CN101495869A - 病原体检测生物传感器 - Google Patents

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Abstract

此处描述的本发明提供了检测如病原体、可溶性抗原、核酸、毒素、化学物质、植物病原体、血源病原体、细菌、病毒等目标颗粒的方法。本发明也描述了一种包含受体的发射体细胞，其中所述受体可以为抗体或Fc受体，以及用于检测样品中的目标颗粒的发射体分子，其中，被检测的目标颗粒被发射体细胞上的一个或多个受体结合。本发明也提供了用于检测样品中(包括多个样品)的目标颗粒的光电传感器设备。

Description

病原体检测生物传感器
相关申请
本申请为2004年12月1日提交的美国申请号11/001,583的部分继续申请，美国申请11/001,583为2004年1月16日提交的美国申请10/467,242的部分继续申请，美国申请10/467,242为2002年2月6日提交、以英文公开的国际申请PCT/US02/03606的美国国家阶段，该国际申请要求2001年2月7日提交的美国临时申请60/266,977的利益。
本申请也要求2005年11月30日提交的美国临时申请60/741,271的利益。
通过引用，上述申请的全部教导内容包含于此。
政府资助
本申请是利用美国空军合约no.F19628-00-C-0002的政府基金完成的，政府在本发明中具有一定权利。
背景技术
生物和化学武器(即穷人的核武器)的扩散增加了对能长时间监测环境的小型、快速、灵敏的生物剂检测器的需求。在战场条件下，有效的检测器能在检测到特定的生物或化学物质时快速警告士兵，从而能够迅速实施反措施。
这种检测器在非军事应用方面也是有益的。病人的抗生素抗性细菌的快速检测将帮助临床医生选择更有效的治疗方案。城市饮用水源的持续监测将提供潜在病原体的早期警告，从而为市政工程官员提供更多时间处理对公众的潜在健康威胁。此外，在肉禽检验中使用这些检测器对于目前的“触和闻(poke and smell)”的方法是显著的改进。通常，在医药(如兽医)、农业、环境保护(如确诊病态楼宇综合症)和食物加工或管理领域中，这种检测器是非常需要的分析和诊断设备。
所有的脊椎动物部分地通过产生极多样的抗体分子获得对外源物质(抗原)的特异性免疫反应。抗体分子高特异性结合抗原，如，它们能够差异结合两种紧密相关的细菌株、病毒、蛋白质、核酸、真菌、原生动物、多细胞寄生虫、或朊病毒，以及由这些微粒产生或诱导的产物。
抗体是由B细胞(免疫系统的一个关键部分)产生的。抗原能够通过结合B细胞表面上的抗体、导致使钙离子流入B细胞胞液内的一连串细胞内生化反应而激活B细胞。
关于抗体结构、功能和B细胞激活的回顾，参见Paul，编者，《基础免疫学(Fundamental Immunology)》，第3版，Raven出版社，纽约(1993)。
在美国专利6,087,114和6,248,542中已描述了利用抗体多样性检测多样和稀有目标颗粒或抗原的设备。
这些设备通常包括含感应细胞(如，B细胞、巨噬细胞或成纤维细胞)(此处也称为“金丝雀(CANARY)”细胞或“发射体”细胞)的液体介质、光学检测器，且该液体介质容纳要检测的目标颗粒。各细胞具有在其表面表达、并且对于被检测抗原是特异性的受体(如嵌合或单链抗体)。抗原与受体的结合导致涉及化学或生化变化(如钙离子浓度增加)的信号通路。这些细胞也在其胞液中包含能够响应于信号通路的信号(如胞液中钙浓度增加)而发射光子的发射体分子(如水母发光蛋白或indo-1)。检测器可以通过对光子透明的遮盖物(如玻璃)与含细胞的介质隔离。这种遮盖物可以用于支撑介质、保护检测器的易碎表面、或被用作透镜。光学检测器，如电荷耦合设备(CCD)，能够检测响应于受体介导信号通路而从细胞发射出的光子，并且能够提示用户存在被检测的抗原。能够在该设备中使用的其它光学检测器包括光电倍增管、光电二极管、互补型金属氧化物半导体(CMOS)成像器、雪崩光电二极管、及图像增强电荷耦合装置(ICCD)(例如，参见英国东萨塞克斯郡Photek公司提供的设备)。在一些实施例中，光学检测器能够辨别个体细胞。
发明内容
本发明提供用于检测目标颗粒的方法。特别是，提供用于检测生物剂、病原体、细菌、病毒、可溶性抗原、毒素、化学药品、炸药、核苷酸序列(例如DNA或RNA)、植物病原体、血源性病原体等的方法。
检测目标颗粒的方法包括液体样品、气溶胶样品、及干试样中的目标颗粒的检测。
本发明也提供了一种包含受体的发射体细胞，其中所述受体可以为目标抗原特异性的抗体，对通用目标(例如，如生物素的标记、或免疫球蛋白等)特异性的抗体。此外，受体可以为Fc受体。
发射体细胞进一步包括用于检测样品中的目标颗粒的发射体分子，其中，受体与目标颗粒的结合激发发射体分子的反应。在一种实施方式中，受体激发细胞内钙离子浓度增加，其中，发射体分子对细胞内钙离子浓度增加作出响应而发射光子。在一种实施方式中，发射体分子为水母发光蛋白。在另一种实施方式中，发射体分子为水母发光蛋白-GFP分子。
本发明还提供了一种使用光子检测器检测多个样品中的目标颗粒的光电子传感器设备。光电子传感器设备能够检测液体样品中的目标颗粒。可选择地，光电子传感器设备能够检测空气或气溶胶样品中的目标颗粒。在一种实施方式中，该传感器设备包括离心装置。在另一种实施方式中，该传感器设备不包括离心装置。在一种实施方式中，该传感器设备包括气溶胶喷雾器。在另一实施方式中，该传感器设备包括管吸(wicking)装置。在再一实施方式中，该传感器设备包括可移动基底。在一实施方式中，该传感器设备包括用于捕获目标颗粒的针头基底(pinhead substrate)。
目标颗粒(如可溶性抗原或核酸)的检测部分由目标颗粒与在发射体细胞的细胞表面表达的受体直接或间接结合介导。直接结合可以通过直接特异性结合目标颗粒的受体，如抗体。目标颗粒的间接结合可以通过结合已连接(结合)于目标颗粒的抗体的Fc受体。
附图简要说明
专利或申请文件至少包含一幅彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的副本。
图1为光电传感细胞概念示意图。
图2为显示具有用于初步感应可疑制剂的取样器(触发器)的光电感应器的一般结构的示意图。
图3为说明光电感应器中所用的细胞系的建立的示意图。
图4为集成生物气溶胶警告感应器(BAWS)/光电感应器系统的示意图。
图5说明在光电感应器中B细胞对口蹄疫病毒的反应。
图6说明光电感应器的干式撞击取样器模块。
图7为说明定位和混合的效果的示意图。
图8说明使用土拉菌细胞的定位效果。
图9说明用于光电感应器的自动细胞输送模块。
图10说明使用光电感应器时土拉菌细胞样品的剂量反应关系。
图11说明B细胞对化学和生物污染物的抗性。
图12说明用于光电感应器的自动离心模块。
图13为说明空气撞击取样器/光电感应器的示意图。
图14为说明光电感应器的示意图。
图15说明用于光电感应器的光学-光电倍增器(PMT)模块。
图16为说明空气撞击取样器/光电感应器的示意图。
图17为说明光电感应器中的多通道离心机的示意图。
图18为说明光电感应器中的湿式离心机/撞击取样器概念的示意图。
图19为说明光电感应器中的湿式离心机/撞击取样器概念的示意图。
图20为用于光电感应器的特制管(custom tube)的示意图。
图21说明集成的干式撞击取样器/光电感应器。
图22说明细胞处理对鼠疫杆菌(Yersenia pestit)特异性B细胞反应的影响。
图23说明设计为收集气溶胶样品的撞击取样器。
图24为解释“CANARY”传感器的概念的示意概述。B细胞已被修饰，从而其在细胞内部表达水母发光蛋白和在细胞表面表达病原体的抗体。当存在病原体时，抗体在细胞表面上“交联”(固定、聚集)，激发导致细胞内钙升高的信号级联。水母发光蛋白通过水母发光蛋白的氧化响应这种细胞内钙增加并发射光。可以使用PMT监测光子输出。
图25为DNA检测的示意图。与目标DNA序列互补、并且含末端地高辛标记的寡核苷酸与靶DNA杂交。多个沿靶DNA结合的地高辛标记的寡核苷酸与CANARY细胞(发射体细胞)表面上的地高辛抗体结合，刺激光发射。
图26A～C为曲线图。表达抗地高辛抗体的金丝雀CANARY细胞(发射体细胞)可以由地高辛标记的DNA进行刺激。向含有50μl标示浓度的地高辛标记DNA标准物的离心管中加入表达抗地高辛抗体的发射体细胞。对离心管进行短暂离心以使细胞在最接近PMT的试管底部成团，并且记录作为时间的函数的光子发射。三种不同类型的地高辛标记的DNA用于刺激细胞，并且各种地高辛标记的DNA以不同的灵敏度成功地刺激细胞。图26A，以约1ng/ml(50pg绝对量)检测极限检测用地高辛密集标记(约4000个碱基对连有200个地高辛分子)的质粒DNA。图26B，以地高辛稀疏标记(每200个碱基对标记一个)的各种尺寸(81～8576碱基对)的DNA分子量标准物在1μg/ml(50ng绝对量)处被检测。图26C，各标记了2个地高辛(DNA分子的各端一个地高辛)的各种大小(8～587个碱基对)的DNA分子量标准物在100ng/ml(5ng绝对量)处被检测。
图27A～B为曲线图。细胞离心可能降低对可溶性抗原的灵敏度。向含有50μl标示浓度的地高辛标记的质粒DNA的离心管中加入表达抗地高辛抗体的发射体细胞。图27A，对离心管进行短暂离心以使细胞在最接近PMT的试管底部成团，并且记录作为时间的函数的光子发射。图27B，细胞和DNA被手工混合，并且不进行离心而置于PMT上。
图28为曲线图。在试验条件下杂交两个互补的Dig标记寡核苷酸(寡核苷酸“3”和寡“NEG3”)。用CO2I培养基以1∶10稀释样品至100μl总体积，加入20μl细胞，并且测量光发射。Dig细胞表达Dig抗体，而对照细胞不表达。
图29为曲线图。地高辛标记的ssDNA寡核苷酸的快速杂交。标示量的寡核苷酸“NEG3”被加入到8μl杂交液中(50mM NaCL，40mMTris pH7.5)。加入1μl的“寡核苷酸3”，然后立即加入90μl CO2I培养基和20μl Dig CANARY细胞。轻弹试管以使混合，迅速置于光度计内并且监测光输出。在添加第二寡核苷酸和置于光度计内(X轴上的“0”)之间的总时间约为15秒。
图30为曲线图。由pBluescript噬粒生成单链DNA，并且与所有10个Dig标记的寡核苷酸杂交。杂交后，反应物以CO2I稀释至100μl，加入20μl Dig细胞，并且测量光发射。图例中标记的摩尔比为寡核苷酸与靶ssDNA的摩尔比。在该试验中理想的比率应在1∶2至1∶4之间。
图31为曲线图。单链DNA的序列特异性检测。10个与pBluescript噬粒的(+)链互补的地高辛标记的寡核苷酸探针与标示量的单链噬粒DNA杂交。加入表达地高辛抗体的发射体细胞，并且在光电倍增管上监测细胞的光输出。仅检测到噬粒的(+)链，说明该识别是序列特异性的。当无寡核苷酸探针时，单链DNA并不激发细胞。在该试验中检测的极限为50ng。
图32A～B为柱形图。杂交温度对核酸检测的影响。单链噬粒DNA与标示浓度的探针在多个温度下杂交，并且标绘RLU最大值。图32A，在PBS中的杂交在51℃下显示最大杂交信号，但是在47℃和42℃下的杂交样品显示类似信号。图32B，在42℃下的杂交显示使用低浓度寡核苷酸探针的试验的信号的增加，0.16pmole寡核苷酸与0.63pmole运作几乎一样好，并且，0.04pmole的信号加倍。
图33为DNA沉降方案的示意图。捕获的寡核苷酸粘附于可沉降颗粒的表面。这些寡核苷酸结合于与Dig-寡核苷酸结合区域分隔的区域。目标DNA结合捕获DNA，并且地高辛标记的寡核苷酸结合在目标上。通过离心(或磁场)沉降整个复合物，并且通过表达抗地高辛抗体的发射体细胞对复合物进行检测。
图34为曲线图。目标DNA的沉降增强灵敏度。用生物素标记的捕获寡核苷酸饱合链霉亲和素偶联的微球，通过清洗去除过量的寡核苷酸。pBluescript ssDNA(+链)与微球在47℃孵育5分钟，并清洗。加入地高辛标记的检测寡核苷酸，在47℃杂交20分钟，并且通过清洗去除多余量。微球重悬在200μl CO2I中，并且在各试验中使用40μl。
图35为柱形图。pBS噬粒ssDNA与连接于链霉素亲和素包被的聚苯乙烯微球的生物素标记的寡核苷酸和地高辛标记的寡核苷酸一起在标示浓度的封闭剂中、在47℃孵育20分钟。在室温下，微球结合的、地高辛标记的目标物质在TBS(50mM Tris，130mM NaCl)中清洗3次。微球重悬在CO2I培养基中，加入发射体细胞，并且反应物被旋转并用光度计监测光输出。
图36A～C为曲线图。图36A，当用IFNγ处理时，U937细胞表现出FcγRI表达的增加。通过免疫荧光法测量IFNγ处理(200ng/ml，空心绿色峰)或未处理(实心紫色峰)的U937细胞上的FcγRI的相对表达。图36B，U937细胞表达功能性水母发光蛋白质。当用离子霉素(50M)处理时，用钙离子-敏感荧光蛋白水母发光蛋白转染的U937细胞发射光。图36C，具有稳定的水母发光蛋白表达的U937细胞上的Fc受体交联后，光被检测到。U937细胞与10μg/ml人IgG预培养10分钟，然后清洗、并用山羊抗-人IgG(Fab2’)处理。
图37A～D为曲线图。U937细胞可以被快速工程化(engineered)以应答多种不同病原体或刺激物。U937细胞用IFNγ(200ng/ml)处理24小时，以增加内源FcγRI的表达，并且准备用于CANARY试验。然后，细胞与以下抗体一起孵育：图37A鼠抗-炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)孢子、图37B兔多克隆抗-炭疽芽胞杆菌孢子、图37C鼠抗土拉热弗朗西斯氏菌(F.tularensis)、或图37D鼠抗枯草芽孢杆菌(B.subtilis)杂交瘤上清液。然后，细胞被用于标准的CANARY试验，在该试验中，用单克隆抗体检测到少至1000cfu的炭疽芽胞杆菌孢子、用兔多克隆抗体检测到少至10,000cfu的孢子、以及10,000cfu的土拉热弗朗西斯氏菌和1000cfu枯草芽孢杆菌。
图38A～C为曲线图。快速工程化的U937细胞是特异性的，并且特异性由抗体决定。图38A，与鼠抗土拉热弗朗西斯氏菌抗体共同孵育的U937细胞对105cfu的炭疽芽胞杆菌孢子未反应，但对106cfu土拉热弗朗西斯氏菌显示反应。图38B，负载鼠抗-炭疽芽胞杆菌孢子抗体的细胞对土拉热弗朗西斯氏菌未反应，但对106cfu炭疽芽胞杆菌孢子反应。图38C，在无抗-土拉热弗朗西斯氏菌抗体时[106cfu F.t.(Noab)]，细胞对106cfu土拉热弗朗西斯氏菌未显示任何反应。
图39为16-通道传感器的说明。传感器设计为使得能够利用单光采集通道同时测量16个样品。该传感器由转子组成，该转子支承有16个围绕其圆周水平、均匀分布的1.5ml管子，并且由绕垂直轴的可变速马达驱动。单固定光子检测部件(如PMT)被置于转子的平面内正好超出管子在旋转过程中的路径之外。这样，各个管子顺序、反复地紧密接近PMT，使其光输出在各次通过时被采样。最终，由光源(红外LED)和检测器(光电晶体管)组成的光开关被用于控制检测到的光子的计数和16个域内的数据的再组织，各域分别与特定的样品相关。
图40为曲线图。来自16-通道传感器的数据显示了与在单通道仪器中获得的数据相同的LOD，除了16个样品被同时测量外。单次测量包括以下步骤：在各个1.5ml管子中准备16个样品(和/或对照)，向各个管子中引入等份发射体细胞，将管子安装到位于暗箱中的转子中，利用短暂(5秒)的高RCF(～2000g)离心旋转将发射体细胞定位到管子的底部，在测量持续期间内降低转子速度至60rpm(每秒钟各管被采样一次)，以及对于各样品生成光子计数的时间序列用于显示和/或输入到评估用的计算机算法中。
图41为便携式16通道传感器设计的说明。
图42为整合了气溶胶收集和发射体细胞输送的CANARY盘(CD)的说明。
图43为具有冲击嘴和透明管的气溶胶收集模块剖面图的说明。
图44为具有阀输送系统的发射体细胞输送模块的说明。
图45为16-通道传感器和其使用结果的概述。
图46为毒素检测的概述。
图47为表达水母发光蛋白和通用抗体受体的感应细胞的概述。
图48为可溶性单体抗原检测的示意图：方案1，单发射体细胞被工程化以表达抗相同单体抗原上的两种不同表位的两种不同的抗体。抗原的存在交联抗体，从而刺激发射体细胞发光。
图49为描述表达抗炭疽杆菌和鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)两者的抗体的细胞系各被炭疽杆菌和鼠疫耶尔森氏菌激发的结果的曲线图。这种克隆细胞系可以检测少至50cfu的任一炭疽杆菌或鼠疫耶尔森氏菌，说明两种抗体的两种抗原结合位点被表达、并且是有功能的。
图50为检测可溶性蛋白质的方案的示意图。使用两种抗体检测包含两种或多种表位的抗原，一种抗体与微球(或者结合多个抗体的任何载体)结合，并且第二种抗体由发射体细胞表达。抗原与抗体包被的微球一起孵育从而用多个抗原修饰其表面。然后将微球呈递给发射体细胞。因为抗原通过微球交联，发射体细胞抗体被交联，并且激发光发射。
图51为描述与G蛋白磁性微球交联的抗体6E10-10与不同量的BoNT/A Hc在4℃孵育3小时的结果。微球用CO2I培养基洗三次。加入表达6B2-2抗体的发射体细胞，反应物旋转5秒，并且在光度计中监测光输出。
图52为检测化学物质的示意图。与关注的化学物质特异性结合的肽被分离，并且产生与肽-化学物质复合体特异性结合的抗体。如果肽-化学物质仅形成单功能表位，则可以向肽中加入附加表位。如图所示，该表位为地高辛分子，但是任何特异性表位都可以。当存在化学物质时，化学物质-肽复合物应包括两个抗体结合位点，并且能以与蛋白质毒素相同的方式被检测。
图53为描述用于检测化学物质的可选择方法的示意图。分离与关注的化学物质顺序结合的两种肽。通过产生抗各肽-化学物质复合体的抗体、或者如图所示通过用肽标记抗体结合位点可以检测这些肽的结合。
图54为另一检测化学物质的可选择方法的示意图。结合两种关注的化学物质的肽被制备，从而形成化学物质-肽二聚体复合物。制备与该化学物质-肽二聚体复合物特异性结合的抗体。所述化学物质-肽二聚体复合物可以包含两个足以刺激发射体细胞增加细胞内钙离子的抗体结合位点，从而通过发射体分子产生光子发射。
图55为曲线图。地高辛标记的寡核苷酸被加入杂交缓冲液(40mM Tris，130mM NaCl，10mM DTT，Rnasin Plus)中的RNA，并且在47℃下孵育2分钟。加入CO2I培养基和细胞，管被旋转5秒钟，并且在PMT上监测光输出。在该试验中的检测极限为20ng。对对照RNA无反应(相反链)说明该试验是序列特异性的。
图56为示意图。抗原(包括毒素)可以包含2个或多个表位。CANARY细胞典型地表达抗目标表位的单个抗体。在最坏的情况下，抗原可以以单体形式存在。尽管CANARY细胞上的抗体能够结合单体抗原，但是抗体不能交联，并且不发射光。
图57为示意图。通过CANARY检测可溶性毒素刺激物。由杂交瘤制备抗BoNT/A Hc蛋白质(6E10-10)上的一个表位的单克隆抗体，并且与G蛋白包被的磁性微球偶联。向含有BoNT/A的溶液中加入这些微球将使微球被多份固定抗原覆盖，这样能激发CANARY细胞表达抗非覆盖型表位的抗体。
图58为曲线图。蛋白A包被的微球与6E10-10抗体偶联，并且这些微球被加入以CO2I培养基稀释的BoNT/A Hc中。管旋转2分钟，表达6B2-2抗体的CANARY细胞被加入，并且将混合物旋转5秒。使用PMT监测光输出。
图59为柱形图。冷冻储藏对BoNT Hc溶解度和抗原性的影响。使用400ng/ml BoNT Hc激发基于微球的CANARY试验。新鲜抗原的反应为背景的35倍。冷冻和解冻的抗原的反应略微降低，并且离心该冷冻-解冻物质显著降低反应，说明在冷冻-解冻过程中产生凝聚。来自同一公司的第二批BoNT Hc显示较低的反应活性，说明抗原有显著的批次差异。
图60为曲线图。血液制品中的BoNT/A Hc的检测。CANARY能检测血液制品中的可溶性BoNT/A Hc。用CO2I掺入BoNT/A Hc(400ng/ml**)、并且与微球一起孵育12分钟，产生强信号。掺入BoNT/A Hc的全血也在去除细胞物质前通过CANARY检测。掺入去除血细胞后(如别处所述处理的)的血浆的BoNT/A Hc也产生统计上显著的信号。**注意：这些试验测试冷冻和解冻BoNT/A Hc，因此，在储藏期间凝聚抗原的损失负向影响了描述的表观灵敏度。
图61为曲线图。尿液中BoNT/A Hc的检测。检测尿样中的BoNT/A无需样品制备。微球被直接加入用400ng/ml**BoNT/A Hc掺入的尿液中，孵育12分钟，并且磁性去除微球。向微球加入培养基，然后加入CANARY细胞，并且旋转样品5秒。三个掺入尿样中的两个显示显著信号，然而第三个样品的信号是低的。在微球加入前未掺入BoNT/A Hc的对照尿液无信号，说明没出现非特异性刺激物。**注意这些试验使用冷冻和解冻BoNT/A Hc，因此，在储藏期间损失的凝聚抗原负向影响了描述的表观灵敏度。
图62为示意图。替代的样品制备程序被用于源自鼻拭子的样品。样品制备需要拭子本身、含一体式5微米滤器的筐和试验管。收集拭子，裁掉拭子柄，并且将拭子头部置于滤筐中。向拭子加入CO2I培养基，并且为该装置加盖、并离心。向滤液中加入微球，并且完成试验而无进一步的改变。
图63为曲线图。如所述收集鼻拭子，将其置入滤筐内，并且加入按400ng/ml**掺入BoNT/A Hc的CO2I培养基。过滤样品，加入微球，进行试验。对这些掺入样品的反应与对无鼻“物质”存在的拟(mock)拭子的反应类似，说明以这种方式制备的鼻分泌物不含抑制物。仅加入CO2I的鼻拭子显示无反应，说明鼻拭子不含任何试验的非特异性刺激物。**注意：这些试验测试冷冻和解冻BoNT/A Hc，因此，在储藏期间凝聚抗原的损失负向影响了描述的表观灵敏度。
图64为柱形图。在不同液体中的毒素检测。BoNT/A Hc被掺入各个溶液达到标示浓度。向10μl上述溶液中加入1.4μl含560mMNaCl、1.4M pH7.9的Hepes和6E10-10偶联的顺磁性微球的溶液。样品旋转12分钟，加入190μl测试培养基，并且磁性捕获微球(30秒)。去除未结合的物质，并且将微球置于50μl测试培养基中。加入20μl表达抗6B2-2表位抗体的CANARY细胞，试管旋转5秒，并且置于光度计中。数值为峰值光输出(光子/秒)除以无抗原的培养基中的CANARY细胞的光输出(红色条，0ng/ml)的值。如通过在未添加抗原的不同基质中孵育的细胞对微球的类似反应所示，清洗步骤去除了非特异性刺激物。CANARY实验检测了掺入桔汁(绿色条)和PBT/triton(浅蓝色条)以及对照溶液(测试培养基)(红色条)中的具有80ng/ml LOD的抗原。在牛奶中(深蓝色条)的灵敏度被抑制超过5倍。
图65为曲线图。CANARY试验检测了A型肉毒毒素。以标示浓度的肉毒毒素掺入CO2I培养基。加入6E10-10微球，并孵育2分钟。加入表达6B2-2抗体的CANARY细胞，混合物旋转5秒，并监测光输出。含160pg毒素(16ng/ml)的样品刺激细胞为背景的10倍多。含32pg毒素(3.2ng/ml)的样品刺激细胞为背景的3倍多。
图66为曲线图。以标示浓度肉毒毒素掺入CO2I培养基。加入与S25抗体偶联的G蛋白微球，并且孵育2分钟。加入表达Raz抗体的CANARY细胞，混合物旋转5秒，并且监测光输出。
图67为曲线图。标示浓度的BoNT/A掺入全血。通过离心去除血细胞，向10μl所得血浆中加入6E’10-10抗体包被的磁性微球。样品旋转2分钟，加入190ml培养基，并且将管置于磁道中20秒。抽吸培养基和血浆，将管从磁体移走，并且加入50μl CO2I培养基。将CANARY细胞置于管盖内，并且样品离心5秒，以引起微球-细胞接触，将管置于光度计内，并且监测光输出。
图68为曲线图。将链霉亲和素包被的微球与已被硫代-NHS-生物素、硫代-NHS-LC-生物素或硫代-NHS-LC-LC-生物素中任一种生物素化的6E10-10抗体结合。向含有800ng/ml BoNT/A Hc的溶液中加入微球，并且孵育2分钟。加入6B2-2 CANARY细胞，将管旋转5秒，并且监测光输出。通过最长间隔臂(LCLC)连接的生物素给出略好的信号。
图69为曲线图。与链霉亲和素包被的微球结合的生物素化6E10-10被加入到标示浓度的BoNT/A中，并且在室温下旋转15分钟。加入6B2-2 CANARY细胞，旋转管5秒，并且在PMT上监测光输出。
图70为曲线图。将链霉亲和素包被的磁性微球与生物素化6C2-4和6E10-10抗体混合物结合。将微球加入到标示浓度的BoNT/A中，并且在室温下旋转15分钟。加入6B2-2 CANARY细胞，旋转管5秒，并且在PMT上监测光输出。
图71为曲线图。微球从标准浓度被稀释10倍。100μl按标示浓度溶于CO2I中的0.32ng/ml BoNT/A被加入，并且管在室温下旋转过夜。加入6B2-2 CANARY细胞，旋转管5秒，并且在PMT上监测光输出。
图72为示意图。
图73为显示U937细胞能被制备以检测多个不同病原体的系列曲线图。
图74为显示负载单克隆或多克隆抗体的U937水母发光蛋白细胞能够检测炭疽芽胞杆菌孢子的一对曲线图。
图75为Fc受体/通用细胞系的概要。
图76为启动/负载U937细胞的试验流程的概要。
图77为Fc受体细胞试验流程的概要。
图78为可选择的实施方式的概要。
图79为可选择的实施方式的概要。
图80为说明对于水母发光蛋白的光发射随EGFP偏移的系列曲线图和柱形图。
图81为说明检测水母发光蛋白-GFP发射体分子的EGFP荧光的系列FACS分析图。
图82为说明通过分光光度计检测水母发光蛋白-EGFP波长偏移的一对曲线图。
图83为说明M12g3R EGFP-水母发光蛋白克隆与仅M12g3R水母发光蛋白细胞具有类似功能的曲线图。
图84为说明通过U937水母发光蛋白和U937 EGFP-水母发光蛋白细胞进行孢子检测的系列曲线图。
图85说明激发的CANARY细胞的荧光的系列曲线图。
图86为多重信号检测的示意图。
图87为具有不同发光颜色的CANARY细胞的示意图。
图88为EGFP-水母发光蛋白的克隆方案的示意图。
图89为产生病原体特异性CANARY细胞的示意图。
图90为通用CANARY细胞的示意图。
图91为本发明的实施方式的例子的梗概。
图92为产生通用CANARY细胞的示意图。
图93为产生通用噬菌体细胞系的示意图。
图94为Fc受体信号传导和通用感应细胞的产生的示意图。
图95为抗-Ig(抗-免疫球蛋白)通用细胞系的示意图。
图96为对照示意图。
图97为通用CANARY细胞的概要示意图。
图98为Fc受体通用细胞的概况。
图99为毒素检测实施方式的概况。
图100为说明如本发明所述检测天竺葵提取物中的青枯雷尔氏菌的曲线图。
图101为说明用于病原体检测的天竺葵组织处理的系列照片。
图102为说明使用如本发明所述的微球结合方法检测马铃薯Y病毒BYMV的曲线图。
图103为说明用于检测血样中的血源病原体的设备的一个实施方式的系列照片、和说明病原体检测结果的曲线图。
图104为说明如所述的本发明的组分的示意图。
图105为说明血样中的病原体检测的曲线图。
图106为曲线图。具有20μl细胞输送的Ba标准品。CO2(I)培养基中制备的、并用20μl B细胞测试的50μl Ba样品。结果显示低背景和50cfu Ba的LOD(n＝2)。
图107为曲线图。Ba B细胞喷雾。CO2(I)培养基中制备的、并用不同数目的B细胞喷雾测试的50μl Ba样品。结果显示了与20μl细胞输送相比、通过两次喷雾背景增加。喷雾的次数不影响峰强度(50000cfu Ba)(n＝1)。
图108为曲线图。具有1-喷雾细胞输送的Ba标准品。CO2(I)培养基中制备的、并用B细胞的一次喷雾测试的50μl Ba样品。结果显示与20μl细胞输送类似的背景和5000cf的LOD。50和500cfu Ba显示50％的检测几率(n＝2)。
图109为曲线图。Ba标准品：使用20μlB细胞的500cfu Ba检测。具有500cfu Ba的50μl Ba样品在CO2(I)培养基中制备并且用20μlB细胞检测。即使具有比正常所见更高的背景，结果也显示500cfu的100％检测(n＝3)。
图110为曲线图。Ba B细胞喷雾：使用1-喷雾B细胞的500cfu Ba检测。具有500cfu Ba的50μl Ba样品在CO2(I)培养基中制备，并且用一次喷雾的B细胞检测。结果显示500cfu的50％检测和2-3倍高的背景(n＝14)。
图111为曲线图。Ba B细胞喷雾：使用1-喷雾B细胞的500cfu Ba检测，无旋转。具有500cfu Ba的50μl Ba样品在CO2(I)培养基中制备，并且用一次喷雾的B细胞检测。样品在读数前不进行5秒旋转。结果显示没有细胞与抗原相互作用，导致500cfu Ba的0％检测(n＝3)。
图112为曲线图。Yp B细胞喷雾：使用20μl B细胞的500cfu Yp检测。在CO2(I)培养基中制备50μl具有500cfu Yp的Yp样品，并用20μl B细胞检测。结果显示典型背景和500cfu Yp的100％检测(n＝4)。
图113为曲线图。Yp B细胞喷雾：使用1-喷雾B细胞的500cfu Yp检测。在CO2(I)培养基中制备50μl具有500cfu Yp的50μl Yp样品，并用一次喷雾的B细胞检测。结果显示略增加的背景和500cfu Yp的100％检测(n＝8)。
图114为曲线图。Yp标准品：使用20μl B细胞的500cfu Ba检测。在CO2(I)培养基中制备50μl具有500cfu Yp的Yp样品，并用20μl B细胞检测。结果显示具有典型背景的500cfu的100％检测(n＝7)。
图115为曲线图。Yp B细胞喷雾：使用20μl B细胞的500cfu干Yp检测。在dH2O中制备5μl具有500cfu Yp的Yp样品，干燥过夜，并用20μl B细胞检测。结果显示500cfu Yp具有100％检测(n＝10)。
图116为曲线图。Yp B细胞喷雾：使用1-喷雾B细胞的500cfu干Yp检测。在dH2O中制备5μl具有500cfu Yp的Yp样品，干燥过夜，并用1-喷雾B细胞检测。结果显示较高背景，但是500cfu Yp具有100％检测(n＝10)。
图117为B细胞冲击试验的图示。
图118为抽吸设备的图示。
图119为基于伯努利原理的抽吸的图示。
图120为本发明的一个实施方式的图示。
图121为说明本发明的便携式16通道传感器的一对照片。该传感器包括容纳绕其圆周水平、均匀分布的试验管的转子，并且所述转子由绕垂直轴的变速马达驱动。单固定光子检测原件(此时为PMT)被置于转子的平面内恰好超出管子旋转过程中的路径之外。这样，各个管子顺序、重复地紧密接近PMT，使其光输出在各次通过时被采样。最终，由光源(红外LED)和检测器(光电晶体管)组成的光开关被用于控制检测到的光子的计数和16个域内的数据的再组织，各域分别与特定的样品相关。
图122为收集可疑抗原到样品表面上的可能的方法的示意图：(a)空气撞击；(b)静电收集；(c)从液体样品中电泳收集；(d)从液体样品中的2-部分收集：与捕获抗原的功能化磁性微球一起孵育；通过磁化“大头针”的非均匀磁场内的吸引捕获微球(此时，由于作用在磁性微球上力与磁场的非均一性相关，因此使用锋利的尖部、而非“头部”应是可取的。)
图123(a)～(c)为示意图：图123(a)具有收集在“头部”上的颗粒的“直的大头针”；图123(b)具有培养基和沉淀的CANARYB细胞的样品管的横截面；图123(c)倒插进B细胞管的大头针，引发发光反应。
图124为对于在针头上干燥、并且引入(在0秒)含50μl沉淀(通过离心)的对Bs敏感B细胞的200μl管中的Bs孢子的针头剂量-反应曲线的曲线图。Bs孢子制剂的浓度在图例中显示。对用107/mlYp制备的大头针的反应显示为阴性对照且显示缺少交联反应。
图125为Bs B细胞对静电收集的Bs孢子的反应的曲线图。将5.5KV的电压施加于对置的大头针(如图122(b)所示)。100～370ACPLA(每升空气含抗原物质颗粒)范围内的Bs孢子浓缩物以2l/min的速率在不同长度的时间内流经大头针。观察收集时间和B细胞反应之间的大致相关性。
图126为曲线图。磁“针头”实施方式。枯草芽孢杆菌颗粒在针头上干燥(刺激空气冲击或任何其它适合的局部收集方法的产物)，然后置于含磁性标记的B细胞的液体内。磁化大头针，以将B细胞吸附于干燥的孢子，并置于光度计内。
图127(a)～(b)为标准的离心CANARY试验和双重磁性微球试验之间的对比的曲线图。图127(a)，在标准的CANARY试验中的鼠疫耶尔森氏菌，和图127(b)在双重磁性微球试验中的鼠疫耶尔森氏菌。鼠疫耶尔森氏菌特异性的磁性微球与鼠疫耶尔森氏菌剂稀释物系列混合5分钟。5分钟后，磁性微球与任何结合的鼠疫耶尔森氏菌一起下降至试验管的底部，并且去除上清液。然后向样品中加入磁性标记的B细胞，并且下降至管的底部。
图128为示意图。在侧向流形式中样品捕获的原理。将样品加至样品垫(～200μl)内，其随之使垫饱和、并流向捕获膜(0.2-μm膜)。然后向样品垫中加入B细胞(50μl)，并且缓慢管吸向捕获膜，在捕获膜处，B细胞遇到捕获的抗原、并发射光子。
图129为手持侧向流试验形式的照片。着色微球(1-μm直径)的样品被置于样品垫上，并使其被管吸至捕获膜，以显示抗原物质捕获带。总尺寸为1英寸×0.25英寸。
图130为显示侧向流试验结果的系列曲线图：(a)在标准的CANARY试验中的大肠杆菌，(b)显示每200ml样品5000个颗粒的LOD的大肠杆菌侧向流试验，(c)在标准CANARY试验中的炭疽芽胞杆菌，以及(d)显示每200ml样品5000个颗粒的LOD的侧向流试验中的炭疽芽胞杆菌。
图131为自动CANARY生物气溶胶传感器的实施方式的示意图。
图132为说明本发明的集成式CANARY盘的一对照片。所述自动CANARY生物气溶胶传感器盘进行气溶胶收集和CANARYB细胞储存及输送功能。为了尺寸比较，显示了光盘(CD)。
图133为说明自动CANARY生物气溶胶传感器盘的收集细节的系列照片。
图134为显示自动CANARY生物气溶胶传感器盘气溶胶收集最优化的系列说明。设计多个冲击器几何结构，并且使用CFD(计算机流体动力学)模拟测试，以及通过收集作为模型颗粒的气溶胶化荧光1μm聚苯乙烯球试验性地检验性能。所有测试说明收集的几何形式和所有最简单的功能几何形式被实现，并且被用于进一步研究中。其它的测试几何形式显示包括颗粒聚集和重指向的有用性能，这些性能在研发能产生相对于标准几何形式更高颗粒密度的新冲击器几何形式中应是有用的。
图135为自动CANARY生物气溶胶传感器盘细胞输送-粘性塞实施方式的系列照片。在该实施方式中，以通过由高粘度、细胞相容的脂或凝胶(如硅脂、或凡士林油)制备的塞能够在盘的平面内以密封的构造形成具有足够容积以容纳用于单试验的CANARY B细胞的腔。其中粘性塞被插入盘内的壁的几何形式被设计为限定所述塞、并在运输和处理过程中保持其稳定，但是当在短暂旋转过程中施加足够的离心力时，能释放所述塞，从而释放细胞以自动移动到分析位点。可以选择凝胶为比含CANARY B细胞的气溶胶培养基具有更高或更低的密度。如果其密度高于B细胞培养基(如硅脂)的密度，则粘性塞将位于远离CANARY分析位点的盘的规定区域内的液体的底部。如果凝胶的密度低于B细胞培养基(如硅脂)的密度，则粘性塞将位于CANARY试剂的顶部，并且能被用于在反应位点的上方形成密封，以使其稳定用于储存和运送至实验室用于进一步验证试验。
