KR20220041174A

KR20220041174A - 해충 방제 또는 감소를 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20220041174A
Application number: KR1020227006618A
Authority: KR
Inventors: 보쉬 마크 페이지; 무리요 프리미티보 카바예로; 아이 아르나우 마르타 시타; 듀란 데이비드 마르티네즈; 쿠르디 하비에르 루시엔테스
Original assignee: 히프라 사이언티픽, 에스.엘.유; 유니버시다드 퍼블리카 데 나바라
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2020-07-27
Publication date: 2022-03-31
Also published as: EP4003020A1; US20220249577A1; WO2021018841A1; JP2022542907A; BR112021026891A2; CA3147860A1; MX2022001071A

Abstract

본 발명은 Dermanyssus Gallinae (가금류 붉은 응애) 침입의 방제 및 감소와 같은 응애 침입을 방제 또는 감소시키기 위한 바실러스 투린지엔시스 (Bt) 균주의 생존가능 포자를 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

해충 방제 또는 감소를 위한 방법 및 조성물

본 발명은, 바람직하게는 수의학적 사용을 위한, 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis ; Bt) 균주의 생존가능 포자를 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 방법 및 조성물은 응애 침입의 예방 및 치료, 특히 조류 종에 특히 영향을 미치는 더마니소스 갈리내(Dermanyssus gallinae)(가금류 붉은 응애)에 의해 생성된 침입의 제어 및 감소와 같이, 체외기생충에 의해 생성된 응애 침입을 제어 또는 감소시키기 위한 것이다.

응애는 작은 무척추동물로, 그 대부분은 자유롭게 생활하지만 일부는 기생한다. 동물에 감염하여 기생하는 응애는 침입 및/또는 감염을 일으키고 인간이 아닌 동물에게 막대한 손실을 준다. 응애는 매우 다양하며 그 분류가 매우 복잡하다. 예를 들어, 응애(mites)와 진드기(ticks)는 곤충(Insecta 클래스)과 별도로 분류된다. 그러나, 응애와 진드기는 완전히 다른 생물학적 특성을 가지고 있다.

동물 응애는 중요한 유형의 피부 질환을 유발하고, 일부 응애는 다른 기관에 감염된다. 응애는 피부의 표재층과 같은 동물 신체의 다른 부분들을 감염시킬 수 있는데, 각질층의 죽은 세포에 감염하는 응애, 예를 들어 Psoroptes ovis ; 숙주의 모낭에 감염하는 응애, 예를 들어, Demodex가 있고; 또는 소위 흡혈 응애, 예를 들어 Dermanyssus gallinae와 같이, 짧은 기간 먹이를 먹는 동안 숙주를 감염시킬 수 있으며; 다른 응애들은 예를 들어, Cytodites nudus 등과 같이, 새의 폐 및 기낭 또는 포유류의 폐에 침입하는 데 적응한 응애들도 있다.

외부기생 응애(ectoparasitic mite)인, Varroa destructor Ander및 Trueman(이전에는 Varroa jacobsoni Oudemans라고 언급됨)는 꿀벌 Apis mellifera L.의 심각한 해충이다. 이 헤모림프를 먹는 응애는 성충과 유충을 약화시킬 뿐만 아니라 바로병에서 바이러스 감염의 매개체 및 유도자 역할을 하여, 전 세계적으로 꿀벌 개체군에 심각한 피해를 준다(Ball & Allen 1988). 심각하고 전 세계적인 침입을 일으키는 또 다른 중요한 병리학적 응애는 소위 "붉은 응애", "가금류 붉은 응애" 또는 Dermanyssus gallinae( D. gallinae )이다. 붉은 응애 감염과 관련된 우려의 첫 번째 원인은 유럽에서 이 질병의 유병률이 급격히 높고 증가하고 있다는 것이다. 최근 역학 조사에 따르면 유럽 농장의 83%가 D. gallinae에 감염되었다. 이 유병률은 네덜란드, 독일 및 벨기에에서 94%에 이른다. 가금류 붉은 응애 감염은 뒤뜰 또는 유기농 농장에서부터 더 집중적이고 강화된 케이지 또는 헛간 시스템에 이르기까지 모든 생산 유형에 영향을 미친다. 가금류 붉은 응애 감염의 영향은 지난 수십 년 동안 유럽에서 증가해 왔으며 앞으로 더욱 증가할 것으로 예상된다.

이러한 증가에 기여한 첫 번째 요인 중 하나는 EU 회원국의 산란계 축산 시스템의 최근의 변화이다. 계란 생산 및 계란 무역에 관한 지침 1999/74/EC는 2012년부터 가금류 새에 대한 전통적인 케이지의 사용을 금지했다. 산란계의 복지를 개선하기 위해 고안되었지만, 이 법안은 결과적으로, 응애 증식을 촉진하고 붉은 응애 침입 문제를 악화시키는 것으로 보이는, 더 복잡한 환경을 통합하는 축사 시스템으로 전환하는 결과를 낳게 되었다. 예를 들어, 강화 케이지는 붉은 응애가 효과적인 치료를 피하기 위해 훨씬 더 많은 은신처를 제공한다. 응애 감염률은 다른 새장에 비해 전통적인 케이지 시스템에서 사육되는 암탉에서 훨씬 낮은 것으로 설명되었다. 2009년에, 종래 케이지의 첫 금지 전(오스트리아와 독일은 2010년부터 그러한 케이지를 금지함), 유럽 연합에서 산란계 사육 시스템의 74.4%가 여전히 종래의 케이지로 이루어져 있었다. 2013년에는, 모든 회원국이 종래의 케이지에서 강화된 케이지, 축사 시스템 및 방목 사육 시스템(free range housing systems)으로의 전환 과정을 완료할 수 있었는데, 이는 2009년 이후 4년 이내에 대부분의 산란계가 응애 증식에 불리한 시스템에서 이를 선호하는 시스템으로 전환되었음을 의미한다.

미래에 붉은 응애 침입의 확산에 유리할 것으로 예상되는 또 다른 환경 요인은 기후 온난화이다. 극단적인 기상 현상 동안, 붉은 응애의 증가된 개체수는 2003년 여름 폭염 동안 수많은 암탉의 죽음에 연루되었다.

마지막으로, 안전성에 대한 관심과 새로운 효과적인 방제 방법의 지속적인 부족으로 인해 국내 시장에서 여러 화학 살비제 제품이 제거되었고 이로 인해 유럽에서 D. gallinae 유행이 악화되었을 수 있다. 따라서, 응애 침입을 방제하거나 감소시키기 위한, 특히 Dermanyssus gallinae(가금류 붉은 응애)에 의해 야기되는 응애 침입을 방제 또는 감소시키기 위한 방법 및 조성물을 제공할 필요가 있다.

이러한 의미에서, D. gallinae의 방제를 위한 다양한 가능한 전략을 설명하는 리뷰가 Chauve C. et al., 1998, The poultry red mite Dermanyssus gallinae(De Geer, 1778): current situation and future prospects for control. Vet. Parasitol. 79(1998) 239-248에 기술되었다. Chauve et al.에 따르면, 몇몇 B. thuringiensis 균주는 나비목 및 일부 쌍룡류 해충에 대한 살충 활성을 보였다. 그러나, 이 문서에 따르면, 척추동물에서 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis)의 사용은 세포 수준에서의 독성으로 인해 절충된다.

Bacillus thuringiensis는 호기성, 포자 형성, 그람 양성 및 곤충 병원성 박테리아이다. B. thuringiensis 종은 일반적으로 계통 발생 및 혈청형 특징에 따라 분류되는 다양한 아종의 대과로 이루어진다(예: B. thuringiensis subsp . kurstaki, B. thuringiensis subsp. aizawai 등).

B. thuringiensis는 농업에서 빠르게 작용하는 숙주-특이적 생물 살충제로 잘 알려져 있다.

최신 기술, 예를 들어, 최근 리뷰 기사 Zhen et al., Comparative genomics of Bacillus thuringiensis reveals a path to specialized exploitation of multiple invertebrate hosts, American Society for Microbiology, 2017, 8(4)를 참조하면, 기본적으로 B. thuringiensis의 독성은 박테리아에 의해 생성되는 다양한 독소에 기인하며, 그 독소는 곤충 및 기타 무척추 동물을 표적으로 삼는데 중요한 역할을 하는 것으로 상기 문헌에 설명되어 있다. 상기 독소 중 살충 Cry 단백질, 식물성 살충 단백질(Vip) 독소 및 세포독소(Cyt) 단백질이 포함된다.

B. thuringiensis에서 확인된 독소는 지속적으로 업데이트되고 있다. 예를 들어 www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/를 참조하라. 다양한 곤충병원성 단백질성 독소를 코딩하는 900개 이상의 독소 유전자가 세계의 여러 지역에서 분리된 B. thuringiensis 균주에서 확인 및 특성화되었다.

위 독소 외에도, B. thuringiensis는 키티나제(효소 단백질) 및 메탈로프로테이나제와 같은 독성 효과를 나타내는 다른 화합물을 생성한다. B. thuringiensis는 또한 열안정성 2차 대사산물인 투린지엔신(thuringiensin)(Thu, beta-exotoxin 또는 β-exotoxin) 과 같은 다른 독성 화합물을 분비한다.

Torres, EC et al., 2018. Actividad acaricida de Bacillus thuringiensis sobre el acaro rojo de las aves, Dermanyssus gallinae. Rev. Vet 29(2): 128-132, 2018에서는 Bacillus thuringiensis 아종 kurstaki(Btk)가 접촉 생물 검정법을 사용하여 가금 붉은 응애 유충에 미치는 영향을 평가한다. Torres 등은 연구에서 상용 제품인 Dipel®을 사용했다. Dipel®의 상업 라벨에 따르면, 해당 제품의 사용으로 얻은 살충 활성은 B. thuringiensis 아종 kurstaki의 4가지 단백질(B. thuringiensis의 아종 kurstaki에 의해 생성된 Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac 및 Cry2 독소)에 기인한다. Cry, Cyt 및 Vip 단백질 함량을 기준으로, 각 균주는 나비목, 쌍제류 또는 딱정벌레류 해충과 같은 곤충 식물과, 식물과 동물 모두에 존재하는 응애 및 선충류와 같은 기타 무척추 동물에 대해 특이적으로 활성일 수 있다.

이미 언급했듯이, B. thuringiensis의 생리활성은 주로 투린지엔신(thuringiensin)과 포자주변 결정 단백질(또는 δ-endotoxins) Cry 독소에 기인한다. 이러한 Cry 단백질은 나비목, 딱정벌레류 및 복목류와 같은 다양한 해충에 유독하다. 이 결정은 B. thuringiensis의 전체 세포 단백질의 약 30%를 구성하는 것으로 추정된다(Den DH et al., 1984).

따라서, 위에서 설명한 바와 같이, 상기 문헌은 특히 농업에서 해충을 치료하기 위해 앞서 언급한 독소의 독성에 주로 초점을 맞추고 있다.

그러나, 이용가능한 동물 응애에 대한 B. thuringiensis의 효과에 관한 최신 기술 지식은 부족하다. 시험관 내 및 생체 내 연구는 동물 응애에 대한 B. thuringiensis 균주의 생물 활성은 고사하고 동물에 대한 B. thuringiensis의 살비제(acaricidal) 활성 조차도 보고한 경우가 거의 없다.

현재, 글로벌 마켓에서 수의학 실습에 응애 침입을 통제하기 위한 승인된 B. thuringiensis 제품은 없다. 방제에는 폭심(phoxim), 아베멕틴(abermectins), 피레스로이드(pyrethroids), 아미트라즈(amitraz) 및 기타 화학 물질과 같은 합성 살비제의 사용이 지배적이며, 여기에는 저항성 문제와 처치 실패가 널리 보고되었다. 따라서, 가금류의 D. gallinae와 같은 동물 생산에서 응애 침입을 제어하기 위해서는 보다 안전하고 효과적인 방제 조치가 필요하다.

결론적으로, 응애, 특히 가금류 응애를 방제하면서 동물이나 인간에게 해를 끼치지 않는 문제에 대한 해결책을 찾는 것이 여전히 당업계에 필요하다. 인간이 아닌 동물에서의 침입/해충을 대량 방제하기 위한 대안으로서 유해한 화학 살충제를 대체하는 환경 친화적인 미생물 살충제를 사용하는 것은 그 문제에 대한 유리하고 새로운 해결책을 제공한다. 이와 관련하여, 본 출원은 B. thuringiensis가 신규의 가치있는 살충제 조성물의 생산에 적합하고 비인간 동물 생산에서 이러한 유형의 침입/해충의 생물학적 방제를 위한 유망한 대안임을 최초로 보여준다.

도 1은 실시예 1에 예시된 5가지 상이한 제형(제형 1 내지 5)에 대한 24시간에서의 평균 응애 사멸율을 나타낸다. 24시간에서 응애 사멸율의 평균 백분율은 세로축으로 표시되며, 다른 제형에 대해서는 가로축으로 표시된다.
도 2는 실시예 2에 예시된 3가지 상이한 제형(제형 1 내지 3)에 대한 24시간 및 48시간에서의 평균 응애 사멸율을 나타낸다. 응애 사멸의 평균 백분율은 24시간 및 48시간에 세로 좌표로 표시되며, 다른 제형에 대해서는 가로 좌표로 표시된다.
도 3은 실시예 3에 예시된 9개의 상이한 그룹(그룹 1 내지 9)에 대한 24시간 및 48시간에서의 평균 응애 사멸율을 나타낸다. 응애 사멸율의 평균 백분율은 세로축으로 9개의 다른 그룹에 대한 24시간 및 48시간에서 가로축으로 표시된다.
도 4는 실시예 5에 예시된 6가지 상이한 제형(제형 1 내지 6)에 대한 24시간 및 48시간에서의 평균 응애 사멸율을 나타낸다. 응애 사멸율의 평균 백분율은 세로축으로, 6개의 다른 제형에 대해 24시간 및 48시간에서의 평균 백분율은 가로축으로 표시된다.

정의

다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 출원 당시 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그러나, 잠재적으로 모호한 경우, 본원에 제공된 정의가 다른 정의보다 우선한다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수 형태도 포함해야 한다.

