CN113227396A - 用于定量生物靶的稀释标签 - Google Patents

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Abstract

用于准确确定生物靶丰度的方法的实施方案可以包括生成与靶序列相关的分子的第一集合，其中所述分子的第一集合包括与相对浓度分布相关的稀释标签的第一集合；生成分子的第二集合，所述分子的第二集合包括与稀释标签的第一集合相关的稀释标签的第二集合；生成加稀释标签的混合物；使用分子的第二集合扩增加稀释标签的遗传靶的子集；从经扩增的子集生成经修饰的加稀释标签的混合物；确定生物样品的包含靶序列的不同分子的计数；和/或确定生物样品中的不同种类(species)的相对浓度的评估，诸如在巨大的动态范围内的评估。

Description

用于定量生物靶的稀释标签
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年8月6日提交的美国临时申请序列号62/715,175的权益，该临时申请通过该引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开内容总体涉及诊断和治疗领域，且更具体地涉及用于准确地定量生物靶的丰度的新的且有用的方法及系统。
附图简述
图1包括用于确定生物靶丰度的方法的实施方案的变化形式的流程图表示；
图2包括用于确定生物靶丰度的方法的实施方案的变化形式的示意性表示；
图3包括加稀释标签(dilution tagging)和确定靶计数的变化形式的示意性表示；
图4A-图4C包括加稀释标签和确定靶计数的变化形式的示意性表示；
图5A-图5C包括图示了在方法(例如，用于确定生物靶丰度)的实施方案的具体实例中确定生物靶分子的计数(例如，数量等)的图形表示。
图5A包括用于在给定靶分子数量的情况下检测稀释标签的存在概率的理论计算的具体实例。假设六个稀释标签(A-F)的浓度以一个数量级连续降低。使用了泊松过程(例如，基于靶分子更可能附接到更高浓度的稀释标签；等等)来计算至少一个靶分子将附接到每个稀释标签的概率，从而通过测序来检测稀释标签的存在。随着靶分子数量增加，每个稀释标签的存在概率增加，直到存在大量靶分子，使存在概率饱和。
图5B图示了具有检测到的读段的稀释标签箱(dilution tag bins)的百分比的特定热图实例。将处于数量级不同的浓度的六个稀释标签(A-F)添加到DNA样品，每个DNA样品包含不同量的靶分子。每个稀释标签与包含随机四核苷酸长的序列的箱标识物相关(例如，其中每个寡核苷酸包含稀释标签和箱标识物，等等)，其中箱标识物允许256个箱。在6*109个靶分子时，所有六个稀释标签都检测到包括所有256个箱的读段，表明稀释标签使靶分子完全饱和。从6*107个靶分子开始，最低浓度稀释标签没有在所有箱中检测到读段。随着靶分子数量减少，对于相同浓度稀释标签，具有检测到的读段的箱的百分比继续减少。在最初的PCR加尾反应后，通过柱纯化去除稀释标签。
图5C包括将图5B中的结果与图5A中的理论概率相结合以估计最初存在的靶分子数量的具体实例。图5C图示了估计的靶分子数量随实验的靶分子数量而变化。将测量的具有检测到的读段的稀释标签箱的百分比(如图5B中示出的)用于通过最佳匹配理论的稀释标签存在概率(如图5A中示出的)来估计靶分子数量。实验的靶分子数量说明将样品分成六等份，用于分别扩增每个稀释标签，并且估计效率因子为11.4％。
图6A-图6B包括针对方法的实施方案的变化形式，在不同测序深度的蒙特卡罗模拟(Monte Carlo simulations)的图形表示，诸如用于表明均衡的加稀释标签(equalizeddilution tagging)能够实现差异富集的模板的定量比较。在图6A中，DTag Eq显示出强的收敛特征，直到N＝64000。在图6B中，DTag Eq分辨出基因座之间<1.4倍的浓度差异；其中DTag Eq估计量对采样深度是不变的，并且对富集偏倚(enrichment biases)有容忍性(resilient)；
