrea permanecen desconocidas y la mascota se recupera (Herstad et al., 2010). Los patógenos bacterianos causantes de diarrea más encontrados son Escherichia coli, Salmonella spp., Qostridium perfringens y Qostridium diffícile toxigénico (Marks, 2003, Kelley et al, 2009, Suchodolski et al, 2012). Esta patología consiste además en un problema de salud pública, ya que se ha demostrado que existe la transferencia oral y piel de microorganismos entre perros y sus dueños (Song etal, 2013). Las bacterias potencialmente probióticas podrían ser una herramienta útil para mejorar la salud gastrointestinal en mascotas porque participan en la recuperación de la microbiota intestinal sin la necesidad estricta de utilizar antibióticos, evitando así la selección y propagación de la resistencia a éstos.
En cuanto a la localización anatómica de las lesiones intestinales que generan éstas bacterias, lo que se puede observar es que; los géneros de dostridium presentan signos clínicos de enfermedad en intestino delgado, intestino grueso o ambos (Marks et al, 2011), en cambio, Escherichia co/i y Salmonella tienen mayor tropismo celular por la porción distal de intestino delgado e intestino grueso (Crum-Cianflone, 2008; Marks et ai, 2011). Por lo general, el tratamiento más utilizado contra la diarrea se aboca en el uso indiscriminado de antimicrobianos de amplio espectro. Debido a ésto, la multiresistencia antibiótica de microorganismos patógenos se convierte en una preocupación mundial, lo que conlleva a nuevas investigaciones en busca de nuevas alternativas como tratamiento antimicrobiano, una de ellas es el uso de los probióticos. La salud y el bienestar de los animales de compañía, al igual que la de sus dueños, dependen en gran medida de la microbiota intestinal. Se ha demostrado que el uso de los probióticos en los animales de compañía además de la modular la respuesta del sistema inmune y la proteger mediante diversos mecanismos de acción posibles infecciones causada por enteropatógenos (reduciendo así la utilización de antibióticos), tienen la capacidad de controlar desórdenes alérgicos y recientemente también la obesidad y el estrés (Grzeskowiak etai, 2015).
En base a la importancia en la utilización de los probióticos en la clínica de animales de compañía en contra las diarreas de origen bacteriano se hace necesaria la caracterización de nuevas cepas con posible potencial probiótico de origen láctico animal.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Pediococcus sp. TUCO-3, dispuestas en sarcinas.
Figura 2: Lactobacillus sp., TUCO-17, dispuestas en cadenas, bacilos.
Figura 3: Gel de agarosa para evaluar la integridad del ADN de la cepa TUCO-3.
Figura 4: Determinación de la viabilidad celular de la cepa de Lactobacillus sp. liofilizada.
Figura 5: Determinación de la viabilidad celular de la cepa de Pediococcus sp. liofilizada.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente tecnología comprende el uso de las cepas de Lactobacillus sp. RGM 2852 y Pediococcus sp. RGM 2609 en la elaboración de una formulación probiótica para prevención de diarreas causadas por patógenos bacterianos que afectan a perros y gatos.
Las cepas utilizadas se encuentran depositadas en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos, estas corresponden a la cepa Pediococcus sp. TUCO- 3, aislada desde leche de gato, la cual está depositada bajo el número de registro RGM 2609 con fecha 8 de agosto de 2018; y la cepa Lactobacillus sp. TUCO-17 aislada desde leche de perra, la cual está depositada bajo el número de registro RGM 2852 con fecha 21 de octubre de 2019.
También se presentan dos formulaciones que contiene a las cepas probioticas, las cuales permiten su fácil utilización, ya que son solubles en agua u otros componentes como alimentos líquidos y jaleas. Se presenta en sobres dosificados con una cantidad específica (gramos), con un contenido de microorganismos viables definidos para generar el efecto probiótico deseado. Cada sobre contendrá la cantidad suficiente para 10 dosis, lo que corresponde a 10 g de formulación, donde cada gramo contendrá un total de 5,5xl09 UFC.
La primera formulación corresponde a un polvo granulado liofilizado de color blanquecino, el cual comprende: a) 5 a 7g de Biomasa de la cepa TUCO-3; b) 5 a 7g de Biomasa de la cepa TUCO-17; c) Recubrimiento de suero de leche corresponde al 8% del volumen total de liofilización; d) Fructooligosacáridos (FOS), corresponde al 4% del volumen total de liofilización; e e) Inulina, corresponde al 4% del volumen total de liofilización.
La segunda formulación se presenta en forma de microcapsulas, las cuales comprenden: a) 5 a 7g de Biomasa de la cepa TUCO-3; b) 5 a 7g de Biomasa de la cepa TUCO-17; c) 10% de maltodextrina; y d) 10% de suero de leche disueltos en agua estéril.
