ES2915074T3 - Métodos de marcaje molecular y bibliotecas de secuenciación - Google Patents

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Abstract

Un método para validar oligos específicos de pacientes para su uso en ensayos multiplexados específicos de pacientes, comprendiendo el método: extraer ADN o ARN de una muestra de un paciente para producir una muestra de ADN o ARN; introducir una pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales en la muestra de ADN o ARN para producir una muestra enriquecida, en donde la pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales comprende secuencias adicionales de concentraciones conocidas; cosintetizar los oligos de control de síntesis y los oligos específicos del paciente; y ensayar la muestra enriquecida con los oligos de control de síntesis para producir una lectura de los recuentos de los conjuntos de secuencias adicionales; y comparar los recuentos de los conjuntos de secuencias adicionales con las concentraciones conocidas de las secuencias adicionales, en donde el límite de detección (LDD) y el intervalo dinámico para los oligos específicos del paciente se validan cuando los recuentos de los conjuntos de las secuencias adicionales corresponden a las concentraciones conocidas de las secuencias adicionales, en donde un conjunto de secuencias adicionales comprende: una secuencia de referencia única; y una pluralidad de secuencias vecinas cercanas, en donde cada secuencia vecina cercana comprende al menos una sustitución, inserción, y/o deleción en comparación con la secuencia de referencia y la concentración de cada secuencia vecina cercana es menor que la concentración de la secuencia de referencia; y en donde la lectura de los recuentos de secuencias adicionales determina las características de dosis- respuesta de los oligos de control de síntesis, que actúan como sustitutos de los oligos específicos del paciente en el ensayo y proporcionan una verificación de control de calidad para la síntesis por lote de los oligos específicos del paciente.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de mareaje molecular y bibliotecas de secuenciación
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos de validación de oligonucleótidos (''oligos'') durante el análisis de muestras biológicas empleando oligos de control adicionales.
Antecedentes de la invención
El desarrollo del análisis de secuenciación genómica ha facilitado la llegada de la medicina personalizada. En dichos ensayos, se aplican generalmente dos enfoques generales. Los ensayos integrales, tal como la secuenciación del genoma completo o la secuenciación del exoma completo, son costosos pero ofrecen alcance, de modo que no es necesario saber antes de realizar el ensayo qué variantes se pueden presentar en una muestra biológica. Los ensayos dirigidos, tales como los paneles de un único gen o de múltiples genes, son menos costosos, pero requieren algunas suposiciones sobre qué variantes se pueden presentar en la muestra; se perderá cualquier variante útil que se presente en la muestra del paciente pero que no se aborde en el diseño del ensayo. Se podría conseguir una estrategia que optimice esta compensación de costo/alcance en los casos en que uno anticipa ensayar las mismas partes del genoma en el mismo paciente repetidamente a lo largo del tiempo. En tales casos, inicialmente se podrían emplear ensayos integrales para identificar mutaciones específicas del paciente y, a continuación, realizar ensayos dirigidos menos costosos en muestras posteriores empleando un ensayo diseñado para ensayar sólo las regiones del genoma que contienen una o más mutaciones específicas del paciente identificadas por el primer ensayo. Kuhn et al., 2004, vol. 14, págs. 2347-2356 enseñan una tecnología de micromatriz para el perfilado cuantitativo de la expresión génica sobre la base de matrices de perlas ensambladas aleatoriamente. El documento WO 2014/127484 describe un método para preparar una molécula de ácido nucleico de control adicional que se puede añadir a muestras biológicas, para rastrear o confirmar la identidad de una muestra. Sin embargo, los factores que limitan la aplicación clínica del análisis del genoma específico del paciente son el coste y la complejidad de validar el rendimiento analítico de los oligos específicos del paciente empleados en estos métodos. Aunque el desarrollo de tecnologías de cribado del genoma ha reducido el coste del análisis integral, aún existen las limitaciones prácticas para validar los oligos específicos del paciente. Por consiguiente, la aplicación genética actual de la medicina personalizada se ha limitado a ensayos amplios y costosos o a la realización de ensayos dirigidos empleando el mismo conjunto de locus de paciente a paciente. Sin embargo, para aprovechar verdaderamente la información transmitida en el genoma de un paciente, se deben superar las limitaciones comerciales y prácticas en el empleo de múltiples oligos específicos de pacientes.
Por ejemplo, el campo de la biopsia líquida en el cáncer requiere de un sistema sensible y preciso para detectar el ADN tumoral circulante (ADNct). Dado que la concentración de ADNct en comparación con la del ADN normal del paciente es muy baja, el cribado de ADNct sería más útil si se evaluaran múltiples dianas de ADNct como un medio para conseguir una mayor sensibilidad. Si el ADNct se empleara como una forma de monitorear la eficacia del tratamiento del cáncer o la recurrencia de la enfermedad, el cribado de múltiples dianas de ADNct se vuelve prohibitiva en términos de costes. En base a la tecnología actual en la técnica, esto requiere la secuenciación en cada momento de una muestra del genoma suficientemente grande para asegurar la captura de múltiples mutaciones somáticas. Si se pudieran emplear oligos específicos del paciente que se dirigiesen al conjunto específico de marcadores de ADNct del paciente, entonces monitorear la progresión de la enfermedad o la eficacia del tratamiento con ADNct requeriría secuenciar sólo una vez el genoma completo o el exoma para determinar las mutaciones somáticas específicas del paciente en el ADNct. El empleo de oligos específicos del paciente también reduciría la huella de secuenciación para reducir el coste del posterior análisis de muestra. Los procedimientos actuales para validar ensayos no son prácticos para validar oligos específicos de pacientes, ya que requieren que cada ensayo se ejecute un gran número de veces para establecer las características de rendimiento analítico del ensayo. Tales ensayos aumentan en gran medida el coste de emplear oligos específicos del paciente e introducen un retraso de tiempo significativo para poder emplear los ensayos específicos del paciente. Por lo tanto, existe la necesidad de una forma rentable y práctica para validar los oligos específicos del paciente.
