CN112442487A - 哈维氏弧菌高效裂解性噬菌体vB-VhaS-yong1及其应用 - Google Patents

哈维氏弧菌高效裂解性噬菌体vB-VhaS-yong1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种哈维氏弧菌高效裂解性噬菌体vB_VhaS‑yong1及其应用，涉及哈维氏弧菌污染和感染的生物处理。vB_VhaS‑yong1保藏于微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18193。vB_VhaS‑yong1的基因组为双链DNA，全长为82703bp，其序列不存在于已有数据库中，是一株未被报导的新的噬菌体。vB_VhaS‑yong1基因组含有126个ORF，不编码毒素和抗生素抗性基因。vB_VhaS‑yong1对动物有明显的保护作用。vB_VhaS‑yong1的应用，用于特异性地抑制、杀死高致病性哈维氏弧菌。

Description

哈维氏弧菌高效裂解性噬菌体vB_VhaS-Yong1及其应用
技术领域
本发明涉及一种病原菌的噬菌体，尤其是涉及一种哈维氏弧菌高效烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 1及其应用。
背景技术
为了防控疾病，抗生素和消毒剂被广泛使用。然而，滥用抗生素使细菌产生耐药性，超级细菌不断产生，严重威胁人类和动物健康；抗生素和消毒剂没有专一性，破坏我们依赖的正常菌群，损害健康并危害环境的微生态平衡；养殖产品中残留的抗生素等残留药物一旦被人体摄入，会影响肠道细菌群落、抑制免疫系统，危害人类健康。
噬菌体(phage)是感染细菌、真菌的病毒。根据生命周期的不同，噬菌体可以分为裂解性噬菌体(lytic phage)和温和性噬菌体(temperate phage)。裂解性噬菌体又可以称为烈性噬菌体或者毒性噬菌体(virulent phage)。裂解性噬菌体进入宿主菌体内后，开始了自己的生命循环，进行不断地复制、增殖得到大量的子代噬菌体，宿主菌被裂解；温和性噬菌体进入宿主菌后，将自身的基因组整合于宿主菌的基因组中，并随着宿主菌的不断分裂传递给子代。噬菌体安全性较高，是最具潜力的抗生素替代品。烈性噬菌体在抗菌药物研发方面具有巨大的潜力和优势。烈性噬菌体特异性侵染目标细菌，将其裂解，并且不感染人和动、植物，也不会对正常微生物群落和环境造成污染，噬菌体具有宿主依赖性，随宿主的清除而消亡，不会残留在动物体内。
哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)属于弧菌科，弧菌属。哈维氏弧菌广泛分布于养殖海水、浮游动植物体表、海底沉积物以及水产动物体内外。因宿主种类和自身健康状况差异的原因，感染哈维氏弧菌而呈现不同症状，如大黄鱼的“烂尾病”、花鲈的“体表溃烂病”和遮目鱼的“眼病”等。哈维氏弧菌可感染螃蟹等甲壳类动物，对虾的种苗、幼体和成体，而且发病率很高。在日本、印度、委内瑞拉、澳大利亚、美国南部以及中国(包括台湾)等国家和地区，哈维氏菌是养殖对虾最主要的病原菌，对虾被感染后一般会出现红眼、肌肉白浊等症状，对虾苗期和动物幼体常被感染，死亡率几乎达100％。成虾感染哈维氏菌后主要症状表现为胰腺、心脏、淋巴器官的坏死、出现发光病等。哈维氏弧菌和溶藻弧菌是梭子蟹育苗期的主要致病性病原，往往给养殖业带来惨重的损失。研发能够高效裂解哈维氏弧菌的噬菌体具有重要的现实意义。宁波大学李登峰课题组从发病梭子蟹分离了一株高致病性哈维氏弧菌LDF，梭子蟹幼体、幼苗的主要致病菌。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可高效、快速地裂解哈维氏弧菌的噬菌体及其应用。该噬菌体特异性感染、裂解哈维氏弧菌。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种以致病性哈维氏弧菌LDF株为靶标分离获得的特异侵染哈维氏弧菌的裂解性噬菌体，依据噬菌体命名原则命名为vB_VhaS-Yong 1(即Virus of bacteria，Vibrio harveyi，Siphoviridae的缩写)，分类上属于长尾科Siphoviridae。vB_VhaS-Yong 1于2019年7月10日保藏于微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18193，保藏机构地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
