CN103382511A - 检测口蹄疫亚洲i型病毒的荧光rt-pcr引物和探针及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针及其试剂盒，所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-TGCCCACTTCCTTCAAC-3′，下游引物核苷酸序列为5′-TTGGACTCCTAAAGCA-3′；所述探针为5′-F-ACACCACACAAGACCGCCGTAAACA-Q-3′，其中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团；所述试剂盒包括所述的引物和探针。采用本发明检测口蹄疫亚洲I型病毒，具有敏感性高、特异性强、自动化程度高、快速简便等优点。

Description

检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针及其试剂盒

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物检测技术领域，具体涉及检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针及其试剂盒。

背景技术

口蹄疫（Foot and mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的一种急性高度接触性传染病，主要侵害偶蹄动物，如牛、猪、羊等。其特征是发热、皮肤或粘膜发生水泡溃疡，尤其是在口腔和蹄叉部位。

口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV）属于小RNA病毒科，约有8500个核苷酸组成。病毒基因组由一个开放性阅读框（ORF）、一个5′端非编码区（NCR）和3′端非编码区（NCR）组成，ORF编码由4种结构蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4）、RNA聚合酶（3D）、蛋白酶（L、2A、3C）以及其他非结构蛋白（如3A等）组成。口蹄疫病毒包括7个血清型和60余个亚型，7个血清型为：A型、亚洲I型、O型、C型、南非Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，各型之间无交叉保护反应，同一血清不同分离株之间也存在广泛的抗原变异；由于亚型分类越来越复杂，现在由用于分析基因组遗传衍化关系的基因型代替。

口蹄疫在亚洲主要流行有A、O型、C型、亚洲I型4个血清型，截至目前，我国仅见O型、亚洲I型、A型三个血清型的口蹄疫。亚洲I型口蹄疫是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，临床以口唇、蹄部、乳房等部位出现水泡、溃烂为特征。其传染性强，发病率高，传播途径多而且速度快，流行及危害的严重性仅次于O型病毒，分布于亚洲部分国家，2005年至2006年亚洲I型口蹄疫在我国大范围的爆发，通常感染牛、羊，我国未有猪感染口蹄疫亚洲I型的报道。

口蹄疫病变典型易辨认，其诊断要点为：①发病急、流行快、传播广、发病率高；②大量流涎，呈引缕状；③口蹄疮定位明确(口腔粘膜、蹄部和乳头皮肤)，病变特异(水泡、糜烂)；④恶性口蹄疫时可见虎斑心；为进一步确诊可采用动物接种实验、血清学诊断及鉴别诊断等。但口蹄疫的多个血清型均可出现以上症状，给鉴别诊断带来困难。

近年来，随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR技术以其快速、敏感、特异性好的优点占有很大优势，引起了众多研究者的关注。荧光PCR技术是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该法自产生以来，不断发展完善，特别是随着TaqMan探针的广泛使用，到目前为止该技术已经非常成熟，具有灵敏度高、特异性强、操作安全方便等优点，目前已被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。

发明内容

本发明的目的是是采用实时荧光PCR技术，提供检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针及其试剂盒，灵敏度高、特异性强，操作安全方便，具有良好的应用前景。

本发明的技术方案为：

检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针，所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-TGCCCACTTCCTTCAAC-3′，下游引物核苷酸序列为5′-TTGGACTCCTAAAGC A-3′，所述探针为5′-F-ACACCACACAAGACCGCCGTAAAC A-Q-3′，其中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。

以上所述检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针，所述的F可为FAM、HEX或TET等报告荧光基团，所述的Q可为TAMARA、BHQ或MGB等淬灭荧光基团。

以上所述的F优选为FAM，所述的Q优选为TAMARA。

一种检测口蹄疫亚洲I型病毒的试剂盒,所述试剂盒包括以上所述的引物和探针。

以上所述检测口蹄疫亚洲I型病毒的试剂盒,所述试剂盒还包括：RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、阴性对照和阳性对照。