본 개시에서, "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "함유하는(containing)" 및 "가지는(having)" 등은 유럽 및 미국 특허법에서 부여된 의미를 가질 수 있고, "포함하다(includes)", "포함하는(including)" 등을 의미할 수 있으며; "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)" 또는 "본질적으로 구성된다(consists essentially)"는 마찬가지로 유럽 및 미국 특허법에 부여된 의미를 가지며, 인용된 사항의 기초적 또는 신규한 특성들이 인용된 사항 이상의 존재에 의해 변경되지 않는 한, 인용된 사항 이상의 존재를 허용하는, 개방형의 용어이며, 단 선행 기술 실시예는 제외된다.

"접촉하는(contacting)"은 터치하거나, 연관되거나, 조성물에 근접함을 의미한다. 이러한 조성물은 배딩(bathing), 분무, 붓기, 페인팅, 분사, 침지 및/또는 더스팅에 의해 제한없이 적용가능하다.

응애 침입의 "방제 또는 감소", "방제 또는 감소에 적합" 또는 "방제 또는 감소를 위한"은 응애 생존을 억제 또는 차단하거나 응애 개체군의 성장을 감소, 감속 또는 안정화함을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 응애는 애벌레(juvenile) 발달, 유충 단계 및 성충 단계와 같이 당업자에게 공지된 수명 주기의 모든 단계일 수 있다.

"생물학적 기능"은 유기체의 생리학적 또는 거동적 활동을 의미한다. 예시적인 생물학적 기능은 제한 없이 생식, 호흡, 신경 활동, 운동을 포함한다.

"유효량"은 동물의 응애 침입을 예방하거나 치료하기 위해, 즉 동물 및/또는 동물의 환경(예: 케이지, 장소, 매개물(fomites) 등)의 기생충 수를 경감 또는 감소시키기 위해, 및/또는 예를 들어, 응애 개체수를 제어 및/또는 감소함으로써, 동물의 응애 감염 발병을 전체적으로 또는 부분적으로 억제하기 위해, 단일 용량으로 또는 일련의 용량의 일부로서 요구되는 유효한 양을 의미한다. 유효량 또는 유효 용량은 또한, 이러한 질병의 치료 또는 예방을 위해, 동물에서 2차 감염의 중증도 또는 질병 발생을 제어 및/또는 감소시킬 수 있다. 이 양은 개체의 물리적 상태를 비롯한 다양한 요인에 따라 달라지며, 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 여하튼, 유효량은 바람직하게는 본 발명의 조성물을 투여하기 전 및 후에, 동물 및/또는 매개물에 대한 응애 수의 관찰 또는 검출에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 예를 들어, 응애 수는 첫 투여 후, 10% 내지 100%, 바람직하게는 50% 초과, 보다 바람직하게는 70% 초과, 보다 더 바람직하게는 80% 초과, 보다 더 바람직하게는 90% 초과, 보다 더 바람직하게는 95% 초과, 및 훨씬 더 바람직하게는 99% 초과로 감소한다. 유효량에 영향을 미치는 요인은, 예를 들어 치료할 기생충 종 및 기생충의 발달 단계, 유형(예: 종 및 품종), 연령, 크기, 성별, 식단, 활동 및 감염된 동물의 상태; 온도, 습도와 같은 환경 조건을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물의 바람직한 유효량은 다양할 수 있다.

"침입"은 해충에 의한 장소의 점령 또는 살아있는 유기체의 기생을 의미한다. 매개물(박테리아, 바이러스 또는 기생충과 같은 감염원으로 오염되었을 때 질병을 새로운 숙주로 옮길 수 있는 무생물체)의 군집화도 본 발명의 맥락에 포함된다. 해충은 동물, 박테리아, 기생충, 바이러스, 식물 또는 곰팡이 여부에 관계없이, 식물이나 동물, 인간 또는 인간의 영역(concerns), 가축 또는 인간 구조에 침입하거나 문제를 일으키는 모든 살아있는 유기체이다. 해충으로서 가장 중요한 동물 그룹(경제적으로 중요한 순서대로)은 곤충, 응애, 선충류 및 복족류이다. 이러한 침입은, 어떤 경우에는, 개체 또는 숙주의 감염, 건강 상태 심화(exacerbating) 및/또는 악화, 및/또는 이러한 개체의 질병 유발을 유도할 수 있다. D. gallinae 감염과 암탉 사멸율 사이에는 연관관계가 있다(Cosoroaba I., 2001. Massive gallinae invasion in battery-husbandry raised fowls. Rev. Med . Vet. Toulouse 152:89-96).

"응애"는 포유류, 어류, 곤충(예: 벌) 및 조류 종, 특히 가금류 동물과 같은 척추동물 및 무척추 동물에 감염되는 거미류(arachnid) 기생충을 의미한다. 상업적으로 중요한 가금류 응애의 예는 다음과 같다. Dermanyssus sp , Ornithonyssus sp , Allopsoroptoides galli , Neocnemidocoptes gallinae , Knemidocoptes mutans , Laminosioptes cysticola , Megninia cubitalis , Megninia ginglymura , Pterolichus obtus, Syringophilus bipectinatus , Columbiphilus polonica , Deroglyphus elongates 및 Gaudoglyphus minor.

본 발명의 맥락에서, 응애는 애벌레기 발달, 유충 단계 및 성충 단계와 같이 당업자에게 공지된 수명 주기의 모든 단계일 수 있다.

"Dermanyssus Gallinae"는 "닭 응애", "빨간 응애" 또는 "거류 응애"라고도 알려진 "가금류 붉은 응애"로도 이해된다. 길이 약 1.5mm의 작은 체외 기생 응애이며, 먹이 상태에 따라 회색에서 갈색/빨간색까지 색이 다양하다. 알을 제외하고, 가금류 붉은 응애는 유충, 전약충(protonymph), 후약충(deutonymph) 및 성충의 4가지 생애주기 단계를 거친다. 유충은 다리가 6개로 부화하고 먹이를 먹지 않는다. 첫 번째 털갈이 후 약충 단계와 성충 모두 8개의 다리를 갖는다. 전약충, 후약충 및 성체 암컷은 일상적으로 숙주의 피를 먹지만, 수컷은 가끔씩만 먹는다. 붉은 응애는 일단 숙주에 들어가면 2~4일마다 한 시간 정도의 짧은 기간동안 먹이를 먹으며 일반적으로 예외적이지는 않지만 어둠의 기간동안 먹이를 먹는다. Dermanyssus gallinae는 알에서 1개의 유충 단계와 2개의 약충 단계를 거쳐 성충으로, 일반적으로 2주에 걸쳐 완전한 발달이 일어난다. Dermanyssus gallinae의 밀도는 일반적으로 케이지 시스템에서 조류당 최대 50,000 응애에 도달하지만 심한 경우 조류당 500,000 응애에 도달할 수 있다. D. gallinae는 일년 내내 존재할 수 있지만, 덥고 습한 계절에 가장 밀도가 높다. D. gallinae는 전 세계적으로 발견되며 온대 지역의 따뜻한 지역에서 특히 심각하다. 일시적인 절지동물로 간주되는 외부기생 응애로서, 이는 그 숙주에서 먹이를 먹지만 숙주에서 영구적으로 살지는 않기 때문이다. 그러나, 대부분의 성체 시기를 그러한 숙주 환경에서 생활하며 보낸다. 응애는 먹이를 먹기 위해서만 숙주에 머물며 알을 낳기 위해 이웃한 크랙과 틈으로 이동한다. 응애는 배터리 케이지와 바닥 시스템 모두에서 발생한다. 그러나, 문제는 동물 복지 문제로 인해 유럽에서 확립된 바닥과 "강화" 케이지 시스템에서 더 일반적이고 널리 퍼져 있다는 것인데, 이는 응애에 적합한 수많은 은신처를 제공하기 때문이다. Dermanyssus Gallinae와 같은 일시적인 기생충의 방제는 숙주 동물과 환경 모두에 존재할 수 있기 때문에 특히 어렵다.

"응애 살충제"는 응애의 생물학적 기능에 대해 해로운 영향을 유발하는 살충 활성을 갖는 제제를 의미한다. 그 효과는, 예를 들어 살란(ovicidal), 살유충 및/또는 살성충 또는 이들의 조합일 수 있다.

“살응애 활성”은 응애 또는 다른 진드기과의 성장, 번식 또는 생존을 억제, 차단, 정지 및/또는 감소시키는 임의의 활성을 의미한다. 그 효과는, 예를 들어 살란, 살유충 및/또는 살성충 또는 이들의 조합일 수 있다.

응애 침입을 "예방하는", "예방하다", 또는 "예방"은 숙주에 침입 이전에 숙주에 침입할 수 있는 성충 기생충 및/또는 모든 발단 단계/유충 단계의 개체를 죽임으로써, 응애가 이전에 치료된 동물에 침입했을 때 응애를 죽이거나 억제함으로써, 또는 응애의 자손 생성 방지, 예를 들어 산란된 알의 수 및/또는 부화율을 감소시킴으로써, 응애 침입이 현장에서 확립될 위험을 감소, 축소, 또는 개선하는 것을 의미하지만 이에 국한되지 않다. 더 나아가, 이는 해충, 바람직하게는 응애 침입에 의해 유발되는 역효과에 대해 동물을 예방 및/또는 보호하는 것을 의미한다. 이 효과는, 예를 들어, 살란, 살유충 및/또는 살성충 또는 이들의 조합일 수 있다. 그 효과는 직접적으로, 즉 예를 들어 알을 파괴함으로써 즉시 또는 일정 시간 경과 후에 응애를 죽이거나, 또는 간접적으로, 예를 들어 산란된 알의 수 및/또는 부화율을 감소시킴으로써 나타날 수 있다.

응애 침입을 "치료하다", "치료하기 위한" 또는 "치료"한다는 것은 숙주의 침입 이전에 숙주에 침입할 수 있는 성충 기생충 및/또는 모든 발단 단계/유충 단계의 개체를 죽임으로써, 응애가 이전에 치료된 동물에 침입했을 때 응애를 죽이거나 억제함으로써, 현장에서 응애 개체군의 성장을 억제, 제한, 감소, 안정화 또는 감속하는 것을 의미하지만, 이에 국한되지는 않는다. 더 나아가, 이는 해충, 바람직하게는 응애 침입에 의해 유발되는, 기존 증상, 임상 신호, 장애, 상태 및/또는 질병과 같은 역효과에 대해 동물을 예방 및/또는 보호하는 것을 의미한다. 이 효과는, 예를 들어, 살란, 살유충 및/또는 살성충 또는 이들의 조합일 수 있다. 그 효과는 직접적으로, 즉 예를 들어 알을 파괴함으로써 즉시 또는 일정 시간 경과 후에 응애를 죽이거나, 또는 간접적으로, 예를 들어 산란된 알의 수 및/또는 부화율을 감소시킴으로써 나타날 수 있다.

"의약" 또는 "의약 제품"은 광범위하게 허용되는, 인간을 포함한 동물의 질병을 치유, 치료 또는 예방하는데 사용되는 모든 약학적 또는 수의학적 조성물(의약, 약물 또는 단순히 약이라고도 함)을 의미한다. 약은 다양한 방식으로 분류된다. 한 가지 주요 구별점은 일반적으로 화학 합성에서 파생되는 전통적인 소분자 약물과 생물 또는 생물 의약품(여기에는 살아 있거나 사멸된 미생물, 재조합 단백질, 백신, 치료용으로 사용되는 혈액 제제(IVIG 등), 유전자 요법, 단일클론 항체 및 세포 요법(예: 줄기 세포 요법)을 포함함)이다. 본 발명에서 의약은 바람직하게는 수의학적 의약이고, 더욱 더 바람직하게는 동물 및/또는 매개물에서 수의학적 사용을 위한 조성물이다.

"약학적 조성물"은 예방 및/또는 치료 용도를 위한 최종 의약품을 제조하기 위한 활성 물질 또는 활성 물질의 조합을 의미한다. 본 발명에서 의약 또는 의약 제품은 바람직하게는 수의학적 의약이고, 더욱 더 바람직하게는 수의학적 사용을 위한 약학적 조성물이다. 약학적 조성물은 동물에 직접 적용되거나 동물이 위치한 환경에 간접적으로 적용될 수 있다.

“약학적으로 허용되는"은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 물질이 아닌 물질을 의미하는데, 즉, 이 물질은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나 유해한 방식으로 조성물 내 임의의 성분과 상호작용하지 않으면서 본 발명의 조성물과 함께 개체에 투여될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약학적으로 허용되는 담체" 및 "약학적으로 허용되는 비히클"은 상호교환가능하며, 부작용 없이 개체 및/또는 환경에 투여될 수 있는 약학적 조성물의 활성 물질을 함유하기 위한 비히클을 의미한다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 멸균수, 정제수, 식염수, 글루코오스, 덱스트로스, 또는 완충 용액을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 담체는 희석제, 안정화제, 방부제, 습윤제, 분산제, 유화제, pH 완충제(예: 인산염 완충제), 점도 첨가제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 보조제를 포함할 수 있다.

"살생물제 조성물"은 화학적 또는 생물학적 용어로 유해한 임의의 유기체를 파괴, 억제, 무해하게 만들거나 제어 효과를 발휘하도록 의도된 화학 물질, 유기체 또는 미생물을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 살생물제 조성물은 살아있는 유기체를 지칭하거나, 또는 미생물과 같은 살아있는 유기체에 의해, 바람직하게는 박테리아 미생물에 의해, 더 바람직하게는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)에 의해 자연적으로 생성된 화합물을 지칭한다. 살생물제 조성물은 살충제, 소독제, 방부제 및 살충제를 포함하여, 인간 또는 동물의 건강에 해롭거나 천연 또는 제조된 제품에 손상을 일으키는 살아있는 유기체의 방제에 사용되는 유해 물질의 다양한 그룹을 포괄할 수 있다. 살생물제 제품은 하나 이상의 살생물제 활성 물질을 함유할 수 있으며 최종 살생물제 제품의 원하는 pH, 점도, 색상, 냄새 등 뿐만 아니라 효과를 보장하는 기타 비활성 공-제형제를 함유할 수 있다. 살생물제 조성물은 동물에 직접 적용하거나 동물이 위치한 환경에 간접적으로 적용할 수 있다.

"박테리아 제제"는 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 세균 배양물, 세균 배양물의 일부 또는 후처리된 세균 배양물을 포함하는 제제를 의미한다. 박테리아 제제는 하나의 고유한 균주의 박테리아 또는 동일한 박테리아의 하나 이상의 균주를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 박테리아 제제는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 이의 아종 중 하나 이상의 종의 박테리아를 포함할 수 있다.

