CN105063230B - 一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：引物、2倍环介导等温扩增反应缓冲液、阳性对照、阴性对照、DNA聚合酶、逆转录酶和显色剂，所述的引物由一对外引物、一对内引物和一组环引物组成。本发明通过加入环引物显著提升反应速率，与PCR技术相比，检测时间减少约50%，在检测成本方面也较PCR明显减少。

Description

一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒 及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速定性检测人类前列腺癌特异性基因PCA3的试剂盒及其应用。
背景技术
前列腺癌（Prostate cancer，Pca）是常见的泌尿系恶性肿瘤，据美国肿瘤学会报道，Pca在美国的发病率已经超过肺癌成为第一位，死亡率也高居第2。随着生活节奏的加快和饮食结构的西化，在我国及其他亚洲国家，Pca的发病率也在逐年升高，且发病年龄也趋于年轻化。早期诊断Pca可通过根治性切除术彻底治愈。因此，早期诊断对Pca的治疗和患者的预后至关重要。
目前在临床上仍根据前列腺特异性抗原（PSA）是否异常，指导前列腺穿刺活检用来诊断Pca，具有一定的应用价值，但是血清PSA为前列腺特异性抗原，只具备组织特异性而不具备肿瘤特异性。前列腺增生、前列腺炎等良性病变也可使PSA表达升高，导致许多患者遭受了不必要的活检，暴露出PSA在Pca诊断中的局限性。因此，探寻敏感性及特异性更加优越的Pca肿瘤标志物，对提高Pca的早期诊断有着十分重要的意义。
PCA3被认为是Pca的特异性基因，研究表明其在前列腺癌组织中高度表达，在正常前列腺组织或者前列腺增生组织中无表达或低表达，在其他肿瘤组织及器官中也无表达。但由于PCA3基因为非编码基因，不表达为蛋白质，检测起来有一定难度。目前用于检测PCA3基因最常用的方法为核酸扩增技术（PCR），虽然扩增结果稳定可靠，但检测时程长，成本较高，操作繁琐，不利于缺少技术设备的基层单位进行检测。
环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新型的核酸扩增方法，它采用4条特异性引物及1条环引物识别靶基因，其可在等温条件下1小时可将目的序列扩增10^9倍以上。LAMP反应会产生大量的焦磷酸根离子，它们与LAMP反应体系中的镁离子（Mg2+）结合产生焦磷酸镁沉淀，引起浊度变化，十分便于观察，且整个扩增过程只需要一台水浴锅，大大加快了扩增进程并节省了实验成本。如在LAMP反应体系中加入钙黄绿素（一种荧光指示剂），那么在反应结束后会产生黄绿色荧光。不仅如此，随着LAMP技术的逐渐发展，实时浊度检测仪器也于今年来问世，将配置好的LAMP反应体系置于浊度仪上进行反应可实时观测浊度曲线，了解反应进程。
目前，公开的试剂盒反应体系不够稳定，不利于检测结果的快速获取且假阳性结果较多，因此使得该试剂盒的商业使用受到了限制。
发明内容
本发明通过设计合适的引物并优化检测条件，提供一种快速、定性检测人类前列腺癌特异性基因PCA3的试剂盒。该试剂盒包括以下试剂：引物、2倍环介导等温扩增反应缓冲液、阳性对照、阴性对照、DNA聚合酶、逆转录酶和显色剂，所述的引物由一对外引物、一对内引物和一组环引物组成，所述的引物序列如下：
F3(外引物)：TGGATATTTATTTGAACGGGAT；
B3(外引物)：AACGCACAGTTTAGGCAG；
LB(环引物)：GGGAGGAGATAACCACGGG；
FIP(内引物)：AGCCATCAAGATTTTCTCGTCTGTTTTTGAAATGAAGTCACAAAGTGAG；
BIP(内引物)：TGCAACAAACAAAATGGAATACTGTAGAATCCTGACCCTCTGC。
上述各引物量浓度分别为： FIP/BIP 40μM、 F3/B3 5μM、LB 20μM。
本发明所述的2倍环介导等温扩增反应缓冲液（2×LAMP反应液）由40mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCL）、20mM氯化钾（KCL）、16mM硫酸镁（MgSO4）、20mM硫酸铵（（NH4）2S04) 1.6mM甜菜碱（Betaine）、2.8mM的dNTPs和0.2%质量百分浓度的吐温20（Tween20）组成。其中mM是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所含有溶质的摩尔数。
本发明的所述阳性对照可以由以下方法制备得到：按常规的Trizol法由前列腺癌组织中提取RNA，逆转录成cDNA之后，PCR法扩增包含等温扩增部分的一段序列，扩增结束经测序鉴定后，装入T载体克隆后抽提质粒DNA，测定DNA浓度，然后调整浓度为每微升10^6拷贝作为阳性对照。