Compendio de la invención
La divulgación es un diseño para conjuntos de controles y métodos para su empleo para la validación en línea de ensayos de muestras biológicas que emplean oligos específicos del paciente. El método comprende normalmente extraer ADN o ARN de una muestra de un paciente para producir una muestra de ADN o ARN; introducir una pluralidad de conjuntos de oligosecuencias adicionales en la muestra de ADN o ARN para producir una muestra enriquecida, en donde la pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales consiste en secuencias conocidas a concentraciones conocidas; cosintetizar oligos de control de síntesis y oligos específicos del paciente; y ensayar la muestra enriquecida con los oligos de control y los oligos específicos del paciente. La lectura de los recuentos de las secuencias adicionales determina las características de dosis-respuesta de los oligos de control de síntesis, que actúan como sustitutos de los del oligo específico del paciente en el ensayo y, por lo tanto, proporcionan una verificación de control de calidad para la síntesis por lote de los oligos específicos del paciente.
En algunos aspectos, la presente divulgación se dirige a un método para validar un oligo específico de un paciente, el método comprende: extraer ADN o ARN de una muestra de un paciente para producir una muestra de ADN o ARN; introducir una pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales en la muestra de ADN o ARN para producir una muestra enriquecida, en donde la pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales comprende secuencias adicionales de concentraciones conocidas; cosintetizar oligos de control de síntesis y el oligo específico del paciente; y ensayar la muestra enriquecida con los oligos de control de síntesis para producir una lectura de los recuentos del conjunto de secuencias adicionales; y comparar los recuentos del conjunto de secuencias adicionales con las concentraciones conocidas de las secuencias adicionales, en donde el límite de detección (LDD) y el intervalo dinámico para el oligo específico del paciente se validan cuando los recuentos del conjunto de secuencias adicionales corresponden a las concentraciones conocidas de las secuencias adicionales.
En otros aspectos, la presente divulgación se refiere a un método para validar un oligo específico de un paciente, el método comprende: extraer ADN o ARN de una muestra de un paciente para producir una muestra de ADN o ARN; introducir una pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales en la muestra de ADN o ARN para producir una muestra enriquecida, en donde la pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales comprende secuencias adicionales de concentraciones conocidas; ensayar la muestra enriquecida con los oligos de control de síntesis para producir una lectura de los recuentos del conjunto de secuencias adicionales, en donde los oligos de control de síntesis se cosintetizan con el oligo específico del paciente; y comparar los recuentos del conjunto de secuencias adicionales con las concentraciones conocidas de las secuencias adicionales, en donde el LDD y el intervalo dinámico para el oligo específico del paciente se validan cuando los recuentos del conjunto de secuencias adicionales corresponden a las concentraciones conocidas de las secuencias adicionales.
En algunos aspectos, analizar la muestra enriquecida con los oligos de control de síntesis comprende realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o secuenciar con los oligos de control de síntesis.
En otros aspectos, la PCR es PCR digital o PCR cuantitativa.
En algunas realizaciones, la pluralidad del conjunto de secuencias adicionales se introduce en la muestra de ADN o ARN antes de la síntesis de la biblioteca.
En otras realizaciones, los recuentos de secuencias adicionales actúan como un representante de las características de dosis-respuesta del oligo específico del paciente en la etapa de ensayo.
En una realización, la pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales comprende al menos 4 conjuntos de secuencias adicionales.
En un aspecto, un conjunto de secuencias adicionales comprende: una secuencia de referencia única; y una pluralidad de secuencias vecinas cercanas, en donde cada secuencia vecina cercana comprende al menos una sustitución, inserción, y/o deleción en comparación con la secuencia de referencia.
En otro aspecto, la concentración de cada secuencia vecina cercana es menor que la concentración de la secuencia de referencia.
En determinadas realizaciones, las proporciones de la concentración de cada secuencia vecina cercana respecto a la concentración de la secuencia de referencia abarcan al menos cuatro órdenes de magnitud.
En otras realizaciones, las proporciones de la concentración de la pluralidad de secuencias vecinas cercanas respecto a la concentración de la secuencia de referencia comprenden 1:10, 1:100, 1:1000, y 1:10.000.
En algunos aspectos, cada conjunto de secuencias adicionales comprende el mismo número de secuencias vecinas cercanas.
En otros aspectos, la pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales comprende el mismo conjunto de proporciones de la concentración de cada secuencia vecina cercana respecto a la concentración de la secuencia de referencia.
En una realización, los recuentos del conjunto de secuencias adicionales corresponden a las concentraciones conocidas de las secuencias adicionales cuando las proporciones de las secuencias vecinas cercanas en relación con la secuencia de referencia en base a los recuentos están dentro del 20%, 15%, 10%, 5%, o 1% de proporciones de las secuencias vecinas cercanas en relación con la secuencia de referencia en base a las concentraciones conocidas.
En otra realización, el LDD y el intervalo dinámico para el oligo específico del paciente se validan cuando las proporciones en base a los recuentos están dentro del 1% de las proporciones basadas en las concentraciones conocidas.
En algunos aspectos, la muestra del paciente es una muestra líquida que contiene ADN libre de células (ADNlc) y/o ARN libre de células (ARNlc). En otros aspectos, el ADNlc y/o ARNlc indican una mutación y/o cambio en la expresión de un gen seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, ERCCI, EGFR, TS, AREG, EREG, VEGFR2, EML4ALK, ROSI, RET, c-Met, FGFRI, KRAS, BRAF, NRAS, Her-2, PIK3CA, KIT, GNAQ, y GNA11.
En otros aspectos más, el oligo específico del paciente detecta el ADN tumoral circulante (ADNct).
En determinadas realizaciones, el paciente tiene o se sospecha que tiene cáncer. En un aspecto, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de cabeza y cuello, periampular, colorrectal, de pulmón, melanoma, gástrico, esofágico, mama, ovario, sarcoma, células renales, próstata, tumor del estroma gastrointestinal (GIST, de sus siglas en inglés) y pancreático.
En determinadas aplicaciones, la pluralidad del conjunto de secuencias adicionales se añade a la muestra de ADN o ARN antes de la síntesis de la biblioteca. En algunas realizaciones, la pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales comprende al menos 10 conjuntos de secuencias adicionales.