Los componentes de cada formulación han sido seleccionados de acuerdo a las propiedades que confieren a las cepas. Los componentes seleccionados fueron elegidos de acuerdo a cada proceso de formulación, así estos confieren protección a las cepas frente altas temperaturas durante el proceso de microencapsulación y a las bajas temperaturas durante la liofilización, de manera de asegurar su estabilidad y viabilidad durante estos procesos. Además, confieren estabilidad en el tiempo (2 años) y temperatura (25°C) de almacenamiento, asegurando que no habrá disminución de la viabilidad de las cepas y como consecuencia manteniendo su actividad intacta. Este producto tendrá efectos beneficiosos en el tratamiento de diarreas agudas de origen bacteriano o viral, y desordenes inmunes en perros y gatos, permitiendo complementar el uso de antibióticos en las infecciones bacteriuanas. Además, por sus propiedades inmunopotenciadoras también es recomendado su uso en animales ancianos, tanto de forma profiláctica para mejorar la condición nutricional, como complemento durante tratamientos terapéuticos, como por ejemplo durante un tratamiento anti-tumoral.
Las cepas utilizadas fueron aisladas y seleccionadas entre otras cepas, lo que da cuenta que no es común encontrar cepas con estas características, principalmente debido a la pobre microbiota encontrada en la leche de estos mamíferos, producto de su dieta basada en pellets comerciales, además, se debe considerar la escasa cantidad de leche que se podía obtener en cada caso. La cepa TUCO-17 corresponden a bacilos (figura 1) y la cepa TUCO-3 a morfología cocoide (figura 2).
La selección de las cepas se basó en su potencialidad a sobrevivir a pH ácido, seguido de su acción inhibitoria sobre cepas patógenas. De esta primera etapa se seleccionaron 4 cepas resistentes a pH 3, incubadas 24 h en microaerofilia. Se eligieron las dos cepas provenientes de leche a fin de homologar el trato de las distintas cepas (Cepas TUCO-3 y TUCO-17). Las cepas también fueron seleccionadas por su resistencia a Cloruro de sodio (2, 6 y 9% p/v de NaCI) y a sales biliares (bilis de buey, Oxgall) en medio de cultivo con hasta 5% p/v; ambas cepas tuvieron desarrollo positivo a todas las concentraciones de NaCI y sales biliares utilizadas (tabla 1). Otra prueba de selección fue la degradación de caseína donde ambas cepas son capaces de degradarla, probadas por siembra en agar de leche, esta propiedad es una característica industrial porque significa que tienen actividad proteolítica (puede servir para fabricar otros productos comestibles).
Todas estas pruebas fueron realizadas comparándose con cepas probioticas comerciales, Biopower® y Shirota. Biopower consiste en un complejo probiótico liofilizado destinado a mascotas, sin embargo, en su descripción no se especifican las cepas ni su proveniencia. Este complejo está formado por bacterias del género Enterococcus, Bifídobacterium y LactobaciHus ( acidophilus) . El complejo dice ser apto para restaurar o reconstituir microbiota intestinal y así aumentar la absorción de nutrientes. La cepa LactobaciHus casei SHIROTA, lleva el nombre del científico que descubrió a cepa. Esta cepa es la que está presente en el producto Yakult (alimento lácteo y probiótico para humano) y ha sido estudiada ampliamente en esta área de probióticos.
Tabla 1. Resistencia de las cepas TUCO-3 y TUCO-17 y cepas comerciales en diferentes concentraciones de Oxgall y NaCI (% p/v)
Oxgall NaCI
Cepas % p/V % p/V
0,5 2 5 2 6 9
TUCO-3 + + + + + +
TUCO- 17 + + + + + +
Biopower® + + + + + +
Shirota + + +
En cuanto a sus características de perfil de inocuidad las cepas sembradas en agar sangre no generaron hemolisis tipo beta y, sembradas en gelatina, no hubo resultados de licuefacción, mostrando aunsencia de gelatinasas (tabla 2). La cepa TUCO-3 es resistente a ciprofloxacino, amikacina, gentamicina, tetraciclina y vancomicina. La cepa TUCO-17 presentó resistencia a amikacina, gentamicina y vancomicina (tabla 3). Al analizar estos resultados, se observó la resistencia intrínseca de este tipo de cepas potencial mente probióticas del género LactobaciHus, la resistencia a vancomicina. Por literatura, la resistencia a tetraciclinas, gentamicina, amikacina y ciprofloxacino son comunes y no están asociadas a genes móviles de resitencia.
Tabla 2. Detección de las enzimas hemolisinas y gelatinasas de las cepas potencial mente probióticas.