本发明所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的BstDNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述逆转录酶采用鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶，活力为10个活性单位/微升；所述的阳性对照为含人前列腺癌特异性基因PCA3的cDNA样本；阴性对照为双蒸水；所述显色剂为钙黄绿素螯合剂，所述钙黄绿素螯合剂，为钙黄绿素与Mg2+的螯合物，是一种荧光指示剂。LAMP反应的副产物焦磷酸离子与镁离子结合释放钙黄绿素，发出黄绿色荧光。以上试剂均由上海生工生物技术公司提供。
本发明还提供一种检测人类前列腺癌特异性基因PCA3的方法，具体包括以下步骤：
（1）常规方法提取组织、血液或尿液中的RNA；
（2）配置扩增体系，每25ul扩增体系中，含有外引物1ul；内引物1ul，环引物1ul，2倍环介导等温扩增反应缓冲液12.5ul，BstDNA聚合酶0.9ul，鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶0.1ul，步骤（1）中RNA提取液1～5ul(具体用量根据提取物来源不同，组织来源1～2ul，血液、尿液来源4～5ul)，其余为去离子水及钙黄绿素显色剂（如采用实时浊度分析仪可不加）；63℃恒温反应1小时；
（3）反应结束后，可直接肉眼观察，反应管内液体变为黄绿色说明检测结果阳性；如采用实时浊度分析仪检测可直接观察反应扩增曲线，如有曲线记录则为阳性。
本发明的工作原理是：LAMP反应分为三步，即：起初反应物模板的合成、循环扩增阶段、延伸和再循环。环介导等温扩增反应过程是先由外引物扩增出内引物扩增所需要的模板，即起始反应物模板的合成；紧接着由内引物引导合成靶基因DNA片段，由于内引物扩增的DNA片段含有该引物5’端DNA片段的反向互补序列，因而这些反向互补序列之间通过杂交形成茎环结构另外一条内引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应，在扩增的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑铃状结构，根据LAMP反应的反应原理，一般扩增反应均在1小时的扩增时间内达到平台期，而如果反应开始的时间约晚就越容易造成一些中间产物相互反应，导致假阳性的产生，影响实验的准确性。为此，我们在哑铃状结构的5’末端的环状单链部分导入具有互补序列的环引物，可增加DNA合成的起点，可使反应开始的时间提升约20%，并在1小时该循环反应可使靶DNA累积到10^9拷贝，可通过荧光染料或实时浊度分析仪来观察扩增结果。
与现有技术相比，本发明通过加入环引物显著提升反应速率，平均反应开始时间为19.3min，而在之前的研究中未加入环引物平均反应开始时间为24.1min。在实验结果可靠性的比较中，加入环引物后假阳性结果明显减少。与PCR技术相比，检测时间减少约50%，在检测成本方面也较PCR明显减少。
附图说明
图1为自然灯光下各个样本的LAMP结果。
图2为各个样本的实时浊度仪扩增曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
如图所示。图1中1~6号管为前列腺癌患者标本经LAMP反应后的情况，可直观看出产生黄绿色荧光，而7~8号的良性前列腺增生患者无荧光产生。图2中1~5号扩增区域为前列腺癌患者血样，6~8号扩增区域为前列腺增生患者血样，平均的反应开始时间提升约20%。一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒，包括：引物、2倍环介导等温扩增反应缓冲液、阳性对照、阴性对照、DNA聚合酶、逆转录酶和显色剂；所述的引物是根据DNA序列数据库公布的人类PCA3基因序列设计的一对外引物、一对内引物及一组环引物，序列如下：
F3(外引物)：TGGATATTTATTTGAACGGGAT；
B3(外引物)：AACGCACAGTTTAGGCAG；
LB(环引物)：GGGAGGAGATAACCACGGG；
FIP(内引物)：AGCCATCAAGATTTTCTCGTCTGTTTTTGAAATGAAGTCACAAAGTGAG；
BIP(内引物)：TGCAACAAACAAAATGGAATACTGTAGAATCCTGACCCTCTGC。
上述各引物量浓度分别为： FIP/BIP 40μM、 F3/B3 5μM、LB 20μM。
本发明所述的2倍环介导等温扩增反应缓冲液（2×LAMP反应液）由40mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCL）、20mM氯化钾（KCL）、16mM硫酸镁（MgSO4）、20mM硫酸铵（（NH4）2S04) 1.6mM甜菜碱（Betaine）、2.8mM的dNTPs和0.2%质量百分浓度的吐温20（Tween20）组成。其中mM是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所含有溶质的摩尔数。
本发明还提供一种检测人类前列腺癌特异性基因PCA3的方法，具体包括以下步骤：
（1）常规方法提取组织、血液或尿液中的RNA；
（2）配置扩增体系，每25ul扩增体系中，含有外引物1ul；内引物1ul，环引物1ul，2倍环介导等温扩增反应缓冲液12.5ul，BstDNA聚合酶0.9ul，鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶0.1ul，步骤（1）中RNA提取液1～5ul(具体用量根据提取物来源不同，组织来源1～2ul，血液、尿液来源4～5ul)，其余为去离子水及钙黄绿素显色剂（如采用实时浊度分析仪可不加）；63℃恒温反应1小时；