Un conjunto de secuencias adicionales comprende una secuencia de referencia y una pluralidad de secuencias vecinas cercanas. Una secuencia vecina cercana comprende al menos una sustitución en comparación con la de referencia. En algunas realizaciones, la concentración de cada secuencia vecina cercana en un conjunto de secuencias adicionales es menor que la concentración de la secuencia de referencia. En determinados aspectos, las proporciones de la concentración de cada secuencia vecina cercana respecto a la concentración de la secuencia de referencia abarcan al menos cuatro órdenes de magnitud. Por ejemplo, las proporciones de la concentración de cada secuencia vecina cercana respecto a la concentración de la secuencia de referencia comprenden 1:10, 1:100, 1:1000, y 1:10.000.
En aplicaciones seleccionadas, cada conjunto de secuencias adicionales comprende el mismo número de secuencias vecinas cercanas. En algunos aspectos, la pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales comprende el mismo conjunto de proporciones de la concentración de cada secuencia cercana respecto a la concentración de la secuencia de referencia.
En una realización, la muestra del paciente es una muestra líquida que contiene ADN libre de células. En una realización preferida, el oligo específico del paciente detecta el ADN tumoral circulante (ADNct).
Los objetivos adicionales, las ventajas y las características novedosas se establecerán en la descripción que sigue o resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras el examen de los dibujos y la descripción detallada que sigue.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 representa una realización de cómo se podría emplear la diana adicional universal (UST, de sus siglas en inglés) en la validación de la síntesis de una biblioteca de secuenciación.
Descripción detallada
Las formas singulares "un", "una", y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una etapa" incluye la referencia a una o más de tales etapas. A menos que se indique específicamente, se pretende que las palabras y frases en la memoria descriptiva y las reivindicaciones tengan su significado simple, ordinario, y habitual para aquellos con conocimientos ordinarios en las técnicas aplicables.
Como se emplea en la presente memoria, el término "paciente" se refiere al donante de una muestra. El paciente puede ser cualquier animal, por ejemplo, mamíferos o aves. En realizaciones preferidas, el paciente es un ser humano.
Como se emplea en la presente memoria, el término "oligo" se refiere a secuencias de ácido nucleico monocatenarias o bicatenarias. En realizaciones preferidas, un oligo puede ser un cebador para análisis de secuencias o aplicaciones que implican la amplificación de ácidos nucleicos. Estos oligos pueden emplear como analito tanto ADN como ARN.
Como se emplea en la presente memoria, el término "oligo de control de síntesis" se refiere a un oligo que es complementario y se une a todas las secuencias adicionales en un conjunto, que incluye la secuencia de referencia y todas las secuencias vecinas cercanas.
Como se emplea en la presente memoria, el término "diana adicional" se refiere a las secuencias adicionales de la descripción.
Las dianas adicionales son oligos monocatenarios o bicatenarios con una dispersión colectiva de longitudes correspondientes a la dispersión en una muestra, por ejemplo, una muestra típica para análisis de ADNct.
Como se emplea en el presente memoria, el término "secuencia adicional" se refiere a un oligo con una secuencia que no está relacionada con ninguna secuencia en la muestra del paciente y que sirve como molde para un oligo de control de síntesis.
Como se emplea en la presente memoria, el término "co-sintetizado" se refiere a oligos que se sintetizan mediante el mismo método, al mismo tiempo, y/o en el mismo lote.
Como se emplea en la presente memoria, el término "muestra" puede ser cualquier muestra biológica de un paciente. La muestra puede ser una biopsia, por ejemplo, de una lesión o más concretamente de un tumor. La muestra también puede ser ADN libre de células de orina, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido intersticial, o lágrimas. La muestra también puede ser una muestra de sangre o plasma.
El ADN tumoral circulante libre de células (ADNct) en el plasma, suero, orina o heces se puede emplear como biopsia líquida. Los cambios en los niveles de ADNct se han asociado con la carga tumoral y la progresión maligna.
La presencia de ADN circulante libre de células (ADNlc) en sangre humana de sujetos se describió por primera vez en 1948 (P. Mandel y P. Métais, Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme., Comptes Rendus de l'Académie des Sciences, vol. 142, págs. 241 -243, 1948). No fue hasta 1994 que se descubrió el ADNct en la sangre de pacientes con tumores (fragmentos del gen Ras mutado) y se asoció con la progresión de tumores malignos. Se liberará aproximadamente un 3,3% de ADNct por día a partir de un tumor que pese 100 g (aproximadamente 3 x 1010 células tumorales) (H. Schwarzenbach, D. S. B. Hoon y K. Pantel, Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients, Nature Reviews. Cancer, vol. 11, págs. 426-37, Junio de 2011). Los ácidos nucleicos libres (tumores) circulantes suelen estar presentes en el plasma o el suero en forma de fragmentos cortos de entre 70 y 200 pb de longitud. También se han detectado fragmentos muy grandes de hasta 21 kb de longitud. La concentración de ADNlc en fluidos biológicos suele ser muy baja y varía mucho entre individuos dentro de un intervalo de 1-100 ng/ml. Sin embargo, se ha confirmado una correlación entre las altas concentraciones de ADNlc (posiblemente aumentadas por ADNct) en pacientes con tumores y las bajas concentraciones en sujetos (C. Alix-Panabiéres, H. Schwarzenbach, y K. Pantel, Circulating tumor cells and circulating tumor DNA., Annual review of medicine, vol. 63, págs. 199-215, Enero. 2012).
