CN113207912A - 一种鸡大肠杆菌生物消毒剂及其制备与应用 - Google Patents

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杨瑞钰
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杨慧敏
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Abstract

本发明具体提供一种鸡大肠杆菌生物消毒剂，采用采用的Ecp2、Ecp3、Ecp6三株鸡大肠杆菌噬菌体为原料，对于鸡大肠杆菌病爆发鸡舍具有良好的消毒作用，本发明提供的一种鸡大肠杆菌生物消毒剂，消毒效果优于葵甲溴铵消毒效果，并且作用时间短，见效快，能够显著降低鸡舍内的细菌总数，喷雾消毒30min后，菌量减少至对照组的0.30％，喷雾70min后细菌量仅为对照组的0.10％，比葵甲溴铵消毒剂对细菌总数的杀灭作用更为显著，对于开发绿色无公害的环境消毒剂及提升肉鸡养殖经济效益具有良好的效果。

Description

一种鸡大肠杆菌生物消毒剂及其制备与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物制剂制备的技术领域，具体涉及一种鸡大肠杆菌生物消毒剂及其制备与应用的技术领域。
背景技术
我国是世界第一养鸡大国，年养鸡总量超过40亿只份，新疆肉鸡存栏数4000万-5000万只，蛋鸡存栏数700-800万只。鸡大肠杆菌病居鸡细菌疾病之首，约占33％。我国每年因大肠杆菌病死亡鸡3107万多只，经济损失3亿多元。据不完全统计，鸡大肠杆菌病给鸡场造成的直接或间接经济损失占饲养成本的8％-11％。传统药物防治方法已经面临耐药性、用药成本升高以及污染环境等问题的挑战。另外，由于长期使用抗菌药，使产品存在药物残留，导致品质下降，很难满足绿色健康养殖的要求。
畜禽规模化养殖中的一个重要问题就是在养殖过程中的污染问题，这不仅仅是我国乡村环境污染的主要来源，并且由养殖环境问题所爆发的疫病也给养殖户造成了巨大的经济损失，同时也对我国的社会经济、公共安全以及动物和动物产品的国际贸易造成了严重影响。养殖场为了控制环境污染问题会频繁的大量使用各种化学消毒剂，但是化学消毒剂不仅会影响动物机体，造成畜禽的残疾、死亡等生产事故，还对对养殖场工作人员的身体健康产生不良影响，导致发生过敏等症状，更甚者还会产生中毒症状。面对化学消毒剂所带来的各种问题，人们迫切的需要一种新型无污染的消毒剂来取代传统消毒剂。
噬菌体作为一种天然而安全的抗生素替代品防治细菌性疾病引起人们的高度关注，申请号为201210570103.2的发明专利提供了一株具有环境消毒能力的噬菌体及其用途，在实验室对于肠杆菌科细菌具有较好的裂解作用，但在实际使用中效果差距较大；申请号为202010160390.4的专利披露了一种大肠杆菌噬菌体组合物及其应用，所述的组合物PD06+PD114的最高大肠杆菌的杀菌率仅为90.84％。
基于上述噬菌体生物制剂对于鸡大肠杆菌病感病鸡舍消毒情况不理想的问题，本课题组前期通过双层琼脂平板法分离得到7株鸡致病性大肠杆菌裂解性噬菌体，分别命名为Ecp1、Ecp2、Ecp3、Ecp4、Ecp5、Ecp6、Ecp7，并进行了简单混合饮水饲喂，获得了较好的饲喂效果。在此基础上，为进一步提升噬菌体生物制剂对于肉鸡养殖中的应用及凸显经济附加值，探寻效果更优的噬菌体生物消毒剂。
发明内容
针对现有技术中存在现有的噬菌体制剂对于鸡大肠杆菌病感病鸡舍消毒情况不理想，消毒作用时间长的技术问题，为此，本发明利用致病性大肠杆菌裂解性噬菌体进行组伍，制备鸡大肠杆菌生物消毒剂。本发明的目的在于提供一种鸡大肠杆菌生物消毒剂，对于鸡大肠杆菌病爆发鸡舍具有良好的消毒作用，消毒效果优于葵甲溴铵消毒效果，并且作用时间短，见效快，能够显著降低鸡舍内的细菌总数，对于开发绿色无公害的环境消毒剂及提升肉鸡养殖经济效益具有良好的效果。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明具体提供一种鸡大肠杆菌生物消毒剂，所述的鸡大肠杆菌生物消毒剂包含大肠杆菌噬菌体Ecp2、Ecp3、Ecp6。
优选的，所述的大肠杆菌噬菌体Ecp2、Ecp3、Ecp6混合体积比比例为1:1:(3-1)。
更有选的，所述的大肠杆菌噬菌体Ecp2、Ecp3、Ecp6混合体积比比例为1:1:1。
优选的，一种鸡大肠杆菌生物消毒剂中噬菌体效价不低于108pfu/ml。