（3）反应结束后，可直接肉眼观察，反应管内液体变为黄绿色说明检测结果阳性；如采用实时浊度分析仪检测可直接观察反应扩增曲线，如有曲线记录则为阳性。
实施例1：一种环介导等温扩增检测前列腺癌组织标本PCA3基因的方法，该方法
（1）肿瘤组织标本RNA提取
取新鲜手术切除前列腺癌组织标本，大小5mm×5mm×5mm，液氮隔夜保存后研钵中磨碎，采用Trizol试剂提取总RNA。
（2）逆转录—环介导等温反应体系（检测管）
2×LAMP反应液 12.5ul
一对外引物 1ul
一对内引物 1ul
一组环引物 1ul
RNA提取液（检测物） 2ul
鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶 0.1ul
钙黄绿素螯合剂 1ul
去离子水 补至25ul
（3）同样成分比例配置阳性及阴性对照反应体系
阳性对照反应体系
2×LAMP反应液 12.5ul
一对外引物 1ul
一对内引物 1ul
一组环引物 1ul
阳性对照cDNA溶液 2ul
鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶 0.1ul
钙黄绿素螯合剂 1ul
去离子水 补至25ul
阴性对照反应体系
2×LAMP反应液 12.5ul
一对外引物 1ul
一对内引物 1ul
一组环引物 1ul
阴性对照双蒸水 2ul
鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶 0.1ul
钙黄绿素螯合剂 1ul
去离子水 补至25ul
（4）恒温水浴或实时浊度仪中于63℃反应1小时。
（5）反应结束后肉眼观察反应管内颜色变化，变为黄绿色，说明检测结果阳性；用实时浊度仪可观察到浊度曲线。
实施例2：一种环介导等温扩增法检测外周血标本中PCA3基因表达的方法，该方法
（1）外周血标本RNA提取
抽取5ml静脉血用乙2胺四乙酸钠抗凝，于4℃用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，收集单个核细胞1.5ml至Eppendorf管中，采用Trizol LS试剂提取总RNA，加入15ul含焦磷酸2乙酯（DEPC）处理的水中保存。
（2）逆转录—环介导等温扩增反应体系（检测管）
2×LMAP反应液 12.5ul
一对内引物 1ul
一对外引物 1ul
一组环引物 1ul
RNA提取液（检测物） 5ul
鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶 0.1ul
BstDNA聚合酶 0.9ul
钙黄绿素 1ul
去离子水 补至25ul
（3）配置阳性和阴性对照反应体系
其他成分比例同检测管，但阳性对照为5ulcDNA，阴性对照为1ul双蒸水。
（4）恒温水浴或实时浊度仪中于63℃反应1小时。
（5）反应结束后肉眼观察反应管内颜色变化，如变为黄绿色说明检测结果阳性。如配备实时浊度仪可观察浊度曲线予以判断结果。
<110> 贾瑞鹏
<120> 一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒及其应用
<160> 1
<210> 1
<211> 3901
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
1 acagaagaaa tagcaagtgc cgagaagctg gcatcagaaa aacagagggg agatttgtgt
61 ggctgcagcc gagggagacc aggaagatct gcatggtggg aaggacctga tgatacagag
121 gaattacaac acatatactt agtgtttcaa tgaacaccaa gataaataag tgaagagcta
181 gtccgctgtg agtctcctca gtgacacagg gctggatcac catcgacggc actttctgag
241 tactcagtgc agcaaagaaa gactacagac atctcaatgg caggggtgag aaataagaaa
301 ggctgctgac tttaccatct gaggccacac atctgctgaa atggagataa ttaacatcac
361 tagaaacagc aagatgacaa tataatgtct aagtagtgac atgtttttgc acatttccag
421 cccctttaaa tatccacaca cacaggaagc acaaaaggaa gcacagagat ccctgggaga
481 aatgcccggc cgccatcttg ggtcatcgat gagcctcgcc ctgtgcctgg tcccgcttgt
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601 tcctgttgtg gatatttatt tgaacgggat tacagatttg aaatgaagtc acaaagtgag