该噬菌体的生物学特征如下：噬菌体vB_VhaS-Yong 1具有呈现二十面体近似球形的头部，直径约为58nm，尾部长度约为212nm；噬菌体vB_VhaS-Yong 1在哈维氏弧菌的菌平板上可以形成透明的噬菌斑；噬菌体vB_VhaS-Yong 1可裂解哈维氏弧菌，使菌液澄清化；噬菌体vB_VhaS-Yong 1的宿主范围具有株特异性；vB_VhaS-Yong 1基因组为双链DNA(dsDNA)，全长为82703bp，GC含量为47.54％。BLAST比对表明vB_VhaS-Yong 1序列不存在于已有数据库中，是一株未被报导的新的噬菌体。vB_VhaS-Yong 1基因组含有126个ORF。vB_VhaS-Yong 1对感染哈维氏弧菌LDF的三疣梭子蟹幼苗的相对保护率为27.0％。
上述噬菌体vB_VhaS-Yong 1的分离纯化方法，具体包括如下步骤：
(1)哈维氏弧菌LDF的活化、培养
取哈维氏弧菌LDF菌种划线接种于含2％(W/V)琼脂的LB海水固体培养基平板上，29℃倒置培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL LB海水液体培养基的试管内，摇床(29℃、180rpm)培养12小时。从试管中取1mL液体培养液1∶100(V/V)稀释至装有100mL LB海水液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床(29℃、180rpm)上扩大培养至菌液OD600≈0.6(约3h)，即得到对数期菌液。
(2)噬菌体的富集
噬菌体vB_VhaS-Yong 1分离自浙江省宁波市北仑区梅山岛海水水(Northlatitude：29.7831421；East longitude：121.9586032)。从海边中采集表层水样，置冰盒内，并立即带回实验室处理。将采集的水样离心(4℃，10000g，10min)后取40mL上清液于锥形瓶中，瓶中另加入20mL 3×LB海水液体培养基与1mL对数期哈维氏弧菌LDF菌液(OD600≈0.6)，混匀后放置于摇床(29℃、220rpm)上培养3小时进行噬菌体富集。将培养液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤。取一支试管，加入4mL上述过滤液、2mL 3×LB海水液体培养基、100μL对数期哈维氏弧菌LDF菌液混匀，作为实验组。另取一支试管加入6mL LB海水液体培养基、100μL对数期哈维氏弧菌LDF菌液混匀，作为对照组。将实验组、对照组试管放置于摇床(29℃、220rpm)上培养至实验组与对照组液体有肉眼可见差异(实验组培养液变澄清或出现细菌碎片)后将实验组培养液继续下一步实验或者4℃避光保存。
(3)噬菌体的分离、纯化
将步骤(2)获得的噬菌体培养液离心(4℃，10000g，10min)取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤后，用LB海水液体培养基做10倍梯度稀释，取各稀释度的稀释液100μL分别与200μL对数期LDF菌液混合，放置于29℃恒温培养箱中孵育10min使噬菌体吸附。从45℃水浴中取出一份4mL/管分装的含0.7％(W/V)琼脂的LB海水培养基，立刻与孵育后的噬菌体-菌混合液混合，漩涡震荡3秒混匀后倒于已于37℃预热30min的LB海水固体培养基平板上，均匀铺平。待凝固后将双层平板置于29℃培养箱中过夜培养，至平板上有噬菌斑形成。选取噬菌斑密度合适的平板，挑取单个噬菌斑中心位置琼脂置于5mL对数期哈维氏弧菌LDF菌液中，摇床(29℃、220rpm)上培养至宿主菌裂解澄清。将培养液离心(4℃，10000g，10min)后取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，过滤液即为新一代噬菌体原液。新噬菌体原液继续使用上述双层平板法重复进行三代噬菌体分离、纯化实验，即得到纯化的噬菌体vB_VhaS-Yong 1原液。
(4)噬菌体的扩大培养
将步骤(3)纯化得到的第三代噬菌体-菌培养裂解液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，将过滤液与对数期哈维氏弧菌LDF菌液按体积200μL∶20mL的比例混合作为实验组，设置20mL对数期LDF菌液作为对照组，一起放置于摇床(29℃，220rpm)上培养，至实验组与对照组液体出现肉眼可见差异时停止培养。将噬菌体-菌培养裂解液置于4℃保存。
(5)噬菌体悬液制备