图7包括用于确定生物靶丰度的方法的实施方案的变化形式的流程图表示；
图8包括用于确定生物靶丰度的方法的实施方案的变化形式的流程图表示。
实施方案的描述
以下对实施方案(例如，包括实施方案的变化形式、实施方案的实例、实施方案的具体实例、其他合适的变型，等等)的描述不意图限于这些实施方案，而是使本领域技术人员能够制造和使用。
1.综述
如图1-图2中示出的，用于准确确定生物靶丰度的方法100的实施方案可以包括：生成与靶序列相关的分子的第一集合S110，其中分子的第一集合包括与相对浓度分布(concentration profile)相关的稀释标签的第一集合；生成分子的第二集合S120，所述分子的第二集合包括与稀释标签的第一集合相关的稀释标签的第二集合；基于对分子的第一集合和来自生物样品(例如血液样品)的遗传靶进行处理，生成加稀释标签的混合物S130，其中加稀释标签的混合物包括处于相对浓度分布的加稀释标签的遗传靶的子集；使用分子的第二集合扩增加稀释标签的遗传靶的子集S140；基于相对浓度分布，从经扩增的加稀释标签的遗传靶的子集生成经修饰的加稀释标签的混合物S150，其中经修饰的加稀释标签的混合物包括处于经修改的相对浓度分布的加稀释标签的遗传靶的子集，所述经修改的相对浓度分布能够减少对包含靶序列的不同分子的数量进行计数(例如，通过启用基于对数的计数，诸如对数计数、LogLog计数、HyperLogLog计数，等等)所需的序列读段的数量(例如，和相关的测序成本，等等)；基于对经修饰的加稀释标签的混合物的分析(例如，基于通过分析鉴定的有限稀释)，确定生物样品的包含靶序列的不同分子(例如，DNA分子)的计数S160；和/或确定生物样品的包括多种靶序列的若干不同种类(例如，DNA或RNA分子)的相对浓度的评估S170，所述若干不同种类可以以差异巨大的丰度存在，即，丰度在巨大的动态范围内。
方法100的实施方案可以另外地或可选择地包括：定量地比较不同的计数S170(例如，在不同时间段确定的计数，其诸如通过对在不同时间段收集的不同生物样品重复方法100的一部分来进行；与不同靶序列相关的计数；等等)；基于计数提供治疗S180；和/或任何其他合适的过程。
在具体的实例中，如图2中示出的，方法100可以包括：生成寡核苷酸的第一集合，所述寡核苷酸的第一集合包括寡核苷酸的不同子集，其中寡核苷酸的每个子集包括具有该寡核苷酸的子集独特的稀释标签的寡核苷酸(例如，其中稀释标签与加稀释标签的混合物的相对浓度分布相关)、被配置成在后处理期间提高计数确定的准确性的箱(bin)标识物(例如，4N，“NNNN”，实现例如44个箱的随机化核苷酸序列，等等)和与靶序列互补的正向或反向引物；生成寡核苷酸的第二集合，所述寡核苷酸的第二集合包括具有与寡核苷酸的第一集合的稀释标签的序列互补的正向或反向引物的寡核苷酸；用寡核苷酸的第一集合和来自生物样品的遗传靶进行标记过程(例如，两轮聚合酶链式反应)，从而生成加稀释标签的混合物，所述加稀释标签的混合物包括加稀释标签的遗传靶的不同子集，所述加稀释标签的遗传靶的不同子集通过由相对浓度分布指示的不同相对浓度的不同稀释标签对(Di F,Dj R)(例如，其中每个稀释标签对包括正向稀释标签和反向稀释标签)识别；用寡核苷酸的第二集合和加稀释标签的混合物进行扩增过程(例如，随后轮的聚合酶链式反应)(例如，对加稀释标签的混合物进行二次取样(subsample)；对于加稀释标签的遗传靶的每个不同子集，使用寡核苷酸的第二集合的互补引物扩增加稀释标签的遗传靶)；基于与稀释标签对相关的相对浓度分布，生成均衡的加稀释标签的混合物(例如，以促进基于对数的计数)，所述均衡的加稀释标签的混合物包括基本上相等浓度的加稀释标签的遗传靶的不同子集；以及基于对均衡的加稀释标签的混合物的分析，确定包含靶序列的不同分子的计数(例如，对均衡的加稀释标签的混合物进行测序；鉴定具有最大相对浓度同时未在序列读段中检测到的稀释标签对，其中与所鉴定的标签对相关的相对浓度指示计数；等等)。