Cepas Hemolisinas Gelatinasas
TUCÓ-3 Pardal Negativa TUCO- 17 Pardal Negativa Biopower® Pardal Negativa Shitora Pardal Negativa Tabla 3. Perfil de resistencia/susceptibilidad antibiótica de las cepas potencialmente probióticas.
Susceptibilidad/resistencia antimicrobiana de las cepas
Antibióticos pg potencialmente probióticas
TUCO-3 TUCO- 17 Biopower® Shirota
Ak 30 . R . . R . . R . . R .
Amp 10 I S S S
Aml 25 S S S S
Cip 5 R I R R
E 15 S S S S
CN 120 R R R R
T 30 R S S S
VA 30 R R R R
R: Resistente (<l,5cm), I: Intermedio (l,5-2,0cm), S: Suceptible (>2,lcm). Ak: Amikacina, Amp:Ampicilina, AmkAmoxicilina, Cip:Ciprofloxacino, E:Eritromicina, CN:Gentamicina, T:Tetraciclina y VA:Vancomicina.
Las cepas fueron sometidas a otras pruebas para complementar posibles características para su uso en la industrial, donde ambas cepas cumplen con la facilidad pruebas de almacenamiento y recuperación en los medios de cultivo y degradación de caseína.
Como ventajas competitivas sobre los probióticos existentes en el mercado (Biopower®, se utilizó en los experimentos para comparar), la asociación de las cepas TUCO-3 y cepa TUCO-17, provenientes de leche felina y canina respectivamente, proporcionará beneficios y mejor adaptación, enriqueciendo la microbiota y favoreciendo la nutrición de las mascotas, tanto como gatos como para perros, con cepas que provienen de leche materna de ambos animales. La otra ventaja es que comparativamente, los resultados de la TUCO-3 y TUCO-17 son ¡guales o mejores que los efectos de la cepa de LactobaciHus acidophilus aislada de Biopower® y mejores que la cepa Le SHIROTA.
A través de la técnica de Soft Spot se determinó la acción sobre patógenos, donde se midieron los halos de inhibición los que se presentan en la tabla 4 y la acción de los sobrenadantes (tabla 5). Estos halos logrados nos indican que todas nuestras cepas son capaces de inhibir a las cepas utilizadas en este estudio. Los halos de inhibición producido mediante la técnica de spot soft agar son mucho mayores que los producidos por los sobrenadantes de las respectivas cepas, incluso, esos halos pueden ser ¡guales o mayores que los producidos por antibióticos.
Tabla 4. Efecto inhibitorio de las cepas TUCO-3, TUCO-17 y Le SHIROTA sobre las cepas patógenas o de referencia, método Spot Soft agar, diámetros de halos en cm
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Lala: Salmonella sp., cerdo; Salmonella: Salmonella entérica ATCC 13076; ETEC: Escherichia coli enterotoxigénica; EHEC: Escherichia coli enterohemorrágica; EC: Escherichia coli ATCC 25922; Listeria: Listeria monocytogenes ATCC 19115 y S. aureus: Staphylococcus aureus ATCC 29213. Signo ± indica desviación estándar.
Ambas cepas, TUCO-3 y TUCO-17 poseen buen efecto inhibitorio sobre todas las cepas probadas, incluyendo L. monocytogenes y S. aureus, bacterias que normalmente no pueden ser inhibidas por cepas potencialmente probióticas. Se resalta que la cepa TUCO-17 obtuvo halos de inhibición más potentes incluso que la cepa SHIROTA, mediante el método de spot soft agar. Es decir, las cepas pueden tener efecto no solo sobre enterobacterias, sino que podrían poseer un efecto en amplio espectro. Estas cepas ya fueron ensayadas para su inhibición sobre otras bacterias patógenas que afectan ell tracto respiratorio. Tabla 5. Efecto inhibitorio de los sobrenadantes de las cepas TUCO-3 y TUCO-17 sobre las cepas patógenas o de referencia
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Lala: Salmonella sp., cerdo; Salmonella·. Salmonella entérica ATCC 13076; ETEC: Escherichia co/i enterotoxigénica; EHEC: Escherichia co/i e nterohemorrágica; EC: Escherichia coi i ATCC 25922; Listeria: Listeria monocytogenes ATCC 19115 y 5. aureus: Staphyiococcus aureus ATCC 29213. Signo ± indica desviación estándar.