取步骤(4)制备的噬菌体-菌培养裂解液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，即为噬菌体vB_VhaS-Yong 1悬液。
上述裂解性噬菌体vB_VhaS-Yong 1的应用，用于抑制哈维氏弧菌生长、杀死哈维氏弧菌。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种新的哈维氏弧菌裂解性噬菌体vB_VhaS-Yong 1及其分离方法和应用，此裂解病毒vB_VhaS-Yong 1可高效裂解哈维氏弧菌；该病毒具有高特异性，专一性感染、裂解哈维氏弧菌，这是保证生态安全的重要前提；成本低，培养大量vB_VhaS-Yong 1较为容易；操作简单，且不会造成环境污染；是一种新型的控制哈维氏弧菌的技术，具有良好的发展前景。
综上所述，本发明提供一种新的哈维氏弧菌裂解性噬菌体vB_VhaS-Yong 1及其分离方法和应用，该噬菌体可高效、快速、专一地感染、杀死哈维氏弧菌LDF。
附图说明
图1为噬菌体vB_VhaS-Yong 1在哈维氏弧菌LDF双层平板上的噬菌斑
图2左侧试管为哈维氏弧菌LDF对照菌液，右侧试管中的LDF菌液因添加了噬菌体vB_VhaS-Yong 1而变澄清。
图3为负染的噬菌体vB_VhaS-Yong 1的透射电镜图
图4为噬菌体vB_VhaS-Yong 1基因组序列在Genbank中进行Blastn比对的结果
图5为动物保护实验各组梭子蟹累积死亡率折线图
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述
实施例1
噬菌体vB_VhaS-Yong 1的分离纯化
水样采自浙江省宁波市北仑区梅山岛海水；靶标宿主菌为哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)LDF，具体制备方法如下：
(1)哈维氏弧菌LDF的活化、培养
取哈维氏弧菌LDF菌种划线接种于含2％(W/V)琼脂的LB海水固体培养基平板上，29℃倒置培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL LB海水液体培养基的试管内，摇床(29℃、180rpm)培养12小时。从试管中取1mL液体培养液1∶100(V/V)稀释至装有100mL LB海水液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床(29℃、180rpm)上扩大培养至菌液OD600≈0.6(约3h)，即得到对数期菌液。
(2)噬菌体的富集
噬菌体vB_VhaS-Yong 1分离自浙江省宁波市北仑区梅山岛海水(Northlatitude：29.7831421；East longitude：121.9586032)。从海边中采集表层水样，置冰盒内，并立即带回实验室处理。将采集的水样离心(4℃，10000g，10min)后取40mL上清液于锥形瓶中，瓶中另加入20mL 3×LB海水液体培养基与1mL对数期哈维氏弧菌LDF菌液(OD600≈0.6)，混匀后放置于摇床(29℃、220rpm)上培养3小时进行噬菌体富集。将培养液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤。取一支试管，加入4mL上述过滤液、2mL 3×LB海水液体培养基、100μL对数期哈维氏弧菌LDF菌液混匀，作为实验组。另取一支试管加入6mL LB海水液体培养基、100μL对数期哈维氏弧菌LDF菌液混匀，作为对照组。将实验组、对照组试管放置于摇床(29℃、220rpm)上培养至实验组与对照组液体有肉眼可见差异(实验组培养液变澄清或出现细菌碎片)后将实验组培养液继续下一步实验或者4℃避光保存。
(3)噬菌体的分离、纯化
将步骤(2)获得的噬菌体培养液离心(4℃，10000g，10min)取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤后用LB海水液体培养基做10倍梯度稀释，取各稀释度的稀释液100μL分别与200μL对数期LDF菌液混合，放置于29℃恒温培养箱中孵育10min使噬菌体吸附。从45℃水浴中取出一份4mL/管分装的含0.7％(W/V)琼脂的LB海水培养基，立刻与孵育后的噬菌体-菌混合液混合，漩涡震荡3秒混匀后倒于已于37℃预热30min的LB海水固体培养基平板上，均匀铺平。待凝固后将双层平板置于29℃培养箱中过夜培养，至平板上有噬菌斑形成。选取噬菌斑密度合适的平板，挑取单个噬菌斑中心位置琼脂置于5mL对数期哈维氏弧菌LDF菌液中，摇床(29℃、220rpm)上培养至宿主菌裂解澄清。将培养液离心(4℃，10000g，10min)后取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，过滤液即为新一代噬菌体原液。新噬菌体原液继续使用上述双层平板法重复进行三代噬菌体分离、纯化实验，即得到纯化的噬菌体vB_VhaS-Yong 1原液。
