JP5651029B2

JP5651029B2 - 発がん性ヒトパピローマウイルス遺伝子型を同定するための混合プライマーセット及び同定方法

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Publication number: JP5651029B2
Application number: JP2011017808A
Authority: JP
Inventors: 邦明成澤
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Priority date: 2010-09-09
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2031-01-31
Also published as: JP2012075437A

Description

本発明は我が国の子宮頸癌の主たる原因であるHPV遺伝子型（１６，１８，
３１，３３，３５，５２，５８型）を同定するための特異的プライマーセット及び我が国では頻度は少ないが高リスクHPVに分類されているHPV（３９，４５，５１，５６，５９，６８型）の感染の有無を判定するプライマーセットを提示する。これを用いたマルチプレックスPCR法によるHPV遺伝子型の同定法は、高感度で且つ特異的であり、簡便で安価な方法である。

HPVは、8000bp弱の環状2本鎖ゲノムDNAを持ち、今日まで100以上のHPV遺伝子型が同定されている。

子宮頚癌は、女性では２番目に多い悪性腫瘍であるが、HPVはこの子宮頚癌の原因ウイルスであることが知られている。

HPV遺伝子型を検出することは、前癌病変や子宮頚癌の予後に必要不可欠である。HPV遺伝子型は、その感染によって導かれた子宮頸部の高度異形成や癌への成り易さから、高リスク型、中間型および低リスク型に分けられている。

これまで世界的には、１３種類が高リスク型に分類されている（非特許文献１）。即ち、HPV１６，１８、３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，
５６，５８，５９，６８型である。

１３種類の高リスク型HPVの感染は必ずしも癌への進展リスクが同一ではないので、すべての高リスクHPV型を同一視することは行き過ぎた管理になる可能性がある。

我が国の子宮頚癌から検出されるHPV遺伝子型は約９５％が１６，１８，
５２，５８，３３，３１，３５型であり（非特許文献２、非特許文献３）、その遺伝子型の型別診断法を開発することによって、我が国に合ったリスク別の管理が可能になる。

HPV遺伝子検査の方法には、HPVのDNAを直接検査するハイブリッドキャプチャー法（HC2）とポリメラーゼ連鎖反応（PCR）でHPVのDNAを増幅した後に検出する幾つかの方法がある。

HC2試験（市販、Digene Corporation社）は、DNA/RNAハイブリダイゼーションアッセイで、DNAの増幅を伴わない。ターゲットDNAと１３種類の高リスク型HPVのRNAプローブとをハイブリダイゼーションし、そのハイブリッド量を化学発光により検出する方法である。

HC２は簡便な方法であり、米国FDAにより認可された唯一の方法である。使用目的は高リスク・低リスクHPVの存在を判定するものであり、各遺伝子型を同定することは出来ない。

PCRを利用する方法には、高リスク型HPVの１３種類を一括検出する方法と各遺伝子型を型別同定する方法がある。

Amplicor HPV試験（市販、Roche Molecular Systems社）は、PCRで標的DNAを増幅し、１３種類の型特異的プローブとハイブリダイズし、比色酵素免疫測定法で検出する方法である。Amplicor HPV試験はHC2試験に比し、感度が高いがHC2と同様１３種類のHPVの検出を一括して行い、各遺伝子型を同定することは出来ない。また、ビオチン化プライマ−やBSA 結合DNA プローブが必要であり、高価である。

PCRを利用する方法で、遺伝子型を同定する方法には、(a) PCRで増幅後アンプリコンを制限酵素で切断し電気泳動で同定する方法(市販、タカラバイオ（株）)、(b) 型特異的プローブを固定したDNAアレイを用いて、ラベルしたアンプリコンとハイブリダイズさせシグナルを検出する方法（特許文献１）、及びマイクロタイタープレートでのハイブリダイゼーション法（特許文献２）、 (c) 型特異的プライマー及び検出プローブを用いたリアルタイムマルチプレックスPCRによるHPV検出法（特許文献３）、(d) HPV遺伝子型毎にアンプリコンの長さが異なるように設計された型特異的プライマーを用いてマルチプレックスPCRを行い、電気泳動で遺伝子型を同定する法（特許文献４）がある。

前項の(a)の制限酵素法は検出感度がそれほど高くなく、複数の制限酵素を用い、電気泳動を行うので、作業は煩雑である。感染した遺伝子型を完全に同定することは出来ない。

(b)のハイブリダイゼーション法は検出感度や同定の特異性が高いが、工程に時間が掛かり、しかも、チップの作成のコストやプライマー又はプローブを標識しなければならないので高価である。

(c)のリアルタイムマルチプレックスPCR法は、シングルチューブアッセイで少なくとも１３種の高リスクHPVを検出出来るが、HPV遺伝子型の同定に各々の型特異的ビーコンプローブが必要であり、高価である。

