JP2010517556A - ヒトパピローマウイルスの検出 - Google Patents
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Abstract
(a)ヒトパピローマウイルスL1遺伝子又は相補体の一部の増幅を促進するのに適した条件下で、前記試料を、前記ヒトパピローマウイルスL1遺伝子又はその相補体の標的部位に結合するフォワードオリゴヌクレオチドプライマー及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることによりアンプリコンを作製すること;(b)前記アンプリコンを、前記アンプリコン内の標的部位に結合するプローブと接触させること;及び(c)前記プローブと前記アンプリコンの結合を検出することを含み、前記フォワードプライマーが配列番号1の配列を有する標的部位に結合し、前記リバースプライマーが配列番号2の配列を有する標的部位に結合する方法が提供される。
Description
[実施例]
オリゴヌクレオチドのLuminexマイクロスフェアへのコンジュゲーション
冷蔵庫から試薬(0.1%SDS、Tween 20及び0.1M MES)を取り出し、室温に適合させる。チューブ上の「nmol」濃度に等しい容量の製薬純水を添加することにより凍結乾燥したプローブを再懸濁し、1mMの保存濃度を与える。ビーズセットを選択し、ペレットを分散させ、超音波処理し、1分間ボルテックスする。5.0×106ビーズ(総量1.25×107のうち)を1.5mlチューブに分散させる(1ml総量のうち400μlに相当する)。チューブにプローブID及びLuminexビーズ領域ID、例えばHPV16[01]を貼ることに留意されたい。新しいプローブを試験するために、150μlのビーズストックを使用し、最終再懸濁液のために300μlの0.1M MESを添加する。10,000rpmで1分間遠心分離にかけ、次に、ビーズを除去しないように注意して上澄みを除去する。50μlの0.1M MESを添加し、ボルテックスして、超音波処理する。
0.1M MES:4.88gのMES(2[N-Morpholino] Ethanesulphonic acid)を250mlのSigma水に添加し、次にほぼ5滴の5NのNaOHを添加することによりpHを4.5に調整し、ろ過滅菌する。
0.02%Tween 20:50μlのTween 20を250mlのSigma水に添加し、次にろ過滅菌する。
0.1%SDS:2.5mlのSDS(ラウリル硫酸10%溶液)を250mlのSigma水に添加し、ろ過滅菌する。
一反応用のPCRマスター混合(45μl)を、Qiagen Hot Start PCRキットを使用して以下の通りに作製する。
・PCRプレート又はチューブを、以下のサイクリングパラメータで熱循環装置にセットする:95℃/15分に続いて8サイクルの95℃/30秒、54℃/1分及び72℃/45秒、確実にアニーリング温度は各サイクルで1.5℃下がるようにする。これに続いて、35サイクルの95℃/30秒、42℃/1分、72℃/45秒、さらに72℃/7分の最終伸長、その後4℃で保持する。
・2%アガロースゲルを使用した電気泳動ステップを含めて、PCRアンプリコンサイズ及びバンド強度を確認してもよい。
1.1.5×TMACで複数分析物(ビーズ)溶液を用意する(添加する各ビーズセットの容積は、以前計算したμlあたりのビーズの濃度に基づく)。
2.12μl TE緩衝液をPCRプレート(Millipore社製)に、5μlビオチン標識PCR産物及び33μlのビーズ調製物を各ウェルに添加する。確実に産物とビーズ溶液が十分混ざり合うようにする。
3.プレートを以下のパラメータでプログラムされた熱循環装置に移す:95℃/5分に続いて53℃を15分。サイクルが進行している間、Luminexゴールドブロックを−20℃冷凍庫に移す。
4.プレートを熱循環装置から取り出し、冷却ブロックに移して1分間「スナップ冷凍する」。プレートをブロックから取り出し、2250×g/3分で遠心分離し、プレートを反転させることによって液体を吸引し、ビーズを1つも失わないように注意して80×g/20秒で穏やかに遠心分離する。ゴールドブロックを53℃まで加熱するように設定されたBioPlex/Luminex機器に移す。
5.ストレプトアビジン−R−フィコエリトリン(S−PE)コンジュゲートを1×TMACで1:1000に希釈する(ウェルの数に75μlを掛けることにより準備する容量を計算する)。
6.70μlの1:1000希釈S−PEを添加し、プレートを20秒間振動させることによりビーズを再懸濁し、その後熱循環装置に戻して、さらに5分間53℃でインキュべートする。
7.プレートを熱循環装置から取り出し、BioPlex/Luminex機器中の予熱されたブロックに移す。BioPlex/Luminex機器で読み取る。
1.確実にレーザーを使用前に予熱しておくようにする。機械にすでに30分以上スイッチが入っている場合は、これはすでに自動的に実行されている。前もって実行されていない場合は、「始動」オプションを選択する。機械は、MCVプレートでの滅菌水及び70%イソプロパノールの位置決めを指示する。「始動」プロセスは約4分かかる。
2.メニューからオプション「オープンプロトコル」を選択し、ファイルHPVを開く。メニューから、オプション「分析物を選択する」及びアッセイにおいて試験中の分析物、すなわち16、18等を「添加する」を選ぶ。
3.X(=未知)をクリックし、カーソルを試験中のウェル上にドラッグすることにより鋳型を定義する。適切な数の「B」として示される空白ウェルを含める。
4.メニュー上の「イジェクト/リトラクト」ボタンを使用してマイクロタイタープレートを挿入し、「ラン」ボタンを押す。機器は試料ごとのビーズ/プローブごとに一連の平均蛍光強度(MFI)値を計算する。
5.機器が読み取りを終えたら、オプションを選択してデータを解析のためにエクセルファイルに移す。
1.アッセイのためのカットオフを1500MFIに設定し、試験を繰り返すべき「グレーゾーン」は1500と2000MFI間である。
2.確実に「空白」ウェル中のMFI値すべてが<1000であるようにする。
3.試料中に存在するいかなるHPV遺伝子型(複数可)もMFI値>2000MFIを与える。
Claims (79)
- 試料中のヒトパピローマウイルス核酸を検出するインビトロ方法であって、
(i)ヒトパピローマウイルスL1遺伝子又は相補体の一部の増幅を促進するのに適した条件下で、前記試料を、前記ヒトパピローマウイルスL1遺伝子又はその相補体中の標的部位に結合するフォワードオリゴヌクレオチドプライマー及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることによりアンプリコンを作製すること;