(4)噬菌体的扩大培养
将步骤(3)纯化得到的第三代噬菌体-菌培养裂解液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，将过滤液与对数期哈维氏弧菌LDF菌液按体积200μL∶20mL的比例混合作为实验组，设置20mL对数期LDF菌液作为对照组，一起放置于摇床(29℃，220rpm)上培养，至实验组与对照组液体出现肉眼可见差异时停止培养。将噬菌体-菌培养裂解液置于4℃保存。
(5)噬菌体悬液制备
取步骤(4)制备的噬菌体-菌培养裂解液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，即为噬菌体vB_VhaS-Yong 1悬液。
将纯化的噬菌体vB_VhaS-Yong 1与对数生长期的哈维氏弧菌LDF感染混合，进行噬菌斑实验，可以得到形态大小均一的透明的圆形噬菌斑，其周围无晕环，边缘清晰规则(图1)。将噬菌体vB_VhaS-Yong 1添加至哈维氏弧菌LDF菌液后，菌体裂解菌液变得澄清(图2)。
其中LB海水培养基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，用经棉花过滤的海水定容至1L，调pH至7.2，121℃高压灭菌20min。
3×LB海水液体培养基的配方如下：胰蛋白胨30g，酵母提取物15g，用经棉花过滤的海水定容至1L，调pH至7.2，121℃高压灭菌20min。
该纯化的噬菌体保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.18193，保藏日期2019年7月10日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
实施例2
噬菌体vB_VhaS-Yong 1的形态观察
取按实施例1步骤(5)新鲜制备(三天内)的噬菌体-菌培养裂解液先低速离心(4℃，12000g，15min)弃沉淀，上清再次离心(4℃，18000g，10min)弃沉淀，然后取1mL第二次离心上清液高速离心(4℃，58000g，1h)充分弃上清，在管中轻轻加满经过棉花过滤并高温灭菌且冷却的海水，倒掉海水后，向沉淀中加入200μL的上述灭菌海水，4℃放置等沉淀泡松后低速漩涡震荡充分混匀得到噬菌体悬液。电镜观察前用纯水将噬菌体悬液稀释10-100倍，用移液枪取一滴稀释噬菌体悬液至铜网上，静置10min后用中性滤纸从侧面轻轻吸去多余水分。在铜网上滴一滴3％乙酸双氧铀，染色30s后，迅速用中性滤纸从侧面吸去染色剂。静置10min晾干后使用透射电镜(日立H-7650)观察噬菌体形态。
结果如图2所示，该噬菌体vB_VhaS-Yong 1具有呈现二十面体近似球形的结构的头部，直径约为58nm，尾部长度约为212nm，是长尾科噬菌体。
实施例3
噬菌体vB_VhaS-Yong 1基因组序列测定和比对
噬菌体vB_VhaS-Yong 1基因组测序采用Illumina MiSeq高通量测序平台。步骤包括基因组提取、基因组文库构建、上机测序及序列拼接。
基因组提取：在噬菌体悬液中加入DNase I和RNase A至终浓度1μg/mL，37℃过夜消化，80℃灭活15min。体系中加入裂解液(0.5％SDS，50μg/mL蛋白酶K，20nM EDTA，均为终浓度)，56℃孵育1h。加入等体积平衡酚，温和振荡后4℃下10000g离心5min。收集上层液体，加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，温和振荡后4℃下10000g离心5min。收集上层液体，加入等体积氯仿，充分混匀后10000g离心5min，收集上层液体，重复2次。加入等体积异丙醇，-20℃放置至少30min，4℃下10000g离心20min，沉淀用75％乙醇洗2次。将核酸沉淀用去离子水重悬，-20℃保存。