在具体实例中，用于确定来自无细胞DNA(cfDNA)的生物靶的丰度的方法100可以包括：生成寡核苷酸的第一集合，所述寡核苷酸的第一集合包括寡核苷酸的不同子集，其中寡核苷酸的不同子集中的每个子集包括这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含：稀释标签(例如，与寡核苷酸的不同子集中的子集相关的稀释标签，其中稀释标签与指示不同稀释标签组合的不同相对浓度的相对浓度分布相关；等等)，和与生物靶相关的靶序列互补的靶相关区域(例如引物区)；生成寡核苷酸的第二集合，所述寡核苷酸的第二集合包括与寡核苷酸的第一集合的稀释标签的核苷酸序列互补的稀释标签相关区域；用寡核苷酸的第一集合和cfDNA进行标记过程，从而生成加稀释标签的混合物，所述加稀释标签的混合物包括加稀释标签的遗传靶的不同子集，所述加稀释标签的遗传靶的不同子集通过由相对浓度分布指示的不同相对浓度的不同稀释标签组合识别；用寡核苷酸的第二集合和加稀释标签的混合物进行扩增过程；生成经修饰的加稀释标签的混合物，所述经修饰的加稀释标签的混合物包括处于经修改的浓度的加稀释标签的遗传靶的不同子集(例如，基于与不同稀释标签组合相关的相对浓度分布；等等)；和/或基于经修饰的加稀释标签的混合物和与不同稀释标签组合相关的相对浓度分布确定生物靶的丰度。在具体实例中，方法100的实施方案可以包括从一种或更多种样品分离cfDNA用于随后分析(例如，确定靶分子的丰度；等等)。
方法100和/或系统200的实施方案可以被应用于确定不同生物靶的相对丰度(例如，在高动态范围内的相对丰度)，诸如液体活组织检查、微生物组宏基因组学、RNA-seq和/或任何其他合适的应用(例如，需要分析相对少量序列读段的应用；需要对以1:1000或更低的比例的多个基因座的相对丰度进行定量的应用；等等)。在实例中(例如，如图7中示出的)，用于对来自无细胞DNA(cfDNA)的不同生物靶的相对丰度进行准确、高动态范围的确定的方法100可以包括：对于与不同遗传基因座相关的不同生物靶的每个生物靶：生成寡核苷酸的第一集合，所述寡核苷酸的第一集合包括基于相对浓度分布处于预先确定的相对浓度的寡核苷酸的不同子集，其中寡核苷酸的不同子集中的每个子集包括包含稀释标签(例如，寡核苷酸的不同子集中的该子集独特的稀释标签，其中稀释标签与指示不同稀释标签对的不同相对浓度的相对浓度分布相关；等等)的寡核苷酸以及与生物靶相关的靶序列互补的引物区；生成寡核苷酸的第二集合，所述寡核苷酸的第二集合包括与寡核苷酸的第一集合的稀释标签的核苷酸序列互补的稀释标签相关引物区；用寡核苷酸的第一集合和cfDNA样品进行标记过程，从而生成加稀释标签的混合物，所述加稀释标签的混合物包括加稀释标签的遗传靶的不同子集，所述加稀释标签的遗传靶的不同子集通过由相对浓度分布指示的不同相对浓度的不同稀释标签对识别；用寡核苷酸的第二集合和加稀释标签的混合物进行扩增过程；基于与不同稀释标签对相关的相对浓度分布，生成均衡的加稀释标签的混合物，所述均衡的加稀释标签的混合物包括基本上相等浓度的加稀释标签的遗传靶的不同子集；以及基于均衡的加稀释标签的混合物和与不同稀释标签对相关的相对浓度分布，确定对应于生物靶的不同靶分子的计数；和/或基于不同生物靶的计数确定不同生物靶的相对丰度。
在具体的实例中，不同生物靶的相对丰度的准确、高动态范围的确定可以用于液体活组织检查，其中不同生物靶与癌症状况相关，并且其中确定不同生物靶的相对丰度包括确定不同生物靶的相对丰度以促进癌症状况的表征。在具体的实例中，不同生物靶包括ERBB2基因(HER2)靶，其中确定不同生物靶的相对丰度可以包括确定关于ERBB2基因靶的相对丰度，以促进与ERBB2基因靶相关的癌症状况(例如，乳腺癌状况)的表征。在具体的实例中，不同生物靶包括KRAS基因突变，其中确定不同生物靶的相对丰度包括确定关于KRAS基因突变的相对丰度，以促进与KRAS基因突变相关的癌症状况的表征。