661 cattaccaat gagaggaaaa cagacgagaa aatcttgatg gcttcacaag acatgcaaca
721 aacaaaatgg aatactgtga tgacatgagg cagccaagct ggggaggaga taaccacggg
781 gcagagggtc aggattctgg ccctgctgcc taaactgtgc gttcataacc aaatcatttc
841 atatttctaa ccctcaaaac aaagctgttg taatatctga tctctacggt tccttctggg
901 cccaacattc tccatatatc cagccacact catttttaat atttagttcc cagatctgta
961 ctgtgacctt tctacactgt agaataacat tactcatttt gttcaaagac ccttcgtgtt
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1201 tcatttccca cttttgtgcc cattctcaag acctcaaaat gtcattccat taatatcaca
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1321 attacatatt ttgttttcca gtgcaaagat gactaagtcc tttatccctc ccctttgttt
1381 gatttttttt ccagtataaa gttaaaatgc ttagccttgt actgaggctg tatacagcca
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1501 aaacaaaatc taacttgtaa ttccttgaac atgtcaggca tacattattc cttctgcctg
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1621 cttacttcat gcaaagaagg gacacatatg agattcatca tcacatgaga cagcaaatac
1681 taaaagtgta atttgattat aagagtttag ataaatatat gaaatgcaag agccacagag
1741 ggaatgttta tggggcacgt ttgtaagcct gggatgtgaa gcaaaggcag ggaacctcat
1801 agtatcttat ataatatact tcatttctct atctctatca caatatccaa caagcttttc
1861 acagaattca tgcagtgcaa atccccaaag gtaaccttta tccatttcat ggtgagtgcg
1921 ctttagaatt ttggcaaatc atactggtca cttatctcaa ctttgagatg tgtttgtcct
1981 tgtagttaat tgaaagaaat agggcactct tgtgagccac tttagggttc actcctggca
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2101 tgtgtgtgag tgtacatgcc aaagtgtgcc tctctctctt tgacccatta tttcagactt
2161 aaaaacaagc atgttttcaa atggcactat gagctgccaa tgatgtatca ccaccatatc
2221 tcattattct ccagtaaatg tgataataat gtcatctgtt aacataaaaa aagtttgact
2281 tcacaaaagc agctggaaat ggacaaccac aatatgcata aatctaactc ctaccatcag
2341 ctacacactg cttgacatat attgttagaa gcacctcgca tttgtgggtt ctcttaagca
2401 aaatacttgc attaggtctc agctggggct gtgcatcagg cggtttgaga aatattcaat
2461 tctcagcaga agccagaatt tgaattccct catcttttag gaatcattta ccaggtttgg
2521 agaggattca gacagctcag gtgctttcac taatgtctct gaacttctgt ccctctttgt
2581 gttcatggat agtccaataa ataatgttat ctttgaactg atgctcatag gagagaatat
2641 aagaactctg agtgatatca acattaggga ttcaaagaaa tattagattt aagctcacac
2701 tggtcaaaag gaaccaagat acaaagaact ctgagctgtc atcgtcccca tctctgtgag