(ii)前記アンプリコンを、前記アンプリコン内の標的部位に結合するプローブと接触させること;及び
(iii)前記プローブと前記アンプリコンの結合を検出することを含み、
前記フォワードプライマーが配列番号1の配列を有する標的部位に結合し、
前記リバースプライマーが配列番号2の配列を有する標的部位に結合する方法。 - フォワードプライマーが、配列番号3の配列を有する核酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- フォワードプライマーが、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7又は配列番号8から選択される核酸配列と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも97%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項2に記載の方法。
- フォワードプライマーが、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7又は配列番号8から選択される核酸配列からなる、請求項3に記載の方法。
- リバースプライマーが、配列番号9の配列を有する核酸配列を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- リバースプライマーが、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又は配列番号14から選択される核酸配列と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも97%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項5に記載の方法。
- リバースプライマーが、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又は配列番号14から選択される核酸配列からなる、請求項6に記載の方法。
- アンプリコンが少なくとも175ヌクレオチド長であり、最大250ヌクレオチド長である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 試料を、ヒトパピローマウイルスL1遺伝子又はその相補体中の標的部位に結合する、少なくとも2つの異なるフォワードプライマー及び少なくとも2つの異なるリバースプライマーと接触させることを含む、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- フォワードプライマーのそれぞれが、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7又は配列番号8から選択される異なる核酸配列からなり、リバースプライマーのそれぞれが、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又は配列番号14から選択される異なる核酸配列からなる、請求項9に記載の方法。
- フォワードプライマーが配列番号4及び5から選択され、リバースプライマーが配列番号10及び11から選択される、請求項10に記載の方法。
- プローブが、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33及び配列番号34から選択される核酸配列と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- プローブが、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33及び配列番号34の核酸配列と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列からなる、請求項12に記載の方法。
- プローブが固体担体又はプラットホーム上に固定化されている、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- プローブがビーズ又はマイクロスフェア上に固定化されている、請求項14に記載の方法。
- 試料を、アンプリコン内の標的部位に結合し、それぞれが異なる核酸配列を含む少なくとも2つの異なるプローブと接触させること、及び前記アンプリコンと前記プローブとの結合を検出することを含む、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- プローブのそれぞれが、
(a)配列番号15と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(b)配列番号16と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(c)配列番号17と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(d)配列番号18と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(e)配列番号19と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(f)配列番号20と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(g)配列番号21と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(h)配列番号22と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(i)配列番号23と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(j)配列番号24と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(k)配列番号25と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(l)配列番号26と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(m)配列番号27と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(n)配列番号28と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(o)配列番号29と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(p)配列番号30と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(q)配列番号31と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(r)配列番号32と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(s)配列番号33と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(t)配列番号34と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列