图136为说明自动CANARY生物气溶胶传感器细胞输送-可破坏泡实施方式的示意图。在该实施方式中，使用常规泡罩包装材料和方法，用于各个分析位点的CANARY B细胞储存室内置到盘盖中。所述泡的形状和厚度将被设计为使施与所述盘的顶部的局部压力能破裂面向试验位点的泡壁，从而通过短暂旋转就使CANARY B细胞能被输送到试验位点。所述盘具有均匀支撑远离反应位点侧的泡、和集中施加的力在特定区域内以提供可再生液体运送的特征。整合泡的吸塑卡具有如图所示开孔，以提供与用于气溶胶收集的引导气流通过盘的管线的适当接触，并且整个卡对于磁盘是密封的，以在各个单独分析通道之间提供隔离。
图137为曲线图。PANTHER盘枯草杆菌孢子冲击结果。使用气溶胶室和碰撞喷雾器，一分钟时间枯草杆菌颗粒(每升空气200个含抗原物质颗粒，或ACPLA)压入测试盘内。随后的测试槽内有对枯草芽孢杆菌特异性(曲线图)和非反应性(耶尔森氏菌细胞系)的B细胞。对于非反应性(耶尔森氏菌)系未观察到信号。
图138为CANARY技术的概要。
图139为病原体检测细胞系的概要。
图140为用于检测新出现疾病的通用CANARY细胞的概要。
图141为用于液体和干样品的CANARY试验的示意图。
图142为液体样品的CANARY试验的例子。
图143为使用本发明所述CANARY技术的毒素检测的示意图。
图144为如本发明所述的使用微球捕获的肉毒杆菌毒素的CANARY检测的例子。
图145为用于血源病原体的CANARY试验的概要。
图146为使用CANARY技术的衣原体研究的概要。
图147为应用于农业病原体的CANARY技术的概要。
图148为植物病原体的CANARY检测的例子。
图149为便携式16-通道CANARY传感器的一对照片。
图150为自动生物气溶胶CANARY(BCAN)试验台的说明。
图151为对于威胁环境的排放物的病原体分析仪(PANTHER)的说明。
图152为集成的PANTHER盘发展的说明。
图153为CANARY技术的概要。
图154为肉毒杆菌毒素的CANARY检测的概要。
图155为CANARY生物气溶胶传感器性能的概要。
图156为植物组织的病毒提取的概要。
图157A和B说明了使用CANARY的植物病毒检测。图157A说明样品制备。图157B的曲线图说明结果。
图158为尿液中BoNT/A的检测结果的曲线图。对于尿样中的BoNT/A检测无需样品制备。与6E10-10抗体偶联的微球被直接加入到掺有活性BoNT/A的尿中，孵育15分钟，并且洗微球。将培养基加到微球中，随后加入CANARY细胞，并且旋转样品5秒。检测限为16ng/ml，比直接稀释到测试培养基介质内的BoNT/A高约5倍。在微球加入前未掺有BoNT/A Hc的对照尿(0ng/ml)没有产生信号，说明任何非特异性刺激物都已去除。
图159为血液中BoNT/A Hc的检测结果的曲线图。CANARY能够检测血制品中的可溶性BoNT/A Hc。BoNT/A被掺入如其它处所述制备的全血和血浆(参见Fran’s关于血样制备的部分)中。向血浆中加入6E10-10抗体包被G蛋白微球，孵育2分钟，在培养基中清洗、并使用6B2-2细胞进行试验。在该试验中对BoNT/A的检测限为16ng/ml。
图160为向血浆中加入NaCl、Tween-20和Triton X-100的影响结果的曲线图。加入NaCl(0.5M终浓度)对信号强度产生了从1700RLU至4800RLU的最显著的提高。加入Tween是无影响的，但是加入Triton提高信号至接近2700RLU。与单独的清洁剂相比，盐和清洁剂结合提高了信号，但未至上述单独加盐所实现的水平。
图161为与链霉亲和素微球连接的6E10-10抗体孵育20分钟的BoNT/A(5fmole＝800pg)和BoNT/A复合物(5fmole＝5ng)的结果的曲线图。加入6B2-2细胞，并且监测光输出。对等摩尔量的两种制剂CANARY试验的相似反应说明所述复合体蛋白质没有影响抗体与BoNT/A结合。
图162为检测对照培养基中的BoNT/A的结果的曲线图。用6E10-10抗体包被的磁性微球被加入到掺有标示浓度的BoNT/A的培养基中。将样品旋转2分钟，以使毒素与微球结合。加入6B2-2CANARY细胞，混合物旋转5秒，并监测光输出。含160pg BoNT/AHc(16ng/ml)的样品产生的信号为背景的6倍。
图163为柱形图。分析等量的覆盖所有三种发射体类型(α、β、和γ)的各种放射材料。CANARY的反应可与市售、基于实验室的仪器相比。
图164为CANARY细胞的化学物质检测的示意图。从概念上看，利用CANARY检测化学物质如生物战试剂与蛋白质毒素的检测非常类似。周质结合蛋白质(PBPs)附于微球的表面。目标化学物质的存在将PBP转化为被CANARY细胞表面上的抗体识别的形式，从而激发光发射。
图165为曲线图。数据点代表使用Pitt发生器气溶胶化多分散聚苯乙烯乳胶球进行的6次冲击测得的平均效率。单APS颗粒分选机在冲击机的进口和出口之间转换。实心红线为与0.7和1.5μm之间的平均数据拟合的指数。2μm以上，由于在Pitter发生器中对这些较大颗粒的气溶胶化效率较低(以及因此颗粒计数低)，计算的效率数字可信度低。
图166A和B说明枯草杆菌(Bacillus subtilis)孢子的干式鉴定的方法和结果。如干式试验流程的示意图(图166A)所示，加入枯草杆菌特异性的B细胞，短暂离心旋转驱使细胞到达样品管底部的收集位点。在干式试验模式中的特异性说明(图166B)：蓝色曲线：撞击到样品管上、并且用抗枯草杆菌的细胞检测的枯草杆菌说明了CANARY检测被冲击样品的能力。阴性对照：观察枯草杆菌细胞暴露于干燥的霍乱弧菌(灰色曲线)、无病原体时的压入空管内的空气污染物(红色曲线)、以及当抗鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)的细胞被暴露于干式冲击的枯草杆菌孢子(黑色曲线)的基础反应。
图167说明用于自动生物气溶胶收集、和CANARY分析的BCAN载体。
图168说明设计为整合气溶胶收集和B细胞输送的CANARY盘(CD)。
图169说明具有冲击嘴和透明管的气溶胶收集模块剖视图。
图170说明具有阀输送系统的CANARY B细胞输送模块。
图171说明去除了不透光盖的TCAN-2自动生物传感器。
图172说明本发明的一个实施方式。PANTHER盘(左侧)为可以像CD一样被加载于便携式PCNTHER CUB传感器(中间)内，或者最终被加载于高通量自动点检测和鉴定传感器(右侧)内的自主式生物气溶胶取样和CANARY分析工具。
图173A和B为如此处所述的本发明的实施方式的示意图解。
图174为本发明的实施方式的另一示意图。
图175为说明流速和通过盘有效输送并且引导冲击到此处所述设备的收集表面上的颗粒大小之间的关系的柱形图。
图176说明本发明的实施方式。
图177说明自动处理图示CANARY盘的压缩传感器设备。
图178说明此处所述的CANARY设备的核心部件。
图179为CUB传感器的性能特征的曲线图。枯草杆菌孢子气溶胶的CUB分析的典型信号。
图180说明本发明的不同实施方式。
图181为正、负双向电泳概念的示意说明。
图182为用于DEP测试芯片的制作过程。
图183A和B说明(a)由在石英基底上的叉指钨薄膜电极组成的DEP芯片的基本设计。(b)线宽和间隔的组合的板。
图184为侧向流模式的样品捕获原理的示意图。将样品加至样品垫(～200μl)内，其随之使所述垫饱合、并且流向捕获膜(0.2-μm膜)。然后向样品垫中加入B细胞(50μl)，并且缓慢管吸向捕获膜，在捕获膜处，B细胞遇到捕获的抗原、并发射光子。
图185为手持侧向-流试验模式的照片。着色微球(1-μm直径)的样品被置于样品垫上，并使其被向上管吸至捕获膜，以显示抗原捕获带。总尺寸为1英寸×0.25英寸。
图186A～D为侧向流试验结果的曲线图：图186A：在标准的CANARY试验中的大肠杆菌，图186B：显示每200ml样品5000个颗粒的LOD的大肠杆菌侧向流试验，图186C：在标准CANARY试验中的炭疽芽胞杆菌，以及图186D：显示每200ml样品5000个颗粒的LOD的侧向流试验中的炭疽芽胞杆菌。
图187A和B为标准的离心CANARY试验和双重磁性微球试验之间的对比的曲线图。图(a)，在标准的CANARY试验中的鼠疫耶尔森氏菌，以及(b)在双重磁性微球试验中的鼠疫耶尔森氏菌。鼠疫耶尔森氏菌特异性的磁性微球与鼠疫耶尔森氏菌剂稀释物系列混合5分钟。5分钟后，磁性微球与任何结合的鼠疫耶尔森氏菌一起被拉至试验管的底部，并且去除上清液。然后向样品中加入磁性标记的B细胞，并且下降至管的底部。
图188为手持传感器筒的示意图。(a)具有处于储存位置的磁拭体的筒。(b)从筒中拉出的拭体。(c)准备使用的拭体，具有：1-柄、2-保护套(拉出)、3-轴、4-磁头。(d)准备插至读取位置的拭体。(e)具有处于读取位置的拭体的筒：5-旋转至接受磁头位置的B细胞囊、6-通过筒底部的孔的光发射。
图189为手持CANARY传感器设计的一对示意图。该设计重新定位PMT，从而其被直接指向试验管的底部，在此处为了收集最大信号而收集CANARY细胞。设计样品插入装置，以经滑动装置运行，所述滑动装置使得操作方便、样品和PMT之间的距离最小、以及在样品负载步骤中遮蔽PMT不受环境光的影响，从而使读取过程中的仪器噪音最小。设计门柄以包含用于样品处理的强稀土磁体，以及在这些处理进行的同时在磁体附近的位置容纳管的管接收器。
图190为手持CANARY传感器样机的系列照片。PMT具有双碱阴极，其具有300～650nm有效光谱灵敏度范围。其以光子计数模式被操作，并且信号被记录、且经RS-232(9针插头)被传递至便携式电脑用于进一步的分析。手持部件具有使用内置在传感器内的可充电NiCd电池运行达8小时、或者当与12V电源(也用于给内部电池组充电)连接时的无限运行的选择。
具体实施方式
此处描述的本发明提供了用于检测可溶性抗原的方法。例如，所述可溶性抗原可以为可溶性蛋白质或化学物质。在一个实施方式中，所述可溶性抗原仅包括一种或两种抗原表位。使用在细胞表面上表达的抗体检测可溶性抗原依赖于抗原交联(或结合，从而固定在细胞表面抗体上)细胞表面上的抗体从而激发细胞内钙增加的能力，其中抗体与抗原的结合引发了钙浓度的增加这又刺激了发射体分子响应细胞内钙的增加而发射光子。可溶性抗原对于交联细胞表面上表达的抗体可能是无效的，并且因而对于激发细胞内钙增加是无效的。此处描述了用于检测可溶性抗原的方法，其中通过所述方法实现抗体的交联，这又激发了细胞内钙增加，并且引起发射体分子响应钙离子浓度增加而发射光子。
待检测的受关注可溶性抗原和化学物质包括多种多样的抗原。例如，但不限于，此处本发明所描述的方法可以被用于检测蛋白质毒素如肉毒杆菌毒素(A、B、C、D、E、F、G血清型)、葡萄球菌肠毒素-B(SEB)和其它超抗原、篦麻毒素、百日咳毒素、志贺毒素、芋螺毒素、产气荚膜梭菌ε毒素、志贺样核糖体灭活蛋白质，其它可溶性细菌产物，如来自鼠疫耶尔森氏菌的F1抗原、来自炭疽杆菌的保护抗原、致死因子、来自炭疽杆菌的水肿因子。检测中的其它受关注分子包括如高丝氨酸内酯的细菌群体感应分子。使用此处描述的方法可以检测的化学战剂、或者其水解后分解产物的例子包括、但不限于氰化物(氰氢酸)、光气(碳氯化物)、CK(氯化氰)、CL(氯)、CX(二氯碳亚胺、氢氧化物)、DP(氯甲酸苄酯、三氯甲基酯)、GA、塔崩(二甲氨基氰磷酸乙酯)、GB、沙林(甲氟膦酸(Methylphosphonofluoridic acid)(1-甲基乙基)异丙酯)、GD、索曼(甲氟膦酸1，2，2-三甲基丙酯)、GF(甲氟膦酸环己酯)、芥子气(1，1’-硫代二[2-氯乙烷])、HN-1、氮芥(2-氯-N-(2-氯乙基)-N-乙基乙胺)、HN-2、氮芥(2-氯-N-(2-氯乙基)-N-甲乙胺)、路维西特(二氯化(2-氯乙烯基)亚胂酸)、PFIB(1，1，3，3，3-五氟-2-三氟甲基-1-丙烯)、三光气(三氯甲基碳酸酯)、V-气(甲硫磷酸S-[2-(二乙胺)乙基]O-2-甲丙酯)、VX(甲硫磷酸S-[2-[二(1-甲乙基)胺]乙基]O-乙酯)、双组分的VX(O-乙基O-2二异丙基胺乙基甲基亚膦酸酯和硫)、双组分的GD(甲膦酰二氟(DF)和频哪基醇与胺的混合物)、双组分的GB(甲膦酰二氟(DF)及异丙基醇与异丙胺的混合物(OPA))。此外，通过本发明的方法也可以检测其它生物源的化学物质，包括毒枝菌素，尤其单端孢霉烯(T2)毒枝菌素、蛇形菌素多样组、贝类毒素或其它腰鞭毛虫(dinoflagellage)产物，微囊藻毒素(各种类型)、水螅毒素、葡萄穗霉毒素H、黄曲霉毒素和河豚毒素。
待检测的其它受关注蛋白质包括APP(淀粉样前体蛋白质)、与CJD、BSE、痒病、苦鲁病和PSA(前列腺特异性抗原)相关的朊病毒蛋白质。此外，适当的可溶性抗原或化学物质的检测在各种应用中都是有用的，如临床应用，例如甲状腺功能、肾上腺功能、骨代谢、生育、不育、IVF、怀孕、生长和生长激素不足、糖尿病、血液病、心脏功能、癌、过敏、自身免疫性疾病、治疗药物监控、药物滥用、研究免疫分析应用、遗传工程蛋白质、乳品的药物残留、肝功能、抗生素和抗生素合成路径。用于在这些应用中分析的适合的可溶性抗原对于本领域普通技术人员是已知的(例如，参见“免疫实验手册(TheImmumoassay Handbook)”(第二版)，David Wild编辑。自然出版集团(Nature Publishing Group)2001。NY NY)。
本发明也提供了对于特异性核酸(NA)序列的检测和鉴定。在一个实施方式中，使用寡核苷酸探针将抗原连接于目标NA。这些探针利用抗原修饰特异性NA序列。这些抗原修饰的(此处也称为“抗原偶联的”)寡核苷酸能够激发表达抗所述抗原的抗体的发射体细胞。自由探针(如果存在)为单体，因而不能激发发射体细胞。同样地，标记的寡核苷酸与NA上的非特异性位点的背景结合不会显著激发发射体细胞，因为由这些极少的背景结合事件得到的抗原非常之少以至于不能有效地交联抗体。
抗原的选择取决于许多因素，包括相应的抗体的可用性和特性、在被测样品中不存在交叉活性的抗原、以及抗原-寡核苷酸复合物的溶解性、稳定性和费用，这些都是本领域的普通技术人员可以理解的。如在此所应用的，寡核苷酸可以为DNA、RNA、肽核酸(PNA)、锁核酸、或具有本领域已知的专门和独特性质的任何种类的修饰核酸替代物。此外，向这些探针中加入阳离子氨基酸(以肽或蛋白质的形式)可以提高杂交率。如果希望，那些阳离子肽/蛋白质可作为被发射体细胞检测的抗原发挥双重职能。因此，在本发明的一个实施方式中，提供基于在其表面上具有一个或多个抗体、且包含化合物(发射体分子)的发射体细胞的检测系统，当被抗原刺激时所述化合物发射光子，特别是通过细胞内钙浓度增加刺激光发射，所述抗原由于存在靶NA而为多体的。
此处所述的本发明也提供了检测被一个或多个抗体结合的目标颗粒的感应细胞。具体地，所述感应细胞包括发射体分子和结合与目标剂或颗粒结合的抗体的Fc受体。在一个实施方式中，包括Fc受体的感应细胞为巨噬细胞，如人巨噬细胞系U937。其它适合的细胞或细胞系对于本领域普通技术人员是已知的。所述Fc受体为结合抗体或免疫复合物的一族膜表达蛋白质。它们在包括单核细胞和巨噬细胞的几种血液细胞上表达。存在Fc受体的多个亚类，包括Fcγ受体(FcγRI)、可溶性抗体的高亲和结合物。FcγRI结合免疫球蛋白G(IgG)的恒定区(Fc部分)，留下抗体的抗原结合区域。抗体结合的Fc受体被特异性抗原交联启动刺激钙离子释放的信号通路。因而，感应细胞上的Fc受体的交联导致细胞内钙浓度增加，并且从而发射体分子响应钙浓度的增加而发射光子。
此处所描述的本发明也提供16-通道传感器。在其最简单的形式中，发射体细胞试验包括在透明管中制备样品、向所述管中引入等份的特别制备的发射体细胞、利用快速离心旋转将发射体细胞驱至管底部、以及用光计数传感器测量管的光输出。在实验室中，大多数发射体细胞试验顺序进行，每次一个样品；在自动BAWS/CANARY仪器中，同时测量四个样品，各样品具有其自己的光收集通道。前一系统需要更多时间，然而后者需要更复杂(和昂贵)的硬件。
此处描述了减少测量多个样品的时间(同时保持硬件需求最小)的不同方法。已设计了允许使用单光收集通道同时测量多个样品的传感器。所述传感器包括容纳16个绕其圆周水平、均匀分布的1.5ml管子、并且由绕垂直轴的可变速马达驱动的转子(图39)。单固定光子检测原件(如PMT)被置于转子的平面内恰好超出管子旋转过程中的轨迹之外。在该设计中，使各个管子顺序、反复地紧密接近光子检测原件，使其光输出在各次通过时被采样。最终，由光源(红外LED)和检测器(光电晶体管)组成的光开关用于控制检测到的光子的计数和将数据再组织在16个域内，各个域分别与特定的样品相关联。该16-通道设计的另一实施方式被称作TCAN传感器。所述TCAN(触发-CANARY)生物传感器为将气溶胶收集和发射体细胞液体输送组合为集成径向盘形式的自动生物传感器。所述TCAN CANARY盘(CD)(图42)与将气流分流到分离的通道内的管线组件连接。气溶胶收集设备(图43)使用干式冲击技术，以随后将来自气流的颗粒定位至干净的塑料管底部。
气溶胶颗粒冲击后，所述CD与所述管线组件连接以驱动位于盘内的阀。所述圆盘快速旋转，这随之使发射体细胞液体利用离心力输送至各个管(图44)。然后使用光检测器基于与气溶胶颗粒相互作用的发射体细胞的光子输出鉴定潜在的生物抗原。该气溶胶收集和发射体细胞输送的过程可以在一个盘中重复多次。该特征使在多个触发事件后进行多次发射体细胞试验，而无需换CD。
以下进一步描述适于本发明中使用的材料和方法。
发射体细胞
所述发射体细胞(此处也称为感应细胞或CANARY细胞)可以为任何天然地或通过遗传工程或通过化学添加而具有适当受体、信号通路和信号输出方法的真核或原核细胞。所述细胞可以为人造或非生命单元，只要其具有功能受体、信号通路和信号输出方法。当抗原-受体结合，例如结合到抗体时，细胞将钙离子调集到细胞质内。在本发明的设备和方法中使用的细胞的例子为可以通过遗传工程表达一个或多个表面结合的单克隆抗体的B细胞(如，具有骨质颚的冷或热血脊椎动物的B细胞)。在所述设备中使用的细胞的另一例子为在细胞表面上表达Fc受体的巨噬细胞，如人细胞系U937。通过向目标中加入抗体，抗原与抗体结合，且该抗原-抗体复合物结合细胞上的Fc受体并激活导致细胞内钙增加的信号传导。
例如，单克隆抗体可以通过如下方法制备：用待检测的抗原免疫动物并收获免疫动物的B细胞，然后，可以分离编码单克隆的DNA，并将其转移至永生化细胞系内，再筛选产生对待检测抗原具有特异性的表面单克隆抗体的细胞。尤其因为当附加的目标试样被暴露于B细胞时B细胞的发射信号典型地不会显著减少，并且也因为该B细胞的发射信号为线性的，因此B细胞对于定性和定量分析都是有用的。
可选择地，细胞可以为成纤维细胞。然而，成纤维细胞并不含有对于将信号从表面抗体的细胞质部分转移到细胞内的钙库所必须的信号转导机制。为了克服该问题，可以在成纤维细胞内表达嵌合表面抗体。这种嵌合抗体含有源自可以将成纤维细胞的质膜的内表面的信号转导至细胞内钙库的多肽(如成纤维细胞生长因子受体)的细胞质氨基酸序列。这样，当抗原与嵌合抗体的细胞外部分结合、以引起在表面上的抗体聚集时，诱导钙动员。使用嵌合抗体的相似方案可以被用于任何其它非B细胞的细胞类型，从而细胞适宜在本发明的设备和方法中使用。
在此处的设备和方法中有用的细胞为被设计成识别特异性物质的细胞，包括在其表面具有与所述物质特异性结合的受体的细胞。尽管其它与待识别的物质特异性结合的适合受体包括促细胞分裂剂受体(如脂多糖(LPS)受体)、巨噬细胞消除剂受体、T细胞受体、细胞粘附分子、如序列特异性限制性酶部分或转录因子的DNA结合蛋白质、单链RNA或双链RNA结合蛋白质、与被识别的DNA或RNA序列互补的寡核苷酸、或其它配体结合受体(如Fas；细胞因子、白介素、或荷尔蒙受体；神经递质受体；着嗅剂受体；化学引诱物受体等)，优选受体为抗体或单链抗体。受体可以通过跨膜域、与受体(如与抗体结合的Fc受体)特异性结合的膜结合分子、或膜结合分子的共价或非共价连接物(如生物素-链霉亲和素、二硫键等)被附于细胞表面。受体也可以为嵌合分子；例如，其可以具有细胞外域，如抗体、单链抗体、凝集素或其它物质特异性结合域或肽，以及胞内域，如胰岛素受体、成纤维细胞生长因子或其它引发第二信号级联反应的蛋白质等的细胞内域。除了待识别物质的直接结合，受体可以特异性结合另一分子或物体，其随之特异性结合待识别物质，如次级抗体、标记的微球、抗原偶联的寡核苷酸等。
可选择地，仅这些结合步骤之一可能需为特异性的。例如，使用与一个抗原偶联的(或直接与微球偶联的、或在基质上的)寡核苷酸探针可以将含特异性序列的DNA或RNA从溶液中调出，并且第二组与目标DNA/RNA退火的非特异性抗原偶联寡核苷酸探针将被用于刺激对第二抗原特异性的细胞。并且，在细胞表面上作为嵌合体表达的非特异性核酸结合蛋白质(组蛋白、鱼精蛋白、RNA结合蛋白)或抗这些结合蛋白质的抗体在序列特异性选择步骤之后也可能被用于检测核酸的存在。
抗体
无论何种源细胞类型，单克隆抗体的抗原结合可变区域可以作为公共来源的DNA序列被获得，或者可以通过RT-PCR由杂交瘤细胞系克隆。使用设计为在5’端与可变区域的前导区或框架区退火、在3’端与恒定区域退火的引物组进行RT-PCR。
然后将抗体可变区域克隆到已含有轻和重链的恒定区域的表达载体内。在Persic等，Gene 187：9-18，1977中描述的轻链表达载体尤其适于该目的。Persic等描述的VKExpress包含EF-1α启动子、前导序列、多克隆位点和人Igκ恒定与和多聚腺苷酸化信号。重链表达载体源自Invitrogen的pDisplay。该载体含有CMV启动子、前导序列、HA标签、多克隆位点和myc标签，之后为PDGFR跨膜域和牛生长激素多聚腺苷酸化信号。
对于重链表达，pDisplay可以被修饰如下。用没有分泌用外显子的鼠IgM恒定区域代替pDisplay的PDGFR跨膜域。这样确保了蛋白质仍为膜连接的。新霉素抗性基因可以包括但不限于潮霉素、争光霉素、嘌呤霉素、卡那霉素、和杀稻瘟菌素基因的多种抗生素抗性基因的任何一种替代。使用重叠PCR、以两步骤方法可以插入重链(或可选择地轻链)可变区域以去除pDisplay的多克隆位点任何一侧出现的HA和myc标签。也可以进一步发展载体以允许含被融合至IgM恒定区域的约300个碱基对的可变区域的重叠延伸产物的插入，从而可以以单步进行克隆。
使用上述抗体载体构建方法实施了以下例子。
与待检测的抗原特异性结合的抗体为结合抗原或抗原的表位的分子，但基本不结合样品中的其它抗原或表位。这种抗体可以为嵌合体(即，含非抗体氨基酸序列)或单链(即由一个连续的多肽序列形成抗体的互补性决定区域)。
可选择地，可以从动物获得产生表面抗体的细胞，并且用于通过标准技术(如最早由Kohler等Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等Immunol Today 4：72(1983)；或Cole等Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss Inc.，pp.77-96(1985)描述的杂交瘤技术)制备表达表面抗体的单克隆群。制备表达单克隆抗体的细胞的技术是公知的(参见，如Current Protocols in Immunology(1994)Coligan等(eds)John Wiley&Sons，Inc.，New York，N.Y.)，对此进行了选择表面抗体而非分泌抗体所必须的改进。
任何被用于融合淋巴细胞和永生细胞系的已知流程都可以被用于制备产生表面单克隆抗体的细胞的目的(参见如Current Protocolsin Immunology，如上；Galfre等，Nature 266：55052，1977；Kenneth，InMonoclonal Antibodies：A New Dimension In Biological Analyses，Plenum Publishing Corp.，New York，N.Y.，1980；和Lemer，Yale J BiolMed 54：387-402(1981))。然而，本领域普通技术人员应理解有许多同样有用的这种方法的变化形式。
通过用待检测的抗原免疫适当的动物可以制备表达抗体的多克隆细胞。产生抗所述抗原的抗体分子的细胞可以从动物(如血液)分离，并且通过如用抗原覆盖的皮氏培养皿淘洗的公知技术被进一步纯化。作为制备单克隆细胞的可选择方法，通过用抗原筛选重组免疫球蛋白库(如抗体噬菌体展示文库)鉴定和分离编码单克隆抗体的核酸，从而分离结合抗原的免疫球蛋白文库成员。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是市售可得的(如，Pharmacia Recombinant PhageAntibody System，货号No.27-9400-01；和Stratagene噬菌体展示试剂盒，货号No.240612)。此外，在如，美国专利No.5,223,409、PCT公开No.WO 92/18619、PCT公开No.WO 91/17271、PCT公开WO 92/20791、PCT公开No.WO 92/15679、PCT公开No.WO93/01288、PCT公开No.WO 92/01047、PCT公开No.WO 92/09690、PCT公开No.WO 90/02809、Fuchs等Bio/Technology 9：1370-1372(1991)；Hay等，Human Antibod Hybridomas 3：81-85(1992)、Huse等Science 246：1275-1281(1989)、Griffiths等EMBO J.12：725-734(1993)中可以找到尤其适于产生和筛选抗体展示文库所用的方法和试剂的例子。
文库的期望成员被鉴定后，特异性序列可以被克隆到任何适合的核酸表达子(如载体)内，并且可以被转染到如成纤维细胞的细胞内。所述表达子可以也编码适合表达抗体之细胞的可操作地连接于抗体序列的氨基酸。如上所述，成纤维细胞生长因子受体的细胞质跨膜序列可以被连接于对待检测的抗原特异性的单链抗体，从而当细胞与抗原接触时固定钙。尽管可以在成纤维细胞中表达单独的重组重链和轻链以形成嵌合抗体，但是单链抗体也是适合的(参见如Bird等Trends Biotechnol 9：132-137，1991；和Huston等Int Rev Immunol10：195-217，1993)。
光子发射体分子
待检测物质与细胞表面受体的结合应引发细胞内的信号通路。优选的信号通路为在B细胞、T细胞、肥大细胞、巨噬细胞和其它免疫细胞中发现的第二信使级联反应，其中细胞表面受体的交联激活了酪氨酸激酶，然后其磷酸化磷脂酶C，然后磷脂酶C将磷酸肌醇4，5-二磷酸(PIP2)裂解为肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)和甘油二酯；然后IP3开启钙通道以从如内质网的细胞内库释放钙、或者放入细胞外的钙，从而提高细胞的细胞溶质内的钙浓度。根据受体类型、细胞类型和所希望的信号传导方法，可以使用替代的第二信使级联，如G蛋白-腺苷酰-环-cAMP-蛋白激酶A级联。
应提供监测细胞内对待检测物质反应的信号。如果内部信号涉及细胞质钙增加，则优选的检测方法为钙敏感发光或荧光分子，如水母发光蛋白、奥贝林(obelin)、thalassicolin、mitrocomin(halistaurin)、钙调发光蛋白(clytin(phialidin))、mnemopsin、瓜水母光蛋白、Indo-1、Fura-2、Quin-2、Fluo-3、Rhod-2、钙绿(calcium green)、BAPTA、cameleons(A.Miyawaki等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.96，213540)或类似分子。预计通过使用钙敏分子所赋予的光的相对强度和感应细胞储存特性可以随特异性发射体分子的光产生效率和活化的发射体分子的半衰期而变化-在某些情况下提供显著的益处(如改善的灵敏度、定量和定性检测)。附加性能改进可以来自发光蛋白发射体分子的天然协同因子的结构类似物。可以被活细胞吸收的各种钙敏荧光染料为从包括Molecular Probes，Inc.Eugene，Oreg的商业来源获得。如水母发光蛋白、奥贝林、thalassicolin、mitrocomin(halistaurin)、钙调发光蛋白(phialidin)、mnemopsin、瓜水母光蛋白、或cameleons的蛋白可以通过遗传学方法加入、注入细胞内或通过HIV TAT的蛋白质吸收标签(大约47-57氨基酸；A Ho等(2001)Cancer Research 61，474-477)运送或通过其它方法。如果希望，该报告分子可以包括将其定向于内质网或质膜的细胞质面、线粒体的内部或其它局部钙浓度变化可能尤其大的区域的定位信号。也可以使用检测信号通路其它点的活性的光学方法，如与信号通路的组分连接的荧光基团的荧光共振能量转移技术(FRET)(S.R.Adams等(1991)Nature 349，694-697)。当内部信号涉及反应性氧物质(如过氧化物阴离子自由基、羟基自由基、辣根过氧化物酶的化合物I或II等)增加时，优选的检测方法为反应性氧敏感发光或荧光分子，如发光蛋白pholasin(来自生物发光软体动物海笋(Pholas dactylus)的34-kDa糖蛋白)或类似分子。可选择地，可以将对于任何荧光素酶的报告基因与被信号通路诱导的启动子连接。在如T细胞和肥大细胞的某些细胞中，信号通路引发含如颗粒溶解酶、类胰蛋白酶、或糜酶的蛋白酶的颗粒的胞外分泌。可以通过测热量或测荧光的方法检测这些蛋白酶的胞外分泌(如与被蛋白酶裂解的肽连接的对硝基苯胺或7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC)[S.E.lavens等(1993)J.Immunol.Methods 166，93；D.Masson等(1986)FEBS Letters 208，84；R&D Systems])。并且，微电极或其它检测与钙通量或其它信号离子通量相关的电活性的方法适用于监测细胞内的信号反应。
适合的发射体分子为任何响应于升高的细胞胞质钙浓度发射光子的分子，包括生物发光和荧光分子。在Button等Cell Calcium14：663-671(1993)、Shimomura等Cell Calcium 14：373-378(1993)、和Shimomura，Nature 227：1356-1357(1970)中描述了一个发射体分子，即生物发光的水母发光蛋白。通过氧化一种小的化学分子(腔肠素)，水母发光蛋白产生光子。腔肠素通过细胞膜扩散，从而腔肠素或其类似物可以被加入到细胞周围的培养基内。可选择地，编码产生腔肠素的酶的基因可以被引入细胞内。在另一实施方式中，生物发光的绿色荧光蛋白(GFP)(参见Chalfie，Photochem Photobio62：651-656[1995])或黄色荧光蛋白(YFP)可以被使用。在该实施方式中，细胞溶质同时含有GFP和水母发光蛋白。对细胞溶质内升高的钙作出响应，水母发光蛋白在无发射的能量转移过程中向GFP供能量。然后GFP发射光子。可选择地，发射体分子可以为通过适于诱导荧光的波长光发光的钙敏荧光分子(如indo-1)。
水母发光蛋白，或任何其它发射体分子可以通过本领域的公知方法引入细胞。如果发射体分子为蛋白质(如使用水母发光蛋白的情况)，则细胞可以含有编码所述蛋白质的表达载体(即，当被引入细胞时将产生发射体分子的核酸或病毒)。表达载体可以存在于染色体外或被整合到细胞基因组内。
偶联抗原/标签
一个或多个抗原或标签可以被加入(此处也称作“偶联到”)提供已知抗原表位的分子中。例如，一个或多个抗原可以与寡核苷酸偶联以产生具有已知抗原表位的抗原偶联寡核苷酸。抗原偶联分子可以包括一个抗原或多个相同或不同的抗原。例如，但不限于，与检测的分子偶联的抗原或标签包括如毛地黄毒苷、地高辛、胆碱磷酸、荧光素或其它荧光基团和生物素的小抗原，和如HIS、VSV-G、FLAG和C(AAKK)多聚体的肽(如Corey，J.Am.Chem.Soc.，(1995)117：9373-4中所述)。
寡核苷酸
除了常规的DNA和RNA探针外，各种修饰核酸已显示以序列特异性的方式与靶核酸序列杂交。这些包括肽核酸(PNA)(Nielsen等，(1991)Science 254：1497-1500)、双PNA(Griffith等，(1995)J.Am.Chem.Soc 117：831-832)、尾夹PNA(Bentin(2003)Biochemistry 42：13987-13995)、PD环(Bukanov等，(1998)PNAS 95：5516-5520)、包含假互补碱基的PNA(Lohse等，(1999)PNAS 96(21)11804-11808)、或锁核酸(Braasch和Corey(2001)Chem.Biol.8：1-7)。各种各样的这些修饰核酸已显示在杂交特性、稳定性、亲和性和特异性方面不同，并且能够代替常规的DNA寡核苷酸使用(由Beck和Nielsen，在Artificial DNA：Methods and Applications中讨论，pp.91-114，CRCPress，Y.E.Khudyakov和H.A.Fields编辑)。阳离子蛋白、肽或DNA结合蛋白的连接已显示改善了杂交动力学(Corey(1995)J.Am.Chem.Soc 117：9373-9374；Zhang等，(2000)Nuc.Ac.Res.27(17)3332-3338)。
通过添加辅助寡核苷酸，已显示改善寡核苷酸的结合(O′Meara等，(1998)Anal.Biochem.225：195-203；Barken等，Biotechniques(2004)36：124-132)。通过添加未标记的发夹竞争探针可以改善特异性(Huang等，(2002)Nucleic Ac.Res.30：(12)e55)。
与目标杂交后，去除未结合的寡核苷酸对于核酸序列检测不是必须的，但可能是可取的。可以根据所用探针的具体化学性质使用包括粒度筛析、疏水相互作用或离子交换的各种常规色谱技术去除未结合的标记寡核苷酸。
其它核酸结合分子