En el desarrollo temprano del tumor, el tumor primario elimina pasivamente el ADNct en el torrente sanguíneo a través de procesos apoptóticos y/o necróticos. Las células necróticas o apoptóticas normalmente se fagocitan por los macrófagos. Los macrófagos que digieren las células necróticas pueden liberar este ADN en el tejido circundante. Experimentos de cultivos celulares in vitro han demostrado que los macrófagos se activan durante este proceso o mueren durante la liberación de ADN (C Roth, K. Pantel, V. Müller, B. Rack, S. Kasimir-Bauer, W. Janni, y H. Schwarzenbach, Apoptosis-related deregulation of proteolytic activities and high serum levels of circulating nucleosomes and DNA in blood correlate with breast cancer progression., BMC cancer, vol. 11, pág. 4, Enero 2011). La liberación activa de células tumorales en sí misma puede ser un mecanismo adicional para la liberación de ADNct. Además de los mecanismos para la formación de ADNct descritos anteriormente, Fleischhacker y Schmidt (2007) publicaron que el ADNct también se puede liberar como consecuencia de procesos inflamatorios durante la progresión tumoral en pacientes con tumores (M. Fleischhacker y B. Schmidt, Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer: a survey., Biochimica et biophysica acta, vol. 1775, págs. 181-232, Enero. 2007). Además, los niveles de ADNct también se determinan mediante la tasa de degradación de las DNasas y mediante el filtrado fisiológico de la sangre. Los ácidos nucleicos en la sangre se filtran por el hígado y los riñones y tienen una vida media que oscila entre 15 minutos y varias horas en la circulación sanguínea. Bendich et al. (1965) publicaron que el ADNct bicatenario se detectó durante más tiempo en la circulación sanguínea que el ADNct monocatenario (A. Bendich, T. Wilczok, y E. Borenfreund, DNA as a Possible Factor in Oncogenesis, Science, vol. 148, n.°. 3668, págs. 374-376, 1965). Un exceso de células moribundas, como se observa a menudo en los tumores, conduce a la saturación del proceso y a un aumento de la concentración de ADNct en la sangre. En la sangre periférica, este ADNct circula principalmente en forma de mono u oligonucleosomas (esta primera etapa de empaquetamiento de cromatina de las células superiores es un complejo de ADN e histonas) o se une a proteínas de unión a ADN en la superficie de las células sanguíneas (P. Laktaniov y S. Tamkovich, Cell Surface Bound Nucleic Acids: Free and Cell Surface Bound Nucleic Acids in Blood of Healthy Donors and Breast Cancer Patients, Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 9, n.°. 1022, págs. 221 -227, 2004). Este ADNct se puede aislar de la sangre y emplearse para medir parámetros genéticos y/o epigenéticos.
El análisis de ADNct proporciona un medio para demostrar la progresión del tumor a nivel molecular y para documentar el estado mutacional del tumor. La detección de mutaciones en el tejido tumoral tiene influencia sobre el pronóstico de la enfermedad y la elección del tratamiento. Es necesario conocer el estado mutacional del tumor en el momento del diagnóstico y detectar mutaciones recién adquiridas durante el trascurso del tratamiento. En este sentido, ha sido posible, empleando métodos cuantitativos de medición, establecer una correlación entre los niveles de ADNct y el tamaño y estadio tumoral y/o mal pronóstico (H. Schwarzenbach, C. Alix-Panabiéres, I. Müller, N. Letang, J.-P. Vendrell, X. Rebillard, y K. Pantel, Cell-free tumor DNA in blood plasma as a marker for circulating tumor cells in prostate cancer. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, vol. 15, págs. 1032-8, Febrero. 2009) presentando una oportunidad para monitorear a los pacientes de forma longitudinal durante el tratamiento y para predecir la (no) respuesta a un medicamento. También existe una fuerte correlación entre los datos de mutación de ADNct y el estado mutacional del tumor primario (E. A. Punnoose, S. Atwal, W. Liu, R. Raja, B. M. Fine, B. G. M. Hughes, R. J. Hicks, G. M. Hampton, L. C. Amler, A. Pirzkall, y M. R. Lackner, Evaluation of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA in Non-Small Cell Lung Cancer: Association with Clinical Endpoints in a Phase II Clinical Trial of Pertuzumab and Erlotinib., Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, vol. 18, Abril de 2012). En la actualidad, el ensayo del estado mutacional todavía se realiza a menudo empleando material embebido en parafina fijado con formalina.
Un problema importante a la hora de detectar el estado mutacional de un tumor es la falta de especificidad y sensibilidad de los métodos de detección. Generalmente, se debe presentar una cantidad relativamente grande de ADNct en la sangre para la realización de los análisis de mutación de ADNct. Además, el ADNct se encuentra normalmente en presencia de un elevado nivel de ADN circulante de tipo natural, lo que dificulta el análisis.
Para detectar ADN mutado mediante secuenciación de Sanger en un nivel alto de tipo natural (WT, de sus siglas en inglés), el ADN mutado debe representar al menos el 25% del contenido total de ADN (W. Pao y M. Ladanyi, Epidermal growth factor receptor mutation testing in lung cancer: searching for the ideal method., Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, vol. 13, págs. 4954-5, Septiembre de 2007). En muestras clínicas, la proporción de ADN mutado es entre 100 y 10.000 veces menor que ésta, lo que hace imposible la detección de la mutación mediante métodos convencionales. Hay métodos analíticos disponibles para cuantificar simultáneamente la concentración de ADN de tipo natural y de ADN mutado.
Se observó que algunos pacientes con tumores desarrollan resistencia durante el tratamiento farmacológico debido a mutaciones, siendo los SNPs individuales (polimorfismos de un solo nucleótido) la causa de la resistencia a una terapia en particular. En determinados aspectos, los métodos de la presente invención se emplean para detectar SNPs en ADN o ARN de una muestra de un paciente. La identificación de estos SNPs puede guiar el tratamiento terapéutico del paciente.
En algunas realizaciones, el paciente tiene o se sospecha que tiene cáncer de cabeza y cuello, periampular, colorrectal, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer pulmonar de células no pequeñas), melanoma, gástrico, esofágico, de mama, ovario, sarcoma, células renales, próstata, tumor del estroma gastrointestinal (GIST) y cánceres pancreáticos.
En determinados aspectos, los métodos descritos en la presente memoria se pueden emplear para validar el análisis de la expresión génica en un paciente. La expresión génica puede ser útil para monitorear el trascurso de la quimioterapia. Si bien el ADN es en gran parte una molécula estática en términos de alteraciones (es decir, las nuevas mutaciones en el ADN pueden tardar mucho en aparecer), los cambios en la expresión génica pueden ocurrir rápidamente, en cuestión de días o incluso horas, y por lo tanto, pueden proporcionar medios rápidos y sensibles para evaluar los cambios en el tumor, tales como los provocados por los efectos de los fármacos. Se puede medir un continuo de valores para la expresión relativa (niveles crecientes, decrecientes o estáticos) de la fracción de transcritos raros o anómalos con respecto a los transcritos normales o de tipo natural a lo largo del tiempo en una biopsia líquida (por ejemplo, plasma) del paciente. Las tendencias ascendentes o descendentes de la expresión se pueden vincular al resultado del paciente con regímenes de quimioterapia específicos.