方法100和/或系统200的实施方案的任何合适的部分可以以任何合适的方式整合。在实例中(例如，如图8中示出的)，用于确定来自无细胞DNA(cfDNA)的生物靶的丰度的方法100可以包括：生成分子的第一集合，所述分子的第一集合包括分子的不同子集，所述分子的不同子集包括与所述分子的不同子集相关的不同稀释标签，其中不同稀释标签与相对浓度分布相关，所述相对浓度分布指示与所述不同稀释标签相关的不同相对浓度；基于分子的第一集合和cfDNA，生成加稀释标签的混合物，所述加稀释标签的混合物包括加稀释标签的遗传靶的不同子集，所述加稀释标签的遗传靶的不同子集包括与由相对浓度分布指示的不同相对浓度相关的不同稀释标签；生成经修饰的加稀释标签的混合物，所述经修饰的加稀释标签的混合物包括处于经修改的浓度的加稀释标签的遗传靶的不同子集(例如，基于相对浓度分布；可选择地不基于相对浓度分布；等等)；和/或基于经修饰的加稀释标签的混合物和相对浓度分布确定生物靶的丰度。
方法100和/或系统200的实施方案可以起到实现对具有一个或更多个靶序列的不同分子进行基于对数的计数的作用(例如，通过利用与鉴定稀释标签对相关的洞察(insights)，所述稀释标签对对应于分析物所处的在稀释系列中低于检测阈值的有限稀释，等等)，这可以促进以下方面的改进：动态范围(例如，如图6A-图6B中示出的；关于准确计数(例如，对罕见靶序列进行准确计数)所需的测序深度，等等)、准确性(例如，通过克服与常规方法相关的富集偏倚，诸如但不限于GC偏倚和扩增噪声，等等)、成本(例如，通过减少计数所需的测序读段的数量)、可部署性(depolyability)(例如，通过与下一代测序系统的兼容整合；通过与本文描述的应用相关的分析系统的兼容整合；等等)，和/或其他合适的方面。在具体实例中，可以进行方法100的实施方案的任何合适的部分，以在大的动态范围内准确地确定一个或更多个靶序列的丰度。方法100和/或系统200的实施方案可以另外地或可选择地起到实现对在不同时间确定的计数、对不同靶序列(例如，在不同基因座处)确定的计数、对不同生物样品(例如，来自不同用户；来自同一用户的不同区域；等等)确定的计数，和/或对任何合适的状况差异确定的计数进行有意义的比较的作用。方法100和/或系统200的实施方案可以被应用于任何合适类型的核酸分子(例如，DNA、RNA、无细胞DNA、无细胞RNA、来自产前样品的核酸；等等)和/或任何其他合适类型的分子的定量(例如，丰度确定，等等)。方法100和/或系统200的实施方案可以被应用于确定任何合适的生物靶的定量(例如丰度确定)，诸如来自不同基因座的(例如，相同染色体的、不同染色体的；等等)生物靶序列的定量(例如丰度确定)，这可以促进相对丰度的比较。
在具体实例中，如图5A-图5C中示出的，方法100的实施方案的一部分可以被应用于准确地估计实验样品中最初存在的靶分子的计数。图5A包括用于在给定的靶分子数量的情况下检测稀释标签的存在概率的理论计算的具体实例。图5B图示了具有检测到的读段的稀释标签箱的百分比的特定热图实例。图5C包括将图5B中的结果与图5A中的理论概率结合以估计最初存在的靶分子数量的具体实例。然而，可以使用任何合适浓度的稀释标签(例如，作为寡核苷酸的一部分)，并且可以使用方法100和/或系统200的实施方案的一部分来估计任何合适的靶分子数量。
方法100和/或系统200的实施方案可以包括在以下一种或更多种情况中的表征(例如，诊断，等等)和/或治疗(例如，治疗确定、治疗评价和随时间的改变，等等)和/或可以以其他方式用于在以下一种或更多种情况中的表征(例如，诊断，等等)和/或治疗(例如，治疗确定、治疗评价和随时间的改变，等等)：癌症(例如，用方法100的实施方案处理液体活组织检查样品，以在对治疗进行确定和/或评价中评价随时间推移的循环肿瘤DNA的盛行率(prevalence)；靶向与癌症相关的基因突变，诸如KRAS基因突变和/或与癌基因相关的其他合适的靶；等等)，非侵入性产前检测(NIPT)(例如，与任何合适的染色体状况的遗传筛查相关，等等)，RNA-seq(例如，用于随时间推移的基因表达分析；其中RNA样品中的靶序列可以是相对罕见的；等等)，外排体分析(exosome