Los sobrenadantes de las cepas potencial mente probióticas también poseen efecto sobre las cepas utilizadas, pero no sobre las cepas Gram positivas. Las cepas potencialmente probióticas también fueron probadas para su agregación (autoagregación y coagregación, tablas 6 y 7), debido a que estas características se asocian con la capacidad de adherencia de las bacterias, tanto a ellas mismas como a con otras cepas. De esta manera, las cepas que poseen alta autoagregación son cepas que actúan como protección del epitelio o de manera excluyente. Por otro lado, las cepas que poseen alta coagregación con cepas patógenas están asociadas a mecanismos de desplazamiento y también de bloqueo de la acción de patógenos, debido a que es necesario un contacto estrecho para que actúen las bacteriocinas, principalmente, a parte de la liberación de ácidos.
Tabla 6. Porcentaje de autoagregación de las cepas TUCO-3 y TUCO-17 a las 3, 6 y 24 h de interacción
Cepas potenciales Porcentajes de autoagregación, a las 3, 6 y 24 h Probióticas de interacción
3 h 6 h 24 h
TUCO-3 14,4 ± 5,0ab 24.7 ± 7,6abc 52,7 ± 10,5def
TUCO-17 23,00 ± 4,7ab 40,5 ± 5,lcd 66,9 ± 12, 8f Z Sh¡rota 13,9 ± 6,9ab 26.7 ± 9,8bc 59,1 ± 9,8ef
Letras distintas indican diferencias significativas (p< 0,05). Signo ± indica desviación estándar. *Probiótico de referencia Lactobaciiius case/ S h i rota . Tabla 7. Porcentajes de coagregación de las cepas TUCO-3 y TUCO-17 con las bacterias de referencia y patógenas a las 24 h de interacción.
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Lala: Salmonella sp., cerdo; Salmonella·. Salmonella entérica ATCC 13076; ETEC: Escherichia co/i enterotoxigénica; EHEC: Escherichia co/i e nterohemorrágica; EC: Escherichia coi i ATCC 25922; Listeria: Listeria monocytogenes ATCC 19115 y 5. aureus: Staphyiococcus aureus ATCC 29213. Signo ± indica desviación estándar.
EJEMPLOS DE APLICACIÓN Ejemplo 1: aislamiento y caracterización de las cepas
Para los diferentes experimentos se utilizaron como controles patógenos 5 cepas: E cotí patotipos enterotoxigénico; enterohemorrágico (0157); Salmonella sp., aislada desde intestino de cerdo; E coli ATCC 25922 y Salmonella entérica ATCC 13076 como cepas de referencias.
Aislamiento de las cepas desde las muestras de leche:
Se tomaron 2 muestras de leche de gata y 4 muestras de perra estas fueron sembradas primero en caldo MRS y luego traspasada a agar MRS. Se seleccionaron las colonias catalasa negativas y Gram positivas para ensayos de acción sobre cepas patógenas. El primer aislamiento fue realizado con la selección de las cepas a pH 3. Cien microlilitros de cada muestra de leche fueron sembrados en caldo MRS e incubadas durante 12h a 35°C. Una alícuota se traspasó en un tubo con caldo MRS ajustado a pH 3. La incubación se realizó durante 24 h. a 37°C. Posteriormente, se hizo un traspaso a agar MRS para verificar viabilidad. En la tabla 8 se muestran las cepas resistentes a pH = 3 en las condiciones de ensayo:
Tabla 8: Cepas resistentes a pH 3.
Cepas Procedencia de las cepas
TUCO-3 Leche felina
TUCO-11 Leche canina
TUCO-16 Calostro canino
TUCO-17 Leche canina
Pruebas de funcionalidad: a) Resistencia a Cloruro de Sodio (NaCI): Las cepas fueron sembradas en caldo MRS con diferentes concentraciones de NaCI (3, 6 y 9% p/v). Los cultivos permanecieron a 37°C durante 24 h en condiciones de microaerofilia. Luego de esto se observó la presencia o ausencia de turbidez en los tubos y se corroboró viabilidad mediante un traspaso en agar. b) Prueba de resistencia a sales biliares (Oxgall, bilis de buey): Las cepas seleccionadas fueron sembradas en caldo MRS y cultivadas a 37°C durante 24h en condiciones de microaerofilia. Luego de esta etapa, los inóculos fueron traspasados a tubos con caldo MRS con diferentes concentraciones de bilis de buey (0,3; 0,5; 2 y 5% p/v) y se cultivaron a 35°C durante 24 h. La viabilidad fue comprobada mediante el posterior cultivo a agar MRS en las condiciones ya mencionadas. c) Prueba de degradación de la caseína (Marroki et al. 2014): las cepas fueron sembradas en agar de leche descremada 10 %, extracto de levadura 0,5 % y 1,5 % de agar. Las placas fueron incubadas a 37°C durante 24 h y se observó la presencia de halos, lo que indica degradación.