からなる群から選択される異なる核酸配列を含む、請求項16に記載の方法。 - 試料を異なるプローブのうちの少なくとも4つと接触させることを含む、請求項16又は17に記載の方法。
- プローブのそれぞれが、配列番号15、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18から選択される異なる核酸配列からなる、請求項18に記載の方法。
- それぞれの異なるプローブが、異なる固体担体又はプラットホーム上に固定化されている、請求項14〜19のいずれかに記載の方法。
- 異なる固体担体又はプラットホームが、一意的に同定可能なビーズ又はマイクロスフェアである、請求項20に記載の方法。
- アンプリコンと異なる固定化プローブの結合に続いて、ビーズ又はマイクロスフェアをその一意的な同定に従ってソーティングすることをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- アンプリコンを、蛍光分子等の検出可能な分子を含み、前記アンプリコンに結合するレポーター構築物と接触させることを含む、請求項1〜22のいずれかに記載の方法。
- フォワード及び/又はリバースプライマーが標識を含み、増幅ステップが前記標識をアンプリコンに組み込むステップを含む、請求項1〜22のいずれかに記載の方法。
- 標識が蛍光分子等の検出可能な分子を含む、請求項24に記載の方法。
- 標識がビオチン等の第1の結合分子を含む、請求項24に記載の方法。
- 第1の結合分子を、第1の結合分子に結合する第2の結合分子を含み、蛍光分子等の検出可能な分子を含むレポーター構築物と接触させることをさらに含む、請求項26に記載の方法。
- 試料中のヒトパピローマウイルス核酸を検出するインビトロ方法であって、
(i)前記試料を、ヒトパピローマウイルスL1遺伝子又はその相補体内の標的部位に結合する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブと接触させること;及び
(ii)前記プローブと前記標的部位との結合を検出することを含み、
前記プローブが、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33及び配列番号34から選択される核酸配列と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列を含む、方法。 - プローブが、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33及び配列番号34から選択される核酸配列と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列からなる、請求項28に記載の方法。
- プローブが固体担体又はプラットホーム上に固定化されている、請求項28又は29に記載の方法。
- プローブがビーズ又はマイクロスフェア上に固定化されている、請求項30に記載の方法。
- 試料を、ヒトパピローマウイルスL1遺伝子又はその相補体内の標的部位に結合し、それぞれが異なる核酸配列を含む少なくとも2つの異なるプローブと接触させること、及び前記プローブと前記標的部位との結合を検出することを含む、請求項28〜31のいずれかに記載の方法。
- プローブのそれぞれが、
(a)配列番号15と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(b)配列番号16と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(c)配列番号17と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(d)配列番号18と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(e)配列番号19と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(f)配列番号20と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(g)配列番号21と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(h)配列番号22と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(i)配列番号23と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(j)配列番号24と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(k)配列番号25と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(l)配列番号26と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(m)配列番号27と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(n)配列番号28と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(o)配列番号29と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(p)配列番号30と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(q)配列番号31と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(r)配列番号32と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(s)配列番号33と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;及び