Los regímenes de quimioterapia pueden diferir según el tipo de cáncer, la etapa, y la genética del paciente. La quimioterapia se puede adaptar a un fenotipo tumoral específico. Los métodos de la presente invención se pueden emplear para controlar la respuesta a un régimen de quimioterapia específico antes, durante, y después del tratamiento. Ejemplos de regímenes de quimioterapia incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con nivolumab de cáncer positivo para PD-L1; y tratamiento del cáncer colorrectal (CCR) con Regorafenib/Cetuximab; crizotinib; FOLFOX; FOLFORI/bevacizumab; y regorafinib/cetuximab.
En otra realización, la divulgación proporciona evaluar cuantitativamente la expresión de genes determinantes de la respuesta a fármacos que pueden predecir la eficacia de los fármacos y, por lo tanto, se pueden emplear para tomar decisiones de tratamiento. Por ejemplo, un estudio reciente muestra que los tumores de mama positivos para HER2 avanzados expresan cantidades variables de HER-2 y que los pacientes con el nivel más alto de expresión obtuvieron un beneficio de supervivencia mucho mayor con HERCEPTIN® que aquellos con expresiones más bajas (Baselga J, et al. Relationship between tumor biomarkers and efficacy in EMILIA, a phase III study of trastuzumab emtansine (T-DM1) in HER2-positive metastatic breast cancer. AACR 2013; Abstract LB-63). Por otra parte, las mutaciones activadoras en PIK3CA, que amortiguan los efectos de los fármacos anti-HER-2, tal como lapatanib, no tuvieron ningún efecto sobre la terapia con HERCEPTIN®. Si los niveles de expresión tisular de HER-2 de estos pacientes con cáncer de mama se reflejan en su ARN libre de células (ARNlc), se puede emplear una extracción de sangre en lugar de una biopsia de tejido para obtener información sobre la expresión de HER-2, así como el estado mutacional de PIK3. Para algunos biomarcadores y/o genes asociados con el cáncer (por ejemplo, Her-2) el número de copias puede variar. Esta variación se podría detectar con ARNlc. El análisis de ARNlc con los métodos descritos en la presente memoria permite la detección y/o la cuantificación de fusiones de genes que son la diana de los agentes quimioterapéuticos. Ejemplos no limitantes de estas fusiones de genes son EML4-ALK, ROS1, y RET.
La medición de la expresión de cada variante o mutación de resistencia emergente en estos genes del plasma de pacientes sometidos a terapia puede ser fundamental para una atención óptima del paciente. Los fármacos específicos que son activos sólo en determinadas fusiones o mutaciones en estos genes se pueden implementar para ayudar al paciente si se produce un diagnóstico rápido y preciso de estas fusiones de genes. La obtención de biopsias de tejido de pacientes sometidos a terapia no es práctica para estos pacientes. Los métodos descritos en la presente memoria permiten la validación de biopsias líquidas que se pueden analizar a lo largo del tiempo para determinar la presencia y los niveles de expresión de cada variante o mutación de resistencia emergente en estos genes.
Ejemplos no limitantes de genes asociados con la respuesta a la quimioterapia que se pueden medir según la metodología descrita en la presente memoria incluyen: EGFR, KRAS, BRAF, NraS, JAK2, ALK, PDGFRA, IDH1, IDH2, y KIT. En algunos aspectos de la invención, el biomarcador es una mutación en un gen o transcrito de fusión seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, ERCC1, EGFR, TS, AREG, EREG, VEGFR2, EML4ALK, ROS1, RET, c-Met, FGFR1, KRAS, BRAF, NRAS, Her-2, PIK3CA, KIT, GNAQ, y GNA11.
En algunas realizaciones, el gen que se detecta y/o cuantifica para su expresión en la muestra se enumera a continuación en la Tabla 1.
Tabla 1
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En otras realizaciones más, el gen y/o la mutación que se detecta y/o cuantifica para la expresión en la muestra se enumera a continuación en la Tabla 2.
Tabla 2
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En algunas realizaciones, la divulgación se refiere al empleo de una pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales (también denominadas en la presente memoria como dianas adicionales universales o USTs) en una muestra de paciente para facilitar aplicaciones multiplexadas específicas del paciente, por ejemplo, muestras de cribado empleando oligos específicos del paciente. En determinados aspectos, las secuencias adicionales tienen menos de 500 nucleótidos de longitud. En otros aspectos, la longitud de las secuencias adicionales está entre 20 y 500 nucleótidos, entre 20 y 400 nucleótidos, entre 20 y 300 nucleótidos, entre 20 y 200 nucleótidos, entre 100 y 500 nucleótidos, entre 100 y 400 nucleótidos, entre 100 y 300 nucleótidos o entre 100 y 200 nucleótidos. En una realización, la longitud de las secuencias adicionales imita el tamaño del ADN y/o ARN correspondiente a analizar en las muestras de pacientes. En algunas aplicaciones, por ejemplo, para validar muestras de ADN sin células, las secuencias adicionales tienen entre 100-200 nucleótidos de longitud, tal como alrededor de 150, 160, 170, 180, o 190 nucleótidos de longitud.
En determinados aspectos, la divulgación hace uso de al menos un conjunto de secuencias adicionales, al menos dos conjuntos de secuencias adicionales, al menos tres conjuntos de secuencias adicionales, al menos cuatro conjuntos de secuencias adicionales o al menos cinco conjuntos de secuencias adicionales. En un aspecto particular, la divulgación hace uso de cuatro o cinco conjuntos de secuencias adicionales.
En algunas realizaciones, un conjunto de secuencias adicionales comprende una secuencia de referencia y una pluralidad de secuencias vecinas cercanas. Las secuencias de referencia en cada conjunto de secuencias adicionales difieren (es decir, son independientes) entre sí. En algunos aspectos, la pluralidad de secuencias vecinas cercanas consisten entre 2 y 10 secuencias vecinas cercanas, entre 2 y 9 secuencias vecinas cercanas, entre 2 y 8 secuencias vecinas cercanas, entre 2 y 7 secuencias vecinas cercanas, entre 2 y 6 secuencias vecinas cercanas, entre 2 y 5 secuencias vecinas cercanas, entre 2 y 4 secuencias vecinas cercanas, o entre 2 y 3 secuencias vecinas cercanas. En algunas aplicaciones, el conjunto de secuencias adicionales comprende las secuencias vecinas cercanas en concentraciones definidas en relación con las secuencias de referencia, por ejemplo, 1:10, 1:100, 1:1000, y 1:10.000. En una realización preferida, la concentración colectiva de secuencias vecinas cercanas en un conjunto de secuencias adicionales abarca cuatro órdenes de magnitud, por ejemplo, 1:10, 1:100, 1:1000, y 1:10.000.