Pruebas de seauridad/inocuidad: a) Prueba de detección de hemolisinas: Las cepas seleccionadas fueron sembradas en agar sangre base Columbia y se cultivaron a 35°C durante 48h, en condiciones de microaerofilia. Estos ensayos resultaron negativos para hemolisis para todas las cepas potencial mente probióticas. b) Prueba de detección de gelatinasas: Las cepas fueron sembradas en picada a un tubo de gelatina y se cultivaron a 35°C durante 72h, en condiciones de microaerofília. Estos ensayos también resultaron negativos para todas las cepas potencial mente probióticas. c) Antibiograma de las cepas probióticas seleccionadas: Las cepas seleccionadas se cultivaron en césped en agar MRS desde una suspensión de 0,5 Me Farland, con los siguientes sensidiscos de antibióticos: ciprofloxacino (5pg), vancomicina (30pg), amoxicilina (25pg), ampicilina (10pg), gentamicina (10pg), eritromicina (15pg) y tetraciclina. Las placas fueron cultivadas a 37°C, en condiciones de microaerofília, durante 48 h. Se midió el diámetro del halo en milímetros para la lectura de los halos (tabla 8). El ensayo se realizó 3 veces, y el criterio de lectura fue el siguiente: Susceptible >21mm de diámetro; Intermedio 16 - 20mm; y Resistente <
15mm
Identificación de las cepas:
La identificación se realizó mediante ensayo de PCR utilizando los primers Lac y LbG. El set Lac es género específico y orienta para la identificación de 5 especies, ( L brevis, L. casei, L rhamnosus, L. saliva ñus y L zeae ) y el set LbG para 20 especies ( L brevis, L casei, L curvatus, L coryniformis, L. faraminis, L fermentum, L harbinensis, L hilgardii, L. kefírí, L kunkeei, L parabrevis, L. parabuchneri, L paracasei, L parapiantarum, L. pentosus, L. piantarum, L rossiae, L sakei, L saiivaríus y L. sanfranciscensis) .
La secuencia de los primers es presentada a continuación:
Lac F: 5' ACA GAC TGA AAG TCT GAC GG Lac R: 5' GCG ATG CGA ATT TCT ATT ATT LbG F: 5' AGA AGA GGA CAG TGG AAC LbG R: 5' TTA CAA ACT CTC ATG GTG TG
La cepa TUCO-17 resultó positiva para el género Lactobaciiius, y la cepa TUCO- 3 no pasó por los ensayos de PCR, debido a que su morfología es cocoide y se arregla en sarcinas, por tanto, no pertenece al género Lactobacillus. Se realizó la secuenciación de la cepa TUCO-3 la cual determinó que su género es Pediococcus. Extracción ADN aenómico
La extracción del ADN cromosómico fue realizado de acuerdo al protocolo descripto por Pospiech, 1995 (Pospiech and Neumann 1995).
Estimación de la concentración v pureza de ADN
La determinación de la pureza de ADN se establece mediante la relación de las lecturas de absorbancias 260 y 280 nm. Las preparaciones puras de ADN tienen una relación DO 260/280 nm de 1,8 a 2,0 (Puerta and Ureña 2005), en nuestro caso se obtuvo un radio 260/280 de 1,75. Y una concentración de ADN de 1563 pg/ml, esto indica que la muestra posee la concentración y pureza requerida. Las mediciones fueron realizadas en el Nabi UV/VIs NANO SPECTROPHOTOMETER.
Integridad del ADN
Se realizo un gel de agarosa para observar la integridad de las cadenas de ADN de la muestra. Se presenta en la figura 3, es te gel, donde el carril 1 es el marcador PM 5 pl 1 Kb Plus DNA Ladder Invitrogen, preparado como recomienda el fabricante, y carril 2 ADN TUCO-3 - Dilución 1/15 - Vol siembra 5mI.
Secuenciación del 16S ribosomal
La amplificación del ADNr 16S a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realiza en un termociclador TlOO™ Thermal Cycler - Bio-Rad con el siguiente perfil de PCR: 94°C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 68°C durante 1 min, 72°C durante 1 min, con una extensión final a 72°C durante 10 min.
Las reacciones resultantes fueron secuenciadas por el Servicio de Secuenciación del Centro de Referencia para Lactobacillus (CERELA-CONICET).