本发明中，采用的Ecp2、Ecp3、Ecp6三株噬菌体，通过纯化培养，对其形成的噬菌斑及具体形态观察，并结合分子水平鉴定为常规的大肠杆菌噬菌体，噬菌体均为农业部允许使用的无害安全菌株，普通技术人员可以通过公众渠道获得，上述三株噬菌体的培养条件及培养基都可采用本领域常见报道获得。
本发明提供经过上述制备工艺获得的一种鸡大肠杆菌生物消毒剂在鸡大肠杆菌病感染鸡舍消毒中的应用。
所述的，一种鸡大肠杆菌生物消毒剂在鸡大肠杆菌病感染鸡舍消毒中的应用，施用方式为喷洒，稀释倍数为1:50。
所述的，一种鸡大肠杆菌生物消毒剂在鸡大肠杆菌病感染鸡舍消毒中的应用，喷洒量为15ml/m3，早晚各一次。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：
(1)本发明的目的在于提供一种鸡大肠杆菌生物消毒剂，对于鸡大肠杆菌病爆发鸡舍具有良好的消毒作用，本发明的目的在于提供一种鸡大肠杆菌生物消毒剂，消毒效果优于葵甲溴铵消毒效果，并且作用时间短，见效快，能够显著降低鸡舍内的细菌总数，对于开发绿色无公害的环境消毒剂及提升肉鸡养殖经济效益具有良好的效果。
(2)使本发明提供的鸡大肠杆菌生物消毒剂喷雾消毒30min后，菌量减少至对照组的0.30％，喷雾70min后细菌量仅为对照组的0.10％。
(2)使本发明提供的鸡大肠杆菌对鸡舍地面的消毒效果与对照组相比，葵甲溴铵消毒剂组的消毒效果差异显著(P<0.05)，而噬菌体组消毒效果差异极显著(P<0.001)，这表示噬菌体作为消毒剂比葵甲溴铵消毒剂对细菌总数的杀灭作用更为显著。
(3)使本发明提供的鸡大肠杆菌对鸡舍空气的消毒效果：噬菌体组消毒后肠杆菌科细菌数极显著低于对照组(P<0.01)，这说明噬菌体在鸡舍空气消毒中对肠杆菌科细菌有极明显的消毒效果。
(4)使本发明提供的鸡大肠杆菌对鸡舍粉尘的消毒效果：噬菌体组对鸡舍粉尘中的细菌总数和肠杆菌科细菌有极显著的消毒效果且极显著优于葵甲溴铵类消毒剂。
附图说明
无
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中采用的试剂有：LB培养基、海藻酸钠、壳聚糖、氯化钙、柠檬酸钠。
本发明中采用的仪器设备有：单人双面洁净工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；海尔4℃冰箱：山东青岛海尔集团；电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；恒温培养震荡箱：上海智城分析仪器制造有限公司；台式离心机：德国Hettich；超速冷冻离心机：美国Thermo；KDM型可调温电热套：江苏南通加热设备有限公司；涂布器；恒温培养箱：上海精宏试验设备有限公司；电子天平(JY1002上海精密科学仪器有限公司)；微孔滤膜(0.22μm)：上海兴亚净化材料厂(和过滤膜安装后进行高压后使用)；微量移液枪：美国eppendorf；培养皿；高压锅；游标卡尺等。
所述试剂、材料均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。
本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例一：一种鸡大肠杆菌生物消毒剂
本发明具体提供一种鸡大肠杆菌生物消毒剂，所述的鸡大肠杆菌生物消毒剂包含大肠杆菌噬菌体Ecp2、Ecp3、Ecp6。
所述的大肠杆菌噬菌体Ecp2、Ecp3、Ecp6混合体积比比例为1:1:(3-1)。
实施例二：一种鸡大肠杆菌生物消毒剂的制备方法
本发明具体提供一种鸡大肠杆菌生物消毒剂的制备方法，具体的生产步骤如下：
将分离得到Ecp2、Ecp3、Ecp6的3株噬菌体从-80℃冰箱取出，将相应的宿主菌用液体LB扩增繁殖8-12h，取菌液和噬菌体各1ml加入5ml装有LB液体培养基的试管中，37℃160r/min震荡培养8-12小时，测定噬菌体效价达到108pfu/ml以上，即完成噬菌体的增殖，按照体积比例混合，即制得鸡大肠杆菌生物消毒剂。
实施例三：一种鸡大肠杆菌生物消毒剂
将分离得到Ecp2、Ecp3、Ecp6的3株噬菌体从-80℃冰箱取出，将相应的宿主菌用液体LB扩增繁殖8-12h，取菌液和噬菌体各1ml加入5ml装有LB液体培养基的试管中，37℃160r/min震荡培养8-12小时，测定噬菌体效价达到108pfu/ml以上，即完成噬菌体的增殖，按照1:1:3体积比例混合，即制得鸡大肠杆菌生物消毒剂。