Las secuencias vecinas cercanas difieren de la secuencia de referencia en al menos una sustitución, deleción, o inserción. En algunos aspectos, las secuencias vecinas cercanas son secuencias homólogas a la secuencia de referencia. Por consiguiente, la relación de secuencia entre la secuencia de referencia y su vecina cercana imita las condiciones de variación genética que se encuentran potencialmente en una muestra del paciente.
Por ejemplo, la secuencia de referencia funciona de manera análoga a un gen de tipo natural, y las secuencias vecinas cercanas funcionan de manera análoga a la variación genética que se encuentra en los ADNct. Alternativamente, la secuencia de referencia puede funcionar de manera análoga a un gen mutado mientras que las secuencias vecinas cercanas funcionan de manera análoga a la variación potencial en el gen mutado. Mediante el cribado de USTs en la muestra empleando oligos de control de síntesis, será posible determinar las características de dosis-respuesta de los oligos de control de síntesis, que actúan como sustitutos de las del oligo específico del paciente en el ensayo y, por lo tanto, proporcionan una verificación de control de calidad para la síntesis por lote de los oligos específicos del paciente. Por lo tanto, las secuencias adicionales no se relacionan con las secuencias de la muestra del paciente. Además, cada conjunto de secuencias adicionales no se relaciona entre sí. Preferiblemente, cada secuencia en los USTs tiene secuencias diferentes.
En determinados aspectos, el método para validar un lote de oligos específicos de un paciente comprende extraer ADN o ARN de una muestra de un paciente para producir una muestra de ADN o ARN; introducir una pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales en la muestra de ADN o ARN para producir una muestra enriquecida en donde la pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales consiste en secuencias adicionales de concentraciones conocidas; ensayar la muestra enriquecida con los oligos de control de síntesis y el oligo específico del paciente para producir una lectura de los recuentos de los conjuntos de secuencias adicionales; y comparar los recuentos del conjunto de secuencias adicionales con las concentraciones conocidas de las secuencias adicionales. Es importante que los oligos de control de síntesis y el oligo específico del paciente se sinteticen de manera conjunta para permitir la lectura de los oligos de control de síntesis para validar el oligo específico del paciente. Por consiguiente, algunas aplicaciones del método comprenden cosintetizar el oligo de control de síntesis y el oligo específico del paciente.
La etapa de análisis se puede realizar empleando cualquier método de cuantificación basado en cebadores (incluidos los métodos absoluto y relativo) de la muestra enriquecida empleando los oligos de control de síntesis y los oligo específicos del paciente. Por tanto, el ensayo se puede realizar mediante un método de secuenciación o mediante PCR (por ejemplo, PCR cuantitativa o PCR digital). En una realización preferida, el ensayo se realiza según los métodos descritos en la solicitud PCT PCT/US17/34329, titulada "Molecular Tagging Methods and Sequencing Libraries". Los recuentos de secuencias adicionales del ensayo permiten al menos una comparación de la concentración de las secuencias vecinas cercanas en relación con la secuencia de referencia. Por ejemplo, una persona con experiencia ordinaria en la técnica sería capaz de calcular una proporción de la concentración de las secuencias vecinas cercanas para la concentración de la secuencia de referencia a partir de los resultados de la secuenciación o PCR.
La lectura de los recuentos de las secuencias adicionales determina el límite de detección (LDD) y el intervalo dinámico del oligo específico del paciente en la etapa de análisis determinando la relación de las secuencias vecinas cercanas en relación con la secuencia de referencia a partir de los recuentos con la concentración conocida de las secuencias vecinas cercanas. Si los resultados del ensayo de los oligos de control de síntesis son precisos, por ejemplo, las proporciones de las secuencias vecinas cercanas en relación con la secuencia de referencia en base a los recuentos están dentro del 20%, 15%, 10%, 5%, o 1% de las proporciones en base a las concentraciones conocidas de secuencias adicionales, y se valida el lote de síntesis de los oligos específicos del paciente. Por consiguiente, se podría predecir que los resultados del ensayo del oligo específico del paciente también serían precisos. En algunas aplicaciones, la pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales se puede introducir en la muestra antes de la síntesis de la biblioteca.
En algunas realizaciones, cada conjunto de secuencias adicionales comprende una concentración tal que la suma de los recuentos de una secuencia de referencia dada más sus secuencias vecinas cercanas es igual al número de copias del genoma en la muestra del paciente. En algunas realizaciones, la proporción de concentraciones entre una secuencia vecina cercana y la secuencia de referencia se replican en los conjuntos de secuencias adicionales, mientras que la concentración de la secuencia de referencia no necesita ser la misma en cada conjunto de secuencias adicionales. Por ejemplo, si un conjunto de secuencias adicionales comprende proporciones de una secuencia vecina cercana a la secuencia de referencia de 1/10, 1/100, 1/1000, y 1:10000, al menos otro conjunto de secuencias adicionales comprenderá también proporciones de una secuencia vecina cercana a la secuencia de referencia de 1/10, 1/100, 1/1000, y 1:10000. En aplicaciones donde el número de secuencias vecinas cercanas difiere de cada conjunto de secuencias adicionales, la relación de concentración entre una secuencia vecina cercana y la de referencia en el conjunto con el número más pequeño de secuencias vecinas cercanas corresponde a una relación de concentración entre una secuencia vecina cercana y la de referencia en el conjunto con el mayor número de secuencias vecinas cercanas. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, en cualquier relación de concentración contendrá réplicas dentro del mismo conjunto de secuencias adicionales y/o de diferentes conjuntos de secuencias adicionales. Como tal, cada punto de la curva dosis-respuesta del ensayo tendrá mediciones diferentes. En algunas realizaciones, esto se debe a que un conjunto de secuencias adicionales contribuye a una medición. Sin embargo, en algunos aspectos, la cantidad de cada secuencia vecina cercana en un conjunto de secuencias adicionales es diferente. Nada en la secuencia de ácido nucleico específica de una secuencia vecina cercana afecta a la cantidad de la secuencia vecina cercana específica que debe estar en el conjunto de secuencias adicionales.