El resultado obtenido fue:
TUCO-3
CGGGCGGT GT GT ACAAGGCCCGGGAACGT ATT CACCGCGGCAT GCT G AT CCGCG ATT ACT AG CGATT CCGACTT CGTGT AGGCGAGTT GCAGCCT ACAGT CCGAACT GAGAAT GGTTTT AAGAG ATT AGCTT AACCT CGCGGTCTCGCGACT CGTT GT ACCAT CCATT GT AGCACGT GT GT AGCCCA GGT CAT AAGGGGCAT G AT G ATTTG ACGT CGT CCCCACCTT CCT CCGGTTT GT CACCGGCAGT CT CACT AGAGT GCCCAACTT AAT GCTGGCAACT AGT AAT AAGGGTT GCGCT CGTTGCGGG AC TT AACCC AACAT CT CACG AC ACG AGCT G ACG AC AACC AT GC ACCACCT GT C ATT CTGTCCCCG AAGGG AACCT CT AAT CT CTT AG ACT GT C AG AAG AT GT C AAG ACCT GGT AAGGTT CTT CGCGTA GCTT CGAATT AAACCACAT GCTCCACCGCTT GT GCGGGCCCCCGT CAATT CTTTT GAGTTT CA ACCTT GCGGT CGT ACT CCCCAGGCGG ATT ACTT AAT GCGTT AGCTGCAGCACT GAN NGGCGG AAACCCT CCAAC ACTT AGT AAT CAT CGTTT AC N GCAT GG ACT AC Identificación de especie
Se empleó el uso de BLAST fhtPs://blast.ncb¡.nlm.n¡h.aov/Blast.caO (Johnson et al. 2008) y la base de datos "16S ribosomal RNA sequences" para la identificación de especie de cada bacteria, el resultado obtenido fue: Pediococcus pentosaceus TUCO-
3.
Caracterización morfológica
Las cepas TUCO-17 y TUCO-3 fueron caracterizadas morfológicamente con un Microscopio Electrónico de Barrido. La metodología consistió en preparar cultivos de 24 h en caldo MRS, luego sin agitación, se toma una gota de la muestra y se deposita en pequeñas plataformas denominadas stubs con una banda de carbono y papel alusa en una mitad. La preparación fue secada en una estufa para posteriormente ser verificada en el microscopio electrónico de barrido. En las figuras 1 y 2 se muestran las morfologías de estas cepas.
Pruebas de acción inhibitorias de patógenos:
Para probar la acción inhibitoria sobre patógenos se ocupó la técnica de soft spot agar, una técnica que permite probar las cepas de potencial probióticos "vivas" y en su medio y condiciones afines en la primera etapa. En una segunda etapa, se desarrollan los patógenos en sus medios y condiciones afines, de esta manera, las cepas en confronta miento actúan con un desarrollo natural. Se midieron los diámetros de los halos producidos. También se evaluó el efecto inhibitorio del sobrenadante de las cepas TUCO-3 y TUCO-17, para esto, se centrifugó cada cultivo de 24 h a 10000 rpm durante 10 min. El sobrenadante obtenido fue filtrado (0,22 mΐti) e inoculado en orificios realizados en agar BHI previamente sembrado en césped con la cepa patógena o de referencia. Se midió el diámetro de los halos de inhibición producidos (cm), los cuáles se pueden observar en la tabla 3. Ambas cepas presentaron inhibición sobre cepas de las siguientes bacterias: E coli, EHEC (E a?// enterohemorrágica), ETEC (E coH enterotoxigénica), Salmonella, Oostridium perfringens, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa.
Pruebas de agregación:
Para la determinación de la autoagregación, cada cepa fue cultivada en caldo MRS durante 24 h. Se prepararon emulsiones con concentración equivalente a 0,5 Me Farland en buffer fostato pH 7, en tubos kann. Los tubos fueron llevados a la estufa a 37 °C y permanecieron sin agitación en incubación. A las 0, 3, 6 y 24 h, se leyó la concentración en McFarland de cada tubo en un Densichek™ Plus. El porcentaje de autoagregación se calculó mediante la fórmula (1-Mcffinal/Mcfinicial)*100. Dónde: Mcffinal = Mcfarland final y Mcfinicial = Mcfarland inicial.
Para la determinación de la coagregación se prepararon emulsiones con concentración 0,5 McFarland de las cepas potencialmente probióticas y de las cepas patógenas o controles. Volúmenes ¡guales fueron mezclados en tubos kann. Los tubos fueron llevados a la estufa a 37°C y permanecieron sin agitación en incubación. A las 0, 3, 6 y 24 h, se leyó la concentración en McFarland de cada tubo en un Densichek™ Plus. El porcentaje de coagregación se calculó a partir de la ecuación utilizada por L¡ et al, (2015).
Mcfmezcla
Figure imgf000016_0001
_ Mcfpat + Mcfprob X 100
Figure imgf000016_0002
2
Figure imgf000016_0003
Donde:
Mcfmezcla = Mcfarland de la mezcla de las cepas en volúmenes ¡guales
Mcfpat = Mcfarland de la cepa patógena
Mcfprob = Mcfarland de la cepa potencialmente probiótica
Ejemplo 2: Proceso de producción de la formulación. Formulación Probiótica liofilizada.