"활성 성분" 또는 "활성 물질"은 생물학적으로 활성인 약학적 조성물 또는 살생물제 조성물의 성분 및/또는 물질을 의미한다.

"보조제" 또는 "허용가능한 보조제"는 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 활성 물질과 함께 투여되어 면역학적 반응을 보다 효과적으로 만드는, 면역계의 비-비특이적 자극제로서 이해된다. 보조제의 몇 가지 예는 다음과 같다: 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 산화알루미늄, 무라밀 디펩티드, 비타민 E, 스쿠알란, 스쿠알렌, 진생, 자이모산, 글루칸, 디메틸아미노에틸-덱스트란, 덱스트란, 비이온성 블록 중합체, 모노포스포릴 지질 A, 식물성 기름, 사포닌, 완전 프로인트 보조제, 불완전 프로인트 보조제, W/O, O/W, W/O/W 유형 에멀젼 및 이들의 혼합물. 또한, 제초제, 살충제, 살진균제, 응애 구충제(miticide) 및 원치 않는 해충을 방제하거나 제거하는 기타 약제와 같은 살충제 및/또는 살생물제의 표적 유기체에 대한 효과를 향상시키고/거나 이를 침투, 표적화 또는 보호하는 능력을 개선하는 데 사용되는 성분(예: 안정화제, 방부제 및/또는 착색제)으로 이해된다.

"개체"란 개별체를 의미한다. 한 측면에서, 개체는 인간을 포함하는 영장류와 같은 포유동물이다. 또 다른 측면에서, 포유동물은 특히 마모셋, 원숭이, 침팬지, 고릴라, 오랑우탄 및 긴팔 원숭이와 같은 비인간 영장류이다. "개체"라는 용어에는 고양이, 개 등과 같은 가축도 포함된다. 예를 들어 소, 말, 돼지, 양, 염소 등과 같은 가축; 실험 동물, 예를 들어 흰 족제비, 친칠라, 마우스, 토끼, 쥐, 저빌, 기니피그 등; 및 닭, 칠면조, 오리, 꿩, 비둘기, 비둘기, 패롯, 코카투스, 거위 등과 같은 조류 종을 포함한다. 개체는 또한 물고기(예: 제브라피쉬, 금붕어, 틸라피아, 연어 및 송어), 양서류 및 파충류를 포함할 수 있지만 이에 국한되지 않다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "개체"는 "환자" 또는 "숙주" 또는 "영향을 받는 피험자"와 동일하고, 이들 용어는 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "조류", "조류 종", "조류 개체" 또는 "조류 숙주"는 응애 감염 및/또는 침입, 바람직하게는 D. Gallinae 감염 또는 침입이 쉽거나 민감한 모든 조류 종을 포함한다. 본 발명에 포함되는 조류 종은, 예를 들어 가금류 또는 가금류 동물로 집합적으로 알려진 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 이러한 용어는 예를 들어, 닭, 칠면조, 꿩, 거위 및/또는 오리 종과 같은 가축 또는 사냥감 새 종을 포함하도록 확장된다. 한 실시양태에서, 용어 "조류", "조류 종", "조류 개체" 또는 "조류 숙주"는 가금류와 같은 상업적으로 중요하거나 사육되는 조류 종으로 확장된다.

"산란 암탉" 또는 "레이어"는 주로 알을 낳기 위해 사육되는 성체 암컷 닭(Gallus domesticus )을 의미한다. 이러한 알은 일반적으로 식용으로 사용된다. 본 발명에서 "산란 암탉"이라는 용어는 미래의 산란계가 부화할 알을 생산하기 위해 보관되는 종축(breeding stocks)을 포함한다.

"브로일러"는 육류 생산을 위해 특별히 사육되고 길러지는 가금류를 의미한다.

“동물이 사육되는 장소(premises)"는 암탉을 낳기 위한 케이지 또는 육계를 위한 가금류 축사와 같이, 동물이 영구적으로 또는 일시적으로 그러한 장소에 수용되어, 제한된 시간(일시적으로 방목하는 암탉을 위한 마구간과 같은)으로 또는 영구적으로 그러한 장소에 접근할 수 있는 장소를 의미한다.

본 발명의 맥락에서, "비포자 단백질" 또는 "비포자성 단백질"이라는 용어는 무엇보다도 포자주변 결정 단백질(parasporal crystal protein)을 포함하여, 포자 코트에 의해 또한 일반적으로 엑소스포리움에 의해 둘러싸여 있지 않은, 식물성 Bacillus thuringiensis 세포에 의해 합성된 단백질 세트를 지칭한다. 엑소스포리움(exosporium)는 성숙 포자의 외부 층이며 포자와 그 상호 작용하는 환경 또는 숙주 사이의 경계를 정의한다. 병원체의 경우, 이러한 상호 작용에는 숙주의 면역계 세포와 포자가 처음으로 접촉하는 지점이 포함된다. 결정 단백질은 일반적으로 엑소스포리움 외부에 위치하지만, 일부 Bacillus thuringiensis 균주의 경우 엑소스포리움이 결정 단백질을 삼킬 수 있는 소수의 경우가 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 엑소스포리움 외부 또는 내부의 위치와 무관하게 포자주변 결정 단백질은 비포자 단백질로 간주된다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "포자주변 결정 단백질"은 식물성 바실러스 투린지엔시스 박테리아에 의해 합성되는 델타(δ)-내독소, 단백질 Cry 및 Cyt로 이해된다. 이 단백질 그룹은 포자 형성 과정에서 응집하여 결정체로 알려진 결정체 내포물을 형성하며, 결정체는 결정체와 동일한 유형의 단백질로 형성되지만 다른 형태를 가진 코트로 둘러싸여 있다. 결정질 단백질 또는 내포물은 프로톡신으로 알려진 단일 또는 다중 폴리펩티드로 주로 구성된다. 식충성(entomophatogenic) 균주 바실러스 투린지엔시스는 하나 이상의 결정성 내포물, 즉 포자주변 결정 단백질을 형성하는 능력이 있다.

델타-내독소의 전체 목록은 예를 들어, http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/에서 확인할 수 있다.(Crickmore et al., 1998, 2016).

본 발명의 맥락에서, 용어 "생존가능 박테리아 포자"는 유리한 환경 변화를 수동적으로 검출하고 발아하여 생리학적으로 활성인 식물성 세포를 생성하는 능력을 갖는 바실러스 투린지엔시스 포자로 이해된다. 이에 반해, 용어 "생존불능 포자"란 조건이 좋아도 발아할 수 없는 포자를 지칭한다. 생존가능 박테리아 포자의 수는 생존 세포 수를 기반으로 하는, 잘 알려진 1 ml당 콜로니 형성 단위(Colony Forming Units per ml; CFU/ml) 기술과 같은 표준 미생물 기술에 의해 결정될 수 있다(Goldman, Emanuel; Green, Lorrence H. Practical Handbook of Microbiology. 3^rd Edition, published 4 June, 2015; Chapter 2. Quantification of Microorganisms. Page 19, Plate Count Method by Peter S. Lee, page 24. CRC Press, 1055 pages. ISBN 978146658739). 콜로니 계산은 일반적으로 펜과 클릭 카운터를 사용하여 수동으로 수행된다. 대안적으로, 반자동(소프트웨어) 및 자동(하드웨어 + 소프트웨어)을 사용할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 농장에서 분리된 B. thurigiensis(Bt)의 생존가능 박테리아 포자가 바람직하고; 가금류 농장에서 분리된 Bt 생존가능 포자가 더 바람직하며, 응애 감염 정도가 낮거나 높은 가금류 농장에서 분리된 Bt 생존가능 포자가 보다 더 바람직하고, 가장 바람직한 것은 응애 감염 정도는 낮지만 최종적으로 Dermanyssus gallinae 응애의 높은 감염률을 초래하는 유리한 조건을 가진 가금류 농장에서 분리된 Bt 생존가능 포자이다.

본 발명의 맥락에서, 바실러스 투린지엔시스의 "비결정성" 균주라는 용어는 Cry 단백질이 없는 게놈(염색체 및 플라스미드 DNA)을 갖는 균주를 의미한다. Cry 단백질의 부재는 InstaGene^TM Matrix, 전체 게놈 시퀀싱과 같은 표준 방법을 사용하여 B. thurigiensis 균주에서 DNA 추출을 수행한 후 http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt(Crickmore et al ., 1998, 2016)와 같이 잘 알려진 게놈 데이터베이스에서 Cry 단백질과 일치하는 항목이 있는지 여부를 확인하여 평가할 수 있다. 이 데이터베이스에는 완전한 Cry 유전자 또는 Cry 단백질과 부분적으로 상동성이 있는 유전자가 포함되어 있다. B. thuringiensis의 비결정성 균주는 해당 유전자(전체 또는 부분 서열)와 어느 정도의 상동성인 Cry 유전자가 없어야 한다. 따라서, 비결정성 B. thuringiensis 균주에서는 이러한 데이터베이스에서 결과(설명된 Cry 단백질의 전체 또는 일부)를 검색할 수 없다.

B. thuringiensis 균주의 전체 게놈 시퀀싱은 Illumina HiSeq 플랫폼과 같은 표준 방법을 사용하여 수행할 수도 있다. 서열들은 CLC Genomic Workbench(CLC Bio, 덴마크)와 같은 소프트웨어 도구를 사용하여 조립될 수 있다. 판독은 일반적으로 극단치; 낮은 품질이 판독치, 및 30개 미만의 염기쌍을 갖는 판독치를 제거하기 위해 트리밍된다. 결과적으로, 수득된 판독치는 노보(novo)를 콘티그(contigs)로 어셈블된다. 획득된 콘티그는 기준 서열과 짝을 이루는 정렬된 서열 및 이와 95% 이상의 상동성을 갖는 서열과 95% 이상의 렉쳐를 포함한다. 콘티그 구성 후, 렉쳐는 콘티그에 다시 할당된다. 얻어진 콘티그는 http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt(Crickmore et al., 1998, 2016)에서 이용가능한 것과 같은 Bacillus thuringiensis 독소의 아미노산 서열로 만들어진 데이터베이스를 사용하여 BLAST(Altschul et al., 1990) 로 분석된다. BLAST는 이 데이터베이스의 사용에 제한되지 않고, 통상의 기술자에게 알려진 다른 사용가능한 데이터베이스의 사용도 포함할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "돌연변이 단백질" 또는 "돌연변이 독소"는 비-침묵 돌연변이를 갖는 유전자에 의해 코딩되는 단백질 생성물로 이해된다. 돌연변이 단백질은 단일 아미노산 변화(사소하지만 여전히 많은 경우 질병으로 이어지는 상당한 변화), 또는 예를 들어, 조기성숙 종결 코돈 도입 후 C-말단의 절단과 같은 광범위한 아미노산 변화를 포함할 수 있다.

상세한 설명

본 발명의 저자는 놀랍게도 D. gallinae 응애와 같은 응애의 사멸율에 대한 다양한 Bacillus thuringiensis(Bt) 균주의 활성이 주로 유효량의 박테리아 생존가능 포자의 존재와 관련이 있으며, 포자주변 결정 단백질 및/또는 상기 Bt 균주에 의해 생성되는 기타 독소와 같은 비포자 단백질의 존재와는 무관하다는 것을 발견하였다. 우리가 아는 한, 이러한 활성이 생존가능 박테리아 포자와 명확하게 연결되어 있고 상기 Bt 균주에 의해 생성된 포자주변 결정 단백질과 같은 비포자 단백질에 대해서는 주로 연관되지 않다는 사실은 최초로 밝혀진 것이다.

현재의 이러한 발견을 뒷받침하는 실험적 증거는 명세서의 실시예를 통해 찾을 수 있다. 이러한 의미에서, 실시예 1은 HIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz- Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany)에 수탁 번호 DSM 33175로 2019년 6월 20일에 기탁된 B. thuringiensis(GR -S5- 8)의 비결정성 균주를 보여주는데, 이는 포자 및 포자주변 결정 단백질을 모두 포함하는 제형(제형 2)보다 83% 더 높은 사멸율을 제공(제형 3)하면서, 포자주변 결정 단백질을 전혀 생성하지 않는다. 또한, 이 실시예에서, 정제된 생존가능 포자로 농축된 실험 제형 4가 다른 제형보다 더 증가된 활성을 가지며, 67%의 응애 사멸율을 초래하는, 포자와 포자주변 결정 단백질을 모두 포함하는 정제되지 않은 제형 2와 비교할 때, D. gallinae 개체군을 더 많이 감소시키는 것(응애 사멸율 80%)으로 추가로 관찰되었다. 생존가능 포자가 풍부한 정제 제형이 포자주변 결정 단백질을 함유하는 조성물에서 관찰된 것보다 응애에 대한 사멸율에 대해 더 나은 활성을 가졌다는 것은 확실히 예상치 못한 일이었다. 또한, 생존가능 포자와 포자주변 결정 단백질이 열처리에 의해 불활성화되었을 때, 응애 사멸은 전혀 관찰되지 않았고(제형 5); 즉, 이는 생존가능 포자가 없는 포자주변 결정 단백질은 응애에 대한 활성을 나타내지 않음을 말하는 것이다. 본 발명자들이 아는 한, 항-D. gallinae 활성과 같은 항-응애 활성은 Bt 균주에 의해 생성된 포자주변 결정 단백질과 같은 비포자 단백질의 존재가 아니라 생존가능 Bt 포자와 명확하게 연결되어 있음이 최초로 밝혀졌다.

더 나아가, 실시예 3에서 보듯이, 실험 제형으로 후-처리한 후 24시간 및 48시간 모두에서, 조성물에 생존가능 포자가 덜 존재하면, D. gallinae의 응애 사멸율이 더 낮아지는 것으로 추가 관찰되었다. 마찬가지로, 생존가능 포자의 용량이 높을수록 조성물의 비포자 단백질 함량에 관계없이 사멸율이 더 높았다. 이러한 결과는 항-응애 활성을 생성하기 위한 생존가능 포자의 역할을 추가로 입증한다. 유사하게, 시험된 모든 Bt 균주는 3.1 × 10⁹생존가능 포자(CFU)/ml로 제형화될 때 상당한 사멸율을 가졌다. 특히, 기탁된 DSM 33035 Bt 균주, DE2-S2-8은 더 높은 정도의 항-응애 활성을 나타내어, 처리 후 48시간에서 66%의 사멸율을 보였다(그룹 9).