寡核苷酸不是唯一的能够鉴定特异性核酸序列的分子。蛋白质也能够进行这种辨别，并且能够在发射体细胞的表面上表达，重组地连附于结合时引发钙离子反应的细胞质域。例如，其包括连接于抗体的Fc部分的核酸结合蛋白。核酸结合蛋白在发射体细胞表面上的表达避免了在寡核苷酸杂交前必须变性双链核酸，并且另外，系统产生所有必须的组分：不需要外源合成的寡核苷酸。可能的序列特异性DNA结合蛋白包括：(1)DNA限制性内切酶(优选具有去除或灭活的DNA切割催化位点，如L.F.Dorner和I.Schildkraut(1994)Nucl.AcidsRes.22，1068-1074)；(2)转录因子或其它特异性DNA-或RNA-结合蛋白，尤其那些识别关注的病原体或生物体中的独特DNA或RNA序列的(如，HIV TAT转录因子：C.Brigati等(2003)FEMSMicrobiology Letters 220，57-65；痘病毒转录因子：S.S.Broyles(2003)Journal of General Virology 84，2293-2303)。具有这种受体的发射体细胞可被设计为在具有特定重复序列或可选择地两个或多个独特序列的靶DNA/RNA上交联。
捕获寡核苷酸
尽管不是检测所必须的，但是在可沉降的或固体载体上捕获靶核酸序列可以改善试验灵敏度。例如使用与链霉亲和素包被的聚苯乙烯或顺磁性微球连接的生物素标记的捕获寡核苷酸可以捕获单链DNA靶。可以通过离心或暴露于磁场(在适当的情况下)将捕获的材料与未结合物质分离。在将寡核苷酸连接于微球中使用中间体结合反应(亲和素-生物素)可能不是必须的，可以使用将寡核苷酸连接于固体载体的任何相互作用，包括直接偶联。此外，可以使用任何捕获寡核苷酸能够连接的固体载体，其可以为其中特异性捕获的寡核苷酸被置于阵列上特定位置的二维阵列形式。可选择地，靶核酸序列可以以非特异性方式被捕获(如，离子交换树脂、沉淀、组蛋白或精蛋白结合)。目标捕获也浓缩靶核酸序列和/或去除试验干扰物。
多价
发射体细胞激发取决于抗原对发射体细胞表现为多价。通常，这可以以至少两种途径完成。首先，多份的抗原可以被连于目标分子，例如，将多个抗原偶联的寡核苷酸与靶核酸序列杂交。第二，各具有被连接的单个抗原的几个靶核酸序列副本可以互相连接，或者被结合在相互接近的位置(如附于微球上)。在该例子中，单个的靶核酸序列不是多价的，但具有连接的多份靶核酸序列的微球将呈递多价抗原。
反应室
适于本发明使用的反应室可以为任何发射体细胞和候选颗粒可以互相混合并接触的基质或容器。在一个实施方式中，反应容器为离心管(如微离心或埃彭道夫管)。如此处所述，离心是尤其适合的先将候选颗粒或发射体细胞形成团粒，然后再向先形成的团粒驱入其它物质的方法。为了进一步促进颗粒和细胞形成团粒，管的侧壁可以被涂覆如牛血清白蛋白的非粘性载体蛋白质，以防止发射体细胞粘附于侧壁，并且管的底部可以被涂覆聚-L-赖氨酸，以帮助确保目标颗粒保持粘附于管底部。其它的防止或促进细胞粘附的蛋白质或分子是细胞生物学领域中已知的，并且适于在本发明中使用。
具有特定的样品孔几何形式的离心管可以提供利用离心增加发射体细胞与难以沉淀的颗粒的相互作用、以及降低定制旋转顺序的需求的另外的实施方式。在该实施方式中，待检测的含样品的颗粒被置于其中样品室的最大宽度几乎等于发射体细胞的直径的管内。在样品上覆盖浓缩的发射体细胞悬浮液、随后离心使大量紧密叠压的发射体细胞通过较小的颗粒，同时形成的几何形式增加了发射体细胞抗体与颗粒相互作用的可能性。细胞相关的抗体与颗粒的结合捕获了沉淀不足的颗粒，并且与发射体细胞一起快速将其拖至管底，从而通过光放大设备检测所得的光。
在另一实施方式中，反应室为二维阵列的孔，比如如附图所示的微量滴定板，或沿带设置的点或孔。这些设置允许多个样品和/或多个目标颗粒的多重检测。对于候选颗粒和/或发射体细胞的自动输送，反应室或样品收集器和发射体细胞库的位置可在至少两维平面内设置。也可以使用如上所述用于离心管的粘性或非粘性涂层处理阵列的孔，以促进发射体细胞和候选颗粒之间的接触。
样品收集器
可以使用不同设备收集如空气中的样品。一般，气体采样设备具有收集室，所述收集室含有空气或气体从其中穿过或从其旁边经过的液体、或含有当空气或气体通过滤器时捕获微粒(如目标颗粒)的多孔滤器。对于含液体的收集室，收集的液体可以被离心或做其它处理以从液体中分离颗粒。然后，在反应室中沉淀这些被分离的颗粒。对于含滤器(硝化纤维)的收集室，滤器或滤器的部分可以起反应室作用。可选择地，可以从滤器洗脱颗粒，或者，滤器可以被溶解或另外与颗粒分离。滤器收集室也可以适于从流经滤器的液体(如供水样品或脑脊液)收集颗粒。此外，如上所述，可以离心液体样品，以去除液体中出现的任何微粒物质。各种取样器是已知的，并且对本发明的使用是可行的。参见销售SKC和其它取样设备的SKC，Inc.公司的目录。
其它空气取样器可以被使用。例如，可选择的设备为气体-O-细胞(Air-O-Cell)取样盒(SKC，Inc.)。在该设备中，空气颗粒被加速，并且使其与直接适于各种染色程序和显微检测的粘性载玻片冲撞。
可以在已知为撞击取样器的设备中利用惯性分离收集气溶胶微粒。将含待收集的微粒的气流从关注的环境吸至撞击取样器中，在此处，气流直接指向用于冲击的表面。通过撞击取样器中的适当的几何参数和流速，具有足够惯性的颗粒不会跟随流线流动，而是冲击在表面上。冲击表面的颗粒的主要部分通过静电和/或范德瓦耳斯相互作用粘附，并且因而被收集和浓缩。这样，使用各种可获得的试验技术(包括此处的设备和方法)可以收集用于检测的含蛋白质(包括毒素)、病毒、细菌(生长的或孢子形式)、寄生虫、花粉和其它可检测的物质的气溶胶颗粒。
空气撞击取样器用于生物试验的干样品收集通过减少或消除流体消耗和转移机制从而提供了超过常规气体-液体样品收集的一般优点，减少试验成本和简化自动操作。此处的设备和方法的特别优点之一为：使用干式冲击的收集确保了此处的设备和方法加入感应细胞之前，所有的收集样品定位在表面上，而无论各分析物颗粒的大小。这样实现了所有分析物的定位，而无论其在液体中的沉降系数，从而使此处的设备和方法的灵敏度最大，且通过去除耗时步骤而极大地加快了试验的实施。
任何保留其上冲击的颗粒的一部分、并且与随后生物试验兼容的表面适于作为收集表面。适合的材料包括生物相容性金属、塑料、玻璃、晶体、气凝胶、水凝胶、纸等。这些材料的尤其有用的构造包括微离心试管、在高通量筛选中使用的多孔板、连续带、滤器、侧向流免疫试验的偶联释放垫等。通过对收集表面的修饰可以增加收集效率，修饰包括：添加促进生物颗粒粘附的涂覆物(这些涂覆物本质上可以为化学的或生物化学的，如多熔素)；增加表面粗糙度，以增加用于收集的表面积；以及促进颗粒在表面上的限定区域内沉积的特定表面几何形式。此外，可以通过调控收集表面和吸入颗粒上的静电荷、从而产生附加引力实现收集效率的进一步提高。
可以通过在收集器上游使用气体-气体浓缩器以增加在收集面上被冲击的空气样品的单位颗粒数目而对干式撞击进行进一步改进。这可以显著降低收集足够数目的气溶胶颗粒以为检测器提供可靠结果所需的时间。
在该收集概念的一个实施例中，图23所述的冲击器已被设计为在市售可得的塑料管的底部收集气溶胶样品。喷嘴向下突出在管内，并且出口按管内表面的曲率半径定位。这种定位增加了颗粒冲击在设备感应细胞最可能与其接触的管底部上的可能性。一旦完成收集，含设备感应细胞的单液滴被直接加入含收集的气溶胶颗粒的管内，旋转5秒以加速细胞输送至管表面，并且使用光子检测器(如PMT、CCD、光电二极管等)检测发射的光。使用该设备，可以从气溶胶中收集干细菌孢子、并且通过光电设备在不到一分钟的时间内直接检测。可以使用多个用于收集样品的管和进行后续分析的自动系统实施该方法。系统如何能够进行至少10个独立试验的例子如图4、6、9、12和15所示。通过实施一种其中能够在单个管中寻找多个分析物的多项测试的途径(多重的)，可以使单个试验周期可检测物质的数目大于可用管的数目。这可以通过建立表达多个具有不同分析物亲和性的受体的单独光电检测设备细胞系、或者通过在单个试管中组合具有不同特异性的多个细胞系而实现。
图4为集成生物气溶胶警告感应器(BAWS)/光电感应器系统的示意图。BAWS触发模块被用于初步检测如预定粒度范围的颗粒的存在。如果检测到符合规定的颗粒，则BAWS触发空气-空气浓缩器从而经干式撞击取样器模块使特定粒度范围内的颗粒在孔(如反应室、管)内被收集、并沉积。所述干式撞击取样器模块允许样品收集、并且与用于在反应室内(如管)进行细胞(如发射体细胞)输送的注射模块连通。运输模块被用于将反应室装置(具有一个或多个室或管)转移至用于沉淀或混合颗粒样品和细胞的离心模块。所述离心模块可以、但非必须与用于检测光发射的光/PMT组件连通。控制器模块对于控制系统的操作是有用的。
图6显示干式撞击取样器模块概念的实施例。在该实施例中，说明了单(如样机系统)以及多通道设备，所述设备包括独立样品管(如PCR管)和管载体，其与从测试样品收集颗粒的空气-空气浓缩器连通。
图9显示了可以为自动化的细胞输送的实施例。感应细胞(如发射体细胞)通过注射器和注射泵装置(其可以包括吸移管管理器和其它输送设备)被引入系统。该类型的装置允许向颗粒样品(如反应室(如管)中的样品)中多重、同时引入感应细胞。
图12显示了用于旋转颗粒样品或细胞样品的离心模块概念的实施例。具有样品管的载体经负载装置被引入适于接收所述载体的转子装置。所述转子旋转样品。转子装置与用于信号收集(如光子发射)的光学模块连通，并且分度马达(indexed motor)可以被用于使样品室与检测器(如光学组件)对准。
图15显示了光学模块的实施例。根据确切构造的不同，该模块允许多个同时测试的样品(如在反应室、试管内)。载体和其内的管被引入所述光学模块，从而其与透镜装置(如整体反射镜、透镜)(如果需要)连通，并最终与光检测器(如PMT)连通。所述PMT产生随后被发送至用于处理和显示的处理器的信号。
图21说明了集成干式撞击取样器/光电感应器。在该感应器内，上述模块与支撑30个可输送至带驱动的运输传输模块的载体的卡盒成线性排列安装。该输送模块将试验管顺序地从收集器输送至细胞输送模块、再至离心模块、最终在完成光检测后输送至确认样品储存模块。该集成感应器的总大小约为54英寸宽、33英寸高、22英寸深。
现实世界中的样品可能包含抑制试验(假阴性)或在无特异性抗原时引起反应(假阳性)的物质。在许多情况下，可以在试验前处理这些样品以去除这些物质。例如，如清洁剂或血清因子的可溶性物质可以通过预离心步骤被去除，在预离心步骤中抗原物质被集中到试管底部，并且用测试培养基(Portal Shield样品)替代液体。通过使用具有允许抗原物质通过、但截留污染物(内燃机或烟灰样品)的孔径(3～5μm)的市售滤器进行过滤可以从样品中去除不溶性大颗粒物质。通过注射滤器可以快速处理样品，这对于总的试验时间仅增加了几分钟。
样本定位
作为样品收集器或反应室的部分，可以使用不同装置(除离心机外)促进发射体细胞和候选颗粒之间的接触。例如，在生物电子设备中电泳、等电子聚焦、双向电泳、磁标记颗粒等的使用可以整合到本发明的系统中。参见，如美国专利No.6,017,696和其它转让给NanogenInc.的其它专利；Goater等，Parasitology 117：S177-189，1998；和美国专利No.5,512,439和4,910,148以及其它转让给Dynal AS的专利。
混合含目标颗粒(此处的颗粒可以为被发射体细胞识别的任何颗粒-蛋白质/毒素、病毒、细菌、寄生虫、核酸等)的水性样品与部分含发射体细胞的培养基导致引起光子发射率短暂增加的颗粒-细胞接触。混合过程开始和最大发射率之间的时间取决于特定细胞对刺激的特征性反应，以及混合发生所经时间(混合时间)和在混合后颗粒和细胞发生接触所需的典型时间(扩散时间)。
因为即使在无目标颗粒存在时也存在检测的光子的背景发射率(例如，背景细胞发射和在光子检测器及其电子设备中的热噪声)，由单个目标-细胞相互作用发射的光子可能难以与该背景区分。为了有用地形成信号，被检测到的光子必须比背景显著提高。对于给定样品，当混合时间和扩散时间最小化时，该比率被最大化。样品中出现目标颗粒的其它可能的信号包括：在某一时间段内检测到的光子的总数目超出单独背景的增加、检测到的光子的统计学的变化、或者检测到的光子的光谱性质的变化。
通过降低混合后颗粒和细胞之间的平均距离可以使扩散时间最小。这可以通过将颗粒和/或细胞定位至较大的混合容积中的小体积(通常为层)内而实现。然而，定位颗粒和/或细胞的时间可能长于细胞的特征性反应时间。在长时间的定位过程中，颗粒和细胞之间的混合通过增加发射之间的平均时间可能产生较低的光子发射率，并且因而产生较低的信号。为了避免此种情况，颗粒和细胞之一或两者应分离定位，而使它们之间的接触最少。这种定位也能导致减少混合时间。
通常，使颗粒或细胞运动的手段包括以下：沉降(通过重力或离心)；流体流动(外力的或对流的)；电力(电泳或双向电泳)；磁力(使用磁性微球)；以及声学/超声(驻波或行波)。
定位需要移动与屏障(barrier)结合的颗粒和/或细胞的手段，例如，所述屏障为收集颗粒和/或细胞的位置，如通道或容器的固体表面、滤器的表面、或围绕电场最低点的潜在能障。例子包括：沉降(将细胞定位在室的下表面)；空气冲击(被冲击的颗粒粘附或定位于收集面上)；过滤(在滤器表面上或体内部收集颗粒或细胞)；亲和性捕获(通过特异性或非特异性结合相互作用可以定位颗粒或细胞)；磁性捕获(通过磁力保持磁性微球紧靠固体表面、滤器表面、或在滤器体内；微球可能具有或可能没有促进颗粒或细胞的粘附的表面化学性质)；电泳(仅带电颗粒；在电极表面上的收集)；以及双向电泳(正：颗粒或细胞在电极表面上的收集；负：收集到最小场区域内)。
颗粒和细胞的定位和混合可以通过结合上述和其它方法实现。在下表中，提供了各种定位/检测器结合的例子。特定的代表性例子说明了二维定位颗粒或细胞的方法，如果使用光子检测器(包括CCD)的阵列，而不是单光子检测器(如PMT)，则所述方法使不同颗粒之间的灵敏度和分辨性得到改进。
例子 定位细胞的方法 定位颗粒的方法 混合：颗粒或细胞/方式 检测器
离心 离心(短) 离心(长) 细胞/沉淀(离心) 单
流动池 沉淀和附于表面 细胞上方的浅槽 颗粒/沉淀(重力) 单
流动池(多细胞系) 沉淀和附于表面 细胞上方的浅槽 颗粒/沉淀(重力) 成像
流动池/磁性 沉淀和附于表 定位的磁性微 颗粒(微球上)/沉 成像
  微球   面   球捕获   淀(重力)
  流动池/电场   沉淀和附于表面   细胞上方的浅槽   颗粒/电泳   单
  带/管吸   流动(管吸内)   气体冲击(带)   细胞/沉淀(重力)   单
  气体冲击   离心(短)   气体冲击(带)   细胞/沉淀(离心)   单
  非针头式滤器/磁性微球   沉淀至表面   在滤器表面上的磁性微球   颗粒(微球上)/沉淀(重力)   单
  流经细胞   在滤器表面上的细胞   流经细胞   单
  对流   通过离心保持在滤器表面上的细胞   置留在滤器表面上   颗粒/与离心力相反地流经细胞   单
  离心管双向电泳捕捉   离心到滤器表面上   通过双向电泳力置留在流中   细胞/沉淀(离心)   单
  行波双向电泳   沉淀并附于行波双向电泳   行波双向电泳   颗粒/沉淀(重力)   单
  可溶性膜管   单独的隔间   离心(长)到可溶性膜上   细胞或颗粒/行波双向电泳   单
  声/超声   溶解膜和沉淀(离心)
定位实施例
在以下各实施例中，除非另行声明，则假设样品为可能含有目标颗粒的(尽管以下描述将假定存在颗粒)与短期细胞生命和功能相容的等分水性溶液。可以由环境、临床、空气-液体、洗-拭或其它样品获得水性样品。可以由驱动的气流(气体取样器或表面捡拾器)、静电捕获、或者沉淀的气源颗粒获得气体样品。所称的细胞应理解为在与其生命和功能相容的水性培养基中的发射体细胞。使颗粒与细胞接触被假定导致一个或多个光子的发射。单个或阵列光子检测器存在于样品与细胞在其中混合的室之外，并且因而可以在所述空间之外或之内存在为了提高发射光子的捕获和检测而设置的附加光学元件。所述室被假定为部分或整体透明的，或具有另外的使得发射光子到达检测器的装置。在实施例中提供本发明的特定实施方式的进一步描述。
离心
样品可以在室(chamber)内离心足以沉降颗粒的时间。细胞可以被引入所述室内不干扰颗粒，并且短暂离心以使其沉降在颗粒上。光子检测可以在旋转过程中、或更典型地在旋转之后发生。
亲和捕获(表面捕获)
样品可以被引入微离心管、多孔盘、过滤装置、或其它与样品接触的部分表面被修饰从而通过特异性或非特异性结合相互作用能够结合和留置样品中可能出现的颗粒的适当装置。可以通过静电/离子交换相互作用、疏水相互作用、亲水相互作用等促进非特异性结合。可以通过将与颗粒(如抗体、受体、糖蛋白、蛋白质、肽、碳水化合物、寡核苷酸等)上的基底结合的组分固定至表面、或者通过固定颗粒(小分子、肽、蛋白质、碳水化合物等)的表面上被受体结合的组分促进特异性结合。
亲和捕获(至移动基底上)
与在表面上的亲和捕获类似，但颗粒通过包括此处所描述的这些方法的各种方法结合至提供使颗粒或细胞运动或定位的额外手段的移动基底(聚合物微球、细胞、带电分子、磁性微球、细菌等)。
流动池
发射体细胞可以被引入至浅流动池，并且使其粘附到底面；可以通过额外流去除非粘附细胞。样品被引入，替换大部分的细胞培养基，并且颗粒可以沉淀在被粘附的细胞上。由于颗粒接触细胞，从而发射光子。
流动池(多细胞系)
与“流动池”类似，其具有对不同目标颗粒敏感的发射体细胞的不同区域。通过成像检测器的光子检测能够鉴别细胞被激发、以及因而判定在样品中存在目标颗粒。
流动池(磁性微球)
其与“流动池”类似。适当的磁性微球与样品混合，以使目标颗粒附于微球。这些被粘附的微球可以被引入流动池，其中强定位磁场(由于永久磁场或电磁)在被结合细胞的上方的表面上捕获所述微球。可以通过去除磁力和使微球沉淀于细胞之上、或者移动磁力以将微球吸引于细胞被吸附的表面上而引发混合。
流动池(电场)
与“流动池”类似，其具有细胞吸附的表面、和与其平行的分隔电极(至少其中之一可以为透明的)。样品可以加入，替换大部分细胞培养基。可以在电极之间施加适当的DC电压，并且颗粒通过电泳移至被吸附的细胞。
带/管吸
可能含有目标颗粒的气体样品可以冲击在可能为刚性或柔性(如条带)、多孔或无孔的透明表面上。吸收物质或管吸装置可以连接在冲击区周围或当为多孔表面时在该表面的相对侧上。细胞可以被置于冲击区之上，并且，由于管吸作用，过量培养基将被吸收，从而减少负载细胞的培养基的体积和深度，并且使其更接近颗粒。如果管吸材料前的表面是多孔的，则细胞沉淀于被冲击颗粒上，或者通过液流额外地被拖向所述颗粒。
气体冲击
可能含有目标颗粒的气体样品可以被冲入适于离心的(固定的且最初为空的)室中。细胞可以被引入所述腔室中而不干扰颗粒，并且细胞被短暂离心，以将其沉淀于颗粒之上。在无旋转时、或在旋转过程中、或者更典型地在旋转之后，可以发生光子检测。
过滤设备/磁性微球
包括室和具有适合滤器(WhatmanTM、Mini-UniprepTM或类似)的活塞的改造的无注射过滤设备可以用能附于所述室的底面的细胞负载；未粘附的细胞可以被洗去。样品可以与具有适当表面亲和力的磁性微球一起被引入所述室。具有插入到滤器的内部、并且固定于其背侧附近的适当磁体的改进活塞可以被插入至所述腔室内，直至圈入的气体通过滤器逸出。该装置可以被反转，并且(可能在使微球沉淀于滤器表面之上的时间之后)将所述腔室向下推至活塞上。通过过滤、沉淀和磁吸引，磁性微球和颗粒可以积聚在滤器表面上。颗粒可以附于所述磁性微球或在其中被捕获。当再反转所述设备时，颗粒通过磁性微球而保持不与细胞接近，而所述磁性微球通过活塞内的磁体被控制。移开该磁体，释放微球和颗粒，所述颗粒越过短距离沉积于细胞之上。
流经细胞
可以使一层或多层细胞沉淀于位于室底部的适当滤器或膜的表面上。样品可以被引入细胞上方的室，并且施压(例如通过活塞或外部泵)。当样品流经紧密接触的细胞时，颗粒被带入细胞的附近范围内，从而发生接触。
对流
一层或多层细胞可以被沉淀于位于“细胞”室底部的适当滤器或膜的表面上。样品可以被置于通过某流动通道与位于滤器下方的点的细胞室连通的分开的“样品”室内。所述室彼此相对而置，从而，在离心机内，样品室更较接近旋转轴；样品室内的流体液面比细胞室内的流体更接近旋转轴。这样，在离心机的旋转过程中，流体将在两个腔室之间流动，以寻求距旋转轴的共同距离。这可以迫使一些样品向上通过支撑细胞的滤器、并且经过细胞，细胞通过向外的离心力抵抗所述液流。当样品流经紧密接触的细胞时，颗粒被带入细胞的附近范围内，从而接触。
离心管滤器
样品可以被引入具有适当粒径截止值的离心管滤器的滤器筐。在适当的离心条件下，样品将被迫使通过滤器，从而在滤器的表面上积累大于滤器的截至粒径的颗粒。细胞可以被加入滤器筐，并且短暂离心，以将其带至滤器表面和颗粒上。
双向电泳捕捉
除了具有在任何表面之上、或探入流动池之内的适当电极外，与“流动池”类似。样品可以通过经过电极的连续流被引入，所述电极可以与外部电源连接、并电驱动。为了适当结合流速、频率、波形和强度，可以通过负双向电泳引导颗粒，并且在细胞上方的最小电场强度区域内被捕获。在停止流体、并且改变对电极的电驱动(可能包括在某些电极之间的DC电压，以产生电泳力)后，颗粒可以沉积于或(通过电泳或正双向电泳)被驱至粘附的细胞上。
行波双向电泳
在浅圆柱室内，可以在平行面中的一个或两个上制备适当的电极(可能透明)，包括用于收集颗粒的中心平面电极、围绕圆周的电极、和一组螺旋电极(与中心平面电极在同一表面上、或在其相对表面上)。样品可以被引入所述室，并且在外周和中心电极之间施加DC电压以通过电泳将颗粒吸引至中心电极。通过流体的交换，细胞可以被引入所述室中。用适当的相移AC电压接通螺旋电极，可以通过行波双向电泳将细胞冲至中心，从而其能在颗粒上沉淀。
可溶性膜管
可以使用电驱动溶解金膜在通过离心沉淀定位颗粒的过程中保持目标颗粒和发射体细胞之间的分隔。颗粒可以被沉淀于细胞上方的膜之上(如图20所示)，或者通过跨分开的腔(或许嵌入物)的底部的膜保持细胞不接近所述腔的底部。在任一情况下，在膜通过电激活被溶解后，颗粒和细胞通过沉淀(可能离心)被混合。
声学/超声
颗粒的浓缩可以通过使用声学或超声信号实现。颗粒可以在处于驻波形(sanding wave pattern)的节点处积累，或通过行波形移动。细胞也可以这样移动，或者通过上述讨论的各种方法之一被输送。
毒素检测
为了检测单价抗原，必须利用两种通用方案之一诱导表面抗体的交联。首先，可以在细胞表面上表达两个独立的结合位点，从而，两个受体分子可以结合于单一配体。可选择地，如果配体以表现为多价的方式被呈现于细胞，则可以在细胞表面上表达一个结合位点。以下为使用抗体抗原识别模式的特定例子。
首先，在单一细胞系的表面上可以表达两个抗体，各个抗体对单独分子的不同表位(表位1和2)具有特异性。单分子与双抗体(一个抗表位1的抗体和另一个抗表位2的抗体)的结合将引发交联和光发射。更特别地，单B细胞系被工程化以表达两个独立抗体，各个抗体识别单分子上的不同表位。单体抗原的出现将能够交联表面抗体，导致细胞内Ca2+的增加和水母发光蛋白的光发射。表达抗鼠疫耶尔森氏菌和土拉热弗朗西斯氏菌的功能性抗体(除了内源表达的PC抗体外)的细胞系已被测试(参见实施例)。这些抗原中的各个都被该细胞系独立识别，说明两个抗体都是功能性的，并且证明发射体细胞能够同时表达两个功能性抗体。
另一个潜在的问题是光电设备和方法对不能使用离心力沉淀的抗原的灵敏度。鼠疫耶尔森氏菌F1抗原在溶液中以低分子量聚合物存在，并且因而在我们的试验中是不沉淀的。然而，表达抗F1抗体的B细胞能够检测5ng/ml的可溶性F1抗原。这与目前的免疫试验技术对比有利，并且表明光电设备对于可溶性抗原可以是相当灵敏的。利用与卵清蛋白偶联的磷酸胆碱抗原进行互补试验。该小抗原刺激在细胞表面上交联的抗体的能力说明该含多PC表位的低分子量抗原能够有效地交联表面抗体、并且产生钙内流和光发射。
第二种方案可以通过利用离心形式的优点提高如上所示的单价抗原的检测极限。这种方案利用了其中毒素抗体之一在良性细菌表面上表达、且第二抗体在B细胞表面上表达的路线。现在可以通过离心沉淀毒素，再加入表达第二抗体的B细胞。因为多个抗原被固定在细菌的表面上，因此，毒素本质上对于B细胞是多价的，并且将引发交联事件和光发射。更具体地，抗单体抗原(如毒素)的表位1的抗体在细菌的表面上表达。可溶性毒素结合这些抗体，从而用毒素抗原覆盖细菌。在加入表达抗表位2的抗体的B细胞之前，通过离心沉淀这些毒素覆盖的细菌。B细胞抗体的交联导致水母发光蛋白的光发射。关于该方案的试验结果证明细菌表面抗原检测的可行性、和在加入B细胞之前沉淀这些细菌所导致的灵敏度增加。对于任何不易沉淀的抗原都可以使用类似的措施改善其对B细胞的呈递。
交联
目标颗粒的交联可以通过任何已知方法实现。例如，可以使用一个或多个如肽、抗体、化合物、抗体、生物素、链霉亲和素的中间剂或分子实现交联，此外，可以通过共价或非共价结合交联。用于交联的方法也包括利用本领域已知的配体、抗体或化学官能团沉淀或粘附于固相。
多重测试
以下为B细胞如何可以被用于增加可检测抗原的数目而不增加检测通道(管等)的数目的说明。检测多个分析物的最简单方法是每个检测通道使用单细胞型、以及通过增加检测通道的数目增加细胞测试的数目。这对于小数目的试验是可接受的，但是，随着加入分析物数目的增加，过程变得更加复杂和需要更多的资源。然而，如果不同B细胞系被混合到一起，在仅5-通道系统内可能进行多达31个具有阴性对照的测试。
作为例子，如果具有单通道，则至多能检测单个B细胞测试。然而，如果具有双通道，则能检测3个单独的试验，其中各个通道含有3种独立B细胞系的两种等量混合物：
例如，如有具有3种B细胞系：A、B、C
并且将其在两个通道内混合，因此，
通道1：A、B    通道2：B、C
然后，有三种阳性读出可能性。
通道1 通道2
是 否 暗示仅A存在
否 是 暗示仅C存在
是 是 暗示仅B存在(或者多于一种抗原存在，目前我们认为这是不可能的)
类似地，如果具有3个通道，则可以通过将四种细胞系的组合混合在一起检测7个独立测试。
(以下为方便说明，其中单个抗原物质的细胞系通过与细胞系的数目对应的字母被标记A，并且记下通道号以说明用于阳性检测各个单独抗原物质需要什么通道，如下：123：F-意味着通道1、2和3必须全部为阳性记录以确认抗原物质F)。
通道1 通道2 通道3
A，B，G，F1：A2：E3：D B，C，E，F12：B13：G23：C C，D，G，F123：F
假定所有试验都是以等比例混合，表达简单描述通过给定数目的通道可以读取的独立试验数的关系的公式为：
#细胞试验＝2n-1其中n为通道的数目，
并且由2(n-1)得出需要在各通道内混合的细胞测试的数目。
因此，为了将16种不同B细胞系混合到一起，需要5个通道以检测31个不同测试。事实上，对于10-通道系统设计可被用于同时具有阴性对照的31个单独抗原物质提供ID(5-通道阳性ID、5-通道阴性对照)。
对于4-通道系统(15个不同测试)的通道混合物和阳性检测关联显示如下：
Figure A20068005161700541
Figure A20068005161700551
无需进一步的详细描述，可以认为基于上述公开内容和以下实施例，本领域的普通技术人员可以将本发明利用至其最充分程度。以下实施例应被理解为仅说明本领域技术人员如何能够实现本发明，而不不以任何方式限定本发明的范围。
实施例
图1为显示本发明的通用细胞组分的示意图表。含发射体分子(此处为水母发光蛋白)的细胞(此处为B细胞)在其表面上具有抗体。这些抗体对如生物战剂的目标颗粒上的抗原是特异性的。目标颗粒与B细胞上的抗体的结合使细胞表面上的两个或多个抗体靠拢，引起导致钙从细胞内库释放到细胞质内的信号转导级联。这种细胞质钙浓度的增加导致水母发光蛋白发射光子。然后，光子被捕获，并且通过如CCD的光倍增设备记录。这样，使用具有功能性表面抗体、且含有对增加的钙离子浓度响应的细胞质发射体分子的细胞可以实施细胞生物传感器。
这种基于细胞的检测系统提供了对任何目标颗粒上的任何抗原的快速、灵敏、特异性、精准和灵活的检测。关于灵活性，该系统可以被修改以把任何颗粒或颗粒组作为目标。在一个实施例中，单发射体细胞可以包含多个抗体类型，各个类型对于目标颗粒的非重叠组是特异性的。然后，该单发射体细胞可以被用于一次鉴定一类目标颗粒物质。
在又一实施例中，反应室可以包含两种类型的发射体细胞。一种类型的发射体细胞包含对一类目标颗粒(如细菌)特异性的抗体，并且响应于该类的任何成员的接触发出第一波长的光子。第二类型的发射体细胞包含对该类内的特定种(如鼠疫耶尔森氏菌)特异性的抗体，并且响应于与该种的接触发射不同于第一波长的第二波长光子。这种设置通过降低或去除假阳性信号而提供了极高的精确性。仅当第一和第二波长的光子被检测到时，阳性事件才被记录。这种发射体细胞特异性的嵌套可以被扩展到两级以上，只要是降低或去除假阳性信号需要的。
图2为用于本发明的一般构造和使用环境的示意图表。
图3为在本发明的一个实施方式中使用的分子生物学概念的示意图表。在该实施例中，表达发射体分子(如水母发光蛋白)、但不表达抗体的通用B细胞系是产生能表达对任何抗原特异性的任何抗体的B细胞的基础。抗体表达载体被引入通用B细胞内、对于表达载体的存在进行选择、并且进行扩增以用于本发明的检测系统。使用这种策略，连同pDisply和VKExpress(在上述“抗体”部分描述)，目标-特异性发射体细胞被产生用于各种目标物质。对口蹄疫病毒(FMDV)、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒、鼠疫耶尔森氏菌、土拉热弗朗西斯氏菌、布鲁氏菌某些种(Brucella spp.)、霍乱弧菌的O1和O139系、以及正痘(orthopox)病毒特异性的发射体细胞已被制备。从USDA获得FMDA抗体可变区的cDNA和序列。从NMRC的研究人员获得鼠疫耶尔森氏菌、土拉热弗朗西斯氏菌、布鲁氏菌某些种、霍乱弧菌的O1和O139系的cDNA和序列。分别由从CDC和USAMRIID获得的杂交瘤克隆得到VEE和正痘抗体的可变区。口蹄疫病毒(FMDV)、鼠疫耶尔森氏菌、土拉热弗朗西斯氏菌和委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)分别引起口蹄疫、瘟疫、土拉菌病和脑炎。利用多篇公开文章中描述的引物的组合进行从杂交瘤的克隆。因为球形芽孢杆菌(Bacillus globigii)被某些军事机构用作生物战剂检测系统的战地试验中的测试生物，因此，正在制备对球形芽孢杆菌特异性的发射体细胞。图5包括显示在多个克隆的FMDV特异性发射体细胞与活的FMDV目标物质接触时光发射反应的曲线图。在各种情况下，在目标颗粒与细胞之间接触后的约20～30秒内，发射体细胞发射光子。图中数据显示当未预想与发射体细胞结合的突变FMDV(在病毒的外壳蛋白中具有单氨基酸突变)与发射体细胞克隆接触时无发射。阴性对照支持检测系统本身的高特异性。
离心机和光电倍增管(PMT)布置的各种配置可以包含在本发明的系统内。所述布置包括由摆动装置(swinging harness)旋转样品微离心管的转子(马达)、并且包括处于固定位置的平衡管。在底部显示PMT，向上朝向静止的样品管的底端。在小于发射体细胞的目标颗粒的典型试验中，含颗粒的液体样品被置于样品管内，并且在足以使大部分颗粒沉淀于管的底部的条件下离心(如对于土拉热弗朗西斯氏菌以5600xg离心60秒)。然后，将发射体细胞的悬浮液层置于管内的样品上(从而不干扰沉淀的颗粒)、并且短暂离心，以使细胞成团与目标颗粒接触。如果在候选颗粒中出现目标颗粒，则从细胞发射特定波长的光子，并且由PMT捕获和记录。
在特定实施方式中，PMT可以为与斯坦福研究系统SR400双通道门控光子计数器接口的Hamamatsu HC 125-08 PMT。离心机可以为具有吊斗配置的Sapphire17转、18.5AWG、5amp马达。
离心管(反应室)可以因促进候选颗粒和发射体细胞之间的接触的需要而改变或升级。在图20所示的一个实施方式中，管在管底部具有容纳预先负载的发射体细胞的封闭隔间。该隔间通过可溶性金正极膜与管的其余部分分隔。在操作中，相同的含候选颗粒的颗粒被沉积于管内，并且离心以在膜处浓缩候选颗粒、然后溶解膜，并且短暂离心试管，以将颗粒与发射体细胞接触。该可溶性膜系统由Langer和其同事在Angewantde Chimie International Edition 39：2396-2407，2000和Nature 397：335-338，1999中描述。
离心过程的步骤可以被自动化，或者可选择地被设计以使用户根本不必停止离心机。例如，通过采用从Beckman Instruments获得的制备离心机(如超离心机)的机械特征可以完成液体和样品的引入和去除而无需停止转子。此外，可以期望在向心力仍被施加的同时(如，当发射体细胞和目标颗粒之间的接触因没有离心而不稳定时)检测光子发射。为了在其旋转的同时检测样品管的发射光子，可以将PMT安置在相对于转子轴的径向位置。在大多数情况下，采用这种布置的PMT不需要与样品管一起旋转，相反可以为静止的、并且当样品管在PMT前面经过时可以方便地记录光子发射。如果发射信号非常弱，则检测器(如PMT、CCD芯片)可以与转子耦联，并且与样品管一起旋转。可选择地，为了检测发射，可以围绕转子的圆周安置多个PMr。
如果在同一转子上旋转多个样品，则如果需要可以改变PMT的定位或信号处理。在一个实施方式中，转子容纳4个各含有在相同波长发射的细胞的样品管。为了区分来自一个样品的发射和来自另一个样品的发射，单个快速对准的PMT可以连续地检测发射。然后，使用监视各个样品在该时期的位置的转子同步追踪解析连续发射数据，以将发射分配到各个样品。在本发明内的其它变化是可以理解的。例如，图17为与转子耦联的两个反应管，且具有两个在所述管下方对准的PMT。在静止位置，转子利用转子位置编码器将各个试管定位于相应PMT下方。在另一实施方式中，图17中所示的离心系统可以与空气样品收集器整合以实现图18所示的系统。径向气溶胶冲击管可以包括任何类型的颗粒监视器，如在美国专利No.5,932,795及其引用的参考文献中所描述的。在再一实施例中，图18描述的系统可以被改变，从而如图19所示，仅需要一个相对于转子轴径向对准的PMT。如上所述，对于各个样品管使用轴角编码器对PMT记录的发射进行解析。
返回参考图17，包括，但不限于被工程化以识别特异性生物剂的B细胞的悬浮液、缓冲液、防腐剂、细胞培养基的流体组分可以被置于多个离心管的各管内，与之前已经在单独的处理中从气溶胶样品收集的样品颗粒的液体悬浮液混合。颗粒可以包含但不限于蛋白质、肽、化学物质、病毒、有活力的和孢子形式的细菌、真菌孢子、花粉颗粒、原生动物、血或组织源的细胞、及其单独或与如灰尘的载体颗粒结合的片段。当旋转马达开动时，离心管向外摆动到径向位置，且B细胞和/或样品颗粒以由颗粒的粒度和密度决定的速率被带动至离心管底部。细胞和含样品的流体被加入和离心的确切顺序可以基于其相对沉淀速度制定以使信号最大化。通常，预计通过在加入B细胞之前旋转这些样品(预旋转)达适当时间、并且旋转以使其接触，可以从比B细胞沉淀慢的颗粒获得最大光输出。对于以与B细胞相同或更快的速率的沉淀的颗粒，混合的样品和B细胞组分的单次旋转将引发该系统的最大光输出。在离心设备的上游加入的颗粒粒径分析器(包括、但不限于BAWS装置和液体颗粒分析器)的数据可以被用于自动确定最优操作顺序、并且启动适当的计算机控制自动样品处理。
当“旋转周期”结束、并且转子到达位于由旋转马达和轴角编码器调控的预定位置的可控停止位时，摆臂在重力作用下旋转，从而离心管的底部被呈现于光电倍增管的敏感面，然后记录任何光信号。在该实施的改进版中，单光电倍增管可以定位于转子/管配置的最大半径处，并且用于当各管连续经过光电倍增管的敏感面时收集各管的光子。基于监测轴角编码系统，可以分配或组合从单个管测得的光输出。