En algunas aplicaciones, el número de conjuntos de secuencias adicionales es inferior a 30, por ejemplo, menos de 20 conjuntos, menos de 15 conjuntos, menos de 10 conjuntos, o preferiblemente, menos de 5 conjuntos. En una realización preferida, el número de conjuntos de secuencias adicionales es cuatro o cinco. En algunas aplicaciones, en cada conjunto de secuencias adicionales, la concentración de las secuencias vecinas cercanas en comparación con la secuencia de referencia es menor que la de la secuencia de referencia. El número de secuencias vecinas cercanas en un conjunto de secuencias adicionales está condicionado por la amplitud del intervalo dinámico que debe medir el oligo de control y la precisión con la que medir el intervalo dinámico. En una realización, donde las concentraciones para todas las secuencias vecinas cercanas abarcan colectivamente cuatro órdenes de magnitud en relación con la secuencia de referencia (por ejemplo, 1/10, 1/100, 1/1000, y 1:10000), el conjunto de secuencias adicionales comprende al menos cuatro secuencias vecinas cercanas. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el número de secuencias vecinas cercanas en el conjunto de secuencias adicionales está entre 5 y 20, entre 5 y 10, o entre 10 y 20 secuencias. Por ejemplo, un conjunto de secuencias adicionales comprende una secuencia de referencia y 10 secuencias vecinas cercanas, 9 secuencias vecinas cercanas, 8 secuencias vecinas cercanas, 7 secuencias vecinas cercanas, 6 secuencias vecinas cercanas o 5 secuencias vecinas cercanas.
En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a métodos en donde:
• Las dianas adicionales son oligos monocatenarios con una dispersión colectiva de longitudes correspondientes a la dispersión observada en una muestra típica de ADNct;
• Las dianas adicionales se fabrican en grandes lotes y se agregan a cada muestra de ADN/ARN del paciente antes de la síntesis de la biblioteca;
• Las dianas adicionales tienen, cada una, una secuencia diferente, sin relación entre sí o con secuencias humanas;
• Cada diana adicional es una mezcla de una secuencia de referencia y nueve secuencias vecinas cercanas, cada una con una o más sustituciones;
• Cada secuencia vecina cercana se añade a la secuencia de referencia a una concentración definida;
• El conjunto de concentraciones para todas las secuencias vecinas cercanas abarca colectivamente cuatro órdenes de magnitud en relación con la secuencia de referencia: por ejemplo, 1/10, 1/100, 1/1000, y 1:10.000;
• Los conjuntos de oligos de ensayo correspondientes a cada diana adicional se sintetizan de manera conjunta con los oligos de ensayo específicos del paciente;
• Un conjunto de oligos de ensayo de la diana adicional dado amplifica la secuencia de referencia y todas las secuencias vecinas cercanas para un conjunto dado de dianas adicionales;
• Al leer los recuentos de doce secuencias de referencia, por ejemplo, y de sus secuencias vecinas cercanas, es posible determinar el LDD y el intervalo dinámico de cada síntesis específica del paciente con cada muestra; y/o
• Cada punto en la curva de dosis-respuesta tendrá 12 mediciones diferentes, por ejemplo, una de cada conjunto de dianas adicionales.
Los oligos de control de síntesis son oligos que son complementarios al conjunto de secuencias adicionales y, a través de un conjunto de etapas de ensayo, generarán una señal medible que informa la secuencia de nucleótidos de los complementos en línea con los oligos específicos del paciente. Por lo tanto, un oligo de control de síntesis reconoce una secuencia de referencia y sus correspondientes secuencias vecinas cercanas. El oligo específico del paciente es un oligo que es complementario a una secuencia en la muestra de ADN o ARN. En algunas realizaciones, el oligo específico del paciente es complementario al ADNct. En algunos aspectos, el oligo específico del paciente es complementario a un oncogén.
Los métodos divulgados validan los oligos específicos del paciente para su uso en ensayos multiplexados específicos del paciente. En particular, la validación descarta cualquier efecto que la síntesis de los oligos pueda tener sobre los resultados de los ensayos específicos del paciente. Los oligos específicos del paciente se pueden emplear en la secuenciación de próxima generación, pero se pueden aplicar a cualquier ensayo multiplexado basado en ADN o ARN en el que la colección de dianas del ensayo esté determinada por la secuencia de los oligos del ensayo. Por tanto, el analito puede ser ADN o ARN. En algunos aspectos, los oligos específicos del paciente se pueden emplear para la evaluación de la expresión génica, tal como la expresión de un transcrito específico del cáncer. En algunos aspectos, los oligos específicos del paciente se pueden emplear para monitorear el desarrollo de la enfermedad o la eficacia del tratamiento rastreando la expresión de un transcrito específico o detectando la presencia de una copia particular de un gen. En una realización preferida, los oligos específicos del paciente se emplean para monitorear el desarrollo y/o la progresión del cáncer o la eficacia del tratamiento del cáncer empleando biopsias líquidas, tales como la detección de ADNct.
El ADN libre de células (ADNlc) liberado en la circulación sanguínea por los tumores permite la identificación no invasiva de las mutaciones iniciales específicas del tumor. Sin embargo, no todos los cambios moleculares en los tumores implican mutaciones en el ADN; en muchos casos, también es importante la cantidad de un gen en particular (por ejemplo, la expresión génica). En una realización, el ARNlc liberado en la sangre se emplea para monitorear la expresión génica en pacientes con cáncer. En una realización particular, la vía PD-1/PD-L1 es una diana terapéutica prometedora y los agentes anti-PD-LI han mostrado una actividad alentadora en una variedad de tipos de tumores.
En determinadas realizaciones, el ARNlc se extrae de una muestra de un paciente y se somete a un análisis adicional como se describe en la presente memoria. Para evaluar la cantidad de ARN celular para un gen en particular (por ejemplo, PD-L1), el plasma se puede fraccionar de la sangre extraída del paciente. Los métodos de fraccionamiento de sangre son conocidos en la técnica e incluyen como ejemplos no limitantes el fraccionamiento mediante el método de Cohn (por ejemplo, fraccionamiento con etanol en frío), cromatografía, o combinaciones de los mismos.