(d)のマルチプレックスPCR法は、型特異的プライマーの設計さえよければ、極めて簡便で、安価な方法である。特許文献４の方法は、１７種類のHPVを同時に特異的に検出すると報告されている。この方法は電気泳動でアンプリコンのサイズによって遺伝子型の同定を行うため、型毎のサイズの違いが十分なければならない。臨床検体中のHPVの遺伝子型を同定するに際して、１７種類のHPV及び内部標準、外部標準のアンプリコンをサイズの違いのみで判別することは、各アンプリコンの長さがお互いに近接しているものがあり、判断に苦しむものが含まれる。例えば、３３型と５８型の区別、３９型と５６型の区別、１８型と４５型の区別、５１型と４５型の区別、１８型と５９型の区別、３９型と３１型の複合感染と１６型感染の区別が困難になり、正確な型別判定が出来ない危険がある。

Seegene Inc.（韓国）から販売されているHPV4A ACE Screeningは１６型、１８型、HRC (その他の高リスク型１６種類）、LRC (低リスク型２種類）をDPOマルチプレックスPCR法で検出する方法である。簡便で安価な方法であるが、
１６型、１８型以外の遺伝子型の型別検査が出来ない。

特表２００８−５２４９８３

特開２００５−５１９６１１

特表２００９−５３３０３０

特開２００６−３４５８００

Bosch FX. et al, J Natl Cancer Inst 87, 796-802, 1995

Miura S. et al, Int.J.Cancer 119, 2713-2715, 2006

Onuki M, et al, Cancer Sci 100, 1312-1316, 2009

Wang X. et al, BMC Cancer 10:19, 2010

本発明は、我が国の子宮頸癌の主たる原因である７種類のHPV遺伝子型（１６，１８，３１，３３，３５，５２，５８型）の型別検査を行い、その他の頻度の低い６種類のHPVは、A群とB群に分け、４５，５１，６８型をA群とし、３９型、５６型、５９型をB群として、一括して感染の有無を判定する。本発明は頻度の高い７種類の型別判定と頻度の低いA群及びB群を１チューブでマルチプレックスPCR法を行うことにより、高感度で且つ特異的に検出し、しかも、簡便で安価な方法を提供することを目的とする。課題は、第一に目的を解決するためのPCRプライマーセットの提供であり、第二にこれらのプライマーセットを混合して、１チューブでPCRを行うマルチプレックスPCRを行い、生成されたアンプリコンを電気泳動で分離同定する工程を提供することである。

本発明は、子宮頸癌の主たる原因である１３種類のPCRプライマーセットを提供する。型別検査を行うための７種類のプラマーセット及びA群、B群のプライマーセットは、アンプリコン（増幅されたPCR産物）の長さがお互いに十分違うように設計される。これらのすべてのプライマーを混合してマルチプレックスPCRを行い、アンプリコンを電気泳動で検出する。各プライマーの塩基配列は下記の表１に示される。配列番号１３及び１４は非特許文献４で公表されたものである。

本発明に係る混合プライマーセットは配列番号１及び配列番号２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２、配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット３、配列番号７及び配列番号８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット４、配列番号９及び配列番号１０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット５、配列番号１１及び配列番号１２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット６、配列番号１３及び配列番号１４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット７、配列番号１５及び配列番号１６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット８、配列番号１７及び配列番号１８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット９、配列番号１９及び配列番号２０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１０、配列番号２１及び配列番号２２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１１、配列番号２３及び配列番号２４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１２、並びに、配列番号２５及び配列番号２６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１３、を含む混合プライマーセットから成る。

各プライマーの設計は、複数のプライマーセットを混合して用いることから、お互いにプライマーダイマーを生じ難いように、又相同性の高いHPVの複数の遺伝型を特異的に同定でき、しかも、非特異的増幅が起きないように設計する必要がある。

マルチプレックスPCR法による遺伝子検査では、アンプリコン（PCR産物）のサイズによって遺伝子型を同定するため、各プライマーセットによって出来るアンプリコンのサイズを変えて設計しなければならない。本発明によるアンプリコンのサイズは、プライマーセット１で536bp、プライマーセット２で427bp、プライマーセット３で132bp、プライマーセット４で249bp、プライマーセット５で633bp、プライマーセット６で332bpである。また、プライマーセット７は385bpである。プライマーセット８，９，１０は166〜181bpであり（A群）、プライマーセット１１，１２，１３は481〜490bpである（B群）。
（参照図１）

本発明に従えば、１３種類のプライマーセットを混合して用いて、７種類のHPV遺伝子型を特異的に検出し、６種類のHPV型を一括検出することが出来る。

高リスクHPVには遺伝子型によって癌病変への進行が早いものと遅いものが含まれる。従って、癌への成り易さを知るにはHPV型別検査が必要である。
本発明では、臨床検体（組織試料、生検、スメア等）を用いて、我が国の子宮頚癌に関連する７種類のHPVを特異的且つ高感度で、しかも迅速かつ簡便に検出することが出来る。加えて、我が国の子宮頚癌の約５％に検出されるに過ぎない“その他の高リスク群”（３９，４５，５１，５６，５９，６８）に対しても、一括して検出するプライマーセットを加えることにより、陽性か否かの判定が出来る。即ち、１本のチューブで７種の型別同定と６種類の“その他高リスク型群”の検出が可能である。これを子宮頚癌の健診に使用すれば、一人ひとりに見合った検診スケジュールをたてることが出来る。これによって、被験者への過度の精神的苦痛を減らし、経済的負担を軽減することが出来るなど適切な子宮頚癌の発症予防に資することが出来る。