基因组文库构建：使用试剂盒NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit forIllumina(#E7645)构建基因组文库。步骤包括1、基因组片段化：将提取的噬菌体基因组用Covaris超声波破碎仪(30s，90s，11min，L)随机打断，得到的DNA片段长度主要集中在500bp。2、末端修复：取50μL打断后的DNA片段到无核酸酶的1.5ml EP管中，分别加入3μLNEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix和7μL NEBNext Ultra II End Prep ReactionB uffer后混匀。20℃孵育30min，65℃孵育30min，4℃保存。3、添加测序接头：在上步体系中加入30μL NEBNext Ultra II Ligation Master Mix、1μL NEBNext Ligation Enhancer、2.5μL NEBNext Adaptor，混匀。20℃下孵育15min。加入3μL
Figure BSA0000188842140000071
Enzyme，充分混匀，37℃孵育15min。4、磁珠片段筛选：在上步体系中加入20μL重悬的AMPure XP磁珠，充分混匀，室温下孵育5min。将EP管置于磁力架上，轻轻旋转分开溶液与磁珠，溶液澄清后，将上清液转移到新EP管中。在上清液中加入10μL重悬的AMPure XP磁珠，充分混匀，在室温下孵育5min。将EP管置于磁力架上，轻轻旋转分开溶液与磁珠，溶液澄清后，弃上清液，保留含有所需DNA的磁珠。加入200μL新鲜制备的80％乙醇，室温下孵育30s，弃上清液，重复2次。将EP管置于磁力架上，打开盖子将磁珠干燥5min。取下EP管，加入17μL无核酸酶水将DNA洗脱，在漩涡振荡器上充分混匀，室温下孵育2min。将EP管放在磁力架上，静置3min后，吸出15μL上清液到PCR管中备用。5、添加Index、PCR扩增：在上一步获得的15μL核酸中，加入25μL NEBNextUltra II Q5 Master Mix、5μL Index Primer/i7 Primer、5μL Universal PCR Primer/i5Primer，充分混匀。进行PCR扩增，反应条件如下：98℃30秒；98℃10秒，65℃70秒，10个循环；最后65℃延伸5min。6、PCR产物纯化：将PCR产物转移至无核酸酶的1.5mL EP管中，加入45μL重悬的AMPure XP磁珠，充分混匀，室温下孵育5min。将EP管置于磁力架上，溶液澄清后，弃去上清液，保留含有所需DNA的磁珠。加入200μL新鲜制备的80％乙醇，室温下孵育30s，弃上清液，重复2次。将EP管置于磁力架上，打开盖子将磁珠干燥5min。取下EP管，加入33μL无核酸酶水洗脱DNA，充分混匀，室温下孵育2min。将EP管放在磁力架上，取30μL溶液移到新的EP管中。使用Qubit测定DNA含量。
上机测序：照Agilent High sensitivity DNA kit 2100说明书鉴定纯化后PCR产物的片段分布。通过实时荧光定量PCR进行定量，根据上机需求量将DNA样品进行混合，最后加入NaOH使DNA变性为单链。使用Illumina PE300试剂盒进行Illumina MiSeq测序。
序列拼接：通过FastQC(http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)对测序数据进行质量评估，然后用Trimmomatic v0.36软件去除低质量值的测序数据，最后使用SPAdes v3.13.0软件对过滤后的数据进行拼接，最终完成全基因组测序工作。
序列比对与注释：用NCBI提供的BLAST工具，将vB_VhaS-Yong 1基因组与所有序列比对。用RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology，http：//rast.nmpdr.org)和hmmer(http：//www.hmmer.org/)对vB_VhaS-Yong 1基因组进行功能注释。
结果发现：vB_VhaS-Yong 1基因组为双链DNA(dsDNA)，全长为82703bp，GC含量为47.54％，具体核苷酸序列见序列表SEQ ID NO.1所示。BLAST比对表明vB_VhaS-Yong 1序列不存在于已有数据库中(图4)，是一株未被报导的新的长尾科噬菌体。在Genbank中对数据库NCBI nucleotide collection(nr/nt)进行Blastn比对结果显示：与vB_VhaS-Yong 1基因组同源性最高的是噬菌体Vibrio phage vB_VcaS_HC，二者的相似性identity为97.70％，覆盖率query coverage为97％(图4)。vB_VhaS-Yong 1基因组含有126个ORF。
实施例4