返回参考图18，气溶胶颗粒的收集过程与使气溶胶颗粒与B细胞接触的过程整合。此处，离心管与摆臂连接使其在旋转时覆盖径向冲击器的末端，并且通过作用于旋转径向冲击器管内的空气的离心力(如必要可以通过额外的送风机装置辅助)，诱导气溶胶样品流入样品入口。气流的高速度使气溶胶颗粒冲击在离心管的内表面、或管内含有的液体表面上，并且导致分别在管的表面上或液体内捕获颗粒。当存在液体时，作用在液体上的离心压力将抵消在液体内捕获颗粒所需的高速气流所赋予的力，并且防止其被冲击空气吹出。在与管表面或液体冲击后，气溶胶颗粒被截留，并且当液体收集时，气溶胶颗粒被迫使径向向外流动，从而在最大半径处(离心管的底部)提高局部颗粒浓度。在收集阶段后加入B细胞并且将其旋转至局部浓缩颗粒带将引发光子输出。可选择地，在收集过程中B细胞可以出现在液体中，并且在单光电倍增管旋转的同时实时检测光输出(图19)。在该实施的改进版中，流体组分(包括但不限于经可选择生物气溶胶收集器收集的颗粒样品、和工程化B细胞悬浮液)可以被加到进口，并且离心力可以被用于将其分散至管中。
当“旋转周期”结束、并且转子到达位于由旋转马达和轴角编码器调控的预定位置的可控停止位时，摆臂在重力作用下旋转，从而离心管的底部被呈现于光电倍增管的敏感面，并且记录任何光信号。在该实施的改进版中，单光电倍增管可以定位于转子/管配置的最大半径处，并且用于当各管连续经过光电倍增管的敏感面时收集各管的光子。基于监测轴角编码系统，可以分配或组合从单个管测得的光输出。
图7为顺序离心结果的示意图。对于小于发射体细胞、但具有与发射体细胞相同密度的目标颗粒，有利的是首先旋转候选颗粒(如以高速)以使其成团。之后，可以加入发射体细胞，并且根据需要在对于防止其反应性下降的较温和的条件下离心(顶部系列)。此外，该离心序列迫使几乎所有候选颗粒和发射体细胞进入离心管底部的相对小空间。相反，将候选颗粒和发射体细胞混合到一起、并且同时旋转将导致颗粒和细胞之间的分离、而非接触(中间系列)。当然，完全无旋转将极度降低反应中颗粒和发射体细胞的有效浓度(底部系列)。
图8包括显示证实图7中所提出的结果的真实试验的曲线图。以图7中所示三种方法将土拉热弗朗西斯氏菌特异性的发射体细胞与灭活的土拉热弗朗西斯氏菌细胞混合。如线图所示，顺序旋转方法导致接触后快速、有效的发射。相反，单旋转方法的发射曲线在时间和幅度方面低得多。非旋转方法几乎不显示反应。
如图8中所示曲线图总结的，单独试验中产生相似的发射特征。发射痕迹的检查表明单旋转方法导致靶特异性发射稍快于双旋转方法。然而，发现该结果主要为双旋转方法所需较长旋转的人为结果，并不反映B细胞反应时间的实际改进。事实上，双旋转方法的起始斜率显著大于单旋转方法，说明双旋转方法导致强烈的发射体反应。
通过滴定测量离心管中沉积的土拉菌细胞的数目评估图8所示检测系统的灵敏度。在图10所示的线图中总结了结果。似乎，响应于约5,300个土拉菌靶颗粒，25,000个发射体细胞能够发射高于背景的可检测的光子。预计反应条件的进一步优化将增加灵敏度。
在单冷冻-解冻循环后改善了细胞反应(参见图22)。在该试验中，鼠疫耶尔森氏菌(YP)特异性的细胞被离心，然后在冷冻培养基(具有10％DMSO和附加10％FBS的RPMI)中被重悬、在-80℃冷冻、并且被转移至液氮中。在37℃解冻细胞并且1ml(2×106)细胞被稀释至4ml RPMI中，并且在37℃孵育过夜。次日，用腔肠素(Coelenterazine)负载2小时，在不依赖CO2培养基(CO2-I)中清洗，并且恢复24小时。用5×105YP(50μl 107/mlYP)激发10,000个细胞。未处理的细胞显示每秒9500个光子的反应，然而冷冻解冻的细胞响应于YP发射约6倍多的光子。通过将细胞暴露于冷冻培养基而无需实际冷冻，这种刺激效应能被很大地复制(5倍刺激)。似乎冷冻培养基中的刺激因子为DMSO。当细胞用2％DMSO处理时(当1ml溶于含10％DMSO的冷冻培养基内的细胞被稀释至4ml正常培养基内时的DMSO的终浓度)，检测到类似水平的刺激。DMSO作用可能由于许多因素。已知DMSO影响造血细胞分化，并且通过该途径刺激细胞。此外，在含有甘油的培养基中冷冻的细胞也显示类似水平的刺激。因此，似乎该影响也部分由于由DMSO诱导的应激反应，并且使用刺激“热激(heat shock)”反应的多个条件中的任一种都可能重复这种刺激。
细胞可以以负载腔肠素的状态被冷冻储存。用腔肠素负载细胞，使其恢复24小时，然后冷冻。当解冻时，通过10ml CO2-I培养基清洗细胞，并且在10ml CO2-I培养基中重悬细胞至5×105个细胞/ml的浓度。这些细胞能够检测YP(在该情况下，解冻后约1小时，但是更短的时间也是可能的)。当在室温下储存时，这些细胞保持检测抗原能力多日。在用腔肠素负载和冷冻之前，用DMSO预处理这些细胞能够增加解冻后细胞对抗原的灵敏度。
在图22中，各种细胞处理之后，用50μl稀释于CO2-I中的10,000,000YP/ml激发细胞。未处理：细胞在RPMI中生长，用腔肠素负载，清洗，恢复24小时，并且用YP激发。冷冻/解冻：细胞在RPMI中生长，转移至冷冻培养基中，并且冷冻。解冻的细胞(1ml)被置于4ml RPMI中，并且在37℃孵育24小时，用腔肠素负载，清洗，恢复24小时，并且激发。冷冻培养基：细胞在RPMI中生长，转移至冷冻培养基并且在室温孵育10分钟。细胞(1ml)被置于4mlRPMI中，并且在37℃孵育24小时，用腔肠素负载，清洗，恢复24小时，并且激发。2％DMSO：细胞在RPMI中生长，转移至含2％DMSO的RPMI并且在37℃孵育24小时，用腔肠素负载，清洗，恢复24小时，并且激发。
成功的生物战检测系统应当对战场中存在的一般环境物质的污染是有抗性的。为了评估发射体细胞是否能在环境应激或污染下运行，在发射体细胞暴露于全强度柴油机排放物达1小时后(图11中的左侧线图)，或者当用107被用作任何战地细菌替代污染物的大肠杆菌污染细胞时(图11中的右侧线图)，混合发射体细胞和目标颗粒。如图11所示，测试的特定化学和生物污染物并未影响发射体细胞响应于目标颗粒发射光子的能力。
图13～14描述了本发明的不需要离心的不同实施例。图13的示意图显示了该实施方式的各种部件。生物气溶胶警告传感器(BAWS)检测如在预定粒度范围内的颗粒的存在。BAWS的例子在Primmerman，Lincoln Laboratory Journal 12：3-32，2000中被描述。如果检测到符合规定的颗粒，BAWS触发空气-空气浓缩器(如美国专利No.5,932,759中所描述的试样收集器)，使得特定粒度范围内的颗粒被收集、并且沉积在图14中不同视图所示的第一站位的部分试样带上的孔(反应室)内。候选颗粒在孔内沉积后，所述带前进至发射体细胞库下方、PMT上方的第二站位。对目标颗粒上的特定抗原特异性的发射体细胞置于孔内，并且监测孔的光子发射。
在通过BAWS检测候选颗粒的时间内，随着传送带通过第一站位前进，候选颗粒可以在后续孔上沉积(图14)。在第二站位，各含有具不同目标特异性的发射体细胞的多个发射体细胞库被安装于转动架上，所述转动架将特定库旋转至位置以在孔内沉积不同发射体细胞。这样，候选颗粒肉的不同目标可以被检测，如图14的孔的示意性俯视图所示。当然，如果不同发射体细胞以不同波长发射，只要第二站位下方的PMT能够区分不同波长的光子，则可能在含候选颗粒的单个孔内沉积不同发射体细胞。
图16示意性地显示本发明的系统的另一实施方式。在该实施方式中，在第一站位，空气颗粒在二维阵列(如具有六行和数百列的带)内的一行中的六个孔的每一个内沉积。随阵列前进一行，上述行定位在第二站位，不同发射体细胞在该行内的各个孔中沉积，并且通过在第二站位下方的一行PMT同时检测所有六个反应的发射。为了促进颗粒与带上的孔的粘附，可以用粘合剂或液体涂覆孔。
具体范例
方法和材料
细胞培养和转染
M12g3R细胞在37℃、在5％CO2的湿润空气中、在补充有10％胎牛血清、1mM丙酮酸钠、2mML-谷氨酰胺、100μM非必须氨基酸、50μM 2-巯基乙醇、50μg/ml链霉素和50U/mL青霉素(LifeTechnologies)的RPMI 1640中维持。用线性化pCMV.AEQ.IRES.NEO[11](每107细胞20μg DNA)通过电穿孔(270V，950μF)转染细胞，并且在1mg/ml G418中选择2周。抗生素抗性的细胞在具有10μM腔肠素(Molecular Probes)的生长培养基中、在室温下孵育2小时，用箔覆盖，清洗两次，并且在生长培养基中重悬。细胞在光度计中就响应于抗-鼠IgM F(ab’)2的光发射进行筛选。
在补充有10％胎牛血清的RPMI 1640中维持U937细胞。在转染细胞的前一天细胞被稀释至5×106细胞/ml。在第二天，2×107个U937细胞在HBSS中被清洗一次，并且在900μl HBSS中重悬。向细胞中加入20μg的线性化pCMV.AEQ.IRES.NEO，并且在室温孵育10分钟。然后将混合物转移至电穿孔小池(0.4cm)，并且在250V、975μF下电穿孔。细胞在37℃下，在生长培养基中孵育48h，然后通过在96孔板中进行有限稀释而在含有5μg/ml杀稻瘟素的培养基中被克隆。10～14天后，选择并生长克隆以进行筛选。用腔肠素负载克隆子，并就对5mM离子霉素的反应进行筛选。阳性克隆被进一步扩增、并鉴定。
抗体表达载体
轻链表达载体VKExpress包括处于人延伸因子-1α(EF-1α)启动子控制下的多克隆位点(MCS)下游的人κ基因恒定区。
通过修饰pDisplay(Invitrogen)、保留巨细胞病毒(CMV)启动子和前导序列、但用鼠IgM的膜结合恒定区的基因代替血小板源的生长因子受体跨膜域、并且去除在MCS任一侧的标签而产生重链载体。使用含EcoRI和Not I位点(分别在5’和3’)的引物，通过PCR扩增鼠IgM的膜结合恒定区的基因组序列，CμM。具有平端EcoRI位点、并用Not I消化制备的插入片段被克隆到具有平端Bsm I、并用Not I消化的pDisplay hygro中。通过利用PCR分别向基因的5’和3’端加入Cla I和BstB I限制性位点，并且将新抗生素抗性基因克隆至pDisplay的这些位点中，新霉素抗性基因被用赋予潮霉素抗性的基因(
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从pcDNA3.1 Hygro(Invitrogen)获得)代替。利用PCR向抗体可变区加入适当的限制性位点，并且在克隆至表达构建体前确认所有PCR产物的序列。
克隆抗体基因
根据制造商的说明用Trizol试剂(Life Technologies)提取RNA，并且使用Retroscript试剂盒(Ambion)进行第一链合成。利用设计在5’端与前导序列或框架区退火、并且在3’端与恒定区或框架区退火的引物组进行PCR。将可变区克隆至表达载体如下进行。通过PCR、使用含ApaL I和BamH I限制性位点序列的引物将这两个位点加到轻链可变区的5’和3’端，并且被克隆至VKExpress中。以两步法将重链可变区(VH)克隆至pDisplay-CμM中，以去除HA和myc标签。首先，重叠延伸PCR被用于将VH与CμM的第一个300个碱基对(bp)融合，同时向5’端添加Bgl II限制性位点。用Bgl II消化插入片段，Bgl II也在恒定区的293bp处切割，并且将插入片段克隆至用同一酶消化的pDis-CμM。第二重叠延伸产物将VH与使用Kpn I和Bgl II位点被克隆到其中的Igκ引导序列融合。通过产生具有紧随引导序列的Bgl II位点的pDisplay-CμM载体以使得去除两个标签的单个克隆步骤，我们随后改进了该克隆方法。
CANARY试验
通过以5×105个细胞/mL的浓度、在添加2％DMSO的生长培养基中孵育制备用于发光的B细胞。20～24小时后，细胞在室温下、在具有50μM腔肠素(Molecular Probes，Eugene，OR)的测试培养基中[不依赖CO2的培养基，10％胎牛血清，50μg/ml链霉素，50U/ml青霉素，和250ng/mL两性霉素B(Life Technologies)]黑暗中孵育2小时。然后，清洗细胞两次，在1.5mL微离心管内用测试培养基以5×105个细胞/mL终浓度重悬，并且将其在室温下旋转过夜。
用测试培养基稀释测试样品，并且用吊斗(swing bucket)或水平离心机以最大速度在0.2mL或1.5mL管内离心2分钟。通过倒置轻混B细胞，并且20μl的细胞被沉积在样品管侧。样品在配有特制水平转子的小的、台式微量离心机(Daigger)中离心4秒，然后插入光度计(Zylux，FB12)中。使用单动力曲线设置、在共60秒内、以1秒的间隔记录反应。阳性反应定义为从4秒离心开始、在15～30秒范围内具有≥3的信号与背景比和最大光输出。
U937细胞(5×105个细胞/mL)与IFNγ(200ng/mL，Sigma)一起在37℃下孵育过夜。次日，7.5×105个细胞在含200μM腔肠素的100μl测试培养基中在室温下黑暗培养2小时，在测试培养基中清洗3次，以5×105个细胞/mL浓度重悬，转移至1.5ml管中，并且在室温下旋转过夜。细胞与抗体(10-100μg/mL纯化的、或1∶1比例的杂交瘤：细胞)在37℃下孵育5～30分钟，然后清洗1次，并且在测试培养基中重悬。如上所述进行试验。
EGFP-水母发光蛋白表达构建体
为了融合水母发光蛋白和GFP，我们制备了含与6个氨基酸连接子(SGGGSG)融合增强的GFP(EGFP)基因、其后为水母发光蛋白基因的构建体。通过PCR从pEGFP-C1载体(BD BiosciencesClontech)扩增EGFP，去除终止密码子、并且在该基因的3’端加入连接区域：
有义引物：5′-GCCACCATGGTGAGCAAGGGC-3′(SEQ ID NO：12)
反义引物：5′-CCTGATCCACCGCCAGACTTGTACAGCTCGTCC-3′(SEQ ID NO：15)。
EGFP含有双氨基酸取代(F64L和S65T)，并且与GFP相比显示了增强的荧光强度。从pCMV水母发光蛋白构建体中扩增水母发光蛋白基因，向该基因的5’端加入连接区域：
有义引物：CTGGCGGTGGATCAGGAATGACCAGCGAACAATA-3′(SEQ ID NO：22)
反义引物：5′-TTAGGGGACAGCTCCA-3′(SEQ ID NO 19)。
然后，通过重叠延伸PCR利用用作重叠区域的连接区域将EGFP和水母发光蛋白基因连接到一起。然后，将该融合基因克隆至pcDNA3.1-TOPO(Invitrogen)中，并且确认序列。
临床样品试验
使用泡沫头拭子(VWR Critical拭子)收集鼻分泌物，然后使用标示量的炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)孢子接种，并且用400μl测试培养基置于含5μm滤器(Millipore Ultrafree-MC)的篮中。通过离心2分钟、在1.5ml微离心管中收集洗出液，离心也用于将孢子浓缩至管底部。离心后，去除篮和拭子，并且在同一管中进行试验。
加入沙眼衣原体(C.trachomatis)(102～105/ml，BiodesignInternational)的人尿液通过5μm注射滤器(Minisart)。0.5毫升等份试样在1.5mL微离心管中、以10,000RCF离心2分钟，弃除上清液，并且通过将试管的边缘抵于干净纸巾而吸走残余上清液。通过旋转振荡重悬沉淀物，加入0.5mL测试培养基，并且以10,000RCF再次离心样品2分钟。如上所述进行CANARY试验。
在特制的肝素化血浆分离管内收集0.5毫升全血，并且以3500RCF离心90秒。通过倒置测试管内收集含病原体血浆，具有在50～250μL范围内的回收体积。50微升血浆与0.5mL测试培养基混合，并且如上述CANARY试验中所述进行处理。为了稀释人血浆中存在的活化剂，向50μL血浆中加入450μL。为了通过吸附去除活化剂，50μL血浆与50μL(2×105个细胞)亲本B细胞系-M12g3R在室温下孵育10分钟。通过以1500RCF离心1分钟沉淀细胞以使细胞成球，将血浆转移至干净管中，并以最大速度离心2分钟。
为了构建用于血液中的细胞内病原体的装置，将200μLFICOLLTM HYPAQUETM溶液置于Capiject血液收集管(T-M，Terumo Medical Corp.)中。由CPT得到的聚酯凝胶(Becton Dickinson)被置于FICOLL的顶部。为了发生血细胞的正确分离，全血应用磷酸盐缓冲液(PBS)以至少6∶1的比率被稀释；因而100μL的PBS被置于凝胶上。肝素化全血(600μL)被置于管内，倒置该管以混合血液和PBS，并且将该装置以3500RCF离心90秒。用试验管代替该装置顶部内的红塞，并且通过倒置在试验管内收集血浆和白细胞。通过向试验管内加入600μL M-Per细胞溶解试剂(Pierce Biotechnology，Inc.)释放细胞内病原体，并且利用周期性旋转振荡在室温下孵育5分钟。以18,000RCF离心样品1分钟，用500μL测试培养基代替上清液，旋转振荡混合，并且重复离心。如上所述分析样品中的病原体的存在。
衣原体确认
用沙眼衣原体细胞系测试以下生物的交叉反应性：绿脓杆菌、酿脓链球菌、粪肠球菌、淋球菌、卡他布兰汉球菌、肠炎沙门式菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变型杆菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄糖球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、微小棒状杆菌、嗜酸乳酸菌、无乳链球菌、腐生葡萄球菌、D群链球菌、变形链球菌、阴道加德纳菌、麻疹孪生球菌(Gemella morbillorium)。沙眼衣原体的血清变型从Biodesign Internationa获得。
背景
CANARY利用已被遗传工程化以产生水母发光蛋白的B细胞，所述水母发光蛋白为一种最初在发光水母(Aequorea victoria)中发现的钙敏生物发光蛋白。该系统工作如下：(1)B细胞可以被暴露于气体样品、血样、或其它来源的可疑生物剂或其它病原体。(2)B细胞具有对特定生物剂特异性的抗体。如果这些抗原物质之一存在于样品中，则其将结合B细胞表面上的抗体。(3)由生物剂导致的B细胞的抗体交联引发了释放细胞内钙的细胞内酶级联。(4)当钙存在时，水母发光蛋白发射469nm的蓝-绿光。(5)可以使用光电倍增管或其它光检测器检测激活B细胞发出的光。
我们具有经遗传工程表达(1)细菌和病毒病原体特异性的抗体、和(2)水母发光蛋白的B细胞系。功能性水母发光蛋白由前水母发光蛋白(apoaequorin)及其底物腔肠素(coelenterazine)组成，腔肠素为一种能够自发穿过细胞膜、并且结合前水母发光蛋白的化合物。结合钙离子后，水母发光蛋白发生导致腔肠素氧化和发射光的构象变化。当暴露于多价抗原时，激活的含水母发光蛋白B细胞(已用重组抗体的DNA表达载体转染使其对抗原具有特异性)发射光。当被并入适当的传感器形式内时，这些细胞对于医学诊断、生物战剂的检测和食品、水和空气的质量的监测是非常有益的。
B细胞检测系统本质上是如此之快(在＜1秒内鉴定)，测试最初的延迟仅为使病原体与B细胞接触所需的时间。该问题并不是微不足道的，因为病原体和B细胞本质上是微小的粘弹性颗粒，其在流体环境中易于互相滑过。我们通过使用离心力将颗粒驱到一起对于细菌和大病毒已解决了该问题。当抗原和B细胞仅被简单地一起放置在悬浮液中时，信号反应在时间上延迟、在强度上是低的。当抗原和B细胞经5秒的旋转离心而成团时，反应的速度和强度都提高。然而，当加入B细胞之前先使抗原预成团时，速度和强度发生最大改进。然后，通过附加5秒的离心驱使B细胞成团。
使用该离心形式获得了对土拉热弗朗西斯氏菌(Francisellatularebsis)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)的数据。这些数据共同证明对任何已知抗原鉴定方法的极好的特异性以及速度和灵敏度(约3分钟内50cfu)的最佳组合。
对于可以以低速快速沉淀的如天花的较大病毒，本离心方法发挥了很好的作用。然而，我们也已经对细胞系进行工程化以产生对如FMD、登革热和VEE的病毒特异性的抗体，它们太小难以在相同条件下被浓缩。尽管对于小病毒的LOD在1分钟测试中约为500,000cfu，但是通过较长离心或亲和纯化可以将该数目提高100倍之多。
用于快速、灵敏鉴定临床样品中的病原体的CANARY B细胞传感器
引言
我们描述了一种已经证明对任何抗原鉴定技术提供最好的速度和灵敏度的组合的新传感器。我们的方案使用为天生为识别抗原而最优化的免疫系统成员-B淋巴细胞。我们对B细胞系进行工程化以表达细胞溶质水母发光蛋白(钙敏生物发光蛋白)以及对关注的抗原具有特异性的膜结合抗体。通过多价抗原导致的膜结合抗体的交联诱发顺序涉及酪氨酸激酶、磷脂酶C和肌醇-三磷酸酯(IP3)的信号转导级联。IP3激活钙通道，从而从内部库和细胞外介质增加细胞溶质钙，这激活水母发光蛋白，进而发射光。该称作CANARY的传感器可以在＜3分钟内(包括了浓缩样品所需时间)内检测＜50cfu的病原体。相反，即使最尖端的免疫试验分析也要花费至少15分钟并具有更高得多的检测极限，而尽管PCR可能是高特异性和灵敏度的，但大多数报告采用＞30分钟的流程。尽管已报道了在仅9分钟内检测5cfu的超快PCR，但是即使与最快的样品制备技术结合，整个试验还需要20～30分钟完成。因为其独特的速度和灵敏度的结合，CANARY能够为医学诊断、生物战争防御、食品和水质量检测以及其它应用中的病原体鉴定带来革命。
我们首先开发了能够有效产生多种B细胞系的遗传工程系统。我们从M12g3R(IgM+)B细胞系产生了稳定表达细胞溶质水母发光蛋白的亲本细胞系，选择在表面IgM交联时具有最大发光量的克隆。随后用含插入了对特定目标物质具有特异性的可变区的含抗体轻、重链恒定区的质粒转染M12g3R-水母发光蛋白细胞。基于其对所述目标物质的反应选择第二转染的克隆。为了提供使用CANARY可以鉴定的抗原物质的范围的概念，我们在下表中列出了已开发的所有24种细胞系。
对于CANARY细胞系可以检测的目标物质
炭疽杆菌孢子炭疽杆菌，有活力的土拉热弗朗西斯氏菌鼠疫耶尔森氏菌霍乱弧菌O139霍乱弧菌O1布鲁氏杆菌某些种衣原体某些种 枯草杆菌孢子沙门式菌痢疾志贺菌大肠杆菌O157:H7FMD病毒登革热病毒正痘病毒(天花)雷尔氏菌某些种 马铃薯y病毒疫霉菌裂谷热病毒李斯特氏菌某些种单核细胞增多性李斯特菌VEE病毒卵清蛋白肉毒杆菌毒素
结果
CANARY试验
在不到3分钟的总测试时间内检测到了少至50cfu鼠疫耶尔森氏菌，该细菌引起瘟疫。然而，对相对大量的不相关的病原体(土拉热弗朗西斯氏菌)无反应。此外，即使极大量的不相关抗原也不妨碍对50cfu之少的鼠疫耶尔森氏菌的反应。事实上，对于大多数大小足以在微离心管中被浓缩的细菌或病毒，我们已观测到了大约50cfu或pfu类似级别的灵敏度。当在几个月内重复测试鼠疫耶尔森氏菌特异性细胞系的灵敏度时，CANARY传感器能在62％的时间检测20cfu(n＝73)、在79％的时间检测50cfu(n＝38)、在99％的时间检测200(n＝74)和2000cfu(n＝71)、以及在100％的时间检测20,000cfu(n＝66)。假阳性率仅为0.4％(n＝1288)，结合接近于PCR的灵敏度以及不到3分钟可以进行的测试，使CANARY试验称为当前发展的最有前景的病原体鉴定技术之一。
因为扩散速率决定B细胞和不可沉淀的目标物质之间的相互作用，因此，CANARY试验对于小病毒的灵敏度高于对于细菌和大病毒的灵敏度。例如，当被暴露于7×105个空斑形成单位(pfu)时，对口蹄疫病毒(FMDV)的A12系特异性的B细胞产生易区分的信号。类似地，用灭活前滴定的TC-83系测试委内瑞拉马脑炎(VEE)特异性B细胞系的灵敏度证明由7×105pfu产生可检测信号。
B细胞表达的抗体决定CANARY细胞的特异性，并且可以与可获得的抗体一样宽或窄。例如，当FMDV细胞系对野生型A12病毒反应时，加入等量A12变异株(B2PD.3)后，未检测到光，所述B2PD.3与野生型A12有三个氨基酸的不同，这种变化打断了抗体表位相互作用。与仅对一个FMDV株反应的FMDV细胞系的特异性相反，VEE B细胞系显示了与亲本单克隆抗体相似的特异性，和代表亚型IA(TC-83，TRD)、IB(PTF-39)、IC(P676)、ID(3880)和IE(Mena II)的VEE株反应。M12g3R亲本系(对照B细胞)也被测试与不同VEE株的反应性，并且，尽管其在TC-83和TRD抗原制剂(其是从幼鼠大脑、而不是从组织培养物提取的)存在时显示非特异性信号，但是由特异性B细胞系产生的信号清楚区别于对照的信号(＞10倍)。我们也由1A4D-1杂交瘤制备了识别除Mena II系外的所有以上所列目标物质的VEE B细胞系。因此，给定适当的单克隆抗体，可以基于我们选择表达的载体设计B细胞的特异性以具有宽或窄范围的反应性。通过根据应用的不同而设计在属、种、或亚种水平上区分生物体极大增加了该系统的灵活性。
对于小病毒灵敏度的改进
多种小病毒浓缩和沉淀的方法已被测试其提高CANARY细胞对这些抗原反应的能力。使用甲醇、TCA或磷钨酸钠的沉淀并没有提高灵敏度，硝酸纤维素的吸附也没有提高灵敏度。各种厂家的离心浓缩器似乎非特异性结合CANARY试验中所使用的低浓度病毒。至今，两种方法已显示好的结果：离心和亲和纯化。
灭活的TC-83 VEE被用于所有以下病毒浓缩试验。为了产生生理学相关的病毒样品，通过穿过0.1μm注射滤器去除VEE聚集体。然后，将样品离心不同时间，并且通过CANARY分析。离心1分钟沉淀少量病毒，5分钟得到中等结果，以及离心10～30分钟沉淀接近完成。这种模式更符合单体VEE的理论沉淀速率，说明我们已制备了具有与现实样品所预计的类似的沉淀特征的测试样品。这也证明在微离心机中离心单体VEE达10～30分钟增加了信号、并且因而增加灵敏度。
进一步的试验检验了经声波处理聚集物质以增加单体病毒的回收。与未处理样品(～50,000,000pfu*)相比，声处理过的样品(～500,000pfu*)中的LOD增加，这反映了存在的和能够穿过0.1μm滤器的单体病毒量的增加。在过滤前被声处理的样品产生高于未声处理的样品几乎100倍的信号。利用声处理制备的单体病毒的沉淀速率也与理论沉淀速率类似，说明声处理并没有打碎病毒至在这些测试中可察觉的程度。离心可以增加灵敏度100倍。
第二种改进CANARY对小病毒的灵敏度的有效方法为亲和纯化。抗VEE的单克隆抗体与G蛋白包被的磁性微球偶联。然后，将这种亲和树脂与含VEE的培养基一起孵育，清洗树脂以去除未结合的病毒，并且CANARY细胞用于检测粘附于沉淀的树脂的病毒。VEE与这些亲和树脂孵育短短15分钟就明显地增加了CANARY细胞反应的强度，并且提高了LOD10倍。
亲和纯化和离心方法都导致CANARY对小病毒反应的提高。选择的方法依赖于被检测的样品的类型。含可沉淀或可溶解干扰物的样品应进行利用磁性微球的抗原亲和纯化。可以使用离心方法测试含可溶性干扰物或完全无干扰物的样品。
快速细胞工程
病原体特异性CANARY细胞的产生需要可用的杂交瘤细胞系、涉及多个步骤、并且可能需几个月。因此需要利用CANARY平台开发出可以用于以快速(＜1天)但特异性的方式产生新的病原体特异性细胞的通用细胞系。为了解决该问题，我们探索使用Fc受体作为将病原体特异性抗原连接于CANARY细胞的可能“接头”分子。Fc受体为结合抗体或免疫复合物的膜表达蛋白质家族。它们在包括单核细胞和巨噬细胞的多种造血细胞上表达。存在多种Fc受体的亚类，包括为可溶性抗体的高亲和性结合物的Fcγ受体I(FcγRI)。FcγRI结合免疫球蛋白G(IgG)的恒定区(Fc部分)，空下抗体的抗原结合区。通过特异性抗原导致抗体结合受体的交联启动刺激钙释放的信号传导途径。
人巨噬细胞系U937含有可以用FcγRI处理时被上调的内源FcγRI。最初的试验证明U937细胞可以被工程化以对多种不同病原体或刺激物快速反应。用IFNγ(200ng/ml)处理U937细胞24小时以增加内源FcγRI的表达，并且准备用于CANARY测试。然后将细胞与以下抗体一起孵育：鼠抗-炭疽杆菌孢子、兔多克隆抗-炭疽杆菌孢子、鼠抗-土拉热弗朗西斯氏菌或鼠抗枯草芽孢杆菌。然后，在标准CANARY测试中试验细胞，其中，使用单克隆抗体检测到少至1000cfu的炭疽杆菌孢子、用兔多克隆抗体检测10,000cfu的孢子，以及10,000cfu的土拉热弗朗西斯氏菌和1000cfu的枯草芽孢杆菌。尽管不像遗传工程的B细胞一样灵敏，但是我们已经证明了需要几天而不是几个月的快速工程化的CANARY细胞的开发。
多重试验
我们已经评估了在单个测试中结合多种不同B细胞系的可行性。这将允许用单个测试检测多种抗原，尽管将不能辨别哪种抗原在样品中。用单个细胞试剂检测3种不同抗原表明对于炭疽杆菌的检测极限为50cfu B.a.、鼠疫耶尔森氏菌为50cfu Y.p.、以及土拉热弗朗西斯氏菌为500cfu F.t.。以40μL1.25×105个细胞/mL的优化细胞浓度和量，我们能够证明可以结合4种细胞系，而没有任何灵敏度损失。
第二种多重方法为表达一种以上抗体、并且能对一种以上抗原反应的细胞系。我们已制备了表达两种抗体的细胞系，一种抗体为炭疽杆菌特异性的，另一种为鼠疫耶尔森氏菌特异性的。该细胞系被用于检测仅50cfu的炭疽杆菌孢子或鼠疫耶尔森氏菌，证明我们能够建立具有多重检测能力、无灵敏度损失的细胞系。
第三种提供多重测试的方法为发射不同波长的光的CANARY细胞。在发光水母中，水母发光蛋白天然地与绿色荧光蛋白(GFP)相关。当水母发光蛋白结合钙并氧化腔肠素时，水母发光蛋白将其能量转移给GFP，并且激发绿光发射(λmax，509nm)。该自然发生的化学发光共振能量转移(CRET)活性可以通过融合水母发光蛋白和GFP在体外复制。GFP可以进行遗传修饰以产生包括蓝绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的多种荧光蛋白。水母发光蛋白与不同GFP构建体融合可以产生多种能够产生不同波长的光的水母发光蛋白。表达这些水母发光蛋白-GFP蛋白的CANARY细胞提供了多重测试，其中一种或多种波长的检测使得能够在单测试中识别多种病原体。这种类型的多重测试具有几种优点，包括在样品量受到限制时在单个测试中识别多种病原体、当使用单通道传感器时同时检测多个病原体的能力、以及通过增加重复数目降低多通道传感器中的假阳性率的可能性。
EGFP-水母发光蛋白构建体被转染至M12g3R鼠B细胞内，并且通过对抗IgM刺激的反应筛选克隆。在流式细胞器上分析阳性克隆，其中表达EGFP(λmax，509nm)的细胞可以在测量515～545nm绿色光谱中的光的FL1通道中被检测到。为了进一步证实表达EGFP-水母发光蛋白的细胞发射与表达野生型水母发光蛋白的细胞不同的波长的光，我们用两个具有480nm和510nm的不同带通滤波器的光电倍增管(PMT)分析光输出。用抗IgM刺激细胞，并且利用两种PMT同时测量光。因为水母发光蛋白和EGFP-水母发光蛋白的发射光谱重叠，因此结果表达为绿/蓝光的比例。由表达EGFP-水母发光蛋白的细胞发射的绿光的量显著高于由表达野生型水母发光蛋白的细胞发出的量。有趣的是，与在缺少任何辅因子时发射荧光的野生型EGFP不同，EGFP-水母发光蛋白在观察到荧光之前需要水母发光蛋白辅因子——腔肠素的存在。
临床样品测试的发展
在许多应用场合快速抗原识别技术是非常有价值的。例如，快速测试能确保在即时治疗直到非常重要作用的感染早期阶段对病人进行及时、准确的治疗，如在吸入性炭疽病的情况中。因此，我们研究了CANARY试验在检测临床相关样品中的病原体中的应用。在样品制剂可以被检测之前，向鼻拭子中加入少至50cfu的炭疽杆菌孢子。在该流程中，用400μl测试培养基将拭子置于含5μm滤器的篮中。通过离心2分钟、在1.5ml微离心管中收集洗出液，离心也用于将孢子集中至管底部。离心后，去除篮和拭子，并且在同一管中进行试验。总测试时间不到5分钟，并且因此，CANARY试验为可能已暴露于气溶胶化炭疽杆菌孢子的人们提供极好的初筛，因而实现即时治疗。
另一个例子为需要快速即时诊断检验以确保疾病的治疗和控制的情况，如所述疾病为具有高的药物治疗不顺应率的通过性传播的疾病。沙眼衣原体为高流行度的性传播疾病，可能导致盆腔炎症性疾病和生育问题，并且因为多数无症状情况从而未被诊断。过去，利用需相当时间和专家的检测已从宫颈和尿道涂片诊断该疾病。尽管该生物的原生小体(EB)可以在微创收集的样品尿液中被发现，但其以极低量存在以至于直到最近具有足够有效的灵敏度的测试为扩增核酸的测试。在最近的报道中，使用定量连接酶链反应确定感染患者的尿液中沙眼衣原体的浓度范围为30至2×105EB/ml，定量连接酶链反应为需要进行几个小时的测试(Abbott)。由于CANARY试验的快速进行，我们能够达到在不到5分钟的时间内检测尿液中的500沙眼衣原体EB。因此，CANARY试验作为在无创测试中诊断沙眼衣原体感染的快速、灵敏测试也是有用的。
全血因为其不透明性和同时存在CANARY测试的活化因子和抑制因子从而是难以测试的基质。我们已经研制的方法依赖于血浆分离管(PST)和差异离心。该方法使用具有在血浆和血细胞的密度之间的密度的触变凝胶，其在离心过程中在血浆和细胞之间形成屏障。离心后，任何血液中存在的任何细菌或病毒保留在血浆相中，然后其可以被收获、并且在CANARY中测试。利用市售成品(“COTS”)部件装配的设备，我们已证明了以三个快速简单步骤分离全血样品。在肝素化血浆分离管内收集0.5mL全血(步骤1)，并且离心90秒(步骤2)。通过倒置在测试管中收集分离的含病原体血浆(步骤3)，回收体积在50～250μL范围内。50μL血浆与0.5mL测试培养基混合(如以下更详细解释，一种降低血浆中存在的CANARY细胞活化因子的作用的过程)，并且离心混合物以沉淀病原体。然后用抗原特异性CANARY细胞测试样品。从血液收集到病原体检测所需总时间为～5分钟。使用PST方法，LOD为～1000cfu活的无毒鼠疫耶尔森氏菌/mL全血。通过使用从0.5mL全血回收的200μL血浆中的50μL，我们检测限达到少至125cfu(假定充分回收)/全血样品。这些结果在迄今测试的各供血者中是一致。
如前提及，人血浆包含干扰CANARY测试的B细胞活化因子，使得难以从低浓度抗原获得可以与背景区分的清晰信号。活化因子产生的信号晚于病原体诱导信号到达峰值，并且信号强度是供者依赖性的，从几乎难于察觉到几个数量级的强度。我们已经研制了三种有效去除活化因子的样品制备方法。方法1利用了活化因子为可溶性的、并且可以通过用测试缓冲液置换血浆而被去除的事实。该技术对于可以在置换前被离心沉淀的细菌和大颗粒是有效的，但是不能用于小病毒或可溶性蛋白质。方法2涉及通过向血浆样品中加入过量的CANARY测试培养基削弱活化因子的作用。该方法是最快速简单的，但是需要进一步测试以确保其对各种血样、尤其含高水平活化因子的血样的有效性。方法3用起到活化因子吸附剂作用的B细胞预处理血样。