Los valores indicados están en base a una fermentación de 1,8 litros de las cepas. La formulación comprende: a) Biomasa de la cepa TUCO-3; 5 a 7g b) Biomasa de la cepa TUCO-17; 5 a 7g c) Recubrimiento de suero de leche corresponde al 8% del volumen total de liofilización d) Fructooligosacáridos (FOS); corresponde al 4% del volumen total de liofilización e) Inulina; corresponde al 4% del volumen total de liofilización
Además, se presenta el procedimiento para secar y conservar las cepas.
El medio de cultivo obtenido de la fermentación se centrifugó a 5000 rpm por 5 min a temperatura ambiente. La mezcla de liofilización se preparó disolviendo 83,2 g de suero de leche, 41,6 g de inulina y 41,6 g de FOS en 180 mi de agua estéril. La biomasa obtenida se re-suspendió en la mezcla de liofilización y se almacenó a -20°C por 4 h. Posteriormente, la mezcla se traspasó a recipientes de fondo plano, de manera en que quede una fina capa de mezcla en cada uno (entre 150 a 200 mi). Los recipientes fueron almacenados a -20°C por 4 h y posteriormente se traspasaron a un refrigerador a -80°C por 16 h. Transcurrido el tiempo de congelación, las muestras fueron liofilizadas y posteriormente se analizó la viabilidad celular del producto obtenido.
La formulación se presenta como un polvo granulado de color blanquecino, que es soluble en agua u otros componentes como alimentos líquidos y jaleas. Se presenta en sobres dosificados con una cantidad específica (gramos), con un contenido de microorganismos viables definidos para generar el efecto probiótico deseado. Este producto tendrá efectos beneficiosos en el tratamiento de diarreas agudos de origen bacteriano y desordenes inmunes en perros y gatos, complementando y/o reduciendo el uso de antibióticos.
La formulación de las cepas, manteniendo una viabilidad de lxlO12 UFC/g, por al menos 24 meses, con un rendimiento de 25-30 g de producto por litro de fermentación.
Estudio de la estabilidad a 25°C en el tiempo (3 meses), de las cepas probíoticas liofilizadas.
La viabilidad de la cepa de Lactobacillus sp. liofilizada se determinó mediante recuento celular en placa de agar MRS, disolviendo un gramo de la formulación en lOmL de buffer Butterfield fosfato y utilizando la técnica de siembra en superficie de distintas diluciones de las muestras en los tiempos establecidos. Después de 3 meses a temperatura ambiente la muestra mantiene el mismo orden de viabilidad que al inicio fijando el resultado en 90 días en I,dcIO13 UFC/g, demostrando la estabilidad de la formulación (Figura 4).
La viabilidad de la cepa de pediococcus sp. liofilizada se determinó mediante recuento celular en placa de agar MRS, disolviendo un gramo de la formulación en lOmL de buffer Butterfield fosfato y utilizando la técnica de siembra en superficie de distintas diluciones de las muestras en los tiempos establecidos. Después de 3 meses a temperatura ambiente la muestra mantiene el mismo orden de viabilidad que al inicio fijando el resultado a 90 días en 9,9xl013 UFC/g, demostrando la estabilidad de la formulación (Figura 5).
Formulación probiótica microencapsulada.
La formulación microencapsulada comprende: a) 5 a 7g de Biomasa de la cepa TUCO-3; b) 5 a 7g de Biomasa de la cepa TUCO-17; c) 10% de maltodextrina; y d) 10% de suero de leche disueltos en agua estéril.
Preparación del cultivo
A partir de un vial de cada cepa almacenada a -80°C se siembran 3 placas de medio de cultivo sólido mediante la técnica de siembra en estría. Las placas se incuban a 37°C por 48 horas. Transcurrido el tiempo de incubación se inoculan tubos con 5 mL de medio líquido y se incuban a 37°C con agitación de 150rpm por 12-16 horas.
A partir de los pre-inóculos de 5 mL se inoculan matraces de 500mL de medio de cultivo líquido. Los cultivos son incubados a 37°C con agitación de 150rpm por 8-12 horas. Finalizado el tiempo de cultivo se realiza un recuento por siembra en placas de medio de cultivo sólido para determinar la viabilidad del cultivo previo a la microencapsulación. Preparación de la muestra
El volumen de medio de cultivo con las cepas probióticas se centrifuga a 5000 rpm durante 10 minutos. El precipitado que contiene las células bacterianas se re suspende en medio de encapsulación el que contiene en un 10% de maltodextrina y un 10% de suero de leche disueltos en agua estéril.