实施例四：一种鸡大肠杆菌生物消毒剂
将分离得到Ecp2、Ecp3、Ecp6的3株噬菌体从-80℃冰箱取出，将相应的宿主菌用液体LB扩增繁殖8-12h，取菌液和噬菌体各1ml加入5ml装有LB液体培养基的试管中，37℃160r/min震荡培养8-12小时，测定噬菌体效价达到108pfu/ml以上，即完成噬菌体的增殖，按照1:1:2体积比例混合，即制得鸡大肠杆菌生物消毒剂。
实施例五：一种鸡大肠杆菌生物消毒剂
将分离得到Ecp2、Ecp3、Ecp6的3株噬菌体从-80℃冰箱取出，将相应的宿主菌用液体LB扩增繁殖8-12h，取菌液和噬菌体各1ml加入5ml装有LB液体培养基的试管中，37℃160r/min震荡培养8-12小时，测定噬菌体效价达到108pfu/ml以上，即完成噬菌体的增殖，按照1:1:1体积比例混合，即制得鸡大肠杆菌生物消毒剂。
实施例六：不同噬菌体混合比例效果测定
选取上述实施例三至实施例五中制备的鸡大肠杆菌生物消毒剂进行灭菌效果测定。
将采集的鸡粪样品中采集纯化获得的45株鸡致病性大肠杆菌悬液1ml加入锥形瓶中，37℃振荡培养24h。取3个高压过的EP管，用微量移液器向每管分别加入按照不同比例噬菌体混合制备获得的鸡大肠杆菌生物消毒剂0.2ml，通过轻微振荡使其充分混匀，在室温下静置10-15min。再将EP管中宿主菌和噬菌体的混合物，于37℃恒温温箱中经过8-12h的倒置培养，然后对液体澄清度情况进行观察。
通过观察发现，按照1:1:3、1:1:2、1:1:1体积比例混合的混合噬菌体液体对于鸡粪样品中纯化的大肠杆菌均具有裂解效果，且均具有维持液体澄清的特性，其中按照1:1:1体积比例混合的混合噬菌体液体所能够维持的液体澄清情况最佳。
实施例七：鸡大肠杆菌生物消毒剂消毒效果测定
基于上述实施例六，选用实施例五中技术方案制备获得的鸡大肠杆菌生物消毒剂进行消毒效果测定。
选取鸡大肠杆菌病爆发鸡舍1栋，划分三块互不相通区域：
采用制备获得的鸡大肠杆菌生物消毒剂采用无菌水进行稀释，稀释倍数为1:50，喷洒量为15ml/m3，对鸡舍地面、鸡舍空气、鸡舍粉尘进行消毒，早晚各一次，为噬菌体组；
采用常规葵甲溴铵消毒剂消毒法对鸡舍地面、鸡舍空气、鸡舍粉尘进行消毒，为葵甲溴铵消毒剂组；
不做任何处理为对照组；
消毒30min后对圈舍相应区域细菌总数进行测定，并比较各处理组之间的差异。结果如下：
(1)噬菌体对宿主菌的喷雾消毒效果：使用噬菌体喷雾消毒30min后，菌量减少至对照组的0.30％，随着作用时间增长，细菌含量呈现逐渐下降趋势，喷雾70min后细菌量仅为对照组的0.10％，说明喷雾形式的噬菌体对宿主菌有及其明显的杀灭作用，30min就能杀灭99％以上的细菌。
(2)对鸡舍地面的消毒效果：与对照组相比，葵甲溴铵消毒剂组的消毒效果差异显著(P<0.05)，而噬菌体组消毒效果差异极显著(P<0.001)，这表示噬菌体作为消毒剂比葵甲溴铵消毒剂对细菌总数的杀灭作用更为显著。
(3)对鸡舍空气的消毒效果：噬菌体组消毒后肠杆菌科细菌数极显著低于对照组(P<0.01)，这说明噬菌体在鸡舍空气消毒中对肠杆菌科细菌有极明显的消毒效果。
对鸡舍粉尘的消毒效果：噬菌体组对鸡舍粉尘中的细菌总数和肠杆菌科细菌有极显著的消毒效果且极显著优于葵甲溴铵类消毒剂。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种鸡大肠杆菌生物消毒剂，其特征在于，包括以下组分：包含大肠杆菌噬菌体Ecp2、Ecp3、Ecp6。
2.如权利要求1所述的一种鸡大肠杆菌生物消毒剂，其特征在于，所述的大肠杆菌噬菌体Ecp2、Ecp3、Ecp6混合体积比比例为1:1:(1-3)。
3.如权利要求1所述的一种鸡大肠杆菌生物消毒剂，其特征在于，所述的大肠杆菌噬菌体Ecp2、Ecp3、Ecp6混合体积比比例为1:1:1。
4.如权利要求1所述的一种鸡大肠杆菌生物消毒剂，其特征在于，所述的大鸡大肠杆菌生物消毒剂中噬菌体效价不低于108pfu/ml。
5.如权利要求1-4任意一项所述制备获得的一种鸡大肠杆菌生物消毒剂在鸡大肠杆菌病感染鸡舍消毒中的应用。
6.如权利要求5所述制备获得的一种鸡大肠杆菌生物消毒剂在鸡大肠杆菌病感染鸡舍消毒中的应用，其特征在于，施用方式为喷洒，稀释倍数为1:50。
7.如权利要求5所述制备获得的一种鸡大肠杆菌生物消毒剂在鸡大肠杆菌病感染鸡舍消毒中的应用，其特征在于，喷洒量为15ml/m3，早晚各一次。
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