噬菌体vB_VhaS-Yong 1的宿主范围检定
表1噬菌体vB_VhaS-Yong 1的宿主范围检定结果
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“+”代表感染，“-”代表不感染
将哈维氏弧菌LDF株、哈维氏弧菌SZT株及其他待试菌株(详见表1)分别培养至对数期(OD600≈0.6)。将这些对数期菌液与噬菌体vB_VhaS-Yong 1悬液分别按按体积100∶1混合作为实验组，对照组用LB海水培养基代替噬菌体，每组设两个平行，各组均置摇床上培养(29℃，180rpm)过夜，翌日用酶标仪测定各组的OD600。取平行组平均值，计算对照组与实验组平均值的比值。若比值大于1.2认为噬菌体可感染该菌，为阳性结果；反之则认为噬菌体不能感染该菌，为阴性结果；肉眼、显微镜观察感染、裂解情况，确认OD600法判定的结果。结果vB_VhaS-Yong 1对宿主感染有株特异性，只感染、裂解哈维氏弧菌LDF株。
实施例5
噬菌体vB_VhaS-Yong 1对的动物保护实验
取健康三疣梭子蟹一期幼虫，随机分为二个组，设为实验组和对照组，每组30只，分别养殖于20L的封闭水体中。实验组、对照组水体中各加入20ml浓度为109CFU/mL的哈维氏弧菌攻毒液。3小时内在实验组水体中加入20ml vB_VhaS-Yong 1噬菌体液；而对照组不加噬菌体。每日投喂一次，每间隔24h统计一次梭子蟹死亡数量。实验开始后24小时内死亡者不计入实验结果。
截至实验结束，对照组累积死亡率为80.8％，而实验组累积死亡率为53.8％。实验组累积死亡率比对照组小27.0％，即vB_VhaS-Yong 1对三疣梭子蟹幼苗的相对保护率为27.0％。
表2噬菌体vB_VhaS-Yong 1动物保护实验每日梭子蟹存活数表
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上述结果显示，噬菌体vB_VhaS-Yong 1对受哈维氏弧菌LDF感染的三疣梭子蟹有明显的保护作用。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
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Claims (8)

1.哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 1，该噬菌体于2019年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18193。
2.根据权利要求1所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 1，该噬菌体具有如下生物学特征：是首株以高致病性哈维氏弧菌LDF为靶标分离获得的噬菌体，命名为vB_VhaS-Yong 1；vB_VhaS-Yong 1可感染并裂解高致病性哈维氏弧菌LDF，使菌液澄清化，在哈维氏弧菌LDF的菌平板上可以形成透明的噬菌斑。
3.根据权利要求1所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 1，该噬菌体具有如下生物学特征：呈现二十面体近似球形的头部，直径约为58nm，尾部长度约为212nm；vB_VhaS-Yong 1基因组为双链DNA(dsDNA)，其序列不存在于已有数据库中，是一株未被报导的新的噬菌体。
4.根据权利要求1所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 1，该噬菌体具有如下生物学特征：分离自浙江省宁波市北仑区梅山岛海水，水样采集位置为Northlatitude：29.7831421，East longitude：121.9586032；具体制备方法如下：
(1)哈维氏弧菌LDF的活化、培养
取哈维氏弧菌LDF菌种划线接种于含2％琼脂的LB海水固体培养基平板上，29℃倒置培养过夜；从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL LB海水液体培养基的试管内，摇床上29℃、180rpm培养12小时后，从试管中取1mL培养液至装有100mL LB海水液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床上29℃、180rpm培养约3小时至菌液OD600≈0.6，即得到对数期菌液；
其中LB海水培养基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，用经棉花过滤的海水定容至1L，调pH至7.2，121℃高压灭菌20min；