analysis)，微生物组分析(例如，用于靶向特定的微生物生物标志物，诸如靶16S rRNA区域；用于靶向致病微生物；等等)，发病机制(例如，用于评价群体中抗生素抗性的传播，等等)，食品分析(例如，用于鉴定含有致病微生物诸如肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)的食品，等等)，环境分析(例如，用于快速检测特定基因产物诸如抗生素抗性基因的水平；评价可能与农业相关的环境样品诸如土壤的物种组成；用于随时间推移的环境监测应用，以测量工业活动或气候变化的生态影响)，免疫系统分析(例如，用于评价与疾病状态相关的抗体和相关受体随时间推移的进展；基于血流中器官供体DNA随时间推移的相对量，评价免疫抑制剂治疗的提供和/或器官供体排斥的风险；评价移植物抗宿主病的风险，诸如确定如何以及是否提供治疗；等等)，以及遗传紊乱(例如基因扩增、基因缺失、部分染色体异常、22q11.2缺失综合征或迪格奥尔格综合征、Charcot-Marie-Tooth综合征、囊性纤维化、亨廷顿氏病、杜氏肌营养不良、镰状细胞性贫血、血友病、地中海贫血，等等)。应用可以另外地或可选择地包括：精神和行为状况(例如，心理障碍；抑郁；精神病；等等)；交流相关的状况(例如，表达性语言障碍；口吃；语音障碍；孤独症障碍；声音状况；听力状况；眼部状况；等等)；睡眠相关的状况(例如，失眠、睡眠呼吸暂停；等等)；心血管相关的状况(例如，冠状动脉疾病；高血压；等等)；代谢相关的状况(例如，糖尿病，等等)、类风湿相关的状况(例如，关节炎，等等)；体重相关的状况(例如，肥胖症，等等)；疼痛相关的状况；内分泌相关的状况；遗传相关的状况；慢性疾病；和/或任何其他合适类型的应用。
实施方案可以另外地或可选择地将实体(例如，生物样品、靶、合成分子、用户、样品处理系统、计算系统等等)转化成不同的状态或事物。例如，方法100可以包括从组分引物(constituent primer)和稀释标签合成寡核苷酸，以便将靶处理成适于提高基因测序效率(例如，从而改进测序系统)和计数准确性(例如，从而改进计算机相关技术和计算机系统本身的运行)的形式，以实现先前不可进行的用户状况表征和/或治疗评价(例如，通过以切实可行的成本促进有意义的计数比较)。然而，在使用与靶标志物相关的非通用计数系统的情况下，实施方案可以提供任何其他合适的一种或更多种益处。
方法100和/或本文描述的方法的一个或更多个实例和/或部分可以通过和/或使用本文描述的系统、组件和/或实体的一个或更多个实例，在时间上相对于触发事件不同步地(例如，顺序地)、同时地(例如，平行地；以多重、自动化的方式同时处理生物样品以确定与一种或更多种靶序列、用户和/或其他合适的实体相关的一组计数；同时地在计算上处理序列读段以提高系统处理能力；等等)，和/或以任何合适的时间和频率以任何其他合适的顺序进行。系统的实施方案可以包括样品处理网络，所述样品处理网络被配置为合成分子、用分子处理生物样品和/或进行其他合适的过程；测序系统，所述测序系统被配置为对来自生物样品的经处理的遗传物质进行测序；计算系统，所述计算系统被配置为对序列进行分析；和/或任何其他合适的组件。然而，方法100和系统200可以以任何合适的方式配置。
另外地或可选择地，本文描述的数据(例如，丰度度量；计数；表征；模型；比率；标识物；读段深度；序列读段；分子设计诸如寡核苷酸设计、引物设计、实验设计；等等)可以与任何合适的时间指示物(例如，秒、分、小时、天、周、时间段、时间点、时间戳，等等)相关，所述时间指示物(例如，秒、分、小时、天、周、时间段、时间点、时间戳，等等)包括以下中的一种或更多种：指示何时收集、确定、发送、接收和/或以其他方式处理数据的时间指示物；为数据所描述的内容提供背景的时间指示物；时间指示物的变化(例如，随时间推移的数据；数据的变化；数据模式；数据趋势；数据外推和/或其他预测；等等)；和/或与时间有关的任何其他合适的指示物。