为了检测白血球中的细胞内病原体，研发了对检测血浆中病原体的原型设备进行改进的方法。这些改进基于市售可得的血液采集管(blood vacutainer tube)，细胞制备管(CPT)。该管被设计收集全血、以及通过在单个管中结合聚酯凝胶和密度梯度细胞分离培养基分离单核白血球。在单离心步骤过程中发生细胞分离。市售管的缺点为其需要至少6mL血和最少15分钟离心。通过将CPT凝胶和密度梯度培养基结合到上述特制的处理设备中，血液的量被降至0.5mL，并且离心时间仅为90秒。
为了使血细胞发生正确分离，全血应用磷酸盐缓冲液(PBS)以至少6∶1的比率被稀释；因而100μL的PBS被置于凝胶上。这样，该设备已准备好处理血样。将肝素化的全血(600μL)置于管内，倒置管，以混合血和PBS。离心90秒后，血液分离为其各种组分。用测试管替代该设备顶部内的红塞(red plug)，并且通过倒置在测试管内收集血浆和白血球。
通过向测试管内加入M-Per细胞溶解剂、并且利用周期性旋转振荡在室温下孵育5分钟实现细胞内病原体的释放。将样品离心1分钟以沉淀病原体，用500μL测试培养基置换上清液，通过旋转振荡混合，并且重复离心。从血液收集到抗原检测的总时间为～12分钟。实现了每mL全血细胞1000cfu活鼠疫耶尔森氏菌(600cfu/测试)的检测。该方法对可以通过低速离心浓缩的细胞内病原体(即细菌和大病毒)的检测是有很好效果的。
验证
进行了其中使用沙眼衣原体细胞系对交叉反应性和灵敏度进行检测的验证。22种类型的被测细菌中的仅两种并且仅在极高浓度(107/mL)下观测交叉反应性。当肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)产生阳性反应时，仅细菌的单体多糖出现在肺炎患者的尿液中，并且单体抗原不刺激CANARY B细胞。另一交叉反应的细菌——麻疹孪生球菌(Gemella morbillorum)为可能污染尿样的正常肠内微生物，但是不可能为如此高浓度。根据测试的沙眼衣原体的血清型不同，沙眼衣原体细胞系的灵敏度在10～150EB的范围内(对于血清型D、H和K分别为10、50和150)。然而，由于不同批次产生稍不同的结果，所以，灵敏度的范围可能归因于定量的精准性而不是细胞系的差异反应。在任一情况下，通过验证确定的LOD在10’s～100’s范围内。
结论
基于CANARY B细胞系的生物传感器利用了与其它识别技术相比具有多种优点的高度发展的病原体识别系统。利用CANARY试验可能在不到5分钟内提供识别，并且利用这些足以在微离心机中被浓缩的大病原体，我们已证实了接近于PCR的灵敏性水平。与此对比，目前发展水平的免疫试验需要至少14分钟，并且具有较高的检测极限(6×104cfu或6×104pfu)。尽管PCR为极灵敏的(1～5cfu)、高度特异性的、并且具有已降低扩增和信号检测时间的喜人技术突破，但是该试验需至少7分钟(但典型地为20～30分钟)，不包括提取和纯化DNA所需时间。从这种技术受益的应用包括复诊率低但社会影响大的疾病(如性传播疾病)的即时诊断。此外，CANARY试验对进口港的农业病原体的检测、生物战争袭击后的鼻拭子症状前检测或易腐食品供应的筛查是有利的。事实上，CANARY试验为在任何时间紧迫情况下实现高度传染病原体的检测和识别的快速、灵敏方法。
用于小颗粒浓缩的双向电泳
引言：CANARY测试可以使用离心作为在将用于识别和信号产生的B细胞引入含抗原颗粒之前使含抗原颗粒共同定位的关键步骤。这种手段在细菌和具有大于500nm粒径的病毒目标物质的快速检测中是非常成功的；然而，一些病毒目标物质小得多，则更难以以这种方式浓缩并且可能需要具有极高速度的更强的离心和/或附加步骤(如目标颗粒与微球的中间结合)以提高复合颗粒的沉淀。为了判定沉淀给定粒径的颗粒需要的离心速度，我们可以使用沉淀的斯托克斯定律(式1)计算随流体粘性和旋转参数变化的颗粒在流体中的速度。
v p = 2 9 r p 2 ( ρ p - ρ m μ ) D ( 2 πN 60 ) 2
Vp＝颗粒速度
rp＝颗粒半径
ρ＝密度
μ＝流体粘性
D＝离心半径
N＝旋转速度
作为例子，使用现有具18,800rpm最大速度的台式CANARY离心机，VEE病毒颗粒(直径70nm)在微离心管内通过50μL的典型样品体积的浓缩需约15分钟。使用具有最高100,000rpm转速的超离心机能将沉淀时间减少至不到1分钟，但是随之具有所需设备的相关复杂性。
我们已研发了用于小颗粒浓缩的非基于离心的方法，一种是动电学的或基于电场的方法。这些技术中最公知的为电泳，其在基于液体和凝胶的介质中处理和分离包括DNA和蛋白质的带电颗粒和大分子方面已非常成功地应用多年。其依靠向颗粒存在其中的介质两端施加电场；在该(恒定)电场的作用下，带电颗粒将朝向一个电极迁移。颗粒移动的方向和速度取决于其电荷和大小、以及介质的性质(包括其pH和离子强度)。电泳以相对不精密的方式处理带电颗粒，是非常有用的技术。然而，为了将颗粒集中至特定位置且另外这些颗粒不是必须带电的而是可极化的，则使用所谓双向电泳的技术。
双向电泳——基础
术语双向电泳(DEP)首先由Pohl使用，Pohl能够通过使用非均一电场在不带电颗粒中产生电荷分离(极化、产生偶极)而诱导多种细胞类型的移动和分离。如图181所示，有正、负两种DEP模式；通过颗粒相对于周围介质的相对极性确定采用哪种模式。在这两种情况下，颗粒和介质在施加的非均一电场的作用下发生电荷分离。如果颗粒比介质更易极化，则净偶极导致颗粒被吸引向最高电场区域；这被称作正DEP。如果颗粒较介质不易极化，则流体介质向高电场迁移，这将颗粒推向电场最小处；这为负DEP。
注意：如果改变电场的极性，则诱导的电荷和偶极也改变极性，从而颗粒仍沿相同方向移动；这使交流(AC)电场能够用于操纵颗粒。AC电场使得能够利用按照频率变化的颗粒的极性；这意味着根据所施加电场的频率的不同，同一颗粒可以既发生正DEP也发生负DEP。AC电场也是比DC更有利的，因为AC电场其不导致由于电泳电解而在电极处产生显著明显的净气(net gas)。一般地，在低频率下，由于在各循环中有足够的时间使颗粒中的电荷相对于介质中的电荷进行分离，因此颗粒将经历正双向电泳。在较高频率下，颗粒内的电荷分布不能“维持”，因而颗粒相对于介质变得较不易极化，使其进入负双向电泳状态。正DEP可以被用于在电极处集中颗粒，而负DEP在远离电极的电场“井”中捕捉他们。使颗粒从正转向负DEP的频率称作分隔频率(crossover frequency)。
式2显示影响双向电泳力(FDEP)的因素；该力与所施电压(V)的平方和颗粒半径(r)的立方成比例，并且与电极间距(d)成反比。其也为颗粒(εp *)和介质(εm *)的相对介电常数的函数，其中，如其对克劳修斯-莫索提(Clausius-Mossotti)因子K(ω)的影响所示，颗粒和介质的介电常数均为频率(ω)依赖的。
F DEP = 2 π r 3 ϵ m Re [ K ( ω ) ] ▿ E 2 ▿ E 2 α V 2 d 3 K ( ω ) = ϵ p * - ϵ m * ϵ p * + 2 ϵ m * - - - ( 2 )
有许多使用正、负DEP操纵和捕捉细胞和较大(＞1μm)颗粒的范例。新近，随着能形成更小几何结构电极的制备方法的发展，DEP已被用于捕获大病毒甚至如蛋白质和DNA的大分子。我们正使用DEP浓缩直径不到100nm的颗粒，这是如式2清楚所示的一个挑战性的问题，即随颗粒粒径降低，需要大大地增大所施加的电场(可能产生电解)和/或降低电极间距及几何尺寸(其使制备工艺复杂)。
材料和方法
DEP芯片的设计
一组具有各种几何结构的叉指电极的设备被制造。各设备包括一组镀在正方形石英芯片上的铂线，所述芯片的尺寸为25mm×25mm×0.5mm，电极布图使用常规的剥离(liftoff)工艺形成，其中，使用光敏聚合物光蚀刻地形成金属布图的负像，之后，使用电子束蒸镀方法镀铂、并且通过溶解下面的光聚合物去除过量铂(图182)。图183显示基本电极图形和完成的设备芯片。除线性双电极布图外，也制备了少量螺旋四电极结构；这些可以被用于实现行波双向电泳，其中在相位中均匀分隔的四个AC信号被施与电极以使颗粒沿所述结构步进到螺旋的中心。
测试设置
两种设置被用于应用DEP芯片，一种是芯片被水平放置而另一种中芯片被垂直放置。注意，尽管模拟使用双芯片结构，但是，最初的试验仅使用单组电极以分别经正、负DEP显示测试颗粒的吸引和排斥。在水平和垂直的两种配置中，通过在含电极芯片和平面石英芯片之间夹入125μm厚的硅橡胶垫圈形成流体槽。该设备被置于两种类型的夹具之一内，并且通过与含电极芯片上的叉指电极连接的金属垫接触的铜鳄鱼夹获得电通路。
使用Hewlett-Packard HP237信号发生器通过在两个电极上施加1～10V(峰值至峰值)强度、1Hz～10MHz频率的方波产生微球运动。测试颗粒包括在蒸馏水中悬浮的各种直径的荧光标记的聚苯乙烯微球(Bangs实验室、在655nm发光)。在水平配置中，通过用在流体中悬浮的微球填充槽道、施加电场、以及使微球的运动成像以静态模式观察微球的运动。在垂直配置中，通过在槽的一端施加少量吸收材料以起管吸作用而产生流体流动。使用与具有各种荧光滤片配备的奥林巴斯BX60荧光显微镜连接的CCD照相机捕获颗粒的图像，并且在DVD录像机中记录。
结果
该研究的目的是显示使用DEP定位小颗粒的能力。因而，以正或负DEP模式评估该设备的这项能力。在低频率下，微球显示正DEP，其中微球向电极定位；随激发频率增加，在某一时间点，微球从电极表面被释放，并且开始移动离开电极。
使用水平配置，我们能够利用具有5μm线宽的电极显示2.7μm和0.3μm直径微球的吸附和排斥，但是，由于测试设置中芯片被水平放置而从上方观察的配置，不能确定排斥距离。随后制造具2μm线宽电极的设备并以垂直配置测试。
结论
使用具2μm线宽的叉指金属电极，我们能证明300nm和更大颗粒的正、负双向电泳移动。在负DEP方案中，颗粒被从电极平面推动直至20μm的距离。也使用50nm颗粒显示负DEP的作用，但仅有5μm的排斥距离。该研究的最终目的为浓缩直径小于100nm的颗粒，并且进一步能够将其推动至离开驱动电极适当距离，以能够使颗粒的浓缩面与其它的样品流体分离。在微流槽中，至少100μm的排斥距离才有助于这种分离，但是，在我们的设备中，我们能实现不到20μm的排斥距离。如果我们查看控制有效DEP力的参数，我们发现与电极线宽的立方呈反比。这暗示对于给定驱动电压和颗粒直径，线宽减小10倍将得到增大1000倍的DEP力，而排斥距离相应增加。使用先进光蚀刻系统可以制备具有0.2μm线宽的电极，而这些设备使50nm颗粒的浓缩成为可能。
利用CANARY的毒素检测
方法和材料
GST-BoNT/A及E Hc重组体表达和纯化
在质粒pGEX-4T3中有编码BoNT/A Hc和BoNT/E Hc的cDNA。根据厂商的说明，将质粒转染至BL21(DE3)pLys(Invitrogen)中。从隔夜培养物稀释持(harboring)质粒的细菌，并且生长至OD600约为0.5，加入IPTG达到400μM终浓度，然后在30℃继续孵育4小时。收获细菌，并且各升重悬在30mL具30μL benzonase核酸酶(Novagen)的BugBuster中，并且管在室温下旋转20分钟。溶解产物在4℃以21,000RCF离心30分钟，将溶解蛋白质轻倒在用PBS、1mM EDTA平衡的谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Amersham Biosciences)上。浆液在4℃旋转2小时，并注于20mL一次性柱子(BioRad)上。用PBS/EDTA洗柱子，并且以溶有10mM谷胱甘肽的100mM、pH8.0的Tris洗脱重组蛋白。
非医用基质
1/7体积的7X HNa(560mM NaCl，1.4M Hepes pH7.9，以及抗体包被的微球)被加入到掺有抗原的溶液中。在12分钟结合步骤结束时，加入190μL测试培养基，管在磁体上放置30秒，然后弃去上清。在50μL测试培养基中重悬微球，加入20μL细胞，管子旋转5秒以沉淀微球和CANARY细胞，并且在光度计上监测光输出。
抗体制备
使杂交瘤适应杂交瘤SFM培养基(Gibco)+1x非必要氨基酸(Gibco，100μM丙酮酸钠和100μM L-谷氨酰胺)。某些杂交瘤最初需要10％血清，但是所有的抗体最终在含0％血清的培养基中产生。
抗体纯化
在无血清的培养基中产生的杂交瘤上清液在临床离心机中以3700RPM离心，并且上清液通过0.2μm滤器过滤。向上清液中加入1mL PBS平衡的G蛋白琼脂糖4快速流(Protein G Sepharose 4 FastFlow(GE Healthcare))，并且在室温下缓慢旋转3～4小时或在4℃缓慢旋转过夜。将树脂注入一次性柱子中，用PBS清洗，并且1mL用100mM KPO4 pH 2.7洗脱的片段被直接加到100μL 1M Hepes pH8.5中。使用NAP-5柱子将缓冲液交换至PBS。
与G蛋白树脂交联
在50mM NaOAc，pH5.0中清洗微球(Dynal Dynabeads G蛋白)。杂交瘤上清液的pH调至约5.0，BSA被加至0.1％，并且溶液通过0.2μm滤器过滤。将100μL的微球加入10mL杂交瘤上清液中，并且管在室温下旋转1小时。微球在pH8.0的0.2M硼酸钠中清洗，并且在1mL含20mM DMP的硼酸盐中重悬。管子在室温下旋转30分钟，加入250μL的1M Tris，pH8.0，并且孵育15分钟。在PBS+0.05％triton X-100中洗微球，并且在1mL液体中重悬。对于大多数试验，每个CANARY试验使用约0.4μL的微球。
生物素交联
在偶联前，使用Nanosep 30K Omega离心浓缩机将抗体浓缩至～1mg/mL。生物素(磺基-NHS-LC-LC-生物素，Pierce)在PBS中重悬达到10mM。生物素加入摩尔量超出抗体(在PBS中平衡)20倍，并且在室温孵育30分钟。Tris(pH7.5)被加入达到100mM，并且用PBS交换缓冲液。生物素化抗体以足够饱和结合位点(每mg微球20μg抗体)的浓度被加到M-280 Dynabeads(Dynal)中，并且在室温下孵育30分钟。收集微球，并且在PBS+0.05％Triton X-100中洗涤并储存。典型地，微球被稀释至其原始储存浓度的1/10，并且每CANARY试验使用0.4μL的微球。
引言
CANARY试验已经证明了在检测病毒和细菌中的优越性能。毒素的检测提出了不同问题。检测毒素的困难在于尽管在B细胞表面上表达的抗体能够结合两个毒素分子，但是各毒素分子仅能结合一个抗体。这意味着可溶性、单体毒素不能导致抗体被交联，结果不会启动导致光发射的细胞内级联。
克服该问题的有效方法为在微球上捕获毒素。然后，这些毒素修饰的微球可以交联CANARY细胞表面上的多个抗体，并且刺激光发射。捕获微球的使用也促进了可溶性蛋白质毒素从细胞不相容溶液(含CANARY细胞的非特异性刺激因子或抑制因子)转移至CANARY细胞相容溶液中。该项重要能力极大地扩展了CANARY可以潜在地用于检测毒素的基质的类型。
肉毒杆菌毒素检测
毒素形式：根据试验的目的和毒素试验的成熟度，使用多种类型的肉毒毒素A(BoNT/A)抗原。在E.coli.中产生BoNT/A重链(BoNT/Hc)的GST融合。该重组蛋白质被用作表达BoNT/A抗体的细胞的CANARY细胞的筛选工具。GST融合使得抗原易于与微球连接、以及能够对CANARY细胞进行筛选。重组BoNT/E Hc被用作对照以证明CANARY细胞的反应是BoNT/A特异性的(抗体不结合BoNT/E)。然而，GST蛋白质具有在溶液中二聚化的特性，因而不是证明CANARY检测单体蛋白质的能力的适当目标物质。
市售BoNT/HC。该BoNT/A的无毒部分从天然毒素中被分离，并且必须使用抗BoNT/A抗体从溶液中捕获。这是检测可溶性蛋白质的好的模式，但是BoNT的重链部分不像全毒素一样稳定，并且这种不稳定性使得难于利用该抗原进行灵敏的检测。重要地，其也未实际证明检测活性BoNT/A的能力。
BoNT/A。使用购自商业来源(Metabiologics)的活性BoNT/A进行大多数试验。
BoNT/A复合物。由肉毒杆菌(Clostridium botulinum)产生的BoNT/A与多种其它蛋白质复合。这些相关的蛋白质阻碍一些抗体的结合，从而有必要证明使用这些抗体研发的CANARY试验不仅能够检测BoNT/A，而且还能够检测BoNT/A复合物。
抗体
大多数试验使用源自6E10-10、6C2-4和6B2-2杂交瘤的抗体。这些抗体结合BoNT/A上的独立表位。大多数以下描述的试验使用表达6B2-2抗体的CANARY细胞以检测与微球结合的6E10-10抗体上捕获的BoNT/A抗原。
其它试验也使用CR1、Raz、和S25抗体，各该抗体在BoNT/A蛋白质上结合3个单独的表位。这些抗体被用于判断抗体亲和性对CANARY试验灵敏度的影响。
微球：谷胱甘肽琼脂糖凝胶被用于捕获重组BoNT/A Hc以在筛选和初始检测中呈递于CANARY细胞。G蛋白包被的微球(琼脂糖或顺磁性)被交联以捕获抗体，并用于在溶液中捕获可溶性BoNT/A产物以呈递于CANARY细胞。链霉亲和素包被的顺磁微球被生物素标记的抗体覆盖。这些微球是具有可再生性的，并且因为它们是顺磁性的，也允许无需离心而进行样品制备(毒素捕获和微球清洗)。
结果：使用BoNT/A毒素模拟物的试验
编码BoNT/A Hc(6B2-2和6E10-10)上不同表位的抗体的基因被克隆，并且在单独的B细胞系中表达以评估其功能。所得的细胞系都对与谷胱甘肽琼脂糖微球结合的BoNT/A Hc-GST融合蛋白质产生反应。为了测试CANARY细胞功能，在谷胱甘肽微球上捕获重组抗原，在测试培养基中清洗微球，并且将捕获的抗原呈递给表达6E10-10抗体的CANARY细胞。通过将微球结合的BoNT/A Hc-GST与6B2-2抗体一起孵育2.5小时或过夜能够使6B2-2 CANARY细胞反应被部分消除。在谷胱甘肽微球上捕获的BoNT/A Hc-GST不刺激细胞，证明CANARY反应是通过与抗病的相互作用被激活的，而并非由微球或毒素非特异性激发的。
GST蛋白质在溶液中二聚化，并且因此不能被用于证明CANARY检测可溶性单体蛋白质的能力。为了显示从溶液中捕获可溶性单体蛋白质，我们使用从天然BoNT/A(Metabiologics)中纯化的BoNT/A Hc。6E10-10抗体与G蛋白标记的微球偶联，并且将这些微球与不同浓度的BoNT/A Hc一起孵育。将CANARY细胞加入BoNT/A Hc修饰的微球，并且混合物离心5秒以共沉淀微球和细胞。捕获的抗原以800pg(80ng/ml)的表观灵敏度按照剂量特异性方式有效地激发CANARY细胞。该试验的总试验时间＜5分钟，包括微球结合、细胞添加和光输出测量。
然而，在储存过程中BoNT/A Hc聚集使试验灵敏度的精确测量变得困难。未冷冻的BoNT/A Hc比曾经冻结的BoNT/A Hc产生较高的反应。离心的冷冻-解冻BoNT/A Hc的上清液甚至显示更低的活性，表明在冷冻-解冻过程中已经形成凝聚物。除了储藏特性外，批次变异性也影响我们准确测定灵敏度的能力。因为证实CANARY试验能够检测可溶性蛋白质是重要的，所以我们典型地测试冷冻储存并且在解冻时进行离心以去除凝聚物的BoNT/A Hc。
如桔汁或水的某些溶液与CANARY试验不相容，因此，必须用测试培养基交换含毒素模拟物的原始溶液。此外，一些基质被发现不仅影响细胞，也影响通过抗体包被微球对毒素的捕获。例如，桔汁因为其低pH(pH＝3.5)而是有问题的。我们的方案是设计单缓冲抗原，当该单缓冲抗原被加入多种溶液时，其使pH标准化并且产生最低的盐浓度以使得能够特异性捕获抗原。对于这些试验，我们创造了加入到所有液体中的浓缩缓冲液(7×HNa)以升高盐到至少80mM终浓度，并且缓冲如桔汁的酸溶液的pH值至约6.5。微球可以储藏在该缓冲液中，从而，毒素检测仍仅需向样品中添加单一溶液(7×HNa+捕获微球)。抗体包被的微球在溶液中孵育12分钟，用测试培养基清洗，并且在CANARY试验中使用。桔汁和PBS-Tx-100中的BoNT/AHc的LOD为80ng/ml，确定为背景的3倍。尽管CANARY试验对桔汁和PBS-Tx-100中的BoNT/A Hc的灵敏度与对照相当，但是牛奶被证明是抑制性的(约对照的20％)，表明必须改变样品制备以获得在该基质中的理想灵敏度。最初的结果显示增加牛奶中的盐浓度可以提高灵敏度。
许多医学相关的基质也已被测试，并且各需要特定的样品制备方法。所研发用于检测鼻腔样品的方法使样品在拭子上被收集、修剪掉拭子的杆并将拭子末端置于配置在埃彭道夫管上方的5μm滤筐内。加入含BoNT/A Hc的测试培养基，给该装置加盖并离心。在埃彭道夫管中收集过滤的洗脱液，并且采用上述微球捕获程序进行测试。实际的和具有BoNT/A Hc模拟拭子的信号是非常相似的，表明鼻腔样品中无抑制因子出现。当无抗原(鼻拭子)时没有CANARY对鼻拭子的反应表明在鼻拭子样品中没有非特异性刺激因子存在。
BoNT/A毒素和CANARY测试灵敏度
为了证明CANARY不仅检测BoNT/A Hc毒素模拟物，而且还检测活性BoNT/A毒素，测试市售的BoNT/A并使用6E10-10微球捕获的毒素进行分析和使用6B2-2 CANARY细胞进行检测。在该测试中的检测极限为约8ng/ml或80pg毒素，其比BoNT/A Hc毒素模拟物提高了约10倍。含16pg毒素(1.6ng/ml)的样品激发细胞反应至约高于背景3倍，但是具有不适于目前检测算法的动力学特征。这种测试灵敏度的提高表明活性BoNT/A毒素在储存过程保持可溶性，或者抗体与全毒素的结合好于与重链的结合。
在实际样品中BoNT/A毒素检测也被证明。在尿液中的BoNT/A毒素的检测被进行，其中，检测极限为16ng/ml。CANARY试验对于全血中的BoNT/A的检测也是有效的。将BoNT/A加入全血中，并且通过聚合物对血进行短暂离心以促进细胞与可溶性物质分离。将6E10-10微球加入所得上清液中，孵育2分钟，并且使用6B2-2CANARY细胞测试。如检测牛奶中的毒素模拟物时所观察的，该试验的检测极限——16ng/mL比使用对照培养基所观测的灵敏度低约5倍。
可能是这两种基质中的高蛋白质浓度抑制溶液中微球结合抗体和浓度中的BoNT/A之间的特异性相互作用。为提高高蛋白质溶液中的灵敏度，测试了添加盐和非离子清洁剂的情况。盐(NaCl)、非离子清洁剂(Tween-20或Triton X-100)或两者的组合被加入到血浆中的48ng/mL BoNT/A中，并且将结果与添加水对比。添加Triton X-100改进了信号，然而添加Tween并没有。单独添加盐具有更剧烈的影响，将信号强度从1700RLU增加至约4800RLU。向含盐的样品中添加清洁剂并未产生相加效应。这暗示添加盐可能降低非特异性蛋白质-蛋白质相互作用并且增加BoNT/A结合抗体包被微球的速率。
试验优化
BoNT/A测试的灵敏度被预计依赖于各微球上的抗原密度，而抗原密度又依赖于用于捕获溶液中毒素的微球的数目。使用大量微球确保了最大捕获效率，但是如果毒素的浓度低，则在各微球上出现的抗原可能太稀疏以至于不能引起有效的细胞反应。因此，微球数目和各微球上的抗原密度之间的平衡必须达到。为了优化这些参数，进行了用不同体积的1.6ng/mL BoNT/A测试各种微球浓度的系列试验。在一个这种试验中，将不同数目的微球加入到各个样品中，并且孵育2分钟。当在小体积中孵育时，大量的微球激发细胞不如小数目微球激发细胞好。这暗示在含少量毒素的样品中，使用大量微球的捕获导致极稀疏的抗原分布，以至于不能有效地激发CANARY细胞。
尽管延长捕获时间显著地提高LOD至0.32ng/ml的BoNT/A，但是，我们也观察到微球数目的影响变得更明确。例如，对于在100μL0.32ng/ml的BoNT/A中孵育过夜的微球，将微球的数目从300,000降至3,000提高了信号。微球的数目越少意味着各个微球将具有越多的毒素，随微球数目降低而提高信号。
生物素化抗体、改进结合和清洗条件以及优化微球数目的组合导致在6分钟测试中提高灵敏度至16pg(1.6ng/ml)。16pg的毒素代表由55kg(120 lb)的人吸入的LD50的约0.000029(1/34，370)。这约为通过注射的LD50的0.00023和通过摄食的LD50的0.00000029。以该灵敏度水平，试验可以检测在34mL液体中存在的约1个LD50的量。
实际毒素：BoNT/A的结果
尽管与对照相比信号强度稍有降低，但是尿液中掺入的BoNT/A可以被检测(图158)。在该试验中，未使用预处理，并且6E10-10包被的微球被直接加入到掺有BoNT/A的尿液中。与在平行试验中毒素被直接稀释至测试培养基中的3.2ng/mL相比，尿液中的BoNT/A的检测极限为16ng/m。
CANARY试验对于使用它处所描述的样品制备方法在全血中筛选BoNT/A也是有效的(图159)。全血被掺有BoNT/A，并且将血液通过聚合物短暂离心以促进细胞与可溶性物质的分离。6E10-10抗体包被的微球被加至所得上清液中，孵育2分钟，并且使用6B2-2CANARY细胞测试。该试验的检测极限为16ng/mL，约比使用对照培养基观察到的灵敏度低5倍。该样品制备方法比先前在无聚合物时通过离心制备的血浆的试验获得显著改进。
在牛奶和血清中，通过CANARY试验的毒素检测极限比对照高约5倍。由于在这两种基质中的高蛋白质浓度抑制了溶液中微球结合的抗体和BoNT/A之间的特异性相互作用，因而这是可能的。在努力提高高蛋白质溶液的灵敏度的过程中，添加盐和非离子清洁剂的情况被测试(图160)，盐(NaCl)、非离子清洁剂(Tween-20或TritonX-100)或两者的组合被加入到血浆中的48ng/mL BoNT/A中，并且将结果与添加水的情况对比。添加Triton X-100改进了信号，然而添加Tween并没有。单独添加盐具有更剧烈的影响，将信号强度从1700RLU增加至约4800RLU。向含盐的样品中添加清洁剂并未产生相加效应。这暗示添加盐可能降低非特异性蛋白质-蛋白质相互作用、并且增加BoNT/A结合抗体包被微球的速率。
我们已经显示了CANARY试验能够有效地检测活BoNT/A，但是如果毒素从特定肉毒杆菌菌株分离，则毒素将与添加的蛋白质复合，产生抗原性差异目标物质——BoNT/A复合物。重要的是，CANARY试验以BoNT/A相同反应水平检测BoNT/A复合物(图161)。等摩尔量的BoNT/A和BoNT/A复合物(各5fmol)被加入到6E10-10包被微球中，并且使用6B2-2细胞检测捕获的毒素。两者的CANARY反应相同，暗示由这些抗体结合的BoNT/A上的表位没有被BoNT/A复合蛋白质封闭。
我们已经选择致力于研制非常快速的检测。较长的孵育对于判断测试的极限是有利的，但是对于诊断或检测目的是不利的。我们发现对捕获抗体生物素化并将其连附于链霉亲和素微球更容易的，并且或多或少地得到更好的结果。生物素化抗体、改进结合和清洗条件、以及优化微球数目的组合导致在一段时间内改善灵敏度。在10μL掺有BoNT/A的可疑溶液的检测中，灵敏度为16pg(1.6ng/ml)(图162)。包括添加微球、结合2分钟、磁性捕获和微球清洗、细胞添加及光输出检测的总实验用时约6分钟。
总结
总之，我们已研制了使用抗体包被微球捕获可溶性毒素的肉毒毒素检测方法。这些毒素修饰的微球被用于将固定毒素呈递给CANARY细胞。重要的是，微球也促进毒素从任何种类的细胞不相容基质转移至测试培养基中。这使得能够进行血液、尿液、鼻拭子、桔汁、牛奶、水和PBS-Triton中的毒素检测。某些基质导致CANARY测试中反应下降，尤其对于那些含有高浓度蛋白质的基质(血浆和牛奶)。这种抑制可以通过加入盐以降低非特异性蛋白质相互作用而被部分克服。该测试在速度方面已被优化，并且可以在6分钟内检测16pg(1.6ng/ml)BoNT/A。灵敏度似乎依赖于捕获抗体的亲和性，但是使用较高亲和性抗体并未改进检测极限。增加微球捕获步骤的孵育时间确实导致更好的灵敏度(不到0.32ng/ml)。即使在困难的基质中，测试也能在6分钟内检测到LD50的小部分的量。
CANARY试验的硬件开发
材料和方法
磁性抗原微球和磁性B细胞系微球试验
B细胞结合的微球：使用
Figure A20068005161700911
小鼠Pan B(B220)，货号为114-41D，不进行进一步改变。
抗原结合微球：根据厂商说明用捕获抗体使甲苯磺酰基活化的、货号为142-03的
Figure A20068005161700912
M-280功能化。
测试流程：在1.5ml管中，将用抗原抗体包被的磁性微球(Dynal/货号142-03)与样品在室温下一起孵育5分钟。用磁体将捕获的抗原和磁性微球向下拖至管的底部。向管中加入B细胞磁性微球(Dynal/货号144-41D)，并且通过暴露于强稀土磁体10秒将其拖至管的底部。将管置于光度计内，并读取信号。
侧向流带
材料：
样品垫：微孔玻璃纤维垫G041/GFCP1 030 00。管吸垫：微孔纤维素吸收样品垫C082/CFSP1 730 00。
捕获膜：Pall 0.45μm GH聚丙烯膜(货号GHP4550001/Pall)
方法
装配侧向流带如下。将0.25英寸×0.25英寸微孔管吸垫放置在包装带上。将0.4英寸×0.1英寸的Pall 0.45μm GH聚丙烯膜置于管吸垫之上使1/3的膜在管吸垫顶上。将0.25英寸×0.5玻璃纤维滤膜置于Pall GH聚丙烯膜。
单通道传感器开发
此处描述了能够进行最佳CANARY试验的被改进的单通道硬件。我们采取两种平行途径：(1)研制能够旋转和分析CANARY样品的单一装置的特别设计概念，以及(2)检测能够被修改、或优选地无需修改就能够使用以进行单一CANARY测试的COTS光度计和小型离心机。该方法的成果为改进CANARY测试方法和性能的廉价COTS硬件的确认。最佳硬件组合包括与配有特制转子的VWR小型离心机联合使用的Berthold检测系统FB12光度计，该特制转子能够以最适合的构造旋转多至8个CANARY样品。
使用单通道传感器的过程开始为在常规吊斗微离心机(如果可能)、或者在VWR小型离心机中以＞6000RCF预旋转约2分钟。向样品中加入一滴B细胞，置于小型离心机内，并且旋转5秒。在信号到达最高之前有足够的时间将样品转移至用于信号读取和CANARY鉴定的光度计中。整个CANARY测试过程可以在3分钟内完成，使由单个使用者操作运行的该单通道CANARY传感器利用平行样品预旋转能够每小时处理多至25个样品。
16通道传感器开发
在其最简单的形式中，CANARY测量包括在透明管中制备样品、向管中引入等份特别制备的B细胞、利用快速离心旋转将B细胞驱至管底、以及用光子计数传感器测量管的光输出。在实验室中，大多数CANARY是顺序进行的，即每次一个样品；在自动BAWS/CANARY生物气溶胶鉴定传感器中，同时测量四个样品，各样品具有其自己的光采集通道。各光采集通道典型地包括光子传感器、高压电源、脉冲鉴别电路和可能的数字计数器。前一系统需要更多时间，然而后者需要更复杂(且昂贵)的硬件。
降低测量多个样品的时间(同时使硬件需求最小)的新途径被成功测试。制造了传感器试验台使其能够使用单光采集通道同时测量多达16个样品。该传感器包括支承有16个围绕其圆周水平、均匀分布的1.5ml管子并且由可变速马达绕垂直轴驱动的转子。单固定光子检测部件(在这里为PMT)被置于转子的平面内刚好在管子旋转过程中的轨迹之外。这样，各个管顺序、反复地紧密接近PMT，使其光输出在各次通过时被采样。
此外，由光源(红外LED)和检测器(光电晶体管)组成的光开关被用于控制检测到的光子的计数和16个域内的数据的再组织，各域分别与特定的样品相关。
单测量包括：1、在单独的1.5ml管中制备16个样品(和/或对照)；2、向各个试管内引入等份的B细胞；3、将管安装于位于暗箱内的转子中；4、通过以高RCF(～2000g)短暂(5秒)离心旋转将B细胞定位至管底部；5、在测量过程中(1～2分钟)降低转子的速度至60rpm，各管每秒采样一次；6、产生各个样品的光子计数的时间序列用于显示和/或输入用于评估的计算机算法。
旋转的同时运行测试，由测试读数分析信号收集特征，以判断在信号开始重叠前，试验床内的16位转子如何能够被充分填充。随转子被充分填充，所有的样品产生具有可以与在单信号通道传感器内观察的信号相比的信噪比的信号，并且，如果提供足够的阻隔以限制光的传送角度，则观察不到通道之间的发射光的可检测的道间干扰(crosstalk)。16通道试验床的数据的例子显示与单管方法相当的LOD。尽管该传感器被设计为测量16个样品，但是，虽然取样的物理大小和统计最终形成实际的限制，更多样品数目也是可能的。
便携式16通道原型传感器的设计中包含旋转形式。该设计的最初目的是在最长尺寸不到12英寸的小型自主便携装置中引入CANARY测试的旋转和读取所必须的硬件。此外，还制定规则以确保能量消耗足够低，以使电池能够包含在用于电池供电运行的范围内。通过将传感器组件制成不透水和不透光的小COTS运送箱、以及通过使用能够利用24V DC电源旋转的较小马达和控制器实现这些目的。
手持传感器开发：简化测试开发
以临床、即时和前线部署应用为目的的紧凑型手持传感器是受到特别关注的。我们已致力于使替代测试方法的操作能够减少或去除离心步骤的需求，因为离心步骤目前是能量消耗和仪器复杂的主要原因。我们实验性地评估了多种采用降低离心需求、微流通道、侧向流装置、过滤、或磁性微球捕获的测试形式的途径。在这些途径中，以下较详细地描述离心需求的降低、侧向流装置的使用和磁性微球捕获。
具有降低离心步骤的标准形式。已观察了无离心步骤时高浓度抗原的反应信号，因此，为了达到性能平衡，我们进行了使用不同离心设置的系列试验。试验表明减少离心和测试次数(从每次试验～3分钟至每次试验～1分钟)将使灵敏度降低约1个数量级。
侧向流形式。我们已经在利用管吸和过滤材料完成样品流体输送和抗原定位的设备中完成了CANARY测试性能而无需离心。在图184和图185中显示了该设备的基本结构和证明其定位孢子大小的颗粒的能力的图片。图186显示从使用相同抗原和细胞样品的标准离心测试和侧向流测试所得的CANARY信号。
双重磁性微球测试。我们已经完成了利用两套磁性微球的测试。一套是CANARY B细胞特异性的，而另一套是特定抗原特异性的。在图187中，使用相同B细胞和抗原稀释系列，标准CANARY测试与双重磁性微球测试并行。鼠疫耶尔森氏菌特异性的磁性微球与鼠疫耶尔森氏菌剂的稀释系列混合5分钟。5分钟后，磁性微球与任何结合的鼠疫耶尔森氏菌一起被拖至测试管底部，并且，去除上清液。然后，将磁性标记B细胞加入样品中，并且拖至管底。迄今，用磁性微球定位抗原和B细胞已证明提供了与离心类似的灵敏度。
手持传感器硬件开发