En aún otras realizaciones, los recuentos de oligos se leen mediante un método cuantitativo o semicuantitativo. Ejemplos no limitantes de dichos métodos incluyen PCR cuantitativa (qPCR), PCR en tiempo real, PCR digital, secuenciación basada en cebadores.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para validar oligos específicos de pacientes para su uso en ensayos multiplexados específicos de pacientes, comprendiendo el método:
extraer ADN o ARN de una muestra de un paciente para producir una muestra de ADN o ARN;
introducir una pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales en la muestra de ADN o ARN para producir una muestra enriquecida, en donde la pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales comprende secuencias adicionales de concentraciones conocidas;
cosintetizar los oligos de control de síntesis y los oligos específicos del paciente; y
ensayar la muestra enriquecida con los oligos de control de síntesis para producir una lectura de los recuentos de los conjuntos de secuencias adicionales; y
comparar los recuentos de los conjuntos de secuencias adicionales con las concentraciones conocidas de las secuencias adicionales, en donde el límite de detección (LDD) y el intervalo dinámico para los oligos específicos del paciente se validan cuando los recuentos de los conjuntos de las secuencias adicionales corresponden a las concentraciones conocidas de las secuencias adicionales,
en donde un conjunto de secuencias adicionales comprende:
una secuencia de referencia única; y
una pluralidad de secuencias vecinas cercanas, en donde cada secuencia vecina cercana comprende al menos una sustitución, inserción, y/o deleción en comparación con la secuencia de referencia y la concentración de cada secuencia vecina cercana es menor que la concentración de la secuencia de referencia; y
en donde la lectura de los recuentos de secuencias adicionales determina las características de dosisrespuesta de los oligos de control de síntesis, que actúan como sustitutos de los oligos específicos del paciente en el ensayo y proporcionan una verificación de control de calidad para la síntesis por lote de los oligos específicos del paciente.
2. Un método para validar oligos específicos de pacientes para su uso en ensayos multiplexados específicos de pacientes, comprendiendo el método:
extraer ADN o ARN de una muestra de un paciente para producir una muestra de ADN o ARN;
introducir una pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales en la muestra de ADN o ARN para producir una muestra enriquecida, en donde la pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales comprenden secuencias adicionales de concentraciones conocidas;
ensayar la muestra enriquecida con oligos de control de síntesis para producir una lectura de los recuentos de los conjuntos de secuencias adicionales, en donde los oligos de control de síntesis se cosintetizan con los oligos específicos del paciente; y
comparar los recuentos del conjunto de secuencias adicionales con las concentraciones conocidas de las secuencias adicionales, en donde el LDD y el intervalo dinámico para los oligos específicos del paciente se validan cuando los recuentos de los conjuntos de secuencias adicionales corresponden a las concentraciones conocidas de las secuencias adicionales,
en donde un conjunto de secuencias adicionales comprende:
una secuencia de referencia única; y
una pluralidad de secuencias vecinas cercanas, en donde cada secuencia vecina cercana comprende al menos una sustitución, inserción, y/o deleción en comparación con la secuencia de referencia y la concentración de cada secuencia vecina cercana es menor que la concentración de la secuencia de referencia; y
en donde la lectura de los recuentos de secuencias adicionales determina las características de dosisrespuesta de los oligos de control de síntesis, que actúan como sustitutos de los oligos específicos del paciente en el ensayo y proporcionan una verificación de control de calidad para la síntesis por lote de los oligos específicos del paciente.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde analizar la muestra enriquecida con oligos de control de síntesis comprende realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o secuenciar con los oligos de control de síntesis.
4. El método de la reivindicación 3, en donde la PCR es PCR digital o PCR cuantitativa.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los recuentos de secuencias adicionales actúan como un representante de las características de dosis-respuesta del oligo específico del paciente en la etapa de ensayo.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales comprende al menos 4 conjuntos de secuencias adicionales.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la concentración de cada secuencia vecina cercana es menor que la concentración de la secuencia de referencia; y/o
en donde las proporciones de la concentración de cada secuencia vecina cercana respecto a la concentración de la secuencia de referencia abarcan al menos cuatro órdenes de magnitud.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las proporciones de la concentración de la pluralidad de secuencias vecinas cercanas a la concentración de la secuencia de referencia comprenden 1:10, 1:100, 1:1000, y 1:10.000.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada conjunto de secuencias adicionales comprende el mismo número de secuencias vecinas cercanas; y/o
en donde la pluralidad de conjuntos de secuencias adicionales comprende el mismo conjunto de proporciones de la concentración de cada secuencia vecina cercana a la concentración de la secuencia de referencia.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los recuentos del conjunto de secuencias adicionales corresponden a las concentraciones conocidas de las secuencias adicionales cuando las proporciones de las secuencias vecinas cercanas en relación con la secuencia de referencia en base a los recuentos están dentro del 20%, 15%, 10%, 5%, o 1% de las proporciones de las secuencias vecinas cercanas en relación con la secuencia de referencia en base a las concentraciones conocidas, opcional o preferiblemente en donde el LDD y el intervalo dinámico para los oligos específicos del paciente se validan cuando las proporciones basadas en los recuentos están dentro del 1% de las proporciones en base a concentraciones conocidas.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la muestra del paciente es una muestra líquida que contiene ADN libre de células (ADNlc) y/o ARN libre de células (ARNlc), opcional o preferiblemente en donde el ADNlc y/o el ARNlc indican una mutación y/o cambio en la expresión en un gen seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, ERCCI, EGFR, TS, AREG, ErEG, VEGFR2, EML4ALK, ROSI, RET, c-Met, FGFRI, KRAS, BRAF, NRAS, Her-2, PIK3CA, KIT, GNAQ y GNA11.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los oligos específicos del paciente detectan el ADN tumoral circulante (ADNct).
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el paciente tiene o se sospecha que tiene cáncer, opcional o preferiblemente en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de cabeza y cuello, periampular, colorrectal, de pulmón, melanoma, gástrico, esofágico, de mama, de ovario, sarcoma, de células renales, de próstata, tumor del estroma gastrointestinal (GIST) y cáncer pancreático.
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