나아가, 예상외로, B. thuringiensis 제제와 미네랄 오일의 혼합물은 B. thuringiensis 균주의 생존력과 항-응애 활성에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 반대로, 실험 제형의 효과를 상당히 증가시켜 응애 사멸율에 대한 상승 효과를 가져왔다. 이러한 의미에서, 그리고 실시예 5에 나타낸 바와 같이, 미네랄 오일 및 3.1 × 10⁹생존가능 포자(CFU)/ml로 제조된 제형 3(그룹 3)은 단 48시간 만에 90% 이상의 응애 사멸율을 달성하였다. 미네랄 오일 제제에 블렌딩된 바실러스 투린지엔시스 제형의 혼합물이 실험 제형에 사용되는 바실러스 투린지엔시스 박테리아의 투여량을 감소시킬 수 있음이 추가로 관찰되었다. 예를 들어, 3.4 × 10⁸ 생존가능 포자(CFU)/ml(그룹 1)의 용량으로 제형화된 미네랄 오일 제제는 48시간에 70.10%의 응애 사멸율을 초래했다. B. thuringiensis 제형이 미네랄 오일과와 혼합되지 않은 경우에도 유사한 사멸율이 얻어졌지만 이 경우 3.1 × 10⁹의 생존가능 포자(CFU)/ml의 용량으로 제형화된 것이었고(그룹 5), 즉 실험 제형에 미네랄 오일이 없는 상태에서 사멸율(68%)과 유사한 결과를 달성하기 위해 훨씬 더 높은 용량이 필요했다 했다.

따라서, Bt 제제와 미네랄 오일의 시너지 효과가 확인되었다. 추가 실험에서, FS Bt 샘플을 1.25%와 같이 매우 낮은 비율의 미네랄 오일을 포함하는 에멀젼과 혼합하면 상승 효과가 여전히 유지되는 것으로 관찰되었다.

지금까지 제공된 결과에 따르면, 본 발명의 제1 측면은 활성 성분으로서 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis)의 적어도 하나의 균주의 박테리아 제제를 포함하는, 응애 침입을 방제하거나 감소시키는데 적합한 약학적 또는 살생물제 조성물로서, 박테리아 제제가 적어도 하나의 상기 B. thuringiensis 균주의 생존가능 포자를 유효량으로 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 박테리아 제제는 조성물 1 ml당 1 × 10⁴ cfu 이상, 바람직하게는 조성물 1 ml당 1 × 10⁵ cfu 이상, 더 바람직하게는 조성물 1 ml당 1 × 10⁶ cfu 이상, 또한 더 바람직하게는 조성물 1 ml당 1 × 10⁷ cfu 이상의 생존가능 포자의 유효량을 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 박테리아 제제는 조성물 1 ml당 3 × 10⁸ cfu 이상의 생존가능 포자의 유효량을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 박테리아 제제는 조성물 1 ml당 3 × 10⁹ cfu 이상의 생존가능 포자의 유효량을 포함한다.

본 발명의 제1 측면의 바람직한 구현예 또는 그 바람직한 구현예 중 어느 하나에서, 박테리아 제제는 바실러스 투린지엔시스( B. thuringiensis ) 의 적어도 하나의 균주의 생존가능 포자가 풍부한 정제된 제형의 유효량을 포함한다. 이러한 정제된 개체군은 바실러스 투린지엔시스 아종 쿠르스타키(Btk )를 포함하는 본 발명 전반에 걸쳐 확인된 임의의 균주를 포함할 수 있음을 주목한다. 특히, 정제된 생존가능 포자 개체군은 생존가능 포자가 단리될 조(crude) 박테리아 개체군보다 훨씬 더 높은 비율의 생존가능 포자를 함유한다. 예를 들어, 정제 절차는 적어도 5배 증가, 바람직하게는 적어도 10배 증가, 더 바람직하게는 적어도 15배 증가, 가장 바람직하게는 적어도 20배 증가, 및 최적으로는 적어도 조 개체군에 비해 생존가능 포자를 25배 이상 증가시킨다.

따라서, 본 발명의 정제 개체군은 상기 기재된 바와 같이 자연에 존재하는 것보다 훨씬 더 높은 수준의 생존가능 포자를 함유한다.

본 발명의 제1 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 박테리아 제제는 Dermanyssus gallinae(가금류 붉은 응애)에 의해 생성된 응애 침입을 방제하거나 감소시키는데 적합한 B. thuringiensis의 적어도 하나의 균주의 생존가능 포자의 유효량을 포함한다.

본 발명의 제1 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, B. thuringiensis의 하나 이상의 균주는 바람직하게는 Dermanyssus gallinae(가금류 붉은 응애)에 의해 생성된 응애 침입을 방제하거나 감소시키는데 적합한 균주이고, 포자주변 결정 단백질과 같은 비포자 단백질을 조성물의 ml당 생존가능 포자보다 더 적게 생성한다. 바람직하게는, B. thuringiensis의 적어도 하나의 균주는 바람직하게는 Dermanyssus gallinae (가금류 붉은 응애)에 의해 생성된 응애 침입을 방제하거나 감소시키는 데 적합한 균주이고, Bacillus thuringiensis 아종 kurstaki (Btk), 아종 aizawai, 아종 israelensis 및 아종 morrisoni보다 포자주변 결정 단백질과 같은 비포자 단백질의 생산량이 더 적다. 더 바람직하게는, B. thuringiensis의 하나 이상의 균주는 Dermanyssus gallinae(가금류 붉은 응애)에 의해 생성된 응애 침입을 방제하거나 감소시키는데 적합한 균주이고, 자연 발생 미생물 Bacillus thuringiensis 아종 kurstaki(Btk)보다 ml당 모든 3.1 × 10⁹의 생존가능 포자에 대해 포자주변 결정 단백질과 같은 B. thuringiensis의 비포자 단백질을 덜 생성한다. 더욱 더 바람직하게는, Dermanyssus gallinae(가금류 붉은 응애)에 의해 생성된 응애 침입을 방제하거나 감소시키는데 적합한 균주이고, ml당 모든 3.1 × 10⁹의 생존가능 포자에 대해 포자주변 결정 단백질과 같은 B. thuringiensis의 비포자 단백질을 1.7 mg/ml 미만으로 생성하고, 바람직하게는 ml당 모든 3.1 × 10⁹의 생존가능 포자에 대해 포자주변 결정 단백질과 같은 B. thuringiensis의 비포자 단백질을 1.5 mg/ml 미만으로 생성하거나, ml당 모든 3.1 × 10⁹의 생존가능 포자에 대해 포자주변 결정 단백질과 같은 B. thuringiensis의 비포자 단백질을 1.3 mg/ml 미만으로 생성하고, 또는 ml당 모든 3.1 × 10⁹의 생존가능 포자에 대해 포자주변 결정 단백질과 같은 B. thuringiensis의 비포자 단백질을 0.8 mg/ml 미만으로 생성하거나, ml당 모든 3.1 × 10⁹의 생존가능 포자에 대해 포자주변 결정 단백질과 같은 B. thuringiensis의 비포자 단백질을 0.5 mg/ml 미만으로 생성하거나, ml당 모든 3.1 × 10⁹의 생존가능 포자에 대해 포자주변 결정 단백질과 같은 B. thuringiensis의 비포자 단백질을 0.3mg/ml 미만으로 생성하거나, ml당 모든 3.1 × 10⁹의 생존가능 포자에 대해 포자주변 결정 단백질과 같은 B. thuringiensis의 비포자 단백질을 0.1 mg/ml 미만으로 생성한다.

보다 더 바람직하게는, 상기 단락에 표시된 포자주변 결정 단백질과 같은 B. 투린지엔시스의 비포자 단백질은 다음으로 구성된 목록에서 선택된다: 식물성(vegetative) 바실러스 투린지엔시스 박테리아에 의해 합성되는 Cry 및 Cyt 단백질과 같은 델타(δ)-내독소. 이러한 단백질 그룹은 포자 형성 과정에서 응집되어 결정체로 알려진 결정체 내포물을 형성하는데, 이 결정체는 결정체와 동일한 유형의 단백질에 의해 형성되지만 다른 형태를 갖는 코트로 둘러싸여 있다. 비제한적인 비포자 단백질 선택은 Cry(Cry1, Cry2, Cry3 등) 및 Cyt(Cyt1, Cyt3 등) 패밀리 단백질과 같은 델타(δ)-내독소(델타-내독소의 자세한 목록은 다음 웹사이트 http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/에서 2019년 7월에 이용 가능함)(Crickmore et al., 1998, 2016); Vip 패밀리 단백질(Vip1, Vip2, Vip3 및 Vip4)과 같은 식물성 살충 단백질; Sip 패밀리 단백질과 같은 분비된 살충 단백질; 투린지엔신과 같은 β-외독소, 및 스페리콜리신 및 폐포 용해소(alveolysins)와 같은 콜레스테롤 의존성 세포용해소 관련 단백질; Bel 인핸싱과 같은 인핸싱-유사 단백질; P19 및 P20 단백질과 같은 헬퍼 단백질, 또는 Bt 41.9-kDa 단백질과 같은 비단백질성 β-외독소(Palma et al., 2014. Bacillus thuringiensis Toxins: An Overview of They Biocidal Activity. Toxins 2014, 6, 3296- 3325, doi:10.3390/toxins6123296).

본 발명의 제1 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, B. thuringiensis의 하나 이상의 균주는 하기로 이루어진 목록으로부터 선택된다:

- HIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany))에 2019년 6월 20일에 각각 수탁 번호 DSM 33175로 기탁된 Bacillus thuringiensis 균주 및 이의 돌연변이체;

- HIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany))에 2019년 2월 21일에 각각 수탁 번호 DSM 33034로 기탁된 Bacillus thuringiensis 균주 및 이의 돌연변이체;

- HIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany))에 2019년 2월 21일에 각각 수탁 번호 DSM 33035로 기탁된 Bacillus thuringiensis 균주 및 이의 돌연변이체.

본 발명의 제1 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 약학적 또는 살생물제 조성물은 살충제, 살비제, 살진균제, 살선충제, 항생제, 세정제, 면역원성 제제, 동물 사료, 에센셜 오일, 미네랄 오일, 기능식품, 프로바이오틱, 프리바이오틱, 공생제, 다당류, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 추가 활성 또는 기능성 성분을 더 포함한다. 바람직하게는, 추가 활성 성분은 조류 감염성 기관지염 바이러스(IBv), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 아데노바이러스, 난자 증후군 바이러스(EDS), 감염성 윤활낭병 바이러스(IBDV), 닭 빈혈 바이러스, 조류 뇌척수염 바이러스, 계두 바이러스, 칠면조 비기관염 바이러스, 오리 흑사병 바이러스, 비둘기 수두 바이러스, 마렉 병 바이러스(MDV), 조류 백혈병 바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스(ILTV), 조류 폐렴 바이러스, 레오바이러스, 대장균(E. coli ), 살모넬라 종, Ornithobacterium rhinotracheale, Haemophilus paragallinarum , Pasteurella multocida , Erysipelothrix rhusiopathiae, Erysipela sp ., Mycoplasma sp ., Clostridium sp ., Eimeria sp ., 및Aspergillus sp .으로 이루어진 군에서 선택되는 미생물 유래의 면역원성 제제이다.

본 발명의 제1 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 약학적 또는 살생물제 조성물은: 분진, 분말, 과립 제제, 미세캡슐화된 제형, 로션, 연고, 젤, 크림, 페이스트, 현탁액, 액체 농축액, 용액 및 유제로 이루어진 군에서 선택되는 약학적 형태이다. 바람직하게는, 약학적 또는 살생물제 조성물은 배씽(bathing), 분무, 붓기, 페인팅, 분사, 침지 또는 더스팅에 의한 적용에 적합하다.

본 발명의 제1 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 비히클 및/또는 하나 이상의 허용가능한 보조제를 추가로 포함한다.

본 발명의 제2 측면은 약제 또는 살생물제로 사용하기 위한, 본 발명의 제1 측면 또는 그 바람직한 실시양태에서 정의된 바와 같은 약학적 또는 살생물제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제3 측면은 응애 침입의 방제 및/또는 감소에 사용하기 위한, 본 발명의 제1 측면 또는 그 바람직한 실시양태에서 정의된 바와 같은 약학적 또는 살생물제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제4 측면은 체외기생(ectoparasite) 응애에 의해 생성된 응애 침입의 방제 및/또는 감소에, 바람직하게는 동물 또는 매개물에 사용하기 위한, 본 발명의 제1 측면 또는 그 바람직한 실시양태에서 정의된 바와 같은 약학적 또는 살생물제 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 체외기생 응애는 Dermanyssus sp , Ornithonyssus sp , Argus sp , Allopsoroptoides galli , Neocnemidocoptes gallinae, Knemidocoptes mutans , Laminosioptes cysticola, Megninia cubitalis , Megninia ginglymura , Pterolichus obtus , Syringophilus bipectinatus , Columbiphilus polonica , Deroglyphus elongates, Gaudoglyphus minor, Otodectes cynotis, Cheyletiella yasguri , Demodex sp ., Notoederes cati , Cheyletiella sp., Psoroptes sp ., Chorioptes sp ., Psorergates ovis , Sarcoptes scabiei , Psorobia ovis , Raillietia auris and Varroa sp., 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 여기서 체외기생 응애는 Dermanyssus Gallinae(가금류 붉은 응애)이다.

본 발명의 제4 측면의 바람직한 실시양태에서, 동물은 조류, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 양, 토끼 및 꿀벌 종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 조류 종은 가금류이다.

본 발명의 제4 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 방제 및/또는 감소가 응애의 25% 이상의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 25% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉되는 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제4 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 방제 및/또는 감소가 응애의 40% 이상의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 40% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉되는 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제4 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 방제 및/또는 감소가 응애의 50% 이상의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 50% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉되는 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제4 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 방제 및/또는 감소가 응애의 60% 이상의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 60% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉되는 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제4 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 방제 및/또는 감소가 응애의 70% 이상의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 70% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉되는 순간으로부터 48시간 내에 초래된다.

본 발명의 제4 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 약학적 또는 살생물제 조성물은 배씽, 분무, 붓기, 페인팅, 분사, 침지 또는 더스팅에 의해 적용된다.