手持传感器硬件研制开发首先设计能够在无离心时进行的单CANARY测试的筒。该筒被设计为含有在其尖部具有小但强的磁体的拭体、和与磁性微球连接的B细胞囊(图188)。在使用拭体对表面采样后，其将被引入含B细胞的囊中，并且磁体将微球结合的B细胞吸引至拭体表面上的抗原。然后，整个筒将滑入特别改制的电池供电的光度计中以记录光发射。该手持传感器可以在野外使用以判断人或表面暴露于特定病原体。该设计的基本原理基于多种因素。通过使用磁体将微球结合的B细胞吸引至液体样品中的抗原(通过离心制备的)，我们已证实了用磁性微球代替离心的能力。我们也已经显示B细胞可以以囊包装，如其在筒内那样，以及或冷冻数周或在室温保藏48小时而无灵敏度损失。最后，尽管磁体对光电倍增管可能有不良影响，但是我们已能够显示磁性拭体和光度计内的光电倍增管之间的距离可被调整以防止这些不良影响。最初的试验已显示无抗原时被吸引至球形钕磁体的微球结合B细胞发射瞬时光信号。这最可能是由于细胞上的机械应力。确定了多种可能的补救方法，包括：使用较弱磁体(钕磁体是非常强的)、“调谐”磁体(在拭体尖端处的磁性材料，被进一步远离拭体内安装的钕磁体磁化)和可缩回磁体(其在B细胞吸引到拭体表面后可以被立即移开)。
磁操控和处理的复杂性抬高了操作成本，因而消除这种复杂性降低了消耗。将磁性样品和细胞操控所需的部件转换到手持读取设备中增加很少的设备总成本。此外，该途径使测试可以在COTS微离心管内进行，并且确保了最大灵敏度和可靠性。基于这些优点，开发了具有可本身完成磁性测试操作的特征的手持光度计。光传感器和支持电子设备基于那些在由Berhold Detection Systems制造的、市售可得的光度计内发现的装置，该制造商还生产安装在单通道CANARY传感器内的COTS光度计。所得设计如图189所示。基于该设计的完整传感器如图190所示。
手持CANARY传感器(图190)的特征为光电阴极距离测试管的底部＜1mm定位的PMT、具有接触垫的读取屏、可充电的电池组和滑动样品门。样品门含有稀土磁体，该稀土磁体被定位以使如图189所述的管插入导致捕获的目标物质和磁性标记B细胞共同定位。该测试程序首先向样品中加入磁性微球、然后混合并孵育5分钟。然后，将样品/微球悬浮液在门上的磁性管支架内放置1分钟以在管底部定位捕获的目标物质。已去除了目标物质的样品被移走、并用含B细胞的测试缓冲液替代，并且将管送回磁性支架。5秒钟后，将管置于门上的读取位置，门关闭，并且记录PMT信号。
这样，我们已经开发了用于产生用作快速鉴定病原体和毒素用的传感器的遗传工程化B细胞的系统。我们使用这些细胞进行的测试证明了已知速度和灵敏度(在不到3分钟内，＜50颗粒的灭活鼠疫耶尔森氏菌，对于实验室样品具有0.4％的错误警报率)的最佳组合，并且因为B细胞是可以自我复制的，因此，材料的成本极低。除24种我们已制备的包括裂谷热(Rift Valley Fever)、登革热病毒(Denguevirus)和其它对临床诊断意义重大的遗传工程化B细胞系外，我们已经产生了其特异性可以在数天而不是数月内被工程化的CANARY细胞系。我们已经开发了用于临床相关样品的5分钟测试，显示了从鼻拭子中检测50cfu炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)孢子、在尿液中检测到500沙眼衣原体(C.trachomatis)EB、以及检测到1000cfu鼠疫耶尔森氏菌/mL全血。我们也已证明通过在单个试验中组合多达3种细胞系、或者通过工程化对不只一种病原体反应的细胞，CANARY测试可以被多重化。可选择地，我们已显示了发射不同波长的光的B细胞的制备，使得能在两种或多种病原体之间进行区分的单一测试成为可能。
我们已将CANARY的能力延伸至包括蛋白质毒素，证明在6分钟的测试内检测少至16pg(1.6ng/mL)的肉毒毒素A。16pg的毒素代表55kg(120 lb)的人吸入LD50的约0.000029(1/34，370)。这约为注射LD50的0.00023和摄食LD50的0.00000029。以该水平的灵敏度，该测试可以检测在34升液体中出现的约1个LD50的量。该灵敏度是否足以使用病人的血清样品诊断BoNT/A是不清楚的(缺少关于血清浓度的公开数据)，但是对于食品污染、气溶胶化物质或吸入暴露(鼻拭子)当然是极好的筛选方法。
尽管使用多片COTS设备可以以单通道形式进行CANARY测试，但是我们已开发了每小时可以处理约100个样品、同时保持细菌或大病毒的50cfu/pfu的最佳LOD的具整合旋转马达和PMT的16通道传感器。我们也研制了利用非离心双磁性途径的手持传感器。
基于CANARY B细胞的生物传感器利用了用于病原体鉴定的高度发展的系统，其提供了多种好于其它鉴定技术的优点。利用CANARY，可能在包括样品制备的约5分钟内提供鉴定，并且，利用那些足够在微离心机内被浓缩的大病原体，我们已证实接近PCR的灵敏度水平。相反，当前技术水平的免疫测试需要至少14分钟，并且具有较高的检测极限(6×104cfu或6×106pfu)。尽管PCR是极灵敏的(1～5cfu)、高度特异性且具有已降低扩增和信号检测时间的喜人技术突破，但是该试验需至少7分钟(但典型地为20～30分钟)，不包括提取和纯化DNA所需时间。从如CANARY的技术受益的应用领域包括对于治疗的复诊率低、但社会影响大的疾病(如性传播疾病)的即时诊断。此外，CANARY对生物战争袭击后鼻拭子的症状前检测、进口港的农业病原体的检测、或易腐烂食品供给的筛查是有价值的。事实上，CANARY是一种在任何时间紧迫情况下能检测和识别高度传染病原体的快速、灵敏方法。
细胞工程化和测试方法实施例
A、细胞工程化方法：
M12g3R细胞在37℃、在5％CO2的湿润空气中、在补充有10％胎牛血清、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、100μM非必须氨基酸、50μM 2-巯基乙醇、50μg/ml链霉素和50U/mL青霉素、250ng/ml两性霉素B(Life Technologies)的RPMI 1640中维持。用pCMV.AEQ.IRES.NEO通过电穿孔(270V，950μF)转染细胞，并且在1mg/ml G418中选择2周。筛选对抗IgM反应的G418抗性克隆。那些当表面IgM交联时具有最大光子发射增加的克隆被用于后续转染以产生对特定病原体特异性的B细胞系。通过与轻、重链的表达载体、以及与编码赋予嘌呤霉素抗性基因的表达载体共转染(通过电穿孔)实现具有工程化特异性的抗体的表面表达。基于其对抗原的反应选择嘌呤霉素抗性池和克隆。轻链表达载体VKExpress包括处于人延伸因子-1α(EF-1α)启动子控制下的多克隆位点(MCS)的人κ基因下游的恒定区。通过修饰pDisplay(Invitrogen)、保留巨细胞病毒(CMV)启动子和前导序列、但是用鼠IgM的膜结合恒定区的基因取代血小板源生长因子(PDGF)受体跨膜域、并且去除MCS两侧的标签获得重链表达载体。使用PCR将适当的限制性位点加入到抗体可变区，并且在克隆至表达构建体之前所有PCR产物的序列都被确认。通过利用随机寡核苷酸引物的反转录(RT)和PCR从cDNA或杂交瘤中克隆用于产生重组抗体的可变区。根据厂商的说明，利用Trizol试剂(Life Technologies)提取RNA，并且使用Retroscript试剂盒(Ambion)进行第一链合成。使用被设计为在5’端与轻或重链[S.T.Jones和M.M.Bendig，Bio/Technology 9，88(1991)]的前导序列退火、并且在3’端与鼠κ基因或IgG2的恒定区退火的引物组完成PCR。
B、对FMDV的生物发光B细胞反应：
制备用pCMV.AEQ.IRES.NEO质粒和识别FMDV的A12株的重组抗体的表达载体稳定转染的M12g3R细胞系用于如下发光测试：在第一天解冻细胞。解冻后24小时细胞的制备对于最大活性和可靠性是关键的。冷冻/解冻步骤将B细胞的反应提高100倍之多。在第二天，106个细胞在室温下、在被箔遮盖的含50μM腔肠素(MolecularProbes，尤金，俄勒冈)的测试培养基[不依赖CO2的培养基，10％FBS、50μg/ml链霉素、50U/m青霉素、和250ng/mL两性霉素B(LifeTechnologies)]内孵育2小时，清洗两次，并且用测试培养基以5×105个细胞/mL的终浓度重悬。将细胞在1.5ml的微离心管内、在室温下保持离心过夜，并且15～20小时后进行测试。对于测试，将25μL细胞与抗原(5μL浓度为1.4×108pfu/ml的wt A12RMC35菌株、10μL浓度为7.5×107pfu/ml的A12突变体，B2PD.3)混合，并且在光度计(Lumat LB 9507，Perkin Elmer)中测量反应。
C、使用细菌和大病毒的生物发光测试
传感器设备和方法可以被用于快速检测细菌以及病毒病原体。对细胞系进行工程化以应答细菌(土拉热弗朗西斯氏菌)，兔热病的病源物质。然而，使用与FMD和VEE病毒相同的方案检测时，信号慢而且几乎与背景难以区别，暗示B细胞和抗原之间的低相互作用速率(0秒预旋转/0秒旋转)。先前用抗原-微球模拟物进行的试验已经表明通过浓缩抗原和B细胞可以增加灵敏度和速度(未显示数据)，因而重新构造光度计以包含位于光电倍增管(PMT)上方的离心机。当抗原物质和细胞被混合到一起、然后通过离心5秒钟被浓缩时，信号提高，并且反应更快(0秒预旋转/5秒旋转)。当在加入细胞之前离心较慢沉降的土拉热弗朗西斯氏菌(60秒预旋转/5秒旋转)时，观察到最佳结果。这种形式确保了在短时间内大量细胞与抗原发生物理接触，从而造成灵敏度和速度的大幅改进。在测试方案进一步优化后，现在，我们能够不到3分钟内(包括预旋转抗原所用时间)检测到少至60集落形成单位(cfu)的土拉热弗朗西斯氏菌，但是对于灭活的土拉热弗朗西斯氏菌未见反应，土拉热弗朗西斯氏菌为导致瘟疫的细菌。已经用两种其它来源的灭活土拉热弗朗西斯氏菌和一种不同菌株确认该检测极限(数据未显示)。此外，传感器设备显示出在检测涉及7个数量级的浓度时的大的检测范围。
如上所述制备B细胞。50μL含标示量的鼠疫耶尔森氏菌或土拉热弗朗西斯氏菌的样品以6500×g离心60秒，然后加入20μL细胞，并且在离心光度计中再旋转5秒。用Hamamatsu HC-125光电倍增管检测光子，并且用斯坦福研究系统SR400门控光子计数器(StanfordResearch Systems SR400 Gated Photon Counter)监测信号。
核酸检测实施例
表达地高辛抗体的发射体细胞的特征
编码抗地高辛抗体的质粒(Daugherty等(1998)Protein Engineering11(9)：825-832)被引入发射体细胞中，并且使用与地高辛化学偶联的蛋白(BAS)(Dig-BSA)筛选这些细胞。选择12个独立池，得到12～24个独立细胞系。第一个试验测试这些细胞是否能够检测DNA交联的地高辛抗原(Dig-DNA)。三种类型的市售Dig-DNA用于测试与Dig抗体表达CANARY细胞的反应性(图26A～C)：每20个碱基对连有一个地高辛的质粒DNA(图26A)；每200个碱基连有地高辛的DNA分子量标志物(图26B)；以及各末端连接一个的地高辛的DNA分子量标志物(图26C)。这些标准物中的每一种激发发射体细胞至不同程度，其中最灵敏反应为对Dig标记的质粒DNA的反应。平均相隔20碱基间隔的抗原比相隔200个碱基间隔的抗原激发细胞强100倍(基于每个地高辛，而不是基于每微克DNA)的事实暗示了200个碱基对于激发理想的反应距离太大。为了激发导致钙释放和水母发光蛋白光发生的细胞内级联，相邻抗体必须足够近地固定以引发细胞内反应。
也注意到就在光输出检测之前进行的离心——其为使用常规CANARY检测可溶性和不溶性抗原的惯用手段，可能实际降低CANARY对可溶性Dig-DNA抗原的灵敏度。在所示试验中(图27A和27B)，通过DNA溶液离心细胞似乎将检测极限降低了将近10倍。该结果可能反应了DNA检测和其它非沉淀抗原的检测之间的差异。
使用发射体细胞检测杂交寡核苷酸探针
该试验设计为检测地高辛标记(Dig-lageled)的探针与靶DNA的杂交。用于这些试验的靶DNA源自噬菌体pBluescript II。该3100个碱基对长的环形噬菌体可以被诱导生成双链DNA(dsDNA)或两种单链DNA(ssDNA)之一。该两种ssDNA链被称为(+)链或(-)链。设计了特异性结合(+)链的10个地高辛标记的寡核苷酸探针：
寡核苷酸号 DNA序列 噬菌体碱基位置  Tm
12345678910NEG3 GCAACGTTGTTGCCATT(SEQ ID NO：1)TACAGGCATCGTGGTGT(SEQ ID NO：2)GCTCGTCGTTTGGTATGG(SEQ ID NO：3)TCATTCAGCTCCGGTTC(SEQ ID NO：4)ACGATCAAGGCGAGTTAC(SEQ ID NO：5)GATCCCCCATGTTGTGC(SEQ ID NO：6)AAAGCGGTTAGCTCCTTC(SEQ ID NO：7)TCCTCCGATCGTTGTCA(SEQ ID NO：8)GTAAGTTGGCCGCAGTG(SEQ ID NO：9)TCACTCATGGTTATGGCA(SEQ ID NO：10)CCATACCAAACGACGAGC(SEQ ID NO：11) 2269-22852288-23042309-23262328-23442348-23652368-23842388-24052408-24242428-24442448-24652326-2309  56.053.357.355.053.157.754.356.555.753.557.3
寡核苷酸以其沿pBluescript噬菌体DNA的位置顺序被编号。对于每一个显示了寡核苷酸DNA序列、在噬菌体上该序列的位置、和该寡核苷酸的解链温度(Tm)(结合亲和力的近似值)。这些寡核苷酸的Tm的小范围说明他们每一个都具有类似的结合特征。
这些寡核苷酸的每一个都具有与第一个残基连接的地高辛(Dig)分子，并且各个具有相当的靶DNA结合特性，如其类似的计算解链温度(Tm)所反映的。该组10个地高辛标记寡核苷酸与靶DNA的(+)链的杂交产生了每20个碱基具有一个Dig分子的双链DNA延伸200碱基。质粒的其余2900个碱基保持单链。该固定的地高辛抗原的集合交联发射体细胞表面上的地高辛抗体，并且激发光产生。
第11个寡核苷酸(NEG3)为对照。设计NEG3直接与3号寡核苷酸结合，产生在各端具有单Dig的20个核苷酸长的dsDNA短片段。表达地高辛抗体的发射体细胞能够检测80千万亿分之一摩尔的输入寡核苷酸(图28)。该对照证明选择的杂交条件至少足以支持在该Tm范围内的两个寡核苷酸的结合。更重要地，该对照证明在20个碱基的互补DNA之间的结合是足够强以交联抗体和从发射体细胞引发信号。
寡核苷酸-寡核苷酸杂交发生极快(图29)。将寡核苷酸NEG3加入杂交液中，随后加入Oligo3。立即在培养基稀释该溶液，加入发射体细胞，并且将反应物置于光度计中(从加入Oligo3起消耗的时间为15秒)。这种简化的杂交方案没有剧烈影响试验的灵敏度(比较图29和图28)。
其次，多Dig标记的寡核苷酸与单链DNA靶杂交。测试该复合体激发发射体细胞的能力。图30显示了不同浓度的Dig-寡核苷酸探针组与给定量的ssDNA的一系列杂交。在该试验中产生最好信号的ssDNA：寡核苷酸探针的比例为1∶2至1∶4之间。在具有较高浓度的探针的情况下，未结合的Dig-标记的寡核苷酸表现出抑制信号。在这些试验中，0.63pmole的寡核苷酸在许多测试条件下工作良好。剂量反应曲线给出约50ng或约50fmole的单链DNA的检测极限(图31)。重要的是注意到在这些试验中的任一个中都未检测到(-)链DNA，表明Dig-标记的寡核苷酸的杂交和随后的发射体细胞发出信号是依赖于靶DNA序列的。
温度和缓冲液组分影响Dig-寡核苷酸与靶DNA的杂交。在47℃和51℃之间、在PBS(图32A)或TBS(图32B)中杂交给出最高反应。在较高或较低温度下进行的杂交降低信号的强度。缓冲液组分的改变将明显影响理想杂交温度。
靶DNA捕获
生物素标记的寡核苷酸与链霉亲和素包被的磁性或非磁性微球的表面结合。设计这些“捕获”寡核苷酸以从远离Dig标记的寡核苷酸的位置处的位置结合靶DNA。靶DNA与可沉淀的载体的结合将允许在加入发射体细胞之前更大量的清洗DNA，因而提高测试的灵敏度。靶DNA沉淀的一种策略如图33所示。在该方案中，生物素标记的捕获寡核苷酸粘附到链霉亲和素包被的聚苯乙烯或磁性微球上。地高辛标记的寡核苷酸与靶杂交，并且通过离心或施加磁场沉淀复合体。然后，用微球重悬和沉淀发射体细胞，并且将反应管置于光度计内。沉淀对检测靶DNA的影响如图34所示。与其中DNA未被沉淀的典型结果相比，在此情况下LOD被提高至高的阿托摩尔(attomole)范围。加入市售封闭试剂(Roche Applied Science，货号1096 176)进一步改进信号。图35显示在杂交/捕获步骤过程中加入不同浓度的封闭试剂的结果。在该试验中，加入1％至10％之间的封闭试剂提高了测试靶在所有浓度下的信号与背景比率。
Fc受体发射体细胞
Fc受体为结合抗体或免疫复合物的膜表达蛋白家族。其在包括单核细胞和巨噬细胞的多种造血细胞上表达。存在多种Fc受体的亚类，包括为可溶性抗体的高亲和性结合物的Fcγ受体I(FcγRI)。FcγRI结合免疫球蛋白G(IgG)的恒定区(Fc部分)而空下该抗体的抗原结合区。由特异性抗原导致的抗体结合受体的交联启动刺激钙释放的信号通路。
人巨噬细胞系U937含有内源FcγRI。如图36A所示，用IFNγ处理这些细胞增加了FcγRI的表达。用钙离子载体离子霉素处理这些细胞表明，用水母发光蛋白表达质粒转染的U937细胞产生功能性水母发光蛋白。如图36B所示，这导致激发水母发光蛋白发射光的快速且短暂的钙上升。然后，测试U937，以判断是否水母发光蛋白被通过Fc受体交联引发的钙升高激发。U937细胞与人IgG在室温下孵育15分钟。清洗细胞以去除未结合的IgG，并且用羊抗人IgG处理。如图36C所示，观察到了钙的快速升高。
试验证明U937可以被快速工程化以应答多种病原体或模拟物。U937细胞用IFN(200ng/ml)处理24小时以增加内源FcγRI的表达，并且被制备用于发射体细胞测试。将细胞与以下抗体一起孵育：鼠抗-炭疽杆菌孢子(图37A)、兔多克隆抗炭疽杆菌孢子(图37B)、鼠抗土拉热弗朗西斯氏菌(图37C)、或鼠抗枯草芽孢杆菌(图37D)。然后，细胞在标准测试中使用，其中它们用单克隆抗体检测少至1000cfu的炭疽芽胞杆菌孢子、用兔多克隆抗体检测到少至10,000cfu的孢子、以及10,000cfu土拉热弗朗西斯氏菌和1000cfu枯草芽孢杆菌。
下一组试验证明测试的特异性由使用的抗体决定。U937细胞与鼠抗土拉热弗朗西斯氏菌抗体一起孵育，并且测试其对105cfu炭疽杆菌孢子的反应。如图38A所示，细胞未对105cfu的炭疽芽胞杆菌孢子反应，但对106cfu土拉热弗朗西斯氏菌产生反应。可选择地，如图38B所示，用鼠抗炭疽杆菌孢子抗体负载的细胞未对土拉热弗朗西斯氏菌反应，但对106cfu的炭疽芽胞杆菌孢子产生反应。此外，如图38C所示，在缺少土拉热弗朗西斯氏菌抗体时，细胞未显示对106cfu土拉热弗朗西斯氏菌的任何反应。
CANARY：放射学检测
CANARY仪器也可以被用于检测放射物质。通过加入闪烁液代替B细胞、并且测量闪烁液响应放射性衰变发射的光进行放射性测量。CANARY硬件已显示检测α、β、和γ源的信号，并且这些测量比得上使用基于实验室的闪烁计数器进行的测量(图163)。在该试验中，等量的各种类型的发射体被加入市售、水性闪烁液中。晃动试管以混合，并且置于商用闪烁计数器或常规台式CANARY光度计内。使用与常规CANARY测试相同的软件、在相同的便携式计算机上监测光输出。CANARY硬件的反应与商用闪烁计数器的反应极相似。
由于一个传感器可以被设置成能够检测各种基质(空气、液体、表面擦拭物、粉末等)中的所有化学、生物、放射、核、以及爆炸(CBRNE)物质，因此该能力(加上化学和爆炸物检测)使CANARY传感器具有极广泛地用途。参见图163，分析等量的覆盖所有三种发射体类型(α、β、和γ)的各种放射物质。CANARY的反应比得上商用的基于实验室的仪器。
检测化学物质和爆炸物的其它方法
背景：细胞周质结合蛋白
用于化学战剂的化学物质和/或爆炸物(此处也称为“CWA/E”)对于CANARY来说太小而不能通过直接的抗体结合检测。然而，细菌被适当地装备以检测和识别营养物质，其中许多为在CWA/E尺寸范围内的小化学物质。CANARY可以利用部分细菌营养物质检测途径，并且被改变以检测CWA/E。
细菌是能动的生物体，并且因而主动向营养物质移动。为了确定营养物质的位置，细菌利用细胞周质结合蛋白(PBP)以监测其环境。该PBP家族具有许多成员，其中每一个都结合特定营养物质。通过X射线晶体照相术，研究人员证明该蛋白质类似于维纳斯捕蝇草(Venus′Flytrap)，包括2个通过铰链连接的裂片。营养物质在2个裂片之间形成的口内结合，并且响应于营养物质在蛋白质的“口”中的结合，所述蛋白质闭合(更精确地说，其平衡状态改变，从而当存在目标化学物质时，其主要处于闭合构象)。该戏剧性的形状改变被用于引导细菌朝向营养物质的移动。
这些和其它结构研究表明PBP使用相对少的氨基酸以实际结合其目标物质。通过计算机设计，人们可以预知如何使这些氨基酸突变从而使PBP结合完全不同于其原始目标的化学物质，如爆炸性TNT、索曼模拟PMPA(频哪基甲基膦酸)和神经递质5-羟色胺(Allert等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：7907-7912(2004)；Looger等，Computational design of receptor and sensor proteins with novelfunctions.Nature 423：185-190(2003))。大量的这些突变PBP已经在细菌中产生，并且显示出对其新的目标物质的牢固地且特异性的结合。
使用标准技术，可以设计产生高亲和性CWA/E结合蛋白。如果需要，该设计可以以多种不同亲本PBP开始，计算机设计所有这些PBP都与给定目标物质结合、并且测试各获得的亲和性。例如，选择3种不同PBP作为开发TNT结合蛋白的起点：阿拉伯糖-结合蛋白(ABP)、组氨酸-结合蛋白(HBP)和核糖-结合蛋白(RBP)。
公开的报告显示单克隆抗体可以容易地被设置成抗HBP的闭合(目标物质结合)形式(Wolf等，J.Biol.Chem.269：23051-23058(1994)；Wolf等，J.Biol.Chem.271：21243-21250(1996))。当蛋白质主要为闭合构象时，在组氨酸存在时这些抗体结合HBP快得多。因而本质上，这样抗体结合HBP蛋白的速率为目标物质(组氨酸)浓度的量度。
所有PBP都经历开放和闭合形式之间的大的构象变化。因而，可以产生抗各PBP的闭合构象的抗体。也需要注意，经突变以改变给定PBP的特异性的氨基酸被限于结合口(binding pocket)。这样，可以设想例如抗RBP的闭合形式的单个抗体也将结合与TNT或PMPA结合的RBP突变体的闭合形式。TNT结合突变体可以被置于传感器的“通道1”中，并且PMPA结合突变体在“通道2”中，但是对RBP的闭合形式作出反应的单CANARY细胞系可以被用于检测在通道1和通道2两者中结合的目标物质。因为在传感器的各个通道内使用不同目标特异性的PBP，所以目标化学物质的身份将被得知。这意味着传感器需要的CANARY细胞系的数目远少于其可以鉴定的化学物质的数目，极大地简化了用于额外的CWA/E试剂的研制。
通过结合各个因素利用计算机设计的PBP的CANARY对化学物质进行检测：(1)细胞周质结合蛋白已经计算机设计为结合多种化学物质。这些蛋白质已在细菌中产生、分离、并且检测其对包括TNT和PMPA的新目标物质的亲和性。(2)当使用对闭合构象特异性的抗体可以测量的配体存在时，这些PBP发生构象改变。(3)CANARY已经证明了使用抗体结合检测阿托摩尔(attomole)级的蛋白的能力。因而，CANARY测试可以适用于检测闭合构象的PBP(参见图164)。该闭合构象将指示CWA/E的存在。
在检测气体中的化学物质和爆炸物时，有至少两种用于蒸气取样的可能方法。第一种方法为冲击，其中气体通过液体起泡，从而捕获蒸汽和微粒。这是一种用于气体取样的久经试验的方法。可替代的收集方案为固相提取(SPE)或固相微提取(SPME)。该技术在干的功能化树脂上直接从空气体中捕集蒸汽。典型地，使用热的或有机溶剂洗脱这些树脂。
16通道传感器实施例
减少测量多个样品的时间(同时使硬件需求最小)的途径已被成功测试。已设计允许利用单光采集通道同时测量16个样品的实验性传感器。该传感器包括转子，该转子支承有16个围绕其圆周水平、均匀分布的1.5ml管子，并且由绕垂直轴的可变速马达驱动(图39)。单固定光子检测部件(如PMT)被置于转子的平面内正好在管旋转过程中的路径外边。这样，各管子顺序、反复地紧密接近PMT使其光输出在各次通过时被采样。最终，由光源(红外LED)和检测器(光电晶体管)组成的光开关被用于控制检测到的光子的计数和16个域内的数据的再组织，各域分别与特定的样品相关。
单次测量包括：
1、在各个1.5ml管中制备16个样品(和/或对照)；
2、向各试管内引入等份的发射体细胞；
3、将管安装于位于暗箱内的转子中；
4、通过以高RCF(～2000g)的短暂(5秒)离心旋转将发射体细胞定位至管底部；
5、在测量过程中(1～2分钟)降低转子的速度至60rpm，各管每秒钟被采样一次；
6、产生各个样品的光子计数的时间序列，以进行显示和/或输入到用于评估的计算机算法。
如图40所示的16通道测量的数据的例子显示了可与单管方法相比的LOD。尽管该16通道传感器按照设计将测量16个样品，但是，通过增加通道的数目从而测量更多样品数目也是可能的，虽然取样的物理大小和统计最终导致实际的限制。类似地，通过降低传感器上负载的样品的数目、或者通过降低传感器上通道的数目，更少的样品数目是可能的。16通道便携式传感器设计的CAD制图如图41所示。
该16通道设计的进一步实施称为TCAN传感器。TCAN(触发的CANARY)生物传感器为将气溶胶收集和B细胞液体输送组合为集成的径向盘形式的自动生物传感器。该FCAN CANARY盘(CD)(图42)与将空气分成独立的通道的管线装置连接。气溶胶收集装置(图43)使用干式冲击技术以将气流中的颗粒定位于干净塑料管的底部。
气溶胶颗粒冲击后，CD与管线装置连接以致动位于盘内的阀。该盘快速旋转，这又导致发射体细胞液体利用离心力输送至单个管内(图44)。然后，使用光学检测器基于与气溶胶颗粒相互作用的发射体细胞的光子输出鉴定潜在的生物剂。该气溶胶收集和发射体细胞输送的过程可以在一个盘中重复多次。这种特征允许在多个触发事件后进行多次CANARY测试，而无需改换CD。
气溶胶收集技术
专门设计用于CANARY传感器的干式气溶胶收集技术已被研制以充分利用CANARY潜在速度的优势。与许多其它需要润湿剂和复杂射流技术空气收集系统不同，干式冲击系统直接从气体收集颗粒到干表面上，因而去除了过程中的几乎所有消耗品。除该冲击系统的低材料消耗外，其不会发生基于液体收集系统所经历的低温结冰的问题。
该简单收集方法通过利用颗粒相对高的动量以迫使颗粒撞击在干表面上从而将更稠密的病原体颗粒与气流分离，在所述干表面处，部分被冲击的颗粒非特异性结合并且被留置。该基本概念和我们的收集器原型之一如图23所示。
理想的气溶胶冲击器显示很少或不收集极小颗粒(其可以跟随转向的气流)、收集几乎100％的大颗粒(其动量将他们带出气流)、和捕获效率在这些极限的粒径之间平滑过渡。冲击器典型地以发生50％收集效率的粒径为特征。图165显示对于该原型管式冲击器，以每分钟5升的流速、约1μm直径产生50％收集效率(D50)。通过增加取样速度或取样时间以增加被取样空气的总体积，很容易地实现收集更多总数的颗粒。
CANARY传感器已被用于鉴定使用干式冲击收集的生物剂而无需进一步处理，因为该方法将生物剂定位于管表面，免去了为了获得最大性能而预旋转样品的需要。这使得用于干样品鉴定的CANARY测试流程比液体样品所用流程更快和操作更简单(和自动的)。因为所有收集的颗粒在冲击过程中被粘附于管底部而无论气溶胶颗粒内包含的单个病原体的大小，因此，干样品的鉴定也具有为不易在液体测试中沉淀的小病毒或其它病原体提供更好的整体灵敏度的可能性。
将干式冲击与CANARY整合的概念的证明
为了证明干式冲击收集对于CANARY传感器应用的功效，利用柯立森雾化器(Collison Nebulizer)将单独的枯草芽孢杆菌孢子气溶胶化，并且以每分钟5升的流速在以上所示原型中收集30秒。直接向含样品管中加入B细胞，置于便携式CANARY设备中，旋转5秒，然后通过PMT定量光信号。结果如图166所示，并且显示直接冲击技术产生与在分析前无需样品制备的预旋转液体样品在动力学方面类似的B细胞反应。
在该概念验证试验中通过1分钟之短的整体反应时间(30秒收集，随后达到最大光子密度，不到30秒的分析时间)，CANARY证明将生物气溶胶鉴定的综合速度和灵敏度比其它所有自动生物气溶胶鉴定传感器提高了超过一个数量级。该显著的性能改进使CANARY传感器能够填补在～3分钟之内提供灵敏检测的传感器性能方面的长期存在的技术空缺，该灵敏检测是警告、并保护人群免于暴露于有威胁的生物气溶胶时所需要的。CANARY传感器第一次(且仍然是唯一的)在生物鉴定传感器中提供了检测-警告(或者称为检测-保护)生物防御能力的潜力的证明。该能力的独一无二的实现推动了自动生物气溶胶传感器的快速发展，以使该技术能够离开实验室、并且在实际环境中操作，从而建立CANARY在现实世界的应用。
自动CANARY生物气溶胶传感器发展
为了证明在生物气溶胶防御应用中的检测-警告能力，CANARY鉴定技术与干式气溶胶收集体系结构在两个第一代传感器——BCAN和TCAN中无缝整合。BCAN传感器被设计为在重新加载之前以足以检测低浓度处理的灵敏性提供30个自动取样和分析循环，并且在多种环境中进行广泛测试，以建立在各种现实环境中实现CANARY性能和假阳性率的ROC曲线。由BCAN传感器证明的优良性能特征提供了在单独程序下促进TCAN发展的基础，以证明设计为满足室内生物气溶胶检测所预期的较低需求条件的简化CANARY传感器。
BCAN传感器开发和测试
基于概念验证结果开发任何自动CANARY传感器的第一步是设计将干式收集与旋转增强的CANARY测试结合的可靠途径。此外，由于在该液体收集试剂输送结构体系(如其在所有其它生物气溶胶鉴定传感器)中不需要射流系统，因此，我们将我们的设计方向集中于没有射流装置的细胞滴储藏和输送上。该以自动形式将无试剂气溶胶收集与基于细胞的生物传感器结合的独特方法能够彻底去除主要导致其它生物气溶胶鉴定传感器平台的高成本、大尺寸和复杂性增加、以及可靠性降低的核心系统。BCAN传感器实现的最终解决方案利用了包含适当的气溶胶收集技术和在COTS囊中储藏的独立等份B细胞的简单载体，其中所述COTS囊在收集后的短暂旋转过程中自动释放其内容物。该设计的关键细节已在图167中描述。
各BCAN载体含有提供四种CANARY分析所必须的四种核心功能的4个平行装置(或通道)，所述四种核心功能为：细胞储存、气溶胶取样、细胞输送和向PMT的信号传输。BCAN试验台在重新加载之间包含并自动处理多至25个这些载体。使用柯立森雾化器产生的枯草芽孢杆菌孢子气溶胶作为炭疽热和其它生物气溶胶的模拟物确定BCAN的速度和灵敏度特征，并且证明该首创传感器对于每升空气≥100含抗原颗粒(ACPLA)浓度的生物气溶胶、以包括自动气溶胶收集和分析的3分钟总反应时间能够提供＞96％的鉴定的可能性。此外，可以在各种室内和室外场所运行该传感器。
在跨大范围背景条件的9个不同场所内完成超过13,000个测试，结果表明该传感器在现实环境中给出的异常阳性信号(假阳性)的频率与在实验室中观察到的假阳性的频率类似。这些结果共同证明该首创传感器在不到3分钟内的快速、灵敏鉴定生物气溶胶的实用性。此外，其证明生物气溶胶阳性鉴定所需的收集时间与存在的生物气溶胶的浓度成比例，从而不到90秒的总反应时间对于足够高浓度的生物气溶胶是可能的。没有其它基于抗体或核酸的传感器平台证明在自动生物气溶胶传感器中具有这种反应速度。
通过将表达多种抗体的多种B细胞系或单一B细胞系置于独立管或通道中，可以实现测试数目的增加。该利用细胞系或抗体结合的系统使硬件复杂性(以及尺寸)最小，并且对于单抗原物质袭击情况，可以独立检测2n-1个抗原(其中，n为通道的数目)。使用三种不同B细胞系的混合物达到每通道使用多种细胞类型的CANARY测试的实际限制。当每管多于三种细胞类型被使用时，低浓度目标物质的信号强度由于正确靶B细胞相互作用的可能性减小而降低到低于检测极限。除了增加对于给定数目的通道可以鉴定的抗原的数目，使用该方法引起测试冗余已经被用于去除不相关的假阳性(其中对于给定抗原不是所有同步测试都给出阳性结果的测试)，因而显著降低假阳性率。
大量的测量和实地测试证明BCAN在少至90秒的时间内检测生物相关浓度的生物气溶胶的能力。该反应时间比任何其它集成生物气溶胶鉴定传感器快一个数量级，并且为与生物防御的检测-保护操作需求速度一致的唯一证明。或许甚至更重要地，在现实环境中的CANARY测试确定的低假阳性率(对于单测试在0.2％和0.3％之间，并且，对于2倍或更多冗余，为0.1％或更低，同时保持≥96％的鉴定概率)显示该能力可以在用于需要低假警报率和优良速度的生物气溶胶鉴定系统中实际应用。尽管BCAN被设计为有效的证明试验台，但是其它传感器结构体系提供用于特定应用的潜在优势。由BCAN的早期成功推动，TCAN传感器开发开始作为平行的传感器发展研究，以使用特定的传感器设计建立对于建筑物保护的CANARY能力。
TCAN传感器开发和测试
TCAN为一种发展为用于在室内建筑物环境中实时监测生物气溶胶的简单、经济的装置的基于CANARY的生物传感器。
将该特定传感器设计为将气溶胶收集和B细胞输送结合为集成径向盘形式。该盘设计为与将负载微粒的气流分离到四个单独通道内的管线连接。然后使用惯性碰撞技术将这些微粒定位于干净的一次性管的底部。
在收集气溶胶颗粒后，安装在盘内的阀被打开，并且将该盘以2000RPM快速旋转5秒。该旋转步骤利用离心力快速驱动B细胞液体与收集的颗粒接触。然后使用单光电倍增管基于随着盘旋转与气溶胶颗粒相互作用的B细胞的光子输出鉴定潜在的生物剂。该气溶胶收集和B细胞输送的过程可以重复多次，使得能够在单盘中进行多重CANARY测试。
该CANARY传感器可以在不到3分钟内提供可疑颗粒的高度可信的鉴定。
PANTHER传感器研制和测试
在所述两种第一代自动CANARY传感器的成功和教训的基础上，我们已将CANARY技术整合至所谓PANTHER(威胁环境排放物的病原体分析仪(Pathogen Analyzer for Threatening EnvironmentalReleases))的灵活生物气溶胶传感器平台内。气溶胶收集和CANARY分析的核心功能设计为具16通道的简单盘，其形成特定任务生物气溶胶鉴定传感器的第二代PANTHER家族的核心。最终的PANTHER传感器设想为单独使用或形成网络以提供场所/建筑物保护、紧急响应、快速扫描和环境监测。使用第一个PANTHER传感器已证明在不到2分钟内对极低浓度生物气溶胶的高可信度鉴定，所述第一个PANTHER为37lb.重、～1ft3大小、并且能够最终以不到$20K被制造的称作CUB的便携装置。该测试的设计是简单且可靠的。其没有射流部件、无液体消耗、移动部件最少、象CD播放器一样加载并且自动收集和分析样品。