(2)噬菌体的富集
取浙江省宁波市北仑区梅山岛海边表层海水(North latitude：29.7831421；Eastlongitude：121.9586032)，置冰盒内，并立即带回实验室，离心4℃ 10000g 10min，取40mL上清液于锥形瓶中，往瓶中加入20mL 3×LB海水液体培养基与1mL对数期哈维氏弧菌LDF菌液，混匀后放置于摇床上29℃、220rpm培养3小时进行噬菌体初步富集；将培养液离心4℃10000g 10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤；取一支试管，加入4mL上述过滤液、2mL 3×LB海水液体培养基、100μL对数期哈维氏弧菌LDF菌液，混匀，作为实验组；另取一支试管加入6mL LB海水液体培养基、100μL对数期哈维氏弧菌LDF菌液混匀，作为对照组；将实验组、对照组试管放置于摇床上29℃、220rpm培养至实验组与对照组液体有肉眼可见差异，即实验组培养液变澄清、出现细菌碎片后，将实验组培养液即噬菌体富集液继续下一步实验或者4℃避光保存；
其中，3×LB海水液体培养基的配方如下：胰蛋白胨30g，酵母提取物15g，用经棉花过滤的海水定容至1L，调pH至7.2，121℃高压灭菌20min；
(3)噬菌体的分离、纯化
将步骤(2)获得的噬菌体培养富集液离心4℃，10000g，10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤后，用LB海水液体培养基做10倍梯度稀释，取各稀释度的稀释液100μL分别与200μL对数期LDF菌液混合，放置于29℃恒温培养箱中孵育10min使噬菌体吸附；从45℃水浴中取出一份4mL/管分装的含0.7％琼脂的LB海水培养基，立刻与孵育后的噬菌体-菌混合液混合，漩涡震荡3秒混匀后，倒于已于37℃预热30min以上的LB海水固体培养基平板上，均匀铺平；待凝固后将双层平板置于29℃培养箱中过夜培养，至平板上有噬菌斑形成；选取噬菌斑密度合适的平板，挑取单个噬菌斑中心位置琼脂，置于5mL对数期哈维氏弧菌LDF菌液中，摇床上29℃、220rpm培养至宿主菌裂解澄清；将培养液离心4℃ 10000g10min后，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，过滤液即为新一代噬菌体原液；取新噬菌体原液继续使用上述双层平板法重复进行三代噬菌体分离、纯化实验，即得到纯化培养的噬菌体vB_VhaS-Yong 1原液；
(4)噬菌体的扩大培养
将步骤(3)纯化得到的第三代噬菌体-菌培养裂解液离心4℃ 10000g 10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，将过滤液与对数期哈维氏弧菌LDF菌液按体积200μL∶20mL的比例混合，作为实验组；设置20mL对数期LDF菌液作为对照组；将实验组和对照组一起放置于摇床上29℃，220rpm培养，至实验组与对照组液体出现肉眼可见差异时停止培养；将噬菌体-菌培养裂解液置于4℃保存；
(5)噬菌体悬液制备
取步骤(4)制备的噬菌体-菌培养裂解液离心4℃ 10000g 10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，即为噬菌体vB_VhaS-Yong 1悬液。
5.根据权利要求1所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 1的应用，其特征在于宿主具有种特异性和株特异性，专一性感染、裂解高致病性哈维氏弧菌。
6.根据权利要求5所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 1的应用，其特征在于对高致病性哈维氏弧菌LDF具有强烈的裂解作用，可用于抑制、杀死高致病性哈维氏弧菌LDF。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 1的应用，其特征在于对动物尤其梭子蟹具有保护作用。
8.根据权利要求1-7任意一项所述所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong1的应用，其特征在于可用于但不限于制备生物制剂，这些生物制剂可用于病害防控和食品包括水产品、生产环境或生产器具的消毒。
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