所述的RNA提取试剂包括：Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇；

所述的RT反应试剂包括：5×buffer缓冲液、dNTPs、HIR和FMDV-Id；

所述的PCR反应试剂包括：Taq DNA酶、10×buffer缓冲液、dNTPs、MgCl₂和cDNA；

所述的阴性对照包括：DEPC水；

所述的阳性对照包括：口蹄疫亚洲I型全病毒。

本发明的具体原理是利用口蹄疫亚洲I型病毒的同源性，应用OLIG6.0软件，合成一对靶核苷酸序列的特异性引物，加入一条探针引物，通过荧光RT-PCR扩增后收集荧光信号，阳性样品产生特定的曲线。试验方法及过程如下：

1.引物设计：

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准，5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。引物长度一般为16-25bp左右，引物之间、引物内无互补序列。通过对口蹄疫亚洲I型基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的片段，设计多对引物，通过匹配、筛选最优引物组合如下：

上游引物FMDV-Iu序列：5′-TGCCCACTTCCTTCA AC-3′；

下游引物FMDV-Id序列：5′-TTGGACTCCTAAAGCA-3′；

探针FMDV-Ip序列：5′-F-ACACCACACAAGACCGCCGTAAACA-Q--3′，其中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。

2.反应体系的建立和优化：

将灭活的待检样品用Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取病毒基因组RNA，分别分装后储存于-20℃备用。

2.1引物用量的优化  在反应体系其他条件相同的情况下，将引物对的用量分别从0.1μL至1.8μL加入体系，通过实验结果分析比较，确定最优引物用量为0.2μL。

2.2探针用量的优化  在反应体系其他条件相同的情况下，探针从0.1μL至0.5μL加入体系，通过实验结果分析比较，确定最优探针用量为0.3μL。

2.3氯化镁浓度的优化  在反应体系其他条件相同的情况下通过实验结果分析比较，确定氯化镁的浓度为25mM最佳。

2.4反转录酶（M-MLV）的优化  通过实验结果对比分析，选择200U/μL反转录酶作为反应体系最佳用量。

2.5Taq DNA聚合酶（Taq酶）的优化  通过实验结果对比分析，选择5U/μL酶作为反应体系最佳用量。

2.6dNTPs浓度的优化  通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，反转录时选择10mM，PCR扩增时选择2.5mM作为反应体系最佳用量。

利用上述引物和各成分的最终浓度，最后确定采用的RT-PCR反应体系为25μL，所需各组及相应浓度见表1。

表1鉴别口蹄疫亚洲I型病毒荧光RT-PCR反应体系

3.荧光RT-PCR反应条件优选如下：

反转录体系：45℃60min，95℃5min；

扩增条件：94℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸7min。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供的引物和探针检测灵敏度可达100个拷贝/ml，说明其具有良好的灵敏度。

2.本发明提供的引物和探针对于无口蹄疫亚洲I型的检测样品无扩增曲线，说明引物和探针对目的基因具有良好的特异性。

3.本发明是针对口蹄疫亚洲I型代表毒株以及高度保守区域进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的产生。

4.本发明设计的引物和探针可以检测样本是否呈口蹄疫亚洲I型阳性，进行35个循环扩增只需2个小时左右，节约了大量的人工时间、实验耗材，提高实验室工作效率，降低了检测成本。