混合プライマーセット、混合テンプレート、QIAGEN Multiplex PCR Kitを使用した時のアンプリコンのエレクトロフェログラム（MultiNAにより分析）。臨床検体のアンプリコンのエレクトロフェログラム。HPV16型の感染を示す。臨床検体のアンプリコンのエレクトロフェログラム。HPV18型の感染を示す。臨床検体のアンプリコンのエレクトロフェログラム。HPV31型の感染を示す。臨床検体のアンプリコンのエレクトロフェログラム。HPV33型とHPV58型の複合感染を示す。臨床検体のアンプリコンのエレクトロフェログラム。HPV35型の感染を示す。臨床検体のアンプリコンのエレクトロフェログラム。HPV52型の感染を示す。臨床検体のアンプリコンのエレクトロフェログラム。HPV A群の感染を示す。臨床検体のアンプリコンのエレクトロフェログラム。HPV16型とHPV B群の複合感染を示す。臨床検体のアンプリコンのエレクトロフェログラム。HPV31型、HPV58型及びHPV16型の複合感染を示す。

本発明のプライマーセットのオリゴヌクレオチドは汎用のDNA合成装置を用いて化学的に合成することができる。

検体におけるHPV遺伝子の存在を検出するためには、検体からDNAを抽出し、これをテンプレートとして、本発明のプライマーセットを用いてマルチプレックスPCRを行い、HPV遺伝子を増幅させる。増幅したHPV遺伝子断片を電気泳動で分離し、同定する。検体としては被験者から得られた組織試料、生検、スメア等を用いることができる。

検体からのDNA抽出は市販の抽出試薬を用いてもよい。

臨床検体から調整したDNA量は検体毎のバラツキがあるため内部標準としてβグロビンのゲノム領域を用いる（PCR産物のサイズ 196bp）。

検体から調整したDNAをテンプレートとし、HPV１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、５２型、５８型、４５型、５１型、６８型、３９型、５６型、５９型の１３種類のプライマーセットとβグロビンのプライマーセットをミックスし（“混合プライマーセット”と云う）、これをプライマーとしてマルチプレックスPCRを行う。各々のプライマー濃度はHPV型によって適宜に調節することができる。

マルチプレックスPCRはQIAGEN Multiplex PCR Kit（Qiagen社)を用いて行うことができる。PCRの反応条件は95℃で15分間、次に95℃で30秒間、60℃で1.5分間、72℃で1分間を30サイクル、最後に72℃で2分間である。

アンプリコンを電気泳動で分離し、バンドの長さを判定することによ
り、試料中に存在するHPV型を知ることができる。

電気泳動に、マイクロチップ電気泳動（MCE-202MultiNA、島津製作所製）を使用することが出来る。

プライマーの設計に必要なHPVの遺伝子配列はGenBankから入手した。
各HPV遺伝子の配列に基づいて、以下の基準を満たすプライマーを設計した。融解温度が60〜63℃の範囲にある、PCR産物のサイズが132〜589 bpの範囲内にある、他の種類のHPVと有意なホモロジーを有しない、
self - complementarityがない、プライマー同士がハイブリダイズしない。

HPV１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６８型、βグロビンのゲノムを含むサンプル（“混合テンプレート”と云う）をテンプレートとして、混合プライマーセットを用いてマルチプレックスPCRを行うと、HPV１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、５２型、５８型のピークとA群、B群のピーク、βグロビンのピークの１０種のピークが同定可能である（図１）。アンプリコンはシークエンス解析で目的の型のHPV遺伝子の配列であることを確認した。

市販のHPV4A ACE Screening法（Seegen Inc. 韓国）は、HPV testのゴールドスタンダードと云われているHC2試験（Digene Corporation）と同等の精度および感度を持っていると報告されている（Hong J.H.,et al, J Korean Med Sci 2009,24:579-84）。表２は臨床検体を用いて、本発明のマルチプレックスPCR法とHPV4A ACE Screening法での結果を比較したものである。本発明の方法は、各型ともHPV4A ACE Screeningと同等の感度を示している。

Claims

（１）配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセット１、
（２）配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号４の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセット２、
（３）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号６の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセット３、
（４）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号７の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号８の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセット４、
（５）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号１０の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセット５、
（６）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号１１の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号１２の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセット６、
（７）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号１４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号１４の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセット７、
（８）配列番号１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号１５の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号１６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号１６の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセット８、
（９）配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号１８の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセット９、
（１０）配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号１９の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号２０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号２０の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセット１０、
（１１）配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号２１の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号２２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号２２の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセット１１、
（１２）配列番号２３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号２３の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号２４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号２４の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセット１２、及び、
（１３）配列番号２５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号２５の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号２６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は配列番号２６の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセット１３、を含む混合プライマーセット。
検体から抽出したＤＮＡをテンプレートとして、請求項１記載の混合プライマーセットを用いて１チューブでマルチプレックスPCRを行い、増幅した遺伝子断片を電気泳動で分離同定する方法。