CUB传感器为最初致力于研制能够实现由美国陆军投入的现有生物气溶胶传感器-联合生物战剂点探测系统(Joint Point BiologicalDetection System，或JBPDS)的所有自动收集和分析功能的基于CANARY传感器的计划的副产物。PANTHER盘被设计为该传感器的核心，并且能够在单气溶胶上同时进行16个测试。CUB的开发跟随了该最初的设计方向，并且实现了与传感器复杂性和性能谱的要求相对的产品：能够自动处理单一PANTHER盘的小型、廉价、便携传感器。所得的CUB传感器已被设计、制备和测试。最初的结果已证实CUB以更小和更廉价的传感器提供了速度和灵敏度的改进，低于10ACPLA的浓度的孢子气溶胶的检测和包括收集和鉴定的不到2分钟的反应时间。在相同环境中用于鉴定BCAN生物气溶胶传感器的其它环境测试已证明PANTHER CUB在现实环境中也具有极低的假阳性率。
PANTHER CUB盘设计和功能
在PANTHER传感器中使用的盘实行两种基本功能：1)其提供使得能够从被吸引通过盘的空气中收集气溶胶颗粒、并且使它们在适合使用CANARY直接分析的聚焦位置沉积的特定几何特征；以及2)其在使得能够无需人工处理而将试剂分配于收集的气溶胶颗粒上的密封储存库内储存CANARY B细胞。载体主体和盖这两个部件被设计为可注塑和可超声波熔接的，以形成具有1mm的大致均一壁厚的直径120mm、且高6mm的完整盘(图173)。用于该盘的优选聚合物为聚丙烯均聚物，因为其已证明与B细胞长期储存的优良相容性，但是任何其它具有足够透明度(用于从B细胞至光感应原件的信号传输)和B细胞相容性的聚合物也都是适合的。
载体主体具有配置垂直壁的连续底部，从而在熔接盘内形成用于气溶胶加速和收集、以及用于液体试剂储存和输送的多个相关特征设置，其绕中心轴径向安置。这些特征可以是相同的，或者他们可以被单独设计以使能够由单一盘提供收集器和测试的许多功能。壁的内部设置(图173A-特征1)使气流指向在沿盘的外周形成的裂缝并加速气流，所述裂缝具有利用文献中已被确定的原理特别设计以提供各种流速的气溶胶颗粒的有效收集的宽度和距外壁的间隔。壁的外部设置(图173A-特征2)形成绕盘的边缘的连续圆周，并且提供具有有助于收集通过壁的内部设置加速的颗粒到多个显示增加颗粒密度的局部区域的位点上的限定几何特征的单独颗粒收集位点。位于壁A和B之间的壁的另一设置(图173A-特征3)在熔接盘内产生多个隔间，其能容纳在随后的旋转或多次旋转过程中释放和分布到收集的颗粒上的液体试剂和其它物质。壁可以设计壁为单旋转输送所有隔间的被储存的CANARY细胞，或者多次旋转可以根据需要输送单独室或部分室的内容物。
所述盖为具有两组关键特征的1mm厚的盘的形式。第一组特征包括多种孔，以将液体试剂(图173B-特征3)和气溶胶样品(图173B-特征1入口和图173-特征2出口)引入装配的盘内，并且提供通过光传感器可以被检测的分度特征(J图173B-特征4)，从而在读取过程中检测盘的定位。第二组特征包括两边的凸起结构，使盖能够提供降低盘内相邻通道之间的光转移的屏障(图173B-特征5)(当用于形成盘的聚合物含有适当颜料使其不透明时)、提供增强盘半体的超声熔接的特征、以及3)减少形成具有管线的气密所需的接触面积，所述管线将气溶胶输送至所述盘且在颗粒在盘内收集后去除废弃空气(恰好在气体出口内侧和外侧的圆环)。
图174说明熔接盘内特征A和B如何共同工作，以引导气溶胶流和颗粒收集。使用一个或多个适当的吹风机或泵向两个圆形脊之间的盘盖上的三角形口的阵列施加部分真空将被取样的气溶胶通过大的中心孔吸到盘内。空气被分布到多个通道内，并且随通道逐渐变细向外径向流动，从而随其接近盘的圆周而加速气溶胶。然后，气流在通过三角形口被吸出之前在盘的外圆周处被迫形成急转。在空气样品中携带的气溶胶颗粒的动量阻止颗粒随空气转向，它们反而在可以通过调整盘外壁的几何特征而被特别设计的焦点处冲击盘的内表面。大部分在目的大小范围内的颗粒(典型地在1和25μm之间)粘附于其冲击的表面，并保持以进行后续的CANARY分析。使用1μm荧光球形聚苯乙烯颗粒确定在盘中的收集分布特征。这些颗粒被气溶胶化，然后气体通过盘以30L/min/通道的速度被吸入，并且所得的颗粒分布在紫外线光照下可见。这证明了收集颗粒的分布可以被特别设计从而收集颗粒在具有由在收集表面上的壁片段交叉的位置所确定的位置处两条浓密线内。当交叉被定位于盘的最大半径处时，其导致用于光信号激发和检测的收集的颗粒与输送的CANARY细胞的可靠共定位。
调整通过喷嘴的流速可以使在该盘中收集的颗粒的粒径范围根据需要进行调整。图175说明了通过盘被有效输送、并且被引导在收集面上冲击的颗粒的流速和粒径之间的关系。在高流速下(如30L/min)，直径≥1μm的颗粒具有足够的动量以接触收集面，然而对于该流速的实际粒径上限为8μm，因为直径≥8μm的颗粒具有太大的动量以至于当气溶胶从中心入口进入处于盘的面内的径向空气通道时不能发生最初的90°转向。减少气流逐渐增加了对于具有足够动量冲击表面的颗粒的临界直径，但是也使较大的颗粒能够在盘内进行最初的转向。例如降低流速到4L/min调整收集的颗粒的粒径范围到2.5μm-25μm，使得大得多的气溶胶颗粒能够被收集和分析。
图176说明熔接盘中的特征C如何共同工作以提供液体试剂的储存和释放。试剂储存区的壁被定向以用于形成具有面向盘的外径的开口的袋，从而盖中适当定位的孔提供了该袋的通路和出口，用于加载1)粘性塞，以封闭对盘其余部分的开口，然后，2)通过加载端口添加液体试剂(如B细胞)，同时空气通过出口逸出。加入将加载口与出口分隔的伸入试剂储存区内的短壁确保了在加载过程中所述袋的完全填充。一旦粘性塞和液体试剂的加载完成，使用胶带覆盖通路孔以将液体密封在保持不透气和液体的袋内，直至需要释放。为了释放液体试剂，旋转盘至足够的RPM(典型地4,000rpm)，从而径向加速力足以将粘性塞从其位置移开，从而朝向盘的外侧打开袋，并且使液体能够流向盘的外径和覆盖收集的气溶胶颗粒。对于含B细胞的液体，被用于分配液体试剂的5秒钟旋转也是足以将悬浮的B细胞沉淀于盘的外壁之上，并且使其共定位于气溶胶颗粒被收集的位置。
在输送B细胞和任何其它液体试剂后，减慢旋转(典型地至30～120rpm)以使单光子感应部件(如光电倍增管(PMT)、通道光电倍增器(CPM)或其它光子计数设备)能够随各通道经过光传感器前面而顺序记录其光发射的水平。盘连续旋转，同时光输出被监测达2分钟，然后，通过用于处理盘的传感器或者通过连接的计算机处理并储存数据。
PANTHER传感器说明
已被制造为自动处理CANARY盘的紧凑型传感器的整体图如图177所示。传感器主体为12”高×12”宽×14”厚、重约37lbs，并且具有所有必须的部件，且使用单个手工加载CANARY盘控制自动收集和分析气溶胶样品。通过打开抽拉盒(图177-特征1)、将盘放置于平台上并且关闭抽拉盒实现盘的加载。当传感器接受信号以收集和分析样品时，传感器开始经进气口(图177-特征2)将空气吸入、引导空气通过盘、然后将去除颗粒的空气通过出口(图177-特征3)排出。在气溶胶收集后由预定参数或由从外部控制器收到的信号决定的一段时间，传感器以足以输送CANARY试剂(典型地4000rpm)的速度旋转盘并且开始分析阶段。在分析过程中，旋转被减慢至能够随盘中的各个独立通道经过单光子计数组件前方而使其光子发射被测量。
以下核心组件(图178所示)被装配至第一传感器内，并且足以进行所有收集和分析功能的所有功能，且赋予如下性能。CANARY盘(图178-特征4)被置于马达装置(不带电刷的DC马达Faulhaber，部件#3564K012BK1155，图178特征-5)上，然后关闭门以将盘加载于特制的不透光盒(图178-特征7)内。两个Ametek送风机(部件#150193，图178-特征1)与特制的管线(图178-特征6)连接，所述管线提供与CANARY盘的连接并且当入口流和出口流进入和离开盘时分离和引导入口流和出口流。当送风机被开启时，盘自动升高进入管线下方的位置，送风机产生的真空使其保持在该位置并且提供确保适当的气溶胶流过盘的足够密封力。在送风机关闭后，盘自动落至马达装置上，其旋转盘至4000rpm 5秒钟以输送细胞，然后将转速降至60rpm。该速度维持2分钟，同时通道光电倍增组件(Perkin Elmer部件#MCP 1984，图178-特征2)测量各个单独通道的光输出。通过机载计算机(具有特制接口板的金刚石系统的PC104-部件#ATH660-128，图178-特征3)调控该完整过程。
PANTHER传感器性能验证
为了确定传感器的灵敏度，测试气溶胶通过碰撞雾化枯草芽孢杆菌孢子的浓缩原液的稀释液被制备，取样1分钟以及在CUB中使用孢子特异性的细胞进行分析。在图179的图例中显示了由各稀释液产生的近似ACPLA水平。1∶8000的稀释液每升产生许多颗粒，其与当向雾化器中加入DI水时产生的室背景是难以区分的，但是基于一般趋势，浓度应该为每升空气约5个孢子的级别。即使在该极低浓度下，以30L/min的一分钟样品始终产生具有比阴性对照大三倍还多的最大强度的易检测信号。
然后，腔室研究的模拟识别数据与使用鼠疫耶尔森氏菌和炭疽杆菌特异性的细胞系在一周期间内(＞1000个测试)、在典型的室内环境内进行的背景测量组合。所得数据的分析证明PANTHER CUB传感器对于≥50ACPLA的浓度提供具～0.1％相应错误警报率的95％以上的检测率。与第一代BCAN和TCAN传感器性能相比，该性能提供了能力的显著改进，并且利用硬件优化和算法发展能够被进一步优化。
毒素检测实施例
可以使用多种方法实现可溶性蛋白的检测。例如，在一种方法中，在同一发射体细胞中可以表达两种抗体，其中，两种抗体各自抗相同分子上的不同表位。然后通过单体抗原交联所述抗体(图48)。应该指出分泌途径的抗体的分选在图48的示意图中是理想化的。在一个实施例中，抗体可以是杂官能的，即，一个抗体可以具有两种不同的功能抗原结合位点。在另一实施例中，各抗体仅具有一种功能抗原结合位点。该方法取决于两个因素：(1)由相同的发射体细胞表达多个功能抗体，以及(2)两个连接的表位足以激发发射体细胞(尽管激发给定细胞可能需要一个以上的这些配对)。
在一个试验中，在相同的发射体细胞中表达多种功能性抗体(图49)。表达抗炭疽杆菌和鼠疫耶尔森氏菌的抗体的单细胞系被制备。该克隆的细胞系以良好的灵敏性对两种抗原发生反应。应该理解抗同一可溶性单体上的两种表位的两种抗体也可能被功能性表达。此外，两个连接的表位足以激发发射体细胞。
检测可溶性单体抗原的第二种方法为交联可溶性抗原以使其对发射体细胞表现为共价(图50)。该交联可以通过将蛋白质经标签—对于重组蛋白的情况、或者经抗体—如对肉毒杆菌毒素Hc片段的情况所示，连接于微球而实现。本领域普通技术人员可以理解有多种有效交联抗原的其它可能方法，包括用三氯乙酸(TCA)、加热或乙醇沉淀抗原，以及将抗原经配体、抗体或其它化学官能团连接于固体相。然后，使用表达识别在交联抗原上仍存在的表位的抗体的发射体细胞可以检测该交联的单体。
使用作为可溶性单体目标蛋白质的A型肉毒毒素的重链(BoNT/A Hc)和在Pless等Infection and Immunity(2001)570-574中描述的抗体实际完成了该第二种方法。抗一种表位的单克隆抗体(6E10-10)与G蛋白包被的微球交联。这些微球与BoNT/A Hc在4℃孵育3小时、清洗、并且被用于激发表达识别不同BoNT/A Hc表位的第二抗体(6B2-2)。BoNT/A Hc装饰的微球有效地激发发射体细胞，具有约6ng的LOD。表达与用于结合BoNT/A和微球的抗体相同的抗体的发射体细胞不被激发，表明目标蛋白的聚集不导致发射反应。
化学物质检测实施例
在军事和临床方面化学物质的检测是重要的。某些化学物质可能具有两种抗体可以独立结合的表位是可能的。在这种情况下，化学物质检测的方法与以上所述的毒素检测方法相同。然而，在许多情况下，在目的化学物质上不具有两种独立的表位。在该情况下，有必要修饰化学物质从而其能够激发发射体分子。以下描述这些修饰中的四种。
1、将目的化学物质固定于固体载体上。产生表达识别化学物质保持可用的部分的抗体的发射体细胞。当固体载体上被固定的化学物质的密度足够高时，发射体细胞表面上的抗体将被彼此足够近地固定从而激发细胞。这与图50中所示的毒素检测的方案类似。
2、首先，产生特异性结合化学物质的肽。其次，制备特异性结合该化学物质-肽复合物的抗体。如果化学物质-肽复合物包括两种或多种表位，则所述复合物能够通过毒素检测的部分中所描述的两种抗体技术中任一被检测。如果所述复合物仅包括一种特异性表位，则，如地高辛的附加表位可以被合成加入肽(图52)。然后该复合物将含两个抗体结合位点：(1)通过肽-化学物质复合物形成的表位，和(2)地高辛表位。仅当化学物质存在时，两种表位才都存在。然后，可以通过在毒素检测的部分中所描述的两种抗体技术中任一检测这两种表位。
3、产生特异性结合化学物质的两种肽(或当存在化学物质时互相结合的两种肽)。这些肽中的每一种都被合成地标记，从而仅在化学物质存在时两种表位才互相结合，因而可被发射体细胞识别(图53)。可选择地，可以制备抗肽-化学物质复合物的一种或多种抗体，并且如上使用抗复合物的抗体的组合、或一种抗复合物的抗体和一种抗肽标签的抗体检测化学物质的存在。
4、如上所述，产生特异性结合化学物质的肽，并且产生特异性结合肽-化学物质复合物的抗体。使化学物质结合肽二聚化，从而如果二聚体结合到两个化学物质，则其将含有两个抗体结合位点。该复合物可以通过表达抗化学物质-肽复合物的抗体的发射体细胞被检测。
结合小分子的肽已从组合的库中被分离。这些小分子包括卟啉(Nakamura等，Biosensors and Bioelectronics 2001，16：1095-1100)、色氨酸(Sugimoto等，1999，677-678)和镉(Mejare等，1998，ProteinEngineering 11(6)：489-494)。然而，使用蛋白质代替肽可能产生较高亲和性结合体。已经构建了库，其中，结合位点已被组合地限定，并且这些结合位点可以与结合小分子的结合位点分离。这种使用脂笼蛋白(lipocalin)作为起始蛋白的库已被用于分离地高辛突变体的结合体(Schlehuber和Skerra，2002，Biophysical Chemistry 96：213-228)。该途径可以以任何数目的其它蛋白作为起始而被使用，但是尤其是那些可能预计已具有某目标化学物质结合活性的蛋白(例如，在VX和沙林情况下的乙酰胆碱酯酶)。
进一步的实施例1
核酸检测
RNA检测比DNA检测在几个方面是有利的。首先，每个细胞中(真核或原核)中具有比基因组副本更多的给定RNA的副本，从而每个细胞的信号被实质地扩增。第二，RNA的存在经常被用作生存能力的测试。第三，RNA的检测不需要两个互补链的变性，如在dsDNA的情况中。除了加入Rnase抑制剂(Rnasin Plus，PromegaCorporation)外，以与ssDNA检测类似的方式进行试验(图55)。地高辛标记的寡核苷酸被加入到不同浓度的RNA中，在47℃孵育2分钟。表达抗地高辛抗体的CANARY细胞被加入，管旋转5秒，并且监测光输出。
可选择的流程
CANARY也可以通过直接标记目标物质而检测核酸。例如，通过在地高辛标记的核苷酸存在下进行PCR，这样产生延其长度具有多个抗原的PCR产物。同样，滚环扩增可以被用于将标记并入随后被CANARY检测的目标核酸内。连接酶链反应及其衍生物实质上使寡核苷酸二聚化并且如果两个寡核苷酸各被一个抗原标记，则CANARY可以被用于监测该二聚化。
毒素检测
基本形式的CANARY不能检测单体抗原(图56)，因为该抗原不能交联单克隆抗体：如此处所述，测试必须被改进。两种通用策略被用于使用CANARY检测毒素模拟物：(1)使毒素抗原对于CANARY细胞表现为多价，或(2)使CANARY细胞表达的抗体多克隆化。例如，蛋白质抗原可以通过将抗原吸附于微球、细胞或将与可溶性抗体交联的抗原而对于CANARY细胞表现为多价。
使用毒素模拟物(肉毒毒素A)重链(BoNT/A Hc)进行最初的试验。至今对通过CANARY的毒素模拟物检测给出最好灵敏性和速度的测试改进是在抗体包被的磁性微球上捕获模拟物，并且使用CANARY细胞检测模拟物修饰的微球(图57)。识别BoNT/A Hc毒素类似物上的非重叠表位的三种单克隆抗体，6E10-10、6B2-2和6C2-2(由Bavari博士和Ludwig博士捐赠，USAMRIID)已被使用。可溶性6E10-10抗体被偶联于G蛋白标记的磁性微球，同时6B2-2在CANARY细胞中表达。6E10-10抗体包被的微球在掺有BoNT/A Hc的溶液中孵育2分钟，产生毒素模拟物修饰的微球。加入CANARY细胞，并且将混合物旋转5秒钟以使微球和细胞成团。这些微球将固定的BoNT/A Hc呈递于CANARY细胞，从而交联抗体和激发光发射。该技术能够在＜5分钟内检测800pg的BoNT/A Hc(80ng/ml)(图58)。
应该注意测试的灵敏度取决于BoNT/A Hc的质量。市售BoNT/AHc的批次差异和储存特性影响我们的表观检测极限(LOD)。其在确定测试以证明CANARY能够检测真正可溶性蛋白质中是重要的。新鲜的、未冷冻的BoNT/A Hc比曾被冷冻(建议的储存方法)的BoNT/A Hc给出更高的反应(图59)。冷冻-解冻的BoNT/A Hc的离心进一步降低了反应性，暗示在冷冻-解冻过程中聚集物形成。在这些测试中使用的曾被冷冻储存的BoNT/A Hc在解冻时通常被离心以去除聚集物。尽管这样低估了测试灵敏度，但是测试间差异被降低。
微球测试形式对于使用此处描述的全血制备方法在血制品中筛查可溶性抗原是有效的。全血被掺入BoNT/A重链，并且将血液通过聚合物短暂离心以促进细胞与可溶性物质分离。将6E10-10抗体包被的微球加入所得上清液中，并且使用6B2-2 CANARY细胞测试。该测试的灵敏度与在对照培养基中进行的测试类似，显示大多数干扰物已被去除。在与血细胞分离后，用相同浓度的BoNT/A Hc掺入血浆中给出相对于其中血液被直接掺入的样品较低的信号。这种差异可能为血液样品制备的人为结果，而不是在血浆中存在其它的CANARY抑制剂。
尽管信号振幅稍微降低，但是掺入尿液中的BoNT/A Hc抗原也可以被检测(图61)。在该试验中，未进行预处理。6E10-10包被的微球被直接加入尿样中，在CO2I中清洗微球，并且加入6B2-2CANARY细胞。三种被掺入的尿样(蓝线)中的两种显示显著反应，然而第三种样品未显示反应。为什么第三种尿样是阴性的、或者为什么尿液样品的信号振幅低于阳性对照(金线)从该有限的数据中还不能弄清楚。
测试在检测被掺入鼻拭子的可溶性抗原方面也是有效的。为了制备用于该测试的样品，收集拭子，剪掉拭子的杆，并且将拭子末端置于装配于埃彭道夫管上方的5微米滤筐内(图62)。加入对照或掺有BoNT/A Hc的CO2I培养基，并且对该装置加盖并离心。使用正常微球方法在埃彭道夫管中收集去除了大颗粒的过滤洗脱液，并进行测试。掺有BoNT/A Hc的实际和模拟拭子的测试结果非常类似，显示在鼻腔样品中无抑制剂存在(图63)。对未掺入抗原(CO2I)的鼻拭子缺少CANARY反应显示在鼻拭子样品中没有非特异性刺激因子存在。
如桔汁或PBS/Tx-100的许多溶液非特异性地激发CANARY细胞，因此有必要用测试培养基置换含毒素模拟物的原始溶液。除了交联目标物质外，磁性微球的使用提供了用细胞相容的测试培养基置换含模拟物的溶液的简单方法。在食品基质的调查中，桔汁由于具有潜在的pH问题(pH＝3.5)和水由于具有潜在的盐问题(无)而表现突出。这些特征中任一都能影响抗体包被的微球结合毒素模拟物的能力。对于这些试验，1/7体积(1.4微升)的含560mM NaCl、1.4M Hepes的溶液(pH7.9)被加入到所有掺有BoNT Hc的基质和抗体包被的微球中。这使水基质达80mM的最终盐浓度，桔汁的pH达到约6.5，并且同时加入诱导抗体结合的偶联微球以引发结合步骤。在12分钟结合步骤的最后，加入190μl测试培养基，将管子在磁体上放置30秒，并且去除上清液。在50μl测试培养基中重悬微球，加入20μl细胞，将管旋转5秒以沉淀微球和CANARY细胞，并且在光度计上监测光输出(图64)。在该图表中，数值代表相对于背景数值(在不具有抗原的测试培养基中的CANRY细胞)标准化了的峰值光输出，从而在极右侧的红色棒设定为1。所有其它的棒为相对于该对照的最大反应。CANARY对在桔汁或PBS/Triton中稀释的BoNT/A Hc的反应与在测试培养基中稀释的BoNT Hc(阳性对照)非常类似，对于所有3种这些基质具有80ng/ml的LOD。牛奶抑制CANARY反应超过5倍。通用的CANARY样品制备方法可以被用于所有的液体食品基质。
证明测试不仅对毒素模拟物起作用、并且对活性BoNT/A毒素也起作用是明显关键的。获得市售BoNT/A，并且使用6E10-10微球和6B2-2 CANARY细胞进行测试(图65)。测试BoNT/A的检测极限为约3.2ng/ml或32pg毒素。还不清楚测试灵敏度的这种改进是否是由于与BoNT/A Hc相比BoNT/A的稳定性、或者在两种制剂之间是否存在抗原性差异。使用由UCSF的James Marks博士提供的替代抗BoNT/A抗体组已观察到类似类型的BoNT/A检测结果。迄今，这些抗体的最好组合为微球结合的S25抗体和表达Raz抗体的CANARY细胞(图66)。目前，使用该不同抗体配对的较低灵敏度的原因还不清楚的。
CANARY也可以检测掺入全血内的BoNT/A(图67)。全血掺有各种浓度的BoNT/A且如前所述制备血浆。6E10-10抗体包被的微球被加入到血浆中，并且孵育2分钟。在CO2I中清洗微球一次，并且使用表达6B2-2抗体的CANARY细胞进行测试。与对照培养基相比，血清中的检测极限下降了约5倍，至约16ng/ml(160pg)。
替代的微球结合化学
通过生物素化可溶性抗体并且将其连接于链霉亲和素包被的微球也已经制备了抗体包被的微球。根据厂商的说明将可溶性抗体与生物素(Pierce Biotechnology Inc)交联。该生物素化抗体与磁性链霉亲和素包被的微球(Dynal，Dynabeads M-280)结合。最初的试验显示与磺基-NHS-LC-LC-生物素偶联的抗体产生稍好于与磺基-NHS-LC-生物素或磺基-NHS-生物素偶联的抗体的信号(图68)。以该方式产生的6E10-10微球能够以与G蛋白微球相似的灵敏度检测可溶性BoNT/A(图69)。尽管至今为止，将多种抗体结合于相同微球的作用还是有限的，但是，使用该技术可以将多种抗体连接于相同的微球上(图70)。
较少微球与较长时间的孵育的结合确实改进了灵敏度(图71)。微球从其标准浓度(每个测试约300,000)以10倍的系列从1X至0.0001X进行稀释。加入0.32ng/ml的BoNT/A，并且孵育过夜。从含标准(1X)量的微球的样品中观察到较差信号，但是具有0.1X和0.01X微球的样品给出加强的信号。使用G蛋白包被的微球观察到对BoNT/A灵敏度的类似改进。
毒素检测的其它形式
毒素的CANARY检测的其它形式已被预见，并且进行了可行性试验(参见图72的概括)。这些变型中的几个在交联抗原呈递于表达一种单克隆抗体的CANARY细胞方面与微球捕获是主题上类似的。在途径2中，例如，抗体包被的微球用CANARY细胞替代，其本质为活的抗体包被微球。表达抗相同毒素上的不同表位的抗体的两种CANARY细胞系在含该毒素的溶液中孵育。一种或两种细胞可能具有发射体分子。在一些例子中，两种CANARY细胞包含发射体分子，其中发射体分子在不同CANARY细胞中是不同的。在另一些实施例中，两种CANARY细胞包含相同的发射体分子类型。在测试中，用毒素修饰两种细胞，但是由于毒素是单体的，因此细胞不被激发。将细胞离心至管的底部，其中2种不同CANARY细胞互相呈递抗原。该方法比微球呈现毒素有效(LOD＝50ng或1μg/ml浓度)、但较不敏感。在用毒素修饰前，这些细胞中的一种进行固定可能将抗体的运动更好地限制在膜内，因此更好地激发相对的CANARY细胞。
可选择的途径是制备多克隆CANARY细胞(途径4)。在单CANARY细胞系中表达两种不同的抗体。因为这些抗体结合在相同毒素分子上的不同的非重叠表位，因此，可溶性抗原可以直接激发CANARY细胞。多重研究已显示给定的CANARY细胞系可以表达多至三种不同的抗体而不影响细胞对抗原的灵敏度，暗示在相同CANARY细胞系中表达2种不同的抗BoNT抗体不应该是问题。因为微球添加步骤不是必要的，从而这将简化测试。然而，样品制备需要用细胞测试培养基交换含毒素的溶液。
最后的途径使用相同的CANARY概念，但是不同的细胞系。在该实施方式中，制备了表达Fc受体和水母发光蛋白的单细胞系。Fc受体结合抗体的Fc部分，使抗原结合区域空下以结合目标物质。加入到这些细胞中的可溶性抗体在10分钟内产生对所添加的抗体具有特异性的“新”细胞系。向这些细胞中加入抗原交联Fc受体，激发水母发光蛋白的光发射。该途径利用抗炭疽杆菌的多克隆和单克隆抗体工作。对于毒素检测，抗毒素的多克隆抗体(或者抗毒素的两种单克隆抗体)可以被加入到细胞中，并且Fc受体通过可溶性抗原交联。
可选择的方案
通过向测试中加入第三种可溶的抗体可以发现进一步的改进。J.D.Mark博士的实验室公开的数据(Nowakowski等PNAS(2002)99(17)：11346-11350)显示BoNT/A与一种单克隆抗体一起孵育将抗不同表位的第二种单克隆抗体的表观亲和性增加了约100倍。在该实施方式中，抗BoNT/A上的第三种表位的可溶性抗体利用抗体包被的微球被加入。第三种抗体与BoNT/A的结合改进了BoNT/A结合微球的动力学特征。
可选择地，当生物素化的抗体被引入测试时不需要出现在微球上。可溶性生物素化抗体和链霉亲和素微球可以被分别加入。可能这将改善抗体与抗原的结合，并且生物素-链霉亲和素相互作用的高亲和性将很快使抗体-抗原复合物结合到微球上。
G蛋白微球或链霉亲和素微球的使用是方便的。任何能够交联抗体的载体都可以被使用，如枝状聚合物、管表面或膜。可以用能将抗体吸引至表面的任何东西标记抗体，抗体能够从所述表面呈递“多聚化”的抗原。
进一步的实施例2
通过CANARY测试植物病原体的方案
植物组织是能够通过非特异性抑制或激活B细胞对CANARY测试产生不利影响的复合基质。因而，已发展了处理植物组织以提取用于通过CANARY检测的抗原物质的特定方法。
细菌抗原物质：
对于封闭木质部的植物细菌病原体，例如但不限于青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)，以下方法被用于提取抗原物质。
●通过在土壤线处切割植物茎的基部回收冠组织。
●压缩的空气或任何其它去除过量土壤的方法被用于清除茎
●距基部切口～1cm进行第二次切割以产生横截面块
●使用稍小于茎的直径的圆形打孔机挖取截面的核心以去除外层(厚度＜1mm)
●将核心置于含1mL蒸馏水或CANARY细胞测试培养基(CO2I)的适当直径管内，并且浸泡5分钟
●从管中去除核心样品，旋转振荡液体
●样品的任何部分或所有样品可以被测试如下：
●在吊斗微离心机内以10K-18K RCF离心样品2分钟
●如果蒸馏水被用于提取，则吸取上清液并弃除，向试管中加入0.5mL CO2I，旋转振荡、并在吊斗微离心机内以10K-18K RCF离心样品2分钟
●如果CO2I被用于提取，无需置换步骤
●向测试管中加入0.02mL CANARY细胞，离心5秒，并且在光度计中读取信号输出
参见图100。图表证明利用以上列出和图101所示的流程检测到天竺葵提取物中100cfu/mL(5cfu/CANARY测试)青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的情况。
雷尔氏菌某些种(Ralstonia spp)
雷尔氏菌感染的组织需要相对较少的样品制剂。由于细菌封闭了木质部(植物的维管系统)，因此，当组织样品置于水下时，导致出现“细菌流”(即向茎的切割端外的细菌流)。这使得能够从感染的组织回收雷尔氏菌而不必碾碎样品，从而免除了从潜在的测试干扰植物碎屑中提取细菌的必要。
为了测试植物样品(在该情况下为天竺葵)，进行以下步骤。刚好在土壤上方的茎的区域-冠部被沿横截面切割，并且去除残余土壤。在第一次切割上方～1cm进行第二次截面切割，并且取下刚稍小于茎的直径的核心样品。该方法保持木质部完好，但去除了干扰CANARY测试的茎的外壳。然后，将核心样品在提取培养基中放置5分钟。因为在CANARY测试培养基中进行提取阶段，因此，避免了使样品与CANARY相容的额外清洗步骤，从而缩短了处理时间。我们能以与单独提取介质中的雷尔氏菌(即无植物组织存在)相同水平的灵敏度检测萌芽的天竺葵提取物中的雷尔氏菌，显示植物提取物的存在并没有抑制雷尔氏菌特异性CANARY信号。
可与背景(即无雷尔氏菌的天竺葵提取物)清晰分辨的信号在从样品被放入光度计内的时间开始30秒内是明显的。包括样品制备的整个过程可以在不到10分钟内被完成。该测试能够检测每个CANRY测试少至5cfu的雷尔氏菌。当活性雷尔氏菌R1bv1的8个不同分离菌被测试时，从CANARY测试获得相当的结果。
病毒抗原物质
马铃薯Y病毒组(Potyvirus group)包括最大的、且经济上最重要的植物病毒组。在CANARY B细胞上表达的广谱反应的单克隆抗体PTY1识别隐位(不是在病毒粒子表面上、而是在完整病毒粒子内的外衣蛋白亚基上发现的表位)。这提出了CANARY的特殊问题，其需要病毒上的隐位被暴露以使B细胞可接近。此处描述的方法通过将马铃薯Y病毒与清洁的1-2微米聚苯乙烯微球结合而暴露隐位，参见图156。该技术也利用磁性聚苯乙烯微球进行工作。当病毒结合微球时，其导致病毒外壳解开并暴露表位。微球也提供了CANARY测试的第二个优势。马铃薯Y病毒是长的弯曲、丝状颗粒(12×680～900nm)，其不能通过迅速的低速离心被沉淀。通过将病毒附于以低转速非常快速地沉淀、或利用磁体可以被浓缩的微球，CANARY测试对于马铃薯Y病毒的灵敏度得到极大提高。不需要特殊的设备或仪器进行包含微球的样品制备/CANARY测试。
参见图102。图表显示利用上述微球吸附方法检测5ng/mL(0.05ng/CANARY测试)的BYMV(一种马铃薯Y病毒)的情况。该方法允许在不到7分钟内完成收集-检测。关于6个其它马铃薯Y病毒株的测试得到类似的检测极限。
疫霉菌某些种(phytophthora spp.)
检测经济上相当重要的真菌样植物病原体-疫霉菌的两种B细胞系被研制。从Neogen公司提供的杂交瘤PH3812和PH4831中提取抗体的基因。抗体识别疫霉菌种的菌丝体部分。
用于菌丝体提取的样品制备稍复杂于用于前述其它两种病原体的样品制备。像被马铃薯Y病毒感染的组织一样，其必须被碾碎以释放生物体。尽管疫霉菌足够大以能够通过离心被沉淀，但是干扰测试的植物碎屑发生共沉淀。除了通过浸解植物组织产生的较大碎屑外，大量的小颗粒(如细粉)也污染样品，并且不能通过过滤与疫霉菌分离而不造成病原体的伴随损失。碎屑通过封闭光检测和在某些情况下导致非特异性信号干扰CANANRY测试。我们再次采取微球结合方法进行从植物组织提取疫霉菌的样品制备。与对聚苯乙烯具有天然亲和性且无需任何特殊处理就与其快速结合的马铃薯Y病毒不同，疫霉菌不结合未处理的微球表面。因而，通过被第二疫霉菌特异性抗体(即，识别与在B细胞的表面上表达的抗体不同的表位的抗体)包被的磁性微球捕获疫霉菌菌丝体，从而使病原体被拖离碎屑。使用磁性“采集笔(pick-pen)”，微球结合的疫霉菌可以容易地被移至测试管，然后CANARY测试可以如前所述进行。在样品制备中的限速步骤为实现疫霉菌与抗体包被微球的充分结合所需的15分钟。
使用该技术，我们能够证明对活马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestan)和辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)菌丝体的剂量依赖反应、以及在萌发马铃薯块茎提取物中的马铃薯晚疫病菌的检测。由于抗原制剂包括从活跃生长的疫霉菌培养物收获的研磨菌丝体，因此对于使用疫霉菌的测试并没有确定LOD。研磨菌丝体的10倍稀释液被测试，直至信号返回基线(无疫霉菌)水平。
通过CANARY测试血源病原体的方案
有许多影响CANARY检测血源病原体的能力的参数。如同其它复杂基质，血液含有CANARY测试的激活剂和抑制剂。因为全血是不透光的，并且病原体可能为细胞内的或者在血样的流体相内，光传输被阻止。此外，不同供者的样品之间的变异性使得开发出能够不考虑供者的状态的通用样品制备方法成为必要。此处描述了克服了所有这些问题、并且仍允许检测血液中的病原体而不牺牲CANARY测试的速度或灵敏度的全血样品制备过程的方法和设备。
该方法使用市售的血浆分离管(PST)和差异离心方法。该过程使用具有血浆和血细胞之间的密度的触变凝胶，当离心时，其在血浆和细胞之间形成屏障。在比凝胶的密度稍低的血液中出现的细菌和病毒在离心过程中保留在血浆(流体)相中。然后血浆可以被收获并在CANARY中测试。
用于流体相血源病原体CANARY检测的设备和方法
由能使全血样品的分离以三个快速、简单步骤进行的改良的成品(COTS)部件组装样品设备(图103)。该设备包括市售的肝素化毛细管PST血液收集管。在PST管盖的上方安装螺纹连接套环，PST管盖顶部已被穿孔。然后塞子被置于套环的上半部。0.5毫升全血在肝素化的血浆分流管内被收集(步骤1)、并且离心90秒(步骤2)。然后用螺纹的1.5mL CANARY测试管代替塞子。然后，通过倒置，在测试管内收集分离的含病原体血浆(步骤3)，具有50～250μL范围的回收体积。将血浆与0.5mL测试培养基混合(减少在血浆中存在的CANARY细胞激活剂的影响的方法)、并且将混合物离心以形成病原体球粒。然后，按照标准流程，用病原体特异性CANARY细胞测试样品。从血液收集到病原体检测的总时间约为5分钟。
使用以上详述的简单的三步方法，使从血液收集到抗原检测/鉴定的总时间在约5分钟内，在全血中的鼠疫耶尔森氏菌的检测极限为1000cfu/mL(125cuf/CANARY测试)。参见图103。
用于细胞内血源病原体的CANARY检测的设备和方法
对用于分离流体相病原体所研制的设备进行改进使得能够在一个步骤中回收含细胞内病原体的白细胞、血浆和流体相病原体。这通过在设备中加入白细胞分离培养基(Ficol-泛影葡胺)而被实现。目前没有以如此小规格(即能分离仅0.5mL全血)制造的具有这种构造的市售设备。因此，装置被组装如下。
代替PST管，空的(无凝胶)毛细管血收集管被用作基础管。然后以下组分按其所列顺序被添加到该管(注意：数量与设备正常发挥机能高度相关)。
●200μL Ficol-泛影葡胺(FD)
●5mm聚酯凝胶
●100μL磷酸盐缓冲液(PBS)
●500μL全肝素化或EDTA血液
该管构造参见图104.