附图说明

图1是本发明检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR扩增曲线图。

1、口蹄疫亚洲I型阳性对照         2、口蹄疫亚洲I型阳性样品

3、阴性样品                      4、阴性对照

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述，但不限制本发明的保护范围和应用范围。

实施例1

一种检测口蹄疫亚洲I型病毒的试剂盒，包括以下试剂，详见表2，引物及探针为本实验室自行设计，其他试剂均可从市场上购买。

表2检测口蹄疫亚洲I型病毒的试剂盒

实施例2

一种检测口蹄疫亚洲I型病毒的试剂盒，包括以下试剂，详见表3，引物及探针为本实验室自行设计，其他试剂均可从市场上购买。

表3检测口蹄疫亚洲I型病毒的试剂盒

实施例3

一种检测口蹄疫亚洲I型病毒的试剂盒，包括以下试剂，详见表4，引物及探针为本实验室自行设计，其他试剂均可从市场上购买。

表4检测口蹄疫亚洲I型病毒的试剂盒

实施例4

一种检测口蹄疫亚洲I型病毒的方法，包括以下步骤：

1.病毒RNA的提取

①取待检样品、阳性对照、阴性对照各500μL于1.5ml灭菌无RNA酶污染的EP管中，加入等量Trizol裂解液进行裂解，充分振荡，室温放置10分钟；

②加入300μL氯仿，摇匀放置10分钟；

③低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟；

④缓慢取出上层液体600μL放置于新的EP管；

⑤加入等量异丙醇轻轻混匀，-20℃放置30分钟；

⑥低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟，弃上清；

⑦用75%的DEPC乙醇吸取1ml于管内洗涤沉淀，充分吸弃洗涤；

⑧将EP管倒置于吸水纸上，尽量吸干液体，放置于37℃温箱中15分钟，管内无可见水珠时取出；

⑨加入25μL DEPC水，-20℃保存备用。

2.RT操作程序

取5×buffer缓冲液5μL、dNTPs2μL、M-MLV0.5μL、HIR0.5μL、FMDV-Id2μL，RNA15μL，将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作：45℃15min，95℃1min。

3.荧光PCR操作程序

上游引物FMDV-Iu0.2μL、下游引物FMDV-Id0.2μL、探针（5′-[FAM]-ACACCACACAAGACCGCCGTAAACA-[TAMRA]-3′）0.3μL、Taq DNA酶0.2μL、10×buffer缓冲液2.5μL、dNTPs2μL、MgCl₂2μL、DEPC水12.6μL,cDNA5μL，将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作,扩增条件：94℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸7min。

4.结果判定

阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。

阳性对照Ct值≤32并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定曲线时，实验结果成立；被检样品32＜Ct＜32并出现特定的扩增曲线判定为可疑，可疑样品需复检，复检仍为可疑者判为阳性。

试验结果详见图1。阳性样品“2”Ct值≤32并出现特定的扩增曲线，表明被检样品呈口蹄疫亚洲I型病毒阳性。本方法敏感性高、特异性强、快速简便、检测成本低，具有良好的市场应用前景。

核苷酸序列表

<110>广西壮族自治区动物疫病预防控制中心

<120>检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针及其试剂盒

<160>3

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成的序列

<223>检测口蹄疫亚洲I型病毒上游引物核苷酸序列

<400>1

TGCCCACTTC CTTCAAC    17

<210>2

<211>16

<212>DNA

<213>人工合成的序列

<223>检测口蹄疫亚洲I型病毒下游引物核苷酸序列

<400>2

TTGGACTCCT AAAGCA    16

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成的序列

<223>检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光探针序列

<400>3

ACACCACACA AGACCGCCGT AAACA    25

Claims (6)

1.检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针，其特征在于，所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-TGCCCACTTCCTTCAAC-3′，下游引物核苷酸序列为5′-TTGGACTCCTAAAGC A-3′，所述探针为5′-F-ACACCACACAAGACCGCCGTAAAC A-Q-3′，其中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。

2.根据权利要求1所述检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针，其特征在于，所述的F为FAM、HEX或TET，所述的Q为TAMARA、BHQ或MGB。

3.根据权利要求1所述检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针，其特征在于，所述的F为FAM，所述的Q为TAMARA。

4.检测口蹄疫亚洲I型病毒的试剂盒, 其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1至3中任一所述的引物和探针。

5.根据权利要求4所述检测口蹄疫亚洲I型病毒的试剂盒, 其特征在于，所述试剂盒还包括：RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、阴性对照和阳性对照。

6.根据权利要求5所述检测口蹄疫亚洲I型病毒的试剂盒, 其特征在于：

（1）所述RNA提取试剂包括：Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇；

（2）所述RT反应试剂包括：5×buffer缓冲液、dNTPs、HIR和FMDV-Id；

（3）所述PCR反应试剂包括：Taq DNA酶、10×buffer缓冲液、dNTPs、MgCl₂和cDNA；

（4）所述阴性对照包括：DEPC水；

（5）所述阳性对照包括：口蹄疫亚洲I型全病毒。