(t)配列番号34と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列
からなる群から選択される異なる核酸配列を含む、請求項32に記載の方法。 - 試料を異なるプローブのうちの少なくとも4つと接触させることを含む、請求項32又は33に記載の方法。
- プローブのそれぞれが、配列番号15、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18から選択される異なる核酸配列からなる、請求項34に記載の方法。
- それぞれの異なるプローブが、異なる固体担体又はプラットホーム上に固定化されている、請求項32〜35のいずれかに記載の方法。
- 異なる固体担体又はプラットホームが、一意的に同定可能なビーズ又はマイクロスフェアである、請求項36に記載の方法。
- プローブと標的部位の結合に続いて、ビーズ又はマイクロスフェアをその一意的な同定に従ってソーティングすることをさらに含む、請求項37に記載の方法。
- プローブと標的部位の結合に続いて、前記結合ヒトパピローマウイルス核酸を、蛍光分子等の検出可能な分子を含み、前記ヒトパピローマウイルス核酸に結合するレポーター構築物と接触させることをさらに含む、請求項28〜38のいずれかに記載の方法。
- 結合ヒトパピローマウイルス核酸が標識化されている、請求項28〜38のいずれかに記載の方法。
- 標識が、蛍光分子等の検出可能な分子を含む、請求項40に記載の方法。
- 標識が、ビオチン等の第1の結合分子を含む、請求項40に記載の方法。
- 第1の結合分子を、第1の結合分子に結合する第2の結合分子を含み、蛍光分子等の検出可能な分子を含むレポーター構築物と接触させることを含む、請求項42に記載の方法。
- 試料を少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブと接触させる前に、ヒトパピローマウイルス核酸を増幅し、それによりヒトパピローマウイルスL1遺伝子又はその相補体内のプローブの標的部位を含むアンプリコンを作製するステップをさらに含む、請求項28〜43のいずれかに記載の方法。
- 増幅ステップが、フォワードオリゴヌクレオチドプライマー及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施され、前記フォワードプライマーが配列番号1の配列を有する標的部位に結合し、前記リバースプライマーが配列番号2の配列を有する標的部位に結合する、請求項44に記載の方法。
- フォワードプライマーが配列番号3の配列を有する核酸配列を含む、請求項45に記載の方法。
- フォワードプライマーが、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7又は配列番号8から選択される核酸配列と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも97%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項45に記載の方法。
- リバースプライマーが、配列番号9の配列を有する核酸配列を含む、請求項44〜47のいずれかに記載の方法。
- リバースプライマーが、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又は配列番号14の核酸配列と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも97%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項44〜47のいずれかに記載の方法。
- フォワードプライマー及び/又はリバースプライマーが標識を含み、増幅ステップが前記標識をアンプリコンに組み込むステップを含む、請求項44〜49のいずれかに記載の方法。
- 標識が、蛍光分子等の検出可能な分子、又はビオチン等の結合分子を含む、請求項50に記載の方法。
- 対象試料中のヒトパピローマウイルス病原体負荷を定量するインビトロ方法であって、
(a)前記対象試料に対して請求項1〜51のいずれかに記載の方法を実施すること;及び
(b)所定の既知ヒトパピローマウイルス病原体負荷の試験試料に対して請求項1〜51のいずれかに記載の方法を実施すること;及び
(c)対象試料から検出されるシグナルを試験試料から検出されるシグナルと比較することを含み、
それにより対象試料中のヒトパピローマウイルス病原体負荷を定量する方法。 - 薬物療法の期間の経過にわたって薬物の有効性を判定するインビトロ方法であって、
(a)薬物療法の期間内の又は先立つ最初の時点で得られる最初の試料に対して請求項1〜51のいずれかに記載の方法を実施すること;
(b)薬物療法の期間内の又は後の1又は複数の後の時点で得られる1又は複数の後期試料に対して請求項1〜51のいずれかに記載の方法を実施すること;及び
(c)最初の試料から検出されるシグナルを、前記1又は複数の後期試料から検出されるシグナルと比較することを含み、
それにより薬物療法の期間の経過にわたって薬物の有効性を判定する方法。 - 薬物療法がワクチン療法である、請求項53に記載の方法。
- 試料中のヒトパピローマウイルスを分類するインビトロ方法であって、
(a)試料に対して請求項1〜51のいずれかに記載の方法を実施すること;及び
(b)ヒトパピローマウイルス核酸に結合しているプローブ又は複数のプローブを同定すること
を含む方法。 - 請求項1〜55のいずれかに記載の方法において使用するためのプローブであって、ヒトパピローマウイルスL1遺伝子又はその相補体内の標的配列に結合し、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33及び配列番号34から選択される核酸配列と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列を含む、プローブ。
- 配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33及び配列番号34の核酸配列と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列からなる、請求項56に記載のプローブ。
- 固体担体又はプラットホーム上に固定化されている、請求項56又は請求項57に記載のプローブ。
- ビーズ又はマイクロスフェア上に固定化されている、請求項58に記載のプローブ。