본 발명의 제4 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 바실러스 투린지엔시스의 적어도 하나의 균주는 하기로 이루어진 목록으로부터 선택된다:

- HIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany)에 수탁 번호 DSM 33175로 2019년 6월 20일에 기탁된 Bacillus thuringiensis(Bt) 균주 및 이의 돌연변이체;

본 발명의 제5 측면은 매개물에서 응애 침입의 방제 및/또는 감소를 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 제1 측면 또는 그의 바람직한 실시양태 중 임의의 것에서 정의된 바와 같은 약학적 또는 살생물제 조성물을 사용하는 것을 포함하고, 바람직하게는 매개물이 동물이 사육되는 구내에 위치하고; 보다 바람직하게는 동물은 조류, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 양, 토끼 및 꿀벌 종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 제5 측면의 바람직한 실시양태 또는 그 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 제어 및/또는 감소가 응애의 적어도 25%의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 25% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉된 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제5 측면의 바람직한 실시양태에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 제어 및/또는 감소가 응애의 적어도 40%의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 40% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉된 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제5 측면의 바람직한 실시양태에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 제어 및/또는 감소가 응애의 적어도 50%의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 50% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉된 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제5 측면의 바람직한 실시양태에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 제어 및/또는 감소가 응애의 적어도 60%의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 60% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉된 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제5 측면의 바람직한 실시양태에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 제어 및/또는 감소가 응애의 적어도 70%의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 70% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉된 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제5 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그의 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 약학적 조성물 또는 살생물제 조성물은 동물이 사육되는 구내에 위치한 매개물에 적용된다.

본 발명의 제5 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그의 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 약학적 또는 살생물제 조성물은 배씽, 분무, 붓기, 페인팅, 분사, 침지 또는 더스팅에 의해 적용된다.

본 발명의 제5 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 바실러스 투린지엔시스의 적어도 하나의 균주는 하기로 이루어진 목록으로부터 선택된다:

본 발명의 제6 측면에서, 본 발명의 제1 측면 또는 그의 바람직한 실시양태 중 임의의 것에서 정의된 바와 같은 약학적 또는 살생물제 조성물은 추가 활성 성분을 포함하고, 상기 추가 활성 성분은 에센셜 오일(essential oil) 또는 미네랄 오일이다. 바람직하게는, 상기 조성물은 상기 에센셜 오일 또는 미네랄 오일로 제형화된다. 더욱 바람직하게는, 추가 활성 성분은 미네랄 오일이고 상기 미네랄 오일은 액체 파라핀이다.

본 발명의 제7 측면은, 바람직하게는 동물 또는 매개물에서, 응애 침입의 방제 및/또는 감소에 사용하기 위한, 본 발명의 제6 측면에서 정의된 바와 같은 약학적 또는 살생물제 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 응애 침입의 방제 및/또는 감소는 매개물에서 수행되며, 여기서 매개물은 바람직하게는 동물이 사육되는 구내에 위치한다. 또한, 바람직하게는, 응애 침입의 방제 및/또는 감소는 동물에서 수행되며, 여기서 동물은 조류, 돼지, 소, 말, 고양이, 개과, 양, 토끼 및 꿀벌 종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 조류 종은 가금류이다.

본 발명의 제7 측면의 바람직한 실시양태 또는 그 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 제어 및/또는 감소가 응애의 적어도 25%의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 25% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉된 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제7 측면의 바람직한 실시양태에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 제어 및/또는 감소가 응애의 적어도 40%의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 40% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉된 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제7 측면의 바람직한 실시양태에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 제어 및/또는 감소가 응애의 적어도 50%의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 50% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉된 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제7 측면의 바람직한 실시양태에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 제어 및/또는 감소가 응애의 적어도 60%의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 60% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉된 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제7 측면의 바람직한 실시양태에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 제어 및/또는 감소가 응애의 적어도 70%의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 70% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉된 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제7 측면의 바람직한 실시양태에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 제어 및/또는 감소가 응애의 적어도 80%의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 80% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉된 순간으로부터 48시간 내에 초래된다. 본 발명의 제7 측면의 바람직한 실시양태에서, 체외기생 응애는 응애 침입의 제어 및/또는 감소가 응애의 적어도 90%의 사멸율을 초래하도록 선택되고; 바람직하게는, 응애의 90% 이상의 사멸율은 조성물이 상기 응애 및/또는 매개물에 적용되고/되거나 접촉된 순간으로부터 48시간 내에 초래된다.

본 발명의 제7 측면의 대안적인 실시양태에서, 본 발명은 필요로 하는 동물에서 체외기생 응애에 의해 야기되는 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 제1 또는 제6 측면에서 정의된 바와 같은 약학적 또는 살생물제 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 질병은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 체외기생 응애에 의해 야기된다: Dermanyssus sp ., Ornithonyssus sp ., Argus sp ., Allopsoroptoides galli , Neocnemidocoptes gallinae , Knemidocoptes mutans , Laminosioptes cysticola , Megninia cubitalis , Megninia ginglymura , Pterolichus obtus, Syringophilus bipectinatus , Columbiphilus polonica , Deroglyphus elongates, Gaudoglyphus minor, Otodectes cynotis , Cheyletiella yasguri , Demodex sp ., Notoederes cati , Cheyletella sp ., Psoroptes sp ., Chorioptes sp ., Psorergates ovis , Srcoptes scabiei , Psorobia ovis , Raillietia auris and Varroa sp., 및 이들의 조합. 또한 바람직하게는, 응애 침입의 예방 및/또는 치료는 동물에서 수행되며, 여기서 동물은 조류, 돼지, 소, 말, 고양이, 개과, 양, 토끼 및 꿀벌 종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 조류 종은 가금류이다.

본 발명의 제7 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그의 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 약학적 또는 살생물제 조성물은 배씽, 분무, 붓기, 페인팅, 분사, 침지 또는 더스팅에 의해 적용된다.

본 발명의 제7 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 바실러스 투린지엔시스의 적어도 하나의 균주는 하기로 이루어진 목록으로부터 선택된다:

본 발명의 제7 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 응애는 체외기생 응애이다. 바람직하게는, 체외기생 응애는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: Dermanyssus sp , Ornithonyssus sp , Argus sp , Allopsoroptoides galli , Neocnemidocoptes gallinae , Knemidocoptes mutans, Laminosioptes cysticola, Megninia cubitalis , Megninia ginglymura , Pterolichus obtus , Syringophilus bipectinatus , Columbiphilus polonica , Deroglyphus elongates, Gaudoglyphus minor, Otodectes cynotis , Cheyletiella yasguri, Demodex sp ., Notoederes cati , Cheyletiella sp ., Psoroptes sp ., Chorioptes sp ., Psorergates ovis , Sarcoptes scabiei , Psorobia ovis , Raillietia auris 및 Varroa sp. 보다 바람직하게는, 체외기생 응애는 Dermanyssus Gallinae(가금류 붉은 응애)이다.

본 발명의 제7 측면의 또 다른 바람직한 실시양태 또는 그의 바람직한 실시양태 중 어느 하나에서, 조성물은 배씽, 분무, 붓기, 페인팅, 분사, 침지 또는 더스팅에 의해 적용된다. 바람직하게는, 조성물은 분무에 의해 적용된다.

본 발명은 단지 본 발명을 예시하지만 이를 제한하지 않는 하기 실시예에 따라 추가로 설명된다. 또한, 본 발명은 여기에 기술된 특정한 바람직한 실시예의 모든 가능한 조합을 포함한다.

실시예

실시예 1: 포자 활성 평가. 섭취에 의한 생물분석

본 실시예의 목적은 Dermanyssus gallinae 응애에 대해, 섭취에 의해 수행되는 생물분석을 사용하여, 상이한 조건에서 제형화된 여러 다른 Bacillus thuringiensis(Bt) 균주의 활성을 연구하는 것이었다.

스페인에서 분리된 Bacillus thuringiensis(Bt) DSM 33173 균주(HIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany))에 수탁 번호 DSM 33173로 2019년 6월 20일에 기탁됨) 및 B. thuringiensis DSM 33175 균주(HIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany))에 수탁 번호 DSM 33175로 2019년 6월 20일에 기탁됨)을 본 분석에서 사용하였다. 균주 DSM 33175는 D. gallinae의 높은 감염률이 기록된 가금류 농장에서 특별히 분리되었다. DSM 33175 균주는 포자주변 결정 단백질을 코딩하는 유전자가 없는 Bt 균주이다. 따라서, 활성 생물분석에 포함된 균주 중 하나는 비-결정성 Bt 균주, 특히 DSM 33175 균주였다. 다른 한편, DSM 33173 Bt 균주는 포자와 포자주변 결정 단백질을 모두 포함하는 균주로 특성화되었다(Bt DSM 33173 균주의 게놈을 표준 방법을 사용하여 시퀀싱하면 Cry21 및 Cry55 유전자가 검출됨).

Bt 균주가 비결정성 균주인지 여부를 결정하기 위해, 당업자는 일반적인 기술상식을 사용할 수 있다. 잘 알려진 바와 같이, B. thuringiensis의 비결정성 균주는 Cry 단백질이 없는 게놈(염색체 및 플라스미드 DNA)을 갖는 균주이다. Cry 단백질의 부재는 InstaGene^TM Matrix, 전체 게놈 시퀀싱과 같은 표준 방법을 사용하여 B. thurigiensis 균주에서 DNA 추출을 수행한 후 http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt(Crickmore et al., 1998, 2016)와 같이 잘 알려진 게놈 데이터베이스에서 확인하여 Cry 단백질과 일치하는 것이 있는지 여부를 평가할 수 있다. 이 데이터베이스에는 완전한 Cry 유전자 또는 Cry 단백질과 부분적으로 상동성이 있는 유전자가 포함되어 있다. B. thuringiensis의 비결정성 균주는 해당 유전자와 어느 정도의 상동성인 Cry 유전자가 없어야 한다. 따라서, 비결정성 B. thuringiensis 균주에서는 이러한 데이터베이스로부터 어떠한 결과(설명된 Cry 단백질의 전체 또는 일부)도 검색할 수 없다.

B. thuringiensis 균주의 전체 게놈 시퀀싱은 Illumina HiSeq 플랫폼과 같은 표준 방법을 사용하여 수행할 수도 있다. 서열들은 CLC Genomic Workbench(CLC Bio, 덴마크)와 같은 소프트웨어 도구를 사용하여 조립될 수 있다. 판독은 일반적으로 극단치; 낮은 품질이 판독치, 및30개 미만의 염기쌍을 갖는 판독치를 제거하기 위해 트리밍된다. 결과적으로 수득된 판독치는 노보(novo)를 콘티그(contigs)로 어셈블된다. 획득된 콘티그는 기준 서열과 짝을 이루는 정렬된 서열 및 이와 95% 이상의 상동성을 갖는 서열과 95% 이상의 렉쳐를 포함한다. 콘티그 구성 후, 렉쳐는 contig에 다시 할당된다. 얻어진 콘티그는 http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt(Crickmore et al., 1998, 2016)에서 이용가능한 것과 같은 Bacillus thuringiensis 독소의 아미노산 서열로 만들어진 데이터베이스를 사용하여 BLAST(Altschul et al., 1990) 로 분석된다. BLAST는 이 데이터베이스의 사용에 제한되지 않고, 통상의 기술자에게 알려진 다른 사용가능한 데이터베이스의 사용도 포함할 수 있다.

본 실시예에서, 두 균주, DSM 33173 및 DSM 33175의 개별 콜로니를 다음과 같이 서로 다른 Erlenmeyers에 접종하였다. 콜로니를 80ml CCY 배지와 함께 250ml의 Erlenmeyer에서 28℃에서 72시간 동안 인큐베이터 진탕기에서 220rpm으로 교반하며 배양하였다(Stewart, GSA, K. Johnstone, E. Hagelberg 및 DJ Ellar. 1981. Commitment of bacteria spores to germinate. Biochem. J. 198:101-106). 72시간째에 1,000×에서 광학현미경을 이용하여 육안으로 포자의 형성을 확인하였고, 완전히 형성되었음을 확인하였다. 이때, 1M NaCl과 10mM EDTA를 배양액에 첨가하였다. 그 후, 배양액을 4℃에서 11,200G로 10분간 원심분리했다. 펠릿을 이어서 Mili-Q 물로 재현탁하고 상청액을 버렸다. 재현탁된 펠릿을 4℃에서 10분 동안 11,200G에서 두 번째로 원심분리했다. 상청액을 다시 한 번 버리고 펠릿을 Mili-Q 물로 재현탁시켰다. 재현탁된 펠릿을 11,200G로 10분 동안 4℃에서 세 번째로 원심분리하고 생성된 상층액을 다시 한 번 버리고 펠릿을 최종 부피가 1.5-1.8ml가 되도록 Mili-Q 물로 최종 재현탁했다. 생물분석을 위한 Bt 샘플의 최종 현탁액을 수득하였다(FS Bt 샘플로 명명됨).

Bt 샘플의 최종 현탁액에 포함된 비포자 단백질의 함량을 정량화했다. 이 정량을 수행하기 위해 FS Bt 샘플을 정제수로 1/10 희석한 후 균질화하였다. 그 후, pH 11.3의 탄산염 완충액 940ml, 디티오트레이톨(DTT) 1M 10㎕ 및 1/10로 희석된 FS Bt 샘플 현탁액 50㎕를 1.5ml Eppendorf 튜브에 첨가했다. 그 다음, Eppendorf 튜브를 220rpm으로 교반하면서 배양 진탕기에서 37℃에서 2시간 동안 배양했다. 이때, Eppendorf 튜브를 13,200G로 5분간 원심분리하였다. 마지막으로, 상층액을 사용하여 비포자 단백질을 정량화했다. 정량화는 Bradford, MM 1976에 설명된 Bradford 단백질 분석과 같은 단백질 정량화를 위한 표준 기술에 의해 수행되었다. 이는 단백질-염료 결합 원리를 활용하여 단백질의 마이크로그램 양을 정량화하는 빠르고 민감한 방법이다(Anal. Biochem. 72:248~254).

생물분석을 수행하기 위해 다음 용액을 미리 준비하였다: 10ml FBS(Fetal Bovine Serum) 균질물, 50mg D-글루코스, 25mg ATP 및 100㎕ 착색 용액(35g/l Quinoline yellow E -104, PBS 중 40g/l Patent blue E-131로 50ml까지)로, FBS 최종 용액으로 라벨링됨.

FBS 최종 용액을 사용하여 5가지 다른 실험 제형이 후속적으로 제조하였다.