2761 ccacaaccaa cagcaggacc caacgcatgt ctgagatcct taaatcaagg aaaccagtgt
2821 catgagttga attctcctat tatggatgct agcttctggc catctctggc tctcctcttg
2881 acacatatta gcttctagcc tttgcttcca cgacttttat cttttctcca acacatcgct
2941 taccaatcct ctctctgctc tgttgctttg gacttcccca caagaatttc aacgactctc
3001 aagtcttttc ttccatcccc accactaacc tgaatgccta gacccttatt tttattaatt
3061 tccaatagat gctgcctatg ggctatattg ctttagatga acattagata tttaaagctc
3121 aagaggttca aaatccaact cattatcttc tctttctttc acctccctgc tcctctccct
3181 atattactga ttgcactgaa cagcatggtc cccaatgtag ccatgcaaat gagaaaccca
3241 gtggctcctt gtggtacatg catgcaagac tgctgaagcc agaaggatga ctgattacgc
3301 ctcatgggtg gaggggacca ctcctgggcc ttcgtgattg tcaggagcaa gacctgagat
3361 gctccctgcc ttcagtgtcc tctgcatctc ccctttctaa tgaagatcca tagaatttgc
3421 tacatttgag aattccaatt aggaactcac atgttttatc tgccctatca attttttaaa
3481 cttgctgaaa attaagtttt ttcaaaatct gtccttgtaa attacttttt cttacagtgt
3541 cttggcatac tatatcaact ttgattcttt gttacaactt ttcttactct tttatcacca
3601 aagtggcttt tattctcttt attattatta ttttctttta ctactatatt acgttgttat
3661 tattttgttc tctatagtat caatttattt gatttagttt caatttattt ttattgctga
3721 cttttaaaat aagtgattcg gggggtggga gaacagggga gggagagcat taggacaaat
3781 acctaatgca tgtgggactt aaaacctaga tgatgggttg ataggtgcag caaaccacta
3841 tggcacacgt atacctgtgt aacaaaccta cacattctgc acatgtatcc cagaacgtaa
3901 agtaaaattt aaaaaaaagt ga

Claims (2)

1.一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括以下试剂：引物、2倍环介导等温扩增反应缓冲液、阳性对照、阴性对照、DNA聚合酶、逆转录酶和显色剂，所述的引物由一对外引物、一对内引物和一组环引物组成，所述的引物序列如下：
外引物F3：ATACAGCACAGCCTCTCC；
外引物B3：GAATCTCATATGTGTCCCTTC；
环引物LB：TTGTTTAGGTGGTATGGGAGG；
内引物FIP：GTCCTGACATGTTCAAGGAATTACATTATCTGTCATCACCATCAACC；
内引物BIP：GCCTGAGAAGCTCTTCCTTGTTGCATGAAGTAAGATAGTCAAC；
所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的BstDNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述的逆转录酶采用鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶，活力为10个活性单位/微升；所述的阳性对照为含人前列腺癌特异性基因PCA3的cDNA样本；所述的阴性对照为双蒸水；所述显色剂为钙黄绿素螯合剂。
2.根据权利要求1所述的一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述的2倍环介导等温扩增反应缓冲液由40mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、20mM氯化钾、16mM硫酸镁、20mM硫酸铵、1.6mM甜菜碱、2.8mM的脱氧核糖核苷三磷酸和0.2％质量百分浓度的吐温20组成，其中mM是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所含有溶质的摩尔数。
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