- 請求項1〜55のいずれかに記載の方法において使用するための少なくとも2つの異なるプローブのセットであって、前記プローブがヒトパピローマウイルスL1遺伝子又はその相補体中の標的部位に結合し、前記プローブのそれぞれが、
(a)配列番号15と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(b)配列番号16と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(c)配列番号17と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(d)配列番号18と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(e)配列番号19と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(f)配列番号20と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(g)配列番号21と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(h)配列番号22と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(i)配列番号23と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(j)配列番号24と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(k)配列番号25と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(l)配列番号26と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(m)配列番号27と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(n)配列番号28と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(o)配列番号29と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(p)配列番号30と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(q)配列番号31と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(r)配列番号32と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(s)配列番号33と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列;及び
(t)配列番号34と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列
から選択される異なる核酸配列を含む、
プローブのセット。 - 異なるプローブのうちの少なくとも4つを含む、請求項60に記載のプローブのセット。
- プローブのそれぞれが、配列番号15、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18から選択される異なる核酸配列からなる、請求項61に記載のプローブのセット。
- それぞれの異なるプローブが、異なる固体担体又はプラットホーム上に固定化されている、請求項60〜62のいずれかに記載のプローブのセット。
- 異なる固体担体又はプラットホームが、一意的に同定可能なビーズ又はマイクロスフェアである、請求項63に記載のプローブのセット。
- 請求項1〜55のいずれかに記載の方法において使用するためのプライマーセットであって、ヒトパピローマウイルスL1遺伝子又はその相補体中の標的部位に結合するフォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーが配列番号1の配列を有する標的部位に結合し、前記リバースプライマーが配列番号2の配列を有する標的部位に結合する、プライマーセット。
- フォワードプライマーが、配列番号3の配列を有する核酸配列を含む、請求項65に記載のプライマーセット。
- フォワードプライマーが、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7又は配列番号8から選択される核酸配列と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも97%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項65に記載のプライマーセット。
- リバースプライマーが配列番号9の配列を有する核酸配列を含む、請求項65〜67のいずれかに記載のプライマーセット。
- リバースプライマーが、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又は配列番号14から選択される核酸配列と少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも97%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項65〜67のいずれかに記載のプライマーセット。
- リバースプライマーが標識を含む、請求項65〜69のいずれかに記載のプライマーセット。
- 請求項56〜59に記載のプローブ又は請求項60〜64に記載のプローブセットを含む、請求項1〜55のいずれかに記載の方法において使用するためのキット。
- ヒトパピローマウイルスL1遺伝子又はその相補体中の標的部位に結合し、配列番号3の配列を有する核酸配列を含むフォワードプライマーをさらに含む、請求項71に記載のキット。
- ヒトパピローマウイルスL1遺伝子又はその相補体中の標的部位に結合し、配列番号9の配列を有する核酸配列を含むリバースプライマーをさらに含む、請求項71又は72に記載のキット。
- 請求項65〜70のいずれかに記載のプライマーセットをさらに含む、請求項71に記載のキット。
- 実質的に以上に記載の、試料中のヒトパピローマウイルスL1遺伝子を検出するインビトロ方法。
- 実質的に本明細書に記載のプローブ。
- 実質的に本明細書に記載のプローブのセット。
- 実質的に本明細書に記載のプライマーセット。
- 実質的に本明細書に記載のキット。
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