- 제형 1: 음성 대조군: 동일한 부피의 정제수로 1:1(v/v) 혼합된 FBS 최종 용액.

- 제형 2(Bt DSM 33173): B. thuringiensis 균주 DSM 33173의 총 비포자 단백질 함량이 0.4 mg/ml까지 정제수로 조정된 Bt 샘플(FS Bt 샘플)의 최종 현탁액과 1:1(v/v)로 혼합된 FBS 최종 용액. DSM 33173 균주에 대한 FS Bt 샘플은 정제 과정을 거치지 않았다.

- 제형 3(Bt DSM 33175): B. thuringiensis 균주 DSM 33175의 총 비포자 단백질 함량이 0.4 mg/ml까지 정제수로 조정된 Bt 샘플(FS Bt 샘플)의 최종 현탁액과 1:1(v/v)로 혼합된 FBS 최종 용액. DSM 33175에 대한 FS Bt 샘플에는 포자주변 결정 단백질이 포함되지 않았다.

- 제형 4(DSM 33173, 포자 정제됨): DSM 33173 균주에 대한 Bt 샘플(FS Bt 샘플)의 최종 현탁액은 생존가능 포자로 FS Bt 샘플을 풍부하게 하기 위해 추가 정제 공정을 거쳤다. 정제 단계를 위해, B. thuringiensis 최종 현탁액(FS Bt 샘플)을 pH 9.0의 탄산염 완충 용액에 용해시켰다. 가용화 후, 현탁액을 원심분리 하고 펠렛을 Mili-Q 물로 재현탁시켰다. 가용화된 단백질이 있는 상층액은 버리고 펠렛을 유지하였다. 그 다음, 펠릿을 정제수로 B. thuringiensis 균주 DSM 33173의 비포자 단백질 함량 0.4mg/ml로 조정했다. 마지막으로, 이를 FBS 최종 용액과 1:1(v/v)로 혼합했다. 제형 4는 생존가능 포자 함량이 풍부하였다.

- 제형 5(DSM 33173, 열처리됨): 120℃에서 20분 동안 열처리되고, 정제수로 B. thuringiensis 균주 DSM 33173의 총 비포자 단백질 함량 0.4 mg/ml로 조정된 Bt 샘플(FS Bt 샘플)의 최종 현탁액과 1:1(v/v) 혼합된 FBS 최종 용액. FS Bt 샘플에 대해 수행된 열처리는 결정성 단백질과 같은 비포자 단백질 및 생존가능 포자 모두를 비활성화하기 위해 수행되었다.

FBS 최종 용액에 포함된 착색 용액은 5가지 실험 제형 중 하나를 먹은 응애를 명확하게 식별하기 위한 지표로 사용되었다.

Dermanyssus Gallinae의 성충 및 님프 샘플은 Dermanyssus Gallinae 응애의 높은 감염률을 가진 가금류(층) 농장에서 수집되었다. 건강하고 움직이는 응애를 이 연구를 위해 단독으로 선택하였다. 응애를 음식 공급원에 접근없이 1주일 동안 24-26℃에서 50ml 환기 용기에 보관하였다.

응애를 각각 약 20 개체씩 5개의 다른 그룹으로 나누었다. 각 그룹은 5가지 다른 실험 제형 중 하나를 받았다. 응애의 각 그룹은 약 10cm 길이와 0.5cm 너비의 메타크릴레이트 튜브에 투입되었다. 메타크릴레이트 튜브는 1 ml 마이크로피펫 절단 팁이 붙은 20㎛ 메쉬를 사용하여 한쪽 끝을 밀봉했다. 다른 쪽 끝에서, 2 × 2cm의 하루된 닭 피부 조각을 0.6ml의 실험 제형(1 내지 5, 각 그룹에 하나씩)을 포함하는 1 ml 마이크로피펫 팁으로 고정했다.

응애의 각 그룹을 실험 제형을 자유롭게 섭취하도록 2시간 동안 30℃ 및 80-100%의 높은 상대습도에서 방치하였다. 나중에, 실험 제형을 섭취한 유색 응애가 선택되었다. 그 다음, 유색 응애를 한쪽 끝이 완전히 밀봉되고, 다른 쪽 끝은 1 ml 마이크로피펫 절단 팁으로 붙인 20㎛ 메쉬로 밀봉된 새로운 메타크릴레이트 튜브에 투입하였다.

5가지 다른 실험 제형의 활성을 각 그룹에서 응애의 사멸율을 모니터링하여 평가하였다. 20-40×에서 스테레오 현미경을 사용하여 24시간에 사멸율을 확인했다.

사멸 결과는 도 1에 요약되어 있다. 본 분석은 결정 단백질을 전혀 생성하지 않는 비결정성 균주 DSM 33175가 포자 및 포자주변 결정 단백질을 모두 포함하는 제형(67%, 그룹 2)보다 높은 83%(그룹 3)의 사멸율을 보임에 따라, 포자주변 결정 단백질과 관련하여, 포자가 D. gallinae 응애에 대해 사멸에 대한 명확한 활성을 갖는다는 것을 입증했다.

더 나아가, 정제된 생존가능 포자가 풍부한 실험 제형 4(그룹 4)는 다른 제형(특히 제형 2)에 비해 활성 증가의 결과를 나타냈는데, 포자 및 포자주변 결정 단백질을 둘 다 함유하는 정제되지 않은 제형 2(그룹 2)와 비교할 때 D. gallinae 개체군의 높은 감소(80%의 응애 사멸율)를 유발하였다. 후자는 응애 사멸율이 67%였다.

또한, 생존가능 포자와 포자주변 결정 단백질을 열처리에 의해 불활성화시켰을 때, 응애 사멸은 전혀 관찰되지 않았다(그룹 5).

선행 기술이 농업에서 살충제로 사용되는 B. thuringiensis 균주의 독성 활성이 결정 단백질에 기인한다는 것을 분명히 개시하고 있음을 고려하면, 이러한 결과는, 본 발명자들이 생존가능 포자가 풍부한 정제 제형이 결정 단백질을 함유하는 조성물에서 관찰된 것보다 응애에 대한 사멸율에 대해 더 나은 활성을 가질 것이라는 것을 예상하지 못했기에, 매우 놀랍고 예상치 못한 것이다.

실시예 2: 플레이트 생물분석에 대한 포자 활성 평가

응애 사멸율에 대한 생존가능 포자의 활성을 입증하기 위해 두 번째 분석을 수행했다. 이번에는 실시예 1에서 사용된 섭취 모델 대신에 한천 플레이트 생물분석에 기초한 새로운 실험 모델을 사용하였다. 플레이트 생물분석은 미래의 현장 조건과 더 유사하다.

플레이트 생물분석을 위해 다양한 실험 제형을 준비하였다.

이를 위해, 7.5g의 유럽 세균학적 한천을 500ml의 Mili-Q 물에서 균질화했다. 생성된 균질화된 한천을 121℃에서 20분 동안 고압멸균 처리했다. 그 다음 한천 용액 25ml를 플레이트(페트리 접시(예: Greiner bio-one 페트리 접시, 참조 번호 633181, 뚜껑이 있는 접시, 외부 직경 93mm, 작업 부피 15ml, 최대 부피 80ml)마다 배치했다.

3가지 상이한 실험 제형을 다음과 같이 제조하였다:

- 제형 1(비정제된 포자 제제): 실시예 1에 기재된 Bt 샘플(FS Bt 샘플)의 최종 현탁액을 정제수로 B. 투린지엔시스 균주 DSM 33173의 비포자 단백질 함량이 약 2.5mg/ml이 되도록 조정하였다.

- 제형 2(정제된 포자 제제): 실시예 1에 기재된 Bt 샘플(FS Bt 샘플)의 최종 현탁액을 정제 공정을 거쳐 생존가능 포자로 FS Bt 샘플을 농축되게 하였다. 정제 단계를 위해, B. 투린지엔시스 최종 현탁액(FS Bt 샘플)을 pH 9.0의 탄산염 완충 용액에 용해시켰다. 가용화 후, 현탁액을 원심분리 하고 펠렛을 Mili-Q 물로 재현탁시켰다. 그 다음 상층액을 버리고 펠릿을 유지했다. 이어서, 펠렛을 정제수로 조정하여 B. 투린지엔시스 균주 DSM 33173의 비포자 단백질 함량이 약 2.5 mg/ml이 되도록 하였다.

- 제형 3(음성 대조군): Mili-Q 물을 음성 대조군으로 사용하였다.

50㎕/플레이트에 기재된 각 실험 제형(1 내지 3)을 한천 플레이트에 남겨두었다.

Dermanyssus Gallinae의 성충 및 님프 샘플을 높은 Dermanyssus gallinae 응애 감염률을 가진 가금류(층) 농장에서 수집하였다. 건강하고 움직이는 응애를 연구를 위해 선택하였다. 응애는 음식 공급원에 접근없이 1주일 동안 24-26℃에서 50ml 환기 용기에 보관하였다. 응애를 각각 약 20마리씩 3개의 다른 그룹으로 나누었다.

각 응애 그룹을 시험할 실험 제형(1 내지 3)로 미리 준비한 한천 플레이트에 놓았다.

응애가 탈출하는 것을 방지하기 위해 페트리 디쉬를 양면 양면 접착 테이프를 사용하여 밀봉하였다. 연구 동안 페트리 접시를 26℃ 및 70% 상대 습도로 유지하였다. 세 가지 다른 실험 제형의 활성은 각 플레이트 그룹에서 응애의 사멸율을 모니터링하여 평가하였다. 20-40×로 스테레오 현미경을 사용하여 24시간 및 48시간에 사멸율을 확인했다.

사멸율 결과는 도 2에 요약되어 있다. 플레이트 생물분석을 사용하여 실시예 2에서 얻은 결과는 섭취 생물분석 실험 모델을 사용하여 이전 실시예 1에서 관찰된 효과를 뒷받침한다.

발명자는 실시예 1에서 사용된 섭취 모델 대신에 한천 플레이트 생물분석에 기초한 실시예 2에서 얻은 더 낮은 사멸율을 정상적인 것으로 고려하였다. 플레이트 생물분석은 미래의 현장 조건과 더 유사하지만 섭취 생물분석을 사용할 때 사멸율은 항상 더 우수하였다. 이는 섭취 생물분석에서 응애가 실험 제형을 섭취하고 그 제형을 섭취한 응애만이 생존 및 사멸율을 확인하기 위해 선택되기 때문이다.

플레이트 생물분석은 정제된 포자 제제를 기반으로 한 제형 2(그룹 2)가 비정제된 포자 제제를 기반으로 한 제형 1(그룹 1)보다 각각 48시간에서 48.81% 및 27.77%의 사멸율을 수득하여 응애 사멸률이 더 높았음을 입증했다. 다시 한번, 본 발명자들은 놀랍게도 포자주변 결정 단백질이 풍부한 조성물이 응애에 대한 사멸율의 관점에서 생존가능 포자가 풍부한 정제된 조성물보다 성능이 더 나쁘다는 것을 발견하였다.

실시예 3: 상이한 Bt 조성물의 용량-반응에 관한 연구

이 실시예는 상이한 용량이 사용될 때 생존가능 포자를 포함하는 상이한 바실러스 투린지엔시스(Bt) 조성물의 활성을 확인하기 위해 수행하였다.

Dermanyssus Gallinae의 성충 및 님프 샘플을 Dermanyssus Gallinae 응애의 높은 감염률을 가진 가금류(층) 농장에서 수집하였다. 용량/반응 분석을 수행하기 위해 건강하고 움직이는 응애를 선택하였다. 이 분석은 한천 플레이트 생물분석(실시예 2에 기초한 모델을 사용하지만 페트리 접시(예: Greiner bio-one 페트리 접시, 참조 번호 633181, 뚜껑이 있는 접시, 외부 직경 93mm, 작업 용량 15ml, 최대 용량 80ml) 대신에, 세포 배양 플라스크(예: Falcon flask, ref. 353107, 12.5 cm², 25ml, 통풍 나사 캡 포함)을 사용하였다. 생물 배양 플라스크를 실시예 2에 기재된 바와 같이 유럽 세균학적 한천으로 미리 제조하였다. 이 경우, 페트리 접시당 25ml 대신에 플라스크당 11 ml의 한천 용액을 넣었다. 응애를 농장에서 수집하여 각각 약 20 개체씩 9개의 다른 그룹으로 나누었다.

본 연구에 사용된 B. thuringiensis 균주는: GR-S5-8로서, D. gallinae의 높은 감염률이 검출된 스페인의 가금류 농장에서 분리된 Bt 균주에 해당하는 분리주; GR-P14-3로서, 역시 D. gallinae의 높은 감염률이 검출된, 스페인에 위치한 가금류 농장에서 분리된 Bt 균주에 해당하는 분리주; 및 DE2-S2-8로서, D. gallinae의 낮은 감염율이 검출된 독일에 위치한 가금류 농장에서 분리된 Bt 균주에 해당하는 분리주였다. GR-S5-8 분리주는 위에 표시된 대로 2019년 6월 20일 라이프니츠 연구소 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen에 부다페스트 조약에 따라 HIPRA SCIENTIFIC, SLU에 의해 기탁된 DSM 33175 균주에 해당한다. DE2-S2-8 Bt 분리주는 또한 부다페스트 조약에 따라 HIPRA SCIENTIFIC, SLU에 의해 라이프니츠 연구소 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen에 수탁 번호 DSM 33035로 2019년 2월 21일에 기탁되었다.

모든 B. thuringiensis 균주는 용량-반응 분석을 수행하기 위한 Bt 샘플(FS Bt 샘플)의 최종 현탁액을 얻기 위해 실시예 1에 기재된 바와 같이 성장시켰다. 바실러스 투린지엔시스 최종 현탁액(FS Bt 샘플)의 ml당 생존가능 포자의 수는 콜로니 형성 단위(CFU)/ml와 같은 표준 미생물학 기술에 의해 결정되었다.

부수적으로, 위에서 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 원하는 효과가 포자에 연결되고 포자주변 결정 단백질에는 연결되지 않는다는 실시예 1 및 2에 예시된 결과로 인해, 포자주변 결정 단백질(비포자성 결정 단백질)의 농도를 결정하거나 정량하는 대신 B. thuringiensis 최종 현탁액 ml당 생존가능 포자의 수를 결정하기로 결정했다는 점이 강조되며 중요하다.