管构造与流体相分离所述的管相同，并且进行了相同的改造以容纳螺纹套环和前述测试管。一旦血液被加入到管中并且加盖，将管倒置几次以混合血液和PBS，然后离心90秒。在图104中较低的线图显示离心后的组分的位置。
用CANARY测试管代替塞子，并且通过设备的倒置收集细胞、血浆和任何游离的病原体。与流体相病原体回收试验相比，附加步骤在此处是有用的。含病原体的白细胞应被裂解以使抗原物质释放，从而其对于CANARY细胞是可以接近的。首先，管以11000RCF离心1分钟，以使白细胞和任何游离的(流体相)病原体成团。弃除液体，向CANARY测试管中加入市售裂解试剂，然后，旋转振荡测试管以混合细胞和裂解试剂。将试管在室温下孵育5分钟，偶尔旋转振荡，然后以11000RCF再离心1分钟，以使病原体成团。去除球粒上方的裂解试剂，并且向管中加入0.5mL CANARY测试培养基，再次旋转振荡和离心试管。现在，样品已准备用于CANARY测试，并且遵循标准的单样品测试形式，即，加入B细胞，离心5秒，并且在光度计中记录光输出。从收集到检测的该试验所需的总时间为～12分钟。
当通过上述方法处理血样以获得细胞内病原体时，掺入全血中的鼠疫耶尔森氏菌的检测极限为1000cfu/mL(参见图105)。
进一步的实施例3
CANARY B细胞冲击技术
本发明描述了用于将CANARY B细胞有效输送至湿或干冲击样品而无需离心的技术。这些技术使基于移动部件的最小化和时间间隔光子读取的较小、较便宜的自动CANARY成为可能。
总结性技术描述
该设备包括使用微滴冲击以使CANARY B细胞与调查的含抗原目标物质之间的快速相遇最大化的技术。描述了几种变型形式(以下列出)，并且以下描述了相关试验和分析技术。
技术1“B细胞喷雾”
技术2“无需离心的CANARY测试”
技术3“CANARY B细胞冲击”
技术4“TCAN-3 B细胞输送概念”
技术5“关于B细胞冲击和CANARY的更新”
此处描述的技术指在抗原收集过程中通过冲击器将气溶胶化抗原或抗原溶液微滴撞击在表面上。随后，CANARY B细胞微滴被气溶胶化并冲击在相同的表面上。用于冲击的方法包括从流体库机械雾化或喷雾在冲击的抗原微滴上(技术1～3)，或者通过由B细胞流体库的快速穿刺而产生的压力差异(技术4)。技术5描述了设计为验证B细胞在该雾化方案过程中的存活率的系列试验。在所有情况下，B细胞在透明面上快速遇到抗原，所述透明面的下方为光检测器或光检测器的光波导器。当B细胞抗体与被冲击的抗原结合时，光发射，并且通过光检测器被检测。通过使光波导器的几何特征与冲击嘴的几何特征匹配，可以改进系统的信号与噪音比，冲击嘴几何特征可以被用于聚焦收集的抗原和雾化B细胞溶液。
此处描述的设备或方法可以被用于进行CANARY测试而无需离心，从而降低了自动识别仪器的复杂性、并且潜在地改进了性能。其使用气溶胶冲击作为快速免疫测试的部分。
CANARY测试为极快的免疫测试，其没有当前技术为了引起与抗原结合而离心B细胞溶液的所导致的初始时间延迟。该方法不仅引起时间延迟，而且更显著地需要比此处建议的方法更复杂的设备(马达、结合和脱离装置、位置和速度编码装置等)。新的技术使用气溶胶冲击以使抗体和抗原接触。降低的复杂性也能导致比现有的更小、更便宜的自动识别传感器，这样提高其作为扩散感应系统的部分的应用。
本领域普通技术人员可以理解，该设备可以应用如下：持续监测或被引发的生物防御检测/识别细胞；人的健康护理——临床疾病和疾病状态鉴定；环境取样和背景植物群鉴定；食品检测；动物健康。
技术1：B细胞喷雾
目的
该试验的目的是确定是否利用喷雾器喷雾B细胞将是一种替代的B细胞输送机制。测量被输送的细胞容积、细胞生存力和活性。
试验设计
输送可控体积的B细胞的可替代的方法被研究。对于液体和干样品研究被喷雾的B细胞的动力学，并且与利用20μL B细胞测试的样品比较。这些试验被测试细胞数目、生存力、浓度内的活性再现性和背景水平。输送后旋转细胞的作用和被喷雾的典型细胞体积也被测试。
将B细胞加载于3mL喷雾器Qosina喷雾瓶内，并且被用于将细胞输送至含Ba或Yp的样品处。为了确定各喷雾的体积，用2ml CO2I填充喷雾瓶，并且将一次喷雾被送至单独的埃彭道夫管内，直至喷雾瓶为空。埃彭道夫管以10,000rpm离心30秒，并且用移液器测量体积。为了测量细胞数目，将Ba B细胞加载于喷雾瓶内，并且喷雾到5个单独的埃彭道夫管内。埃彭道夫管以10,000rpm离心30秒，并且用移液器测量体积。然后将10μL细胞加载于血球计数器内以进行计数。将细胞计数与由细胞制剂的原始管直接计数的细胞比较。
为了测量液体样品的B细胞活性，用1.5mL埃彭道夫管内的试剂制备50μL样品，并且以10,000rpm离心2分钟。对于干样品，在1.5mL埃彭道夫管内制备的5μL试剂用水稀释，以10,000rpm离心2分钟，并且干燥过夜。典型地具有34±8μL/喷雾体积的1次喷雾的B细胞被直接喷到管内。然后样品在微离心机内旋转5秒，并且用Berthold光度计读数。
结果
结果显示各喷雾瓶可以被加载2mL的B细胞，并且能够被喷雾45～47次。各喷雾输送34±8μL/喷雾(n＝47)。尽管由原始管直接计数的细胞平均为3.2×105±8×104个细胞/mL(n＝5)，但是，喷雾的细胞显示1.3×105±2.9×104个细胞/mL(n＝5)的较低平均值。结果，输送的细胞数目/样品对于被喷雾的细胞为5392±954(n＝5)，并且对于用20μL移液器输送的细胞为5283±76(n＝5)。
图106为具有20μl细胞输送的Ba标准品的曲线图。在CO2(I)培养基中制备的、并用20μl B细胞测试的50μl Ba样品。结果显示低背景和50cfu Ba的LOD(n＝2)。
图107为Ba B细胞喷雾的曲线图。在CO2(I)培养基中制备的、并用不同数目的B细胞喷雾测试的50μl Ba样品。结果显示了与20μl细胞输送相比，两次喷雾增强背景。喷雾的数目并未影响50,000cfu Ba(n＝1)的峰强度。
图108为具有1-喷雾细胞输送的Ba标准品的曲线图。在CO2(I)培养基中制备的、并用一次喷雾的B细胞测试的50μl Ba样品。结果显示具有20μl细胞输送的类似背景和5,000cfu的LOD。50和500cfuBa显示50％的检测几率(n＝2)。
图109为Ba标准品的曲线图：使用20μl B细胞的500cfu Ba检测。在CO2(I)培养基中制备具有500cfu Ba的50μl Ba样品，并且用20μl B细胞检测。即使具有高于常规所见的背景，结果也显示500cfu的100％检测(n＝3)。
图110为Ba B细胞喷雾的曲线图：使用1-喷雾的B细胞的500cfuBa检测。在CO2(I)培养基中制备具有500cfu Ba的50μl Ba样品，并且用一次喷雾的B细胞检测。结果显示500cfu的50％检测和2-3倍高的背景(n＝14)。
图111为Ba B细胞喷雾的曲线图：使用1-喷雾B细胞、并且无旋转的500cfu Ba检测。在CO2(I)培养基中制备具有500cfu Ba的50μl Ba样品，并且用一次喷雾的B细胞检测。在读数前，样品未被旋转5秒。结果显示没有细胞与试剂相互作用，导致500cfu Ba的0％检测(n＝3)。
图112为Yp B细胞喷雾的曲线图：使用20μl B细胞的500cfu Yp检测。在CO2(I)培养基中制备具有500cfu Yp的50μl Yp样品，并用20μl B细胞检测。结果显示典型背景和500cfu Yp的100％检测(n＝4)。
图113为Yp B细胞喷雾的曲线图：使用1-喷雾B细胞的500cfuYp检测。在CO2(I)培养基中制备50μl具有500cfu Yp的Yp样品，并用一次喷雾的B细胞检测。结果显示500cfu Yp的100％检测，具有略增加的背景(n＝8)。
图114为Yp标准品的曲线图：使用20μl B细胞的500cfu Ba检测。在CO2(I)培养基中制备50μl具有500cfu Yp的Yp样品，并用20μl B细胞检测。结果显示具有典型背景的500cfu的100％检测(n＝7)。
图115为Yp B细胞喷雾的曲线图：使用20μl B细胞的500cfu干Yp检测。在dH2O中制备5μl具有500cfu Yp的Yp样品，干燥过夜，并用20μl B细胞检测。结果显示500cfu Yp的100％检测(n＝10)。
图116为Yp B细胞喷雾的曲线图：使用1-喷雾的B细胞的500cfu干Yp检测。在dH2O中制备5μl具有500cfu Yp的Yp样品，干燥过夜，并用1-喷雾B细胞检测。结果显示较高背景，但是500cfu Yp具有100％检测(n＝10)。
结论
结果显示喷雾B细胞为用于B细胞输送的适当方法。尽管利用喷雾细胞数目降低，但是较大体积使每样品具有类似数目的细胞被输送。喷雾Ba B细胞继续显示具有50和500cfu的检测能力，但检测率为50％。优化喷雾条件是可能的，可能通过B细胞的较高浓度或更新的细胞，该活性可以被恢复。Ba B细胞喷雾试验也显示对于适当的B细胞活性仍需要5秒钟的旋转步骤。有趣地，Yp B细胞喷雾不像Ba检测影响那么多的B细胞活性。背景水平保持相似，并且500cfu Yp显示100％检测。B细胞对液体和干样品的作用也被测试。首先，利用20μl细胞输送对湿或干形式的500cfu Yp的检测未发生变化。尽管利用干样品与20μl细胞输送相比，对于被喷雾的细胞背景增加，但是干500cfuYP的检测仍显示100％检测。
这些结果表明在经历某些泵输送装置后，B细胞可以保持类似的LOD，并且能够承受在毛细或小口环境中所见的某些压力。喷雾B细胞输送可有助于野外试验，其中储存和输送在同一个部分内，并且不需要移液器。
技术2：无离心的CANARY测试
CANARY测试。CANARY为快速灵敏的生物测试。其使用当结合抗原时发射荧光的B细胞的改进系。抗原细胞被离心或在表面上被冲击。然后，B细胞被离心到这些细胞上，并且通过光度计测量荧光。许多方案(如BCAN和TCAN)使用CANARY现场检测病原体，将气溶胶收集和冲击与CANARY测试结合。
原有CANARY系统
在CANARY现场检测器的当前版中，笨重的离心设备和精细的光学设备必须在小空间内被组合。这种需求使这些检测器的设计和构造变得麻烦。去除离心降低了设计成本、建造成本和维修成本，另外提高了可靠性。我们描述了使用冲击的替代的技术。
冲击B细胞的可选择的技术
为了避免由于离心的花费和设计复杂化，已建议了几种方法作为将B细胞移至结合表面的替代方法。这些包括在细胞内磁性微球的操控、热泳、电泳和声学处理。各个方法都需要开发和细化作为CANARY系统内的新技术。
建议的技术
此处描述了以新颖方式使用CANARY技术的技术，尤其通过冲击使B细胞结合抗原的方式。该技术使用与BCAN或TCAN中所用的非常相似的冲击。B细胞溶液通过抗原细胞冲击嘴被喷雾。因为其较大的质量，所以，即使B细胞在溶液中，其仍冲击在冲击面上。这在以下部分更详细地被描述。喷雾为与生物气溶胶收集所用相同的流速。因此，用于生物气溶胶收集的相同的泵可以驱动B细胞冲击。
B细胞冲击的物理学
颗粒通过液体的冲击与颗粒通过气体的冲击类似。当流体流线因物理障碍而突然改变方向时，流体内足够大的颗粒穿过流线、并与障碍物发生撞击。描述撞击可能性的无量纲参数为斯托克数(Stokesnumber)。其为颗粒的停止距离与障碍的尺寸的比值。斯托克数约为
Stk≈τU/D
其中，U为朝向障碍物移动的流体速度，D为障碍物的尺寸和τ为颗粒弛豫时间。所述弛豫时间为颗粒直径、颗粒密度和流体粘性的函数。对于从喷嘴出流到冲击面上的流体，D为喷嘴的直径。
对于冲击嘴的颗粒临界直径的等式为
d 50 = ( 9 η D 3 ( Srk 50 ) 4 ρ p Q ) 1 / 2 ,
其中Stk50为常数(～0.5)，η为流体粘度(对于水为0.01P，对于空气为0.0002P)，并且Q为流速。对于BCAN，Q为2lpm，且D为0.1cm。然后，对于水计算的d50为6微米，对于空气为0.8微米。
因此，相同的冲击波导管可以被用于冲击空气中的颗粒、以及冲击溶液中的B细胞。
新方法具有多种优点。该新技术免去了B细胞离心步骤。该方法快——其仅需数秒以冲击B细胞。在PMT附件中无移动部件，这意味着PMT具有较长的运转寿命，并且，其可以被定位以获得更灵敏的信号。与基于离心机的设备相比，该检测器并不昂贵，并且是结实的。通过改造现有的BCAN或TCAN，其制造容易。
技术3：CANARY B细胞冲击
目的：
为了研制不涉及离心步骤的用于CANARY现场设备的可替代的B细胞输送方法。
试验设计
早期CANARY方案对于B细胞输送需要以500g离心5秒的步骤。然而，通过对包括如B细胞和PMT的精细组分的自动系统设置苛刻的设计限制，离心样品限制了CANARY现场设备的有效性。此处描述的新方法通过以与BCAN或TCAN系统类似的方式冲击抗原物质和B细胞从而免去了额外的移动部件。其不同于其中仅抗原物质被冲击的现有方法。结果，唯一的移动部件为用于喷雾B细胞的阀，其被安装于距结合面一定距离处。
在该新方法中，B细胞微滴在冲击流中被分散。在技术1“B细胞喷雾”中的试验显示B细胞至少在某形式的雾化中存活。在技术2“无离心的CANARY测试”中的计算显示B细胞通过以BCAN中所用的流速流动的水性溶液进行冲击。因为BCAN具有1微米的冲击临界值，所以，具有10微米直径和更高直径的B细胞微滴在由使用相同流速的BCAN泵所提供的气流内容易发生冲击。由于微滴尺寸远小于BCAN嘴，因此，喷嘴处的损失可以忽略不计。是否B细胞在冲击中存活仅能通过试验确定。
该新的喷雾方法去除了用于抗原物质冲击、B细胞冲击和PMT测量三个操作的移动部件。结果，这样简化了用于B细胞可以以一定距离储存在单储存库中的野外设备的设计需要。因为气流不需要与B细胞添加分离，所以在冲击器内使用单阀装置。
该技术需要能够气溶胶化10或20微米液滴的扩散器。用于生物气溶胶的实验室标准扩散器柯立森雾化器对大于5微米的液滴具有低效率。两种可替代的喷雾器已被考虑。第一种为从Qosina得到的、且为化妆品工业研制的定量喷雾器。某些试验显示颗粒尺寸为10微米或更大，并且产生气溶胶脉冲。这些喷雾器各价值$1。用于这些颗粒尺寸的另一种类型的喷雾器为用于连续流的超声喷雾器。生产超声喷雾器系统的两家公司为Sono-tek和Sonaer。这些系统价值$7.5k～$15k。
用BCAN原型测试Qosina喷雾器的试验设定如下(参见图117)。将盘置于为BCAN试验制造的冲击装置内。其包括冲击嘴、支承冲击盘的孔和出口倒钩。所述倒钩通过管与旋转流量计、HEPA滤器和以接近5lpm的流速运行的泵连接。管将装置的入口与三通管连接，所述三通管的一端对周围空气是开放的，另一端对Qosina喷雾器开放，所述Qosina喷雾器包含B细胞溶液。将PMT置于玻璃盘的下方。因为PMT对光敏感，因此，将冲击装置和PMT置于暗箱内。暗色管将出口与旋转流量计连接，将入口与三通连接。在测试过程中，抗原物质模拟物将被点在玻璃冲击盘上，并且将盘置于装置内。其次，启动泵，B细胞从喷雾器喷出。此时，如果B细胞在喷雾和冲击中存活的量足够，可以预期从PMT得到发光信号。支持测试为将B细胞冲击在无抗原物质的盘上，以测试单独的冲击不导致B细胞发光。
技术4：TCAN-3 B细胞输送概念
目的：
目前，TCAN-2生物传感器包括控制B细胞释放和输送的COTs喇叭阀。该喇叭阀即昂贵且笨重。此外，喇叭阀内的弹簧在使用前必须移开以在离心步骤过程中保持阀开放。该技术建议了基于伯努利原理的简单应用的B细胞释放和输送的可替代方案。
概念
该建议的概念利用了将B细胞从液体池吸入气溶胶通路的气溶胶收集泵。这通过用在气溶胶收集过程中关闭的箔封条密封B细胞储存库而被实现。在气溶胶收集后，封条被穿孔，导致气溶胶通路和储存库之间的压力差(ΔP)。
该概念基于伯努利原理，其阐述了流体的压力随速度反向变化；因而，空气速度增加将产生压力下降。此概念的原理与常规喷雾器相同。大多数喷雾器通过在液体储存库上方产生气流而工作。快速移动的空气在入口处降低压力，基于压力差将液体吸入气体通路内。
伯努利原理：
P/ρ+1/2V2+gz＝常数
P＝压力；ρ＝流体密度；V＝速度；g＝重力加速度；z＝高度
因为基于理想的气体法则，尾端压力(P2)与入口压力(P1)平衡，所以在刺穿封条前B细胞应保持在池中。假定温度保持相同，当流体塞被拖到气溶胶通路内时，气体的体积(V2)也增加，导致尾端压力(P2)下降。尾端压力将与入口压力实现自我平衡，直至封条撕破。在封条撕破后，尾端压力与周围的大气压力平衡。
理想气体法则：
PV＝nRT
设计参数：
有多个需要完成的关键试验。关键的设计参数包括确定储存库通道的理想直径和几何形式。该直径将影响液体-气体界面处的表面张力。由于毛细管内的表面张力导致的压力差如下：(对于水，表面张力＝γ＝0.073N/m)
ΔP＝2γ/半径
随半径减小，将液体从储存库吸出所需的压力也增加。
结论：
该释放和输送B细胞的方法简化了在TCAN-2中目前被使用的CD的设计。该方法也降低了CD的成本和尺寸，导致部件的生产更便宜和简单。该技术可以被用于此处所描述的非离心B细胞输送方法。
技术5：关于B细胞冲击和CANARY的进一步试验
此处描述的方法通过在抗原基底上冲击B细胞微滴从而将B细胞靶定在抗原上。这尤其适于CANARY干式冲击。将B细胞置于与抗原相同的位置处，因为他们通过相同的装置被放置。
B细胞遭受的过量应力为气溶胶化所致。具体地说，在气溶胶运送和气溶胶冲击过程中发生的应力。在生物气溶胶产生过程中，细胞可能遭受剧烈的机械应力，并且带电。在输送阶段中，液滴可能发生溶剂蒸发和溶质浓度改变。这些影响可能导致脱水、氧中毒、和渗透压不平衡。在冲击阶段中，颗粒再次遭受机械应力。所有这些影响可能灭活B细胞，阻碍其作为抗原检测器的应用。
在FACS分析过程中B细胞没有被气溶胶化灭活，细胞生存能力也没受到影响。在FACS/流式细胞分析过程中，FACS机器每次一个地将细胞分散到微滴(即气溶胶)内，并且，微滴进行光学分析，然后(任选地)将微滴在管中收集用于进一步分析。在冲击到干管中后，即使存在离子螯合剂时，B细胞也存活数小时。1小时后，仅10％的细胞损失。因此，足够CANARY检测的B细胞在不到一秒的时间内进行冲击。
测试研究
为了进一步研究气溶胶化对B细胞的影响，将抗原置于FACS分选机测试管的底部。然后，通过FACS设备处理CANARY B细胞。然后，测试管可以在光度计内分析CANARY B细胞的光子发射。阴性对照在管中省略抗原。此外，抗原和CANARY细胞一同冲击在管内的情况可以被测试。
进一步的实施例4
16通道传感器：
此处描述的是精制和改进的16通道传感器，其提供与利用单通道系统所观察到的相同灵敏度水平(图121)。该便携式样机适于外部验证和测试。特别地，其使用单光采集通道同时测量16个样品。该传感器由转子组成，该转子支持有16个围绕其圆周水平、均匀分布的测试管，并且由绕垂直轴的可变速马达驱动。单固定光子检测部件，此时为PMT，被置于转子的平面内恰好在管旋转过程中的路径之外。这样，使各个管顺序、反复地紧密接近PMT，使其光输出在各次通过时被采样。最后，由光源(红外LED)和检测器(光电晶体管)组成的光开关被用于控制检测到的光子的计数和16个域内的数据的再组织，各域与特定的样品相关。
单次测量包括：
1、在各个管中制备16个样品(和/或对照)。
2、使用包括但不限于人工转移、自动转移、胶囊或泡包装的各种方法中的任一种向各个试管内引入等份的B细胞。
3、将测试管安装于转子中。
4、以相对高的离心力(RCF)(～2000g)短暂(5秒)离心旋转将B细胞定位至管底部。
5、在测量过程中(1～2分钟)降低转子的速度至10～120rpm，每次旋转各管被采样一次。
6、产生各个样品的光子计数的时间序列以进行显示和/或输入用于评估的计算机算法。
非离心测试形式
可用于以临床、即时和前线应用为目标的小型手持传感器的其它测试形式也在此被描述。通常，在开发过程中的目标为确定能简化CANCARY测试程序和其所需硬件，同时尽可能保持较高速度和灵敏度的形式。具体地说，注重实现能够降低或去除离心步骤需求的替代测试程序，因为离心步骤是当前能耗和仪器复杂的主要原因。关于使用表面结合目标物质的物理处理、微流槽、管吸装置、过滤或磁性微球捕获的测试形式的许多途径已被实验性评估。以下详细描述侧向流装置和尤其是磁性微球捕获的应用。
表面结合颗粒的物理处理(也称作“针头”)方法
这是一类通过(以及最初的测试使用)常规直的大头针启示的用于使用CANRY B细胞的非离心方法。实践中，直的大头针可以被满足3个基本标准的任何适合固体表面取代：1)表面不激发B细胞钙流，2)表面能够以不改变CANARY B细胞上的抗体与被结合的目标物质结合的能力的方式容纳和保留/结合目标物质，以及3)表面易于物理处理以使其与在反应容器的表面上的B细胞(发射体细胞)层接触。通常，被测试的颗粒可以通过各种方式从气体或液体样品中被收集到“针头”上(图122)，并且随后被呈现给等份的固定B细胞(图123)，如果被收集的样品包括那些细胞表达抗体的抗原，弱光信号将被产生，并且通过灵敏的光度计被收集。
在离心的CANARY方法中，被测试的颗粒(包括细菌、病毒或毒素)通过气体冲击(如在BCAN内)、或者，对于液体样品，通过长时间(≥2分钟)、有力(≥10K RCF)离心“预旋转”被定位于样品位置(这些样品制剂之一在样品点附近有效地将颗粒浓缩在小体积中)。然后，将CANARY B细胞引入样品容积内，并且在短暂(≈5秒)、轻柔(≈500RCF)细胞输送旋转后，其被带到其中他们可以遇到颗粒的样品位点处。因为其将B细胞移至样品表面需要短时间，所以这些相遇在短时间内发生；所得的B细胞的发光被同步以产生被检测光子的可识别图形形式的更清楚的可识别信号。
针头方法在表面上或表面附近实现颗粒和B细胞相似的浓缩：被测试的颗粒通过多种方式在表面(针头)上被收集，并且该表面被物理操纵到提前布置的B细胞薄层(重力沉降、预旋转、或生长粘附于表面)。这又导致B细胞的同步激活，导致足够强的信号。
这些概念的第一个试验验证包括在针头上干燥2μL含有已知量的抗原模拟物的样品，以及将这些针头引入固定的(通过离心)等份的多种B细胞系(各“系”被表达已知试剂或模拟物的抗体的B细胞克隆群)。当使用相应抗原和细胞系时观察到强反应，而在错配的情况下未观察到信号(图124显示典型的剂量反应)。
第二个实验性验证包括与图122(b)类似的条件中静电收集Bs孢子。使用空气中大概相似浓度的Bs孢子、固定气流速度、并且改变收集时间，当将收集针引入固定的含表达Bs抗体的B细胞的管内时，观察到剂量反应(图125)。
双重磁性微球测试
此处描述了利用两组磁性微球的测试。一组为CANARY B细胞特异性的，而另一组为特定抗原物质特异性的。这些抗原物质特异性微球能对特定类的抗原物质(如，gram+/-细菌、病毒、蛋白质、DNA等)(例如参见US2005/118570和美国专利11/056,518，通过引用所有这些的教导内容被包含在此处)具有通用亲和性，或者具有对单抗原物质的特异性亲和性。在图127中，在双重微球测试旁边进行标准CANARY测试。鼠疫耶尔森氏菌特异性磁性微球与鼠疫耶尔森氏菌剂的稀释液系列混合5分钟。5分钟后，磁性微球与任何结合的鼠疫耶尔森氏菌一起被拖到测试管的底部，并且弃掉上清液。然后，向样品中加入磁性标记的B细胞，并且向下拖至管的底部。迄今，用磁性微球定位抗原物质和B细胞已证明提供了与离心相似的灵敏度。
管吸形式
此处描述了使管吸和过滤材料成层以实现样品液输送和抗原定位而无需离心的设备内的CANARY测试。该设备的基本构造和表明其定位孢子大小的颗粒的能力的图片如图128和129所示。
图130显示了使用相同抗原物质和细胞样品进行标准离心测试和侧向流测试所得的CANARY信号。这些和其它试验已显示尽管在侧向流测试中可以使用B细胞，但是信号-噪音水平有低于离心测试的倾向，因此降低了整体LOD。降低的信号强度表明该形式在定位抗原颗粒或者当其到达过滤材料上的颗粒时使B细胞同步呈现方面、或者在两方面都是不够有效的。也观察到背景水平的增加。这些随管吸材料和流速的不同而在强度方面发生变化，并且通常与预料由于增加的表面粘附和液体剪切力导致的对B细胞的机械应力增加的材料和流速相关。可能的补救包括选择使用对机械应力具有较高抗性的B细胞、使用低水平的清洁剂以降低系统剪切应力、降低捕获区的厚度和大小以确保所有被捕获的抗原可以被B细胞发现、以及通过降低管吸带的长度降低剪切应力。最初设备使用0.2μm滤器用于捕获，但可以与捕获小于0.2μm的颗粒的微球结合。
进一步的实施例5
自动CANARY生物气溶胶传感器实施方式
此处描述了在自动传感器中通过惯性冲击的气溶胶收集与CANARY鉴定的结合，以证明在90秒之少的时间内收集和鉴定气源病原体。对于其它自动生物气溶胶收集和鉴定设备目前所报道的最快反应为＞18分钟，因此，与现有技术的当前状态相比，这代表了超过一个数量级的改进。基于该设计的两个实施方式，BCAN和TCAN传感器(图131)已制造并测试，此处描述了引入下一代CANARY技术中的关键材料、方法和装置，我们称之为PANTHER(威胁环境排放物的病原体分析仪(Pahtogen Analyzer for Threatening EnvironmentalRelease)，图131)。
在相关图及其图例中(图131-137)描述了核心技术的关键细节，并能够被总结如下：
1)含被分析的气溶胶颗粒的空气通过4.75”直径的盘吸入，该盘具有引导并加速气流通过16或更多通道的特征，所述通道具有使气流携带的气溶胶颗粒冲击在盘表面的易于直接进行CANARY分析的适当定形区域内的几何学特征。
2)CANARY B细胞被分成16或更多独立等份储存于仪器中，小份的细胞可以使用多种现有的装置自动释放并经短暂(不到5秒)旋转可以被输送至各个气溶胶收集位点。
3)旋转力使CANARY B细胞和收集的颗粒之间接触，并且从任何含有CANARY B细胞的病原体目标的样品发射光。盘在反应区内对于光的发射波长是透明的，并且使用光子计数光检测装置(如光电倍增管)收集并定量发射的光。
4)如上描述的多个盘被负载在提供储存、运输、处理和数据分析的设备上。该仪器的运行提供能够在90秒之少的时间内鉴别气源病原体的病原体收集和分析能力。
附录
缩略词/符号定义：
AC           交流
AFB          空军基地
ATP          三磷酸腺苷
BAWS         生物试剂警告传感器
Bcl2l11      Bcl2-样ll
Bmf          Bcl2修饰因子
BoNT/A       肉毒毒素A
BoNT/A Hc    肉毒毒素A重链
CANARY       抗原风险及产生的细胞分析及通告(CellularAnalysis and Notification of Antigen Risks and Yoelds)
CCD          电荷偶联设备
CDC          疾病控制中心
COTS         市售成品
CPT          细胞制备管
CRET         化学能量共振转移
DC           直流
DEP         双向电泳
DMSO        二甲亚砜
DNA         脱氧核糖核酸
DoD         国防部
EBs         原生小体
EGFP        增强的绿色荧光蛋白
FcyRI       Fcγ受体I
FMD         口蹄疫
GADD45Pβ   生长阻碍和DNA修复诱导β
GFP         绿色荧光蛋白
GST         谷胱甘肽转移酶
HA          红血球凝聚素
HBSS        Hanks平衡盐溶液
Hells       解旋酶，淋巴特异性的
HistlHlc    组蛋白1 Hlc
HSF1        热激因子1
IFNγ       干扰素γ
LD50        50％致死剂量
LOD         检测极限
NiCd        镍-镉
PBS         磷酸盐缓冲液
PCR         聚合酶链反应
Pdcdllgl    程序细胞死亡1配体1
PMT         光电倍增管
PST         血浆分离管
RCF         相对离心力
RLU         相对光单位
TCA         三氯乙酸
Tx-100      TritonX-100
USAMRIID    美国军方传染病医学研究所
VEE         委内瑞拉马脑炎
尽管本发明已参照其优选实施方式被具体显示和说明，但是本领域普通技术人员可以理解，在其中可以进行各种形式和细节的改变，而不背离通过附加权利要求所选定的本发明的范围。
此处引用的所有参考文献、专利和专利申请的教导内容通过引用而被全部包含于此。
                   序列表
<110>麻省理工学院
     E·施沃贝尔
     J·哈珀
     M·S·佩特罗维克
     F·纳尔吉
     M·霍利斯
     B·约翰逊
     J·拉西里格诺拉
     R·马修斯
     K·霍根
     T·维安
     A·赫夫
     M·亨尼西
     S·帕尔乔德休里
     T·赖德
<120>病原体检测生物传感器
<130>0050.2091002
<150>US 11/001,583
<151>2004-12-01
<150>US 10/467,242
<151>2004-01-16
<150>PCT/US02/03606
<151>2002-02-06
<150>US 60/266,977
<151>2001-02-07
<150>US 60/741,271
<151>2005-11-30
<160>22
<170>Windows 4.0版FastSEQ
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>1
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<210>2
<211>17
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<220>
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<400>9
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<220>
<223>合成引物
<400>12
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<210>13
<211>12
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>部分EGFP蛋白序列
<221>NON_CONS
<222>(6)...(7)
<400>13
Met Val Ser Lys Gly Glu Met Asp Glu Leu Tyr Lys
 1               5                  10
<210>14
<211>39
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>部分EGFP核酸序列
<221>misc_feature
<222>(18)...(19)
<223>不连续核苷酸
<400>14
atggtgagca agggcgagat ggacgagctg tacaagtaa    39
<210>15
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>15
cctgatccac cgccagactt gtacagctcg tcc          33
<210>16
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>16
tggcggtgga tcaggaatga ccagcgaaca ata          33
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>部分发光蛋白序列
<221>NON_CONS
<222>(6)...(7)
<400>17
Met Thr Ser Glu Gln Tyr Tyr Gly Gly Ala Val Pro
 1               5                  10
<210>18
<211>39
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>部分发光蛋白核酸序列
<221>misc_feature
<222>18-19
<223>不连续核苷酸
<400>18
atgaccagcg aacaatacta cggtggagct gtcccctaa               39
<210>19
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>19
ttaggggaca gctcca                                        16
<210>20
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>EGFP发光蛋白的部分蛋白序列
<221>NON_CONS
<222>2-3，12-13
<400>20
Met Val Tyr Lys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met Thr Val Pro
 1               5                  10
<210>21
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EGFP发光蛋白的部分核酸序列
<221>misc_feature
<222>12-13，42-43
<223>不连续核苷酸
<400>21
gccaccatgg tgtacaagtc tggcggtgga tcaggaatga ccgtccccta a    51
<210>22
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>22
ctggcggtgg atcaggaatg accagcgaac aata    34

Claims (17)

1、一种用于检测样品中可溶性抗原的方法，包括：
a)向样品中加入发射体细胞，其中所述发射体细胞包含受体和响应于样品中的目标抗原与所述受体的结合而发射光子的发射体分子；
b)检测光子发射，其中光子发射为样品中可溶性抗原的指示。
2、如权利要求1所述的方法，其中，所述可溶性抗原为核酸、毒素、肽、化学物质、病毒或其组合。
3、一种用于检测样品中的可溶性抗原的设备，其中，该抗原被发射体细胞上的受体结合，所述发射体细胞包含受体和响应于样品中的目标抗原与所述受体的结合而发射光子的发射体分子，其中所述设备检测光子的发射，从而检测样品中的可溶性抗原。
4、如权利要求3所述的设备，其中所述设备为手持设备。
5、一种用于检测空气样品中的目标颗粒的方法，包括：
a)向基底上冲击气体样品；
b)向基底加入发射体细胞，其中所述发射体细胞包含受体和响应于目标颗粒与所述受体的结合而发射光子的发射体分子；
c)检测光子，其中光子发射为空气样品中目标颗粒的指示。
6、如权利要求5所述的方法，其中所述基底为针头。
7、如权利要求5所述方法，其中所述发射体细胞为B细胞。
8、如权利要求5所述方法，其中所述受体为抗体。
9、如权利要求8所述方法，其中所述抗体为抗免疫球蛋白抗体。
10、如权利要求5所述方法，其中所述受体为Fc受体。
11、如权利要求5所述方法，其中所述空气样品中的目标颗粒为化学物质、爆炸物颗粒或生物颗粒。
12、一种用检测空气样品中的目标颗粒的设备，包括：
a)向基底上冲击气体样品的装置，其中，将发射体细胞加入所述基底，并且其中所述发射体细胞包含受体和响应于目标颗粒与所述受体的结合而发射光子的发射体分子；
b)检测光子发射的装置，其中光子发射为空气样品中目标颗粒的指示。
13、如权利要求12的设备，其中所述设备为手持设备。
14、一种检测植物病原体的方法，包括：
a)制备包括植物病原体的植物样品；
b)向所述植物样品中加入发射体细胞，其中所述发射体细胞包含受体和响应于样品中的植物病原体与所述受体的结合而发射光子的发射体分子；
c)检测光子发射，其中光子发射为样品中植物病原体的指示。
15、一种用于检测临床样品中的病原体的方法，包括：
a)制备用于测试病原体的临床样品；
b)向样品中加入发射体细胞，其中所述发射体细胞包含受体和响应于样品中的病原体与所述受体的结合而发射光子的发射体分子；
c)检测光子发射，其中光子发射为样品中病原体的指示。
16、如权利要求15所述方法，其中所述临床样品为鼻拭子、尿样、唾液样品或血样。
17、如权利要求15所述方法，其中所述病原体为细菌、病毒或毒素。
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