Proceso de microencapsulación
El equipo de secado por atomización spray-dryer se ajusta con los siguientes parámetros de trabajo, flujo de aire (35-45%), aspiración 50%, flujo de la muestra 10% y temperatura de entrada 170°C. El volumen de muestra, en constante agitación, pasa por el sistema y el producto sólido formado es recibido en un contenedor de vidrio. Finalizado el proceso se pesa la cantidad de sólido obtenido, el que se almacena a 4°C, en un contenedor de vidrio estéril. Al producto microencapsulado obtenido se le realiza un recuento por siembra en placa de medio de cultivo sólido para determinar la viabilidad de la cepa probiótica al final del proceso de microencapsulación.
La viabilidad de ambas cepas tras la encapsulación resulta ser óptima, lográndose recuentos de al menos 1010 Ufc/g, tanto para la cepa gatuna como la canina, considerando al menos un mes post encapsulamiento.
La formulación microencapsulada de las cepas, mantendrá una viabilidad de lxlO10 UFC/g por al menos 24 meses, con un rendimiento de aproximadamente 40 g de producto por litro de fermentación.
Ejemplo 3: Ensayos funcionales
La evaluación de la formulación en diarreas agudas en perro, se desarrolló clínica veterinaria de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Concepción.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una cepa probiótica de Lactobacillus sp. CARACTERIZADA porque fue aislada desde leche de perra, la cual está depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos bajo el número de registro RGM 2852 con fecha 21 de octubre de 2019.
2. Una cepa probiótica de Pediococcus sp. CARACTERIZADA porque fue aislada desde leche de gata, la cual está depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos bajo el número de registro RGM 2609 con fecha 8 de agosto de 2018.
3. Uso de las cepas de Lactobacillus sp. RGM 2852 y Pediococcus sp. RGM 2609, según reivindicación 1 y 2 CARACTERIZADO porque se utilizan en la elaboración de una formulación probiótica para prevención de diarreas causadas por patógenos bacterianos que afectan a perros y gatos.
4. Una formulación probiótica para prevención de diarreas causadas por patógenos bacterianos que afectan a perros y gatos, según reivindicación 3, CARACTERIZADA porque corresponde a un polvo granulado liofilizado de color blanquecino, el cual comprende: a. 5 a 7g de Biomasa de la cepa TUCO-3; b. 5 a 7g de Biomasa de la cepa TUCO-17; c. Recubrimiento de suero de leche corresponde al 8% del volumen total de liofilización; d. Fructooligosacáridos (FOS), corresponde al 4% del volumen total de liofilización; e e. Inulina, corresponde al 4% del volumen total de liofilización.
5. Una formulación probiótica para prevención de diarreas causadas por patógenos bacterianos que afectan a perros y gatos, según reivindicación 3, CARACTERIZADA porque se presenta en forma de microcapsulas, las cuales comprenden: a. 5 a 7g de Biomasa de la cepa TUCO-3; b. 5 a 7g de Biomasa de la cepa TUCO-17; c. 10% de maltodextrina; y d. 10% de suero de leche disueltos en agua estéril.
6. Uso de la formulación probiótica para prevención de diarreas causadas por patógenos bacterianos que afectan a perros y gatos, según reivindicación 3,
CARACTERIZADA porque al ser soluble en agua u otros líquidos permite disponer de las cepas probioticas en alimentos para mascotas líquidos o jaleas.
7. Uso de la formulación probiótica para prevención de diarreas causadas por patógenos bacterianos que afectan a perros y gatos, según reivindicación 3,
CARACTERIZADA porque se presenta en sobres dosificados con una cantidad suficiente para 10 dosis, lo que corresponde a 10 g de formulación, donde cada gramo contendrá un total de 5,5xl09 UFC.
8. Uso de la formulación probiótica para prevención de diarreas causadas por patógenos bacterianos que afectan a perros y gatos, según reivindicación 3,
CARACTERIZADA porque permite una estabilidad en el tiempo por 2 años a temperatura de 25°C de almacenamiento, asegurando que no habrá disminución de la viabilidad de las cepas y como consecuencia manteniendo su actividad intacta.
9. Uso de la formulación probiótica para prevención de diarreas causadas por patógenos bacterianos que afectan a perros y gatos, según reivindicación 3,
CARACTERIZADA porque presenta efectos beneficiosos en el tratamiento de diarreas agudas de origen bacteriano o viral, y desordenes inmunes en perros y gatos, permitiendo complementar el uso de antibióticos en las infecciones bacterianas.
10. Uso de la formulación probiótica para prevención de diarreas causadas por patógenos bacterianos que afectan a perros y gatos, según reivindicación 3,
CARACTERIZADA porque por sus propiedades inmunopotenciadoras se utiliza en animales ancianos, tanto de forma profiláctica para mejorar la condición nutricional, como complemento durante tratamientos terapéuticos.
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