균주 GR-S5-8 및 GR-P14-3에 대한 Bt 샘플의 최종 현탁액을 정제수로 4가지 다른 고정 용량의 생존가능 포자/ml(CFU/ml) 제제가 되도록 조정했다. 생존가능 포자의 4가지 고정 용량은 3.8 × 10⁷, 1.1 × 10⁸, 3.4 × 10⁸및 3.1 × 10⁹생존가능 포자(CFU)/ml 제제였다. 이들 상이한 용량은 각각 GR-P14-3 균주에 대한 그룹 1 내지 4 및 GR-S5-8 균주에 대한 그룹 5 내지 8에 해당한다. 한편, B. 투린지엔시스 균주 DE2-S2-8에 대한 Bt 샘플의 최종 현탁액은 3.1 × 10⁹생존가능 포자(CFU)/ml의 용량이 되도록 조정하였다. 이 고정 용량은 그룹 9에 해당한다.

상이한 용량의 생존가능 포자/ml로 조정된 이들 상이한 Bt 제제 50㎕를 세포 배양 플라스크에 도입하였다. 플라스크는 연구 동안 26℃ 및 70% 상대 습도로 유지하였다. 이들 상이한 포자 제제의 활성은 각 플라스크에서 응애의 사멸을 모니터링하여 평가되었다. 20-40×로 스테레오 현미경을 사용하여 24시간 및 48시간에 사멸율을 확인했다.

결과는 도 3에 요약되어 있다. 이 결과는 항응애 활성을 생성하기 위한 생존가능 포자의 명확한 역할을 보여주었다. 이 실험 제형으로 처리한 후 24시간 및 48시간 모두에서, 조성물에서 생존가능 포자가 적을수록 D. gallinae 응애의 사멸율이 더 적은 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 생존가능 포자의 용량이 높을수록 조성물의 비포자 단백질 함량에 관계없이 높은 사멸율도 관찰되었다.

또한, 시험된 모든 Bt 균주는 3.1 × 10⁹생존가능 포자(CFU)/ml 로 제형화될 때 상당한 사멸율을 나타냈다. 특히, 기탁된 DSM 33035 Bt 균주인 DE2-S2-8은 처리 후 48시간에서 66%의 사멸율을 보여, 더 높은 정도의 항응애 활성을 나타냈다(그룹 9).

실시예 4: 응애에 대한 다양한 Bt 균주의 활성의 비교 분석

본 실시예에서는 가금류 농장에서 분리된 다양한 B. thuringiensis(Bt) 균주의 활성을 평가하고 다양한 종류의 해충에 대해 농업에 사용되는 상업용 제품에서 분리된 Bt 균주와 비교했다.

7개의 다른 B. thuringiensis 균주가 비교 분석에 포함되었다. Bt 균주는 다음과 같다.

- DE2-S2-8 균주(독일에서 D. gallinae 감염률이 낮은 가금류 농장에서 분리됨, DSM 33035),

- DE1-S2-4 균주(독일에서 D. gallinae 감염률이 높은 가금류 농장에서 분리됨, DSM 33034),

- DE2-S1-1 균주(독일에서 D. gallinae 감염률이 낮은 가금류 농장에서 분리됨),

- GR_P1_4 균주(스페인에서 D. gallinae 감염률이 높은 가금류 농장에서 분리됨),

- MA_S15_3 균주(스페인에서 D. gallinae 감염률이 낮은 가금류 농장에서 분리됨),

- DE2-S3-4 균주(독일에서 D. gallinae 감염률이 낮은 가금류 농장에서 분리됨), 및

- B. thuringiensis susbsp . kurstaki 균주 ABTS-351(농업 해충의 다양한 상업 제품에 존재하는 균주). 이 경우, Valent BioScience LLC에서 제조한 상용 제품인 bioMAX 32®에서 분리하였다.

7개의 Bt 균주 모두를 실시예 1에 기재된 바와 같이 배양하여 비교 분석을 수행하기 위한 Bt 샘플(FS Bt 샘플)의 최종 현탁액을 얻었다. B. thuringiensis 최종 현탁액(FS Bt 샘플)의 ml당 생존가능 포자의 수는 콜로니 형성 단위(CFU)/ml와 같은 표준 미생물학 기술에 의해 결정되었다(Goldman, E.; Green, LH Practical Handbook of Microbiology. 3^rd Edition, published 4 June, 2015; Chapter 2. Quantification of Microorganisms. Page 19, Plate Count Method by Peter S. Lee, page 24. CRC Press, 1055 pages. ISBN 9781466587397). 콜로니 카운팅은 펜과 클릭 카운터를 사용하여 수동으로 수행하였다.

Dermanyssus Gallinae의 성충 및 님프 샘플을 Dermanyssus Gallinae 응애의 높은 감염률을 가진 가금류(층) 농장에서 수집하였다. 비교 분석을 수행하기 위해 건강하고 움직이는 응애를 선택하였다. 응애를 농장에서 수집하여 각각 약 20개체씩 7개의 다른 그룹으로 나누었다. 이 분석은 실시예 3에 기술된 플라스크 생물분석을 사용하여 수행하였다(이들은 모두 실시예 2에 기술된 바와 같이 유럽 세균학적 한천으로 사전에 제조됨). 플라스크당 11 ml의 한천 용액을 넣었다.

각 특정 균주로 제조된 Bt 샘플(FS Bt 샘플)의 최종 현탁액 50 ㎕를 각 그룹의 세포 배양 플라스크에 도입하였다. 특정 균주를 실시예 1에 기재된 바와 같이 성장시키고 정제수를 사용하여 3.1 × 10⁹생존가능 포자(CFU)/ml 제제의 함량이 되도록 조정하였다. 비포자 단백질 함량을 실시예 1에 기재된 바와 같이 추가로 결정하였다.

이 플라스크를 연구 동안 26℃ 및 70% 상대 습도로 유지하였다. 이들 상이한 포자 제제의 활성은 각 플라스크에서 응애의 사멸율을 모니터링하여 평가하였다. 20-40×로 스테레오 현미경을 사용하여 24시간 및 48시간에 사멸율을 확인했다.

사멸율의 결과는 표 1에 요약하였다.

B. 투린지엔시스 균주	48시간 응애 사멸율	비포자 단백질 함량
DE2-S2-8	58.94%	0.270mg/ml
DE1-S2-4	56.79%	0.529mg/ml
DE2-S1-1	53.77%	0.390mg/ml
GR_P1_4	51.92%	0.220mg/ml
MA_S15_3	51.30%	0.210mg/ml
DE2-S3-4	48.64%	0.750mg/ml
ABTS-351	24.68%	1.758mg/ml

모든 제제들이 48시간에 응애 사멸을 초래했다. 그러나, 농업 해충 방제에 사용되는 Bt 시판품에서 관찰된 Dermanyssus galinae와 같은 응애에 대한 사멸율은, 일반적인 농업 상품에 존재하는 것으로 알려져 있는 B. thuringisensis 아종 kurstaki 균주 ABTS-351를 함유한 제제를 사용했을 때, 현저히 감소하였다. 이에 반해, 상업용 Bt 아종 Kurstaki 이외의 Bt 균주는 응애에 대한 사멸율에 대한 활성을 배가시켰다. B. thuringiensis 아종. aizawai(3.09 mg/ml; 21.33% 사멸율), B. thuringiensis 아종. Morrisoni(1.24 mg/ml; 22.50% 사멸율), 또는 B. thuringiensis 아종. israelensis(0.91 mg/ml; 30.36% 사멸율)와 같이 높은 비포자 단백질 함량을 갖는 다른 시험 제제들은 위에서 언급한 응애에 대한 사멸율에 대한 활성과의 관계를 추가로 입증했다.

따라서, 놀랍게도, 일반적으로 응애에 대한 높은 사멸율을 초래하는 Bt 균주는 제제에 함유된 생존가능 포자에 비해 더 적은 양의 비포자 단백질을 생성하는 것으로 관찰되었다. 비포자 단백질의 함량이 높을수록 관찰되는 활성은 더 적었다.

실시예 5: 미네랄 오일을 포함하는 Bt 조성물의 활성

본 실시예에서는, 미네랄 오일을 포함하는 바실러스 투린지엔시스 조성물의 활성을 평가하였다. 이 연구를 위해, 실시예 1에 기재된 바와 같이 Bt 균주 DE2-S2-8(DSM 33035)에 기초한 Bt 샘플(FS Bt 샘플)의 현탁액을 제조하였다. 이어서, 상이한 양의 생존가능 포자/ml를 함유하고 미네랄 오일이 있거나 없는 제형화된 6개의 상이한 제형을 다음과 같이 제조하였다:

- 제형 1. DE2-S2-8 균주의 FS Bt 샘플을 20%(v/v)의 미네랄 오일(Marcol 52), 0.9%의 폴리소르베이트 80, 0.65%의 Sorbitan monooleate 및 2.4%의 Simulsol 5100을 함유하는 PBS 에멀젼 86.2%(v/v)와 혼합했다. 샘플의 최종 함량은 3.4 × 10⁸생존가능 포자(CFU)/ml로 조정되었다.

- 제형 2. DE2-S2-8 균주의 FS Bt 샘플을 20%(v/v)의 미네랄 오일(Marcol 52), 0.9%의 폴리소르베이트 80, 0.65%의 Sorbitan monooleate 및 2.4%의 Simulsol 5100을 함유하는 PBS 에멀젼 86.2%(v/v)와 혼합했다. 샘플의 최종 함량은 1.03 × 10⁹생존가능 포자(CFU)/ml로 조정되었다.

- 제형 3. DE2-S2-8 균주의 FS Bt 샘플을 20%(v/v)의 미네랄 오일(Marcol 52), 0.9%의 폴리소르베이트 80, 0.65%의 Sorbitan monooleate 및 2.4%의 Simulsol 5100을 함유하는 PBS 에멀젼 86.2%(v/v)와 혼합했다. 샘플의 최종 함량은 3.10 × 10⁹생존가능 포자(CFU)/ml의 함량으로 조정되었다.

- 제형 4. DE2-S2-8 균주의 FS Bt 샘플을 정제수를 사용하여 1.03 × 10⁹생존가능 포자(CFU)/ml의 함량으로 조정하였다.

- 제형 5. DE2-S2-8 균주의 FS Bt 샘플은 정제수를 사용하여 3.10 × 10⁹생존가능 포자(CFU)/ml의 함량으로 조정하였다.

- 제형 6. Mili-Q 물의 음성 대조군을 사용하였다.

Dermanyssus Gallinae의 성충 및 님프 샘플을 Dermanyssus Gallinae 응애의 높은 감염률을 가진 가금류(층) 농장에서 수집하였다. 본 분석을 수행하기 위해 건강하고 움직이는 응애를 선택하였다. 응애는 농장에서 수집되어 각각 약 20 개체씩 6개의 다른 그룹으로 나누었다. 이 분석은 실시예 3에 기술된 플라스크 생물분석을 사용하여 수행되었다(이들은 모두 실시예 2에 기술된 바와 같이 유럽 세균학적 한천으로 사전에 제조됨). 플라스크당 11 ml의 한천 용액을 넣었다.

각각의 제형(1 내지 5)로 제조한 Bt 샘플(FS Bt 샘플)의 최종 현탁액 50㎕를 각 그룹의 세포 배양 플라스크에 도입하였다. 그룹 6은 음성 대조군으로 Mili -Q 물 50㎕를 받았다. 플라스크들을 연구 동안 26℃ 및 70% 상대 습도로 유지하였다. 각 플라스크에서 응애의 사멸을 모니터링함으로써 상이한 제형의 활성을 평가하였다. 20-40×로 스테레오 현미경을 사용하여 24시간 및 48시간에 사멸율을 확인했다.

사멸율 결과는 도 4에 요약되어 있다. 예상치 못하게, B. thurginsiensis 제제와 미네랄 오일의 혼합물은 B. thuringiensis 균주의 생존력과 그 항-응애 활성에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 반대로, 실험 제형의 효과를 상당히 증가시켜 응애 사멸율에 대한 상승 효과를 가져왔다. 미네랄 오일과 3.1 × 10⁹생존가능 포자(CFU)/ml(그룹 3)로 제조된 제형 3은 단 48시간 만에 90% 이상의 응애 사멸율을 달성했다.

미네랄 오일 제제에 블렌딩된 바실러스 투린지엔시스 제형의 혼합물이 실험 제형에 사용된 바실러스 투린지엔시스 박테리아의 투여량을 감소시킬 수 있음이 추가 관찰되었다. 예를 들어, 3.4×10⁸생존가능 포자(CFU)/ml(그룹 1)의 용량으로 제형화된 미네랄 오일 제제는 48시간에 70.10%의 응애 사멸율을 초래했다. B. thuringiensis 제형이 미네랄 오일과와 혼합되지 않은 경우에도 유사한 사멸율이 얻어졌지만 이 경우 3.1 × 10⁹생존가능 포자(CFU)/ml의 용량으로 제형화된 것이었다(그룹 5). 즉, 실험 제형에 미네랄 오일이 없는 상태에서 사멸율(68%)에 대해 유사한 결과를 달성하기 위해서는 훨씬 더 높은 용량이 필요했다.

따라서, 본 발명자들은 Bt 제제와 미네랄 오일의 시너지 효과를 확인하였다. 추가 실험에서, FS Bt 샘플을 1.25%와 같이 매우 낮은 비율의 미네랄 오일을 포함하는 에멀젼과 혼합해도 상승 효과가 여전히 유지되는 것으로 관찰되었다.

Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany)

DSM33034

20190221

DSM33035

20190221

DSM33173

20190620

DSM33175

20190620

Claims

응애 침입을 방제하거나 감소시키는데 적합한 약제학적 또는 살생물제 조성물로서,
활성 성분으로서 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis) 균주의 박테리아 제제를 포함하고,
상기 박테리아 제제는 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스 균주의 생존가능 포자 유효량을 포함하는,
약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항에 있어서, 박테리아 제제는 더마니소스 갈리내(Dermanyssus gallinae)(가금류 붉은 응애)에 의해 생성된 응애 침입을 제어하거나 감소시키는 데 적합한 하나 이상의 B. thuringiensis 균주의 생존가능 포자 유효량을 포함하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스 균주는 B. thuringiensis 아종 Kurstaki 보다 적은 양의 B. thuringiensis 비포자 단백질을 생산하는 균주인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스 균주는 ml 당 매 3.1 × 10⁹개의 생존가능 포자에 대해 1.7 mg/ml 미만의 바실러스 투린지엔시스의 비포자 단백질을 생산하는 균주인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제3항 또는 제4항에 있어서, B. thuringiensis의 비포자 단백질은 델타(δ)-내독소, 단백질 Cry 및 Cyt, 식물성 살충 단백질(Vip1, Vip2, Vip3 및 Vip4), 분비된 살충 단백질(Sip 단백질), β-외독소(투린지엔신(thuringiensin)), 콜레스테롤-의존성 세포용해소 연관 단백질(스페리콜리신(sphaericolysins) 및 폐포 용해소(alveolysins)), 강화형 단백질(Enhancing-like proteins)(Bel 강화 단백질), 헬퍼 단백질(P19 및 P20 단백질), 또는 비단백질성 β-외독소(Bt 41.9-kDa 단백질)로 이루어진 목록에서 선택되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 제제가 조성물 ml당 1 × 10⁴cfu 이상의 생존가능 포자 유효량을 포함하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제6항에 있어서, 박테리아 제제가 조성물 ml당 3 × 10⁸cfu 이상의 생존가능 포자 유효량을 포함하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제6항에 있어서, 박테리아 제제가 조성물 ml당 3 × 10⁹cfu 이상의 생존가능 포자 유효량을 포함하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 살충제, 살비제, 살진균제, 살선충제, 항생제, 세정제, 면역원성 제제, 동물 사료(animal feedstuff), 에센셜 오일, 미네랄 오일, 기능식품, 프로바이오틱, 프리바이오틱, 공생제, 다당류, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 활성 또는 기능성 성분을 더 포함하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제9항에 있어서, 추가 활성 성분은 조류 감염성 기관지염 바이러스(IBv), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 아데노바이러스, 난자 증후군 바이러스(EDS), 감염성 윤활낭병 바이러스(IBDV), 닭 빈혈 바이러스, 조류 뇌척수염 바이러스, 계두 바이러스, 칠면조 비기관염 바이러스, 오리 흑사병 바이러스, 비둘기 수두 바이러스, 마렉 병 바이러스(MDV), 조류 백혈병 바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스(ILTV), 조류 폐렴 바이러스, 레오바이러스, 대장균(E. coli ), 살모넬라 종, Ornithobacterium rhinotracheale, Haemophilus paragallinarum , Pasteurella multocida , Erysipelothrix rhusiopathiae, Erysipela sp ., Mycoplasma sp ., Clostridium sp., Eimeria sp ., 및 Aspergillus sp .으로 이루어진 군에서 선택되는 미생물 유래의 면역원성 제제인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 분진, 분말, 과립 제제, 미세캡슐화된 제형, 로션, 연고, 젤, 크림, 페이스트, 현탁액, 액체 농축액, 용액 및 유제로 이루어진 군에서 선택되는 형태인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 배씽(bathing), 분무, 붓기, 페인팅, 분사, 침지 또는 더스팅에 의한 적용에 적합한, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 비히클 및/또는 하나 이상의 허용가능한 보조제를 더 포함하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스 균주는 HIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany)에 수탁 번호 DSM 33034로 2019년 2월 21일에 기탁된 B. thuringiensis 균주 및 이의 돌연변이체인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스 균주는 HHIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany))에 2019년 2월 21일에 각각 수탁 번호 DSM 33035로 기탁된 Bacillus thuringiensis 균주 및 이의 돌연변이체인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스 균주는 HIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany)에 수탁 번호 DSM 33175로 2019년 6월 20일에 기탁된 Bacillus thuringiensis(Bt) 균주 및 이의 돌연변이체인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 약제 또는 살생물제로 사용하기 위한, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 응애 침입의 방제 및/또는 감소에 사용하기 위한, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 필요 동물의 체외기생 응애에 의해 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제19항에 있어서, 상기 질병은 하기:
Dermanyssus sp., Ornithonyssus sp., Argus sp., Allopsoroptoides galli, Neocnemidocoptes gallinae, Knemidocoptes mutans, Laminosioptes cysticola, Megninia cubitalis, Megninia ginglymura, Pterolichus obtus, Syringophilus bipectinatus, Columbiphilus polonica, Deroglyphus elongates, Gaudoglyphus minor, Otodectes cynotis, Cheyletiella yasguri, Demodex sp., Notoederes cati, Cheyletella sp., Psoroptes sp., Chorioptes sp., Psorergates ovis, Srcoptes scabiei, Psorobia ovis, Raillietia auris, Varroa sp., 및 이들의 조합
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 체외기생 응애에 의해 유발되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 동물 또는 매개물에서, 체외기생 응애에 의해 유발되는 응애 침입의 방제 및/또는 감소에 사용하기 위한, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제21항에 있어서, 상기 체외기생 응애는 하기:
Dermanyssus sp, Ornithonyssus sp, Argus sp, Allopsoroptoides galli, Neocnemidocoptes gallinae, Knemidocoptes mutans, Laminosioptes cysticola, Megninia cubitalis, Megninia ginglymura, Pterolichus obtus, Syringophilus bipectinatus, Columbiphilus polonica, Deroglyphus elongates, Gaudoglyphus minor, Otodectes cynotis, Cheyletiella yasguri, Demodex sp., Notoederes cati, Cheyletiella sp., Psoroptes sp., Chorioptes sp., Psorergates ovis, Sarcoptes scabiei, Psorobia ovis, Raillietia auris, Varroa sp., 및 이들의 조합
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 체외기생 응애는 Dermanyssus Gallinae(가금류 붉은 응애)인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제18항 및 제21항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 응애 침입의 방제 및/또는 감소가 응애의 25% 이상의 사멸율을 초래하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제24항에 있어서, 응애의 25% 이상의 사멸율은 조성물을 상기 응애에 적용하고/하거나 접촉한 순간으로부터 48시간 이내에 발생하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 배씽, 분무, 붓기, 페인팅, 분사, 침지 또는 더스팅에 의해 적용되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스 균주는 HIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany)에 수탁 번호 DSM 33034로 2019년 2월 21일에 기탁된 B. thuringiensis 균주 및 이의 돌연변이체인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스 균주는 HHIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany))에 2019년 2월 21일에 각각 수탁 번호 DSM 33035로 기탁된 Bacillus thuringiensis 균주 및 이의 돌연변이체인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스 균주는 HIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany)에 수탁 번호 DSM 33175로 2019년 6월 20일에 기탁된 Bacillus thuringiensis(Bt) 균주 및 이의 돌연변이체인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 조류, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 양, 토끼 및 꿀벌 종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제30항에 있어서, 조류 종은 가금류인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 사용하는 것을 포함하는, 매개물에서 응애 침입의 방제 및/또는 감소 방법.
제32항에 있어서, 응애 침입의 방제 및/또는 감소가 응애의 25% 이상의 사멸율을 초래하는, 방법.
제33항에 있어서, 응애의 25% 이상의 사멸율은 조성물을 상기 응애 및/또는 매개물에 적용하고/하거나 접촉한 순간으로부터 48시간 내에 발생되는, 방법.
제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 배씽, 분무, 붓기, 페인팅, 분사, 침지 또는 더스팅에 의해 적용되는, 방법.
제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 매개물은 동물이 있는 구내에 위치하는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 추가의 활성 성분을 포함하고, 상기 추가의 활성 성분이 에센셜 오일 또는 미네랄 오일인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제37항에 있어서, 상기 조성물이 에센셜 오일 또는 미네랄 오일로 제형화 된, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제37항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 활성 성분이 미네랄 오일이고, 바람직하게는 상기 미네랄 오일이 액체 파라핀인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 동물 또는 매개물에서, 응애 침입의 방제 및/또는 감소에 사용하기 위한, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 균주가, 응애 침입의 방제 및/또는 감소가 응애의 50% 이상의 사멸율을 초래하도록 선택되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제41항에 있어서, 응애의 50% 이상의 사멸율은, 조성물을 상기 응애 및/또는 매개물에 적용하고/하거나 접촉한 순간으로부터 48시간 내에 발생되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제41항 또는 제42항에 있어서, 응애의 50% 이상의 사멸율, 바람직하게는 조성물을 상기 응애 및/또는 매개물에 적용하고/하거나 접촉한 순간으로부터 48시간 내에 발생되는 응애의 50% 이상의 사멸율은 배씽, 분무, 붓기, 페인팅, 분사, 침지 또는 더스팅에 의해 수행되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 응애는 체외기생 응애인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제44항에 있어서, 상기 체외기생 응애는 하기:
Dermanyssus sp, Ornithonyssus sp, Argus sp, Allopsoroptoides galli, Neocnemidocoptes gallinae, Knemidocoptes mutans, Laminosioptes cysticola, Megninia cubitalis, Megninia ginglymura, Pterolichus obtus, Syringophilus bipectinatus, Columbiphilus polonica, Deroglyphus elongates, Gaudoglyphus minor, Otodectes cynotis, Cheyletiella yasguri, Demodex sp., Notoederes cati, Cheyletiella sp., Psoroptes sp., Chorioptes sp., Psorergates ovis, Sarcoptes scabiei, Psorobia ovis, Raillietia auris, Varroa sp., 및 이들의 조합
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제45항에 있어서, 체외기생 응애는 Dermanyssus Gallinae(가금류 붉은 응애)인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 응애 침입의 방제 및/또는 감소가 조류, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 양, 토끼 및 꿀벌 종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 동물에서 수행되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제47항에 있어서, 조류 종은 가금류인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 배씽, 분무, 붓기, 페인팅, 분사, 침지 또는 더스팅에 의한 적용에 적합한, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 분무에 의한 적용에 적합한, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제37항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 응애 침입의 방제 및/또는 감소는 매개물에서 수행되고, 상기 매개물은 동물이 있는 구내에 위치하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
응애 침입을 방제하거나 감소시키는데 적합한 약제학적 또는 살생물제 조성물로서,
활성 성분으로서 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis) 균주의 박테리아 제제를 포함하고,
상기 박테리아 제제는 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스 균주의 생존가능 포자 유효량을 포함하는,
약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항에 있어서, 박테리아 제제는 더마니소스 갈리내(Dermanyssus gallinae)(가금류 붉은 응애)에 의해 생성된 응애 침입을 제어하거나 감소시키는 데 적합한 하나 이상의 B. thuringiensis 균주의 생존가능 포자 유효량을 포함하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스 균주는 B. thuringiensis 아종 Kurstaki 보다 적은 양의 B. thuringiensis 비포자 단백질을 생산하는 균주인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스 균주는 ml 당 매 3.1 × 10⁹개의 생존가능 포자에 대해 1.7 mg/ml 미만의 바실러스 투린지엔시스의 비포자 단백질을 생산하는 균주인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제3항 또는 제4항에 있어서, B. thuringiensis의 비포자 단백질은 델타(δ)-내독소, 단백질 Cry 및 Cyt, 식물성 살충 단백질(Vip1, Vip2, Vip3 및 Vip4), 분비된 살충 단백질(Sip 단백질), β-외독소(투린지엔신(thuringiensin)), 콜레스테롤-의존성 세포용해소 연관 단백질(스페리콜리신(sphaericolysins) 및 폐포 용해소(alveolysins)), 강화형 단백질(Enhancing-like proteins)(Bel 강화 단백질), 헬퍼 단백질(P19 및 P20 단백질), 또는 비단백질성 β-외독소(Bt 41.9-kDa 단백질)로 이루어진 목록에서 선택되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 제제가 조성물 ml당 1 × 10⁴cfu 이상의 생존가능 포자 유효량을 포함하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 살충제, 살비제, 살진균제, 살선충제, 항생제, 세정제, 면역원성 제제, 동물 사료, 에센셜 오일, 미네랄 오일, 기능식품, 프로바이오틱, 프리바이오틱, 공생제, 다당류, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 활성 또는 기능성 성분을 더 포함하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제7항에 있어서, 추가 활성 성분이 미네랄 오일이고, 상기 미네랄 오일이 액체 파라핀인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바실러스 투린지엔시스 균주가
a. HIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany)에 수탁 번호 DSM 33034로 2019년 2월 21일에 기탁된 B. thuringiensis 균주 및 이의 돌연변이체;
HHIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany))에 2019년 2월 21일에 각각 수탁 번호 DSM 33035로 기탁된 Bacillus thuringiensis 균주 및 이의 돌연변이체; 및
HIPRA SCIENTFIC, SLU(Avda de La Selva 135, 17170 Amer, Girona, Spain)에 의해 부다페스트 조약에 따라 Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germany)에 수탁 번호 DSM 33175로 2019년 6월 20일에 기탁된 Bacillus thuringiensis(Bt) 균주 및 이의 돌연변이체
로 이루어진 그룹에서 선택되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약제 또는 살생물제로 사용하기 위한, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 체외기생 응애 침입의 방제 및/또는 감소에 사용하기 위한, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 필요 동물의 체외기생 응애에 의해 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 체외기생 응애는 하기:
Dermanyssus sp ., Ornithonyssus sp ., Argus sp ., Allopsoroptoides galli , Neocnemidocoptes gallinae , Knemidocoptes mutans , Laminosioptes cysticola , Megninia cubitalis , Megninia ginglymura , Pterolichus obtus , Syringophilus bipectinatus, Columbiphilus polonica , Deroglyphus elongates, Gaudoglyphus minor, Otodectes cynotis , Cheyletiella yasguri , Demodex sp ., Notoederes cati , Cheyletella sp ., Psoroptes sp ., Chorioptes sp ., Psorergates ovis , Srcoptes scabiei, Psorobia ovis, Raillietia auris, Varroa sp., 및 이들의 조합
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제13항에 있어서, 체외기생 응애는 Dermanyssus Gallinae(가금류 붉은 응애)인, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 비히클 및/또는 허용가능한 보조제를 추가로 포함하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 배씽, 분무, 붓기, 페인팅, 분사, 침지 또는 더스팅에 의해 적용되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 조류, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 양, 토끼 및 꿀벌 종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 동물에 적용되는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제11항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 응애 침입의 방제 및/또는 감소가 응애의 25% 이상의 사멸율을 초래하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제18항에 있어서, 응애의 25% 이상의 사멸율은 조성물을 상기 응애에 적용하고/하거나 접촉한 순간으로부터 48시간 이내에 발생하는, 약제학적 또는 살생물제 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 사용하는 것을 포함하는, 매개물에서 응애 침입의 방제 및/또는 감소 방법.