另外地或可选择地，本文描述的参数、度量、输入、输出和/或其他合适的数据可以与值类型相关，所述值类型包括以下中的任何一种或更多种：分数(score)、二进制值、分类、置信水平、标识物(例如，本文描述的任何合适的分子的样品标识物、分子标识物，等等)、沿谱的值(values along a spectrum)和/或任何其他合适类型的值。本文描述的任何合适类型的数据可以用作输入物，生成为输出物，和/或以任何对于与方法100和/或系统200的实施方案相关的任何合适的组分合适的方式操纵。
与方法100和/或系统200的实施方案的一个或更多个部分相关(例如，关于对加稀释标签的遗传靶进行测序；与测序引物相关；等等)的测序和/或测序相关技术(例如，关于加稀释标签的S130和/或S140的测序)可以包括高通量测序，该高通量测序可以包括以下中的任何一种或更多种，和/或与以下中的任何一种或更多种相关：NGS、NGS相关技术、大规模平行签名测序(massibely parallel signature sequencing)、聚合酶克隆测序(Polonysequencing)、454焦磷酸测序、Illumina测序、SOLiD测序、Ion Torrent半导体测序、DNA纳米球测序、Heliscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序、纳米孔DNA测序、任何代数的测序技术(例如，第二代测序技术、第三代测序技术、第四代测序技术，等等)、扩增子相关测序(例如，靶向扩增子测序)、宏基因组相关测序、合成测序(sequencing-by-synthesis)、隧穿电流测序(tunneling currents sequencing)、杂交测序(sequencing byhybridization)、质谱测序、基于显微术的技术，和/或与高通量测序有关的任何合适的技术。另外地或可选择地，测序和/或测序相关技术可以包括和/或应用任何合适的测序技术(例如，Sanger测序、毛细管测序、任何合适的测序技术，等等)。
方法100和/或系统200的实施方案可以以遗传方式或以其他方式在生物系统(例如活细胞，诸如细菌、真菌、昆虫细胞系、哺乳动物细胞系、人类细胞系和模式生物，其实例包括但不限于黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、斑马鱼(Danio rerio))中直接或间接编码，其例如通过在细胞系统或生物系统内在体内将以不同浓度天然存在于细胞中或者被工程化为以不同浓度产生(例如通过使用不同强度的启动子或改变分子标签的转录、翻译、产生或分子标签向其活性形式转化的任何其他方法100)的化学或分子标签(例如生物素、泛素、麦芽糖结合蛋白、MS2外壳结合蛋白或任何其他要素、代谢物、化学物质，或在细胞中天然或人工产生的蛋白质产物)附接到任何生物靶分子(例如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物)进行，联合用于分子标签和相关实体的亲和纯化的模式(modality)，和/或联合通过化学、荧光或免疫组织化学手段检测分子标签的系统，和/或联合用于使用质谱、核磁共振、显微术或任何合适的技术定量或以其他方式表征分子标签的量或时空分布的系统，作为同时推断一种或许多种生物靶的相对丰度或阈值浓度的方法(例如，比较两种不同蛋白质的浓度或鉴定细胞中在一定浓度范围内存在的所有蛋白质)。
系统200的实施方案可以包括样品处理网络，该样品处理网络被配置为生成分子(例如，分子的第一集合、分子的第二集合；等等)、处理生物样品(例如cfDNA样品；等等)、促进加稀释标签的混合物的生成和/或进行其他合适的方法；测序系统，该测序系统被配置为对加稀释标签的遗传靶和/或其他合适的材料进行测序；计算系统(例如，远程计算系统、本地计算系统，等等)，该计算系统被配置为分析序列、进行计数过程、确定丰度度量、促进表征和/或进行合适的计算过程；和/或任何其他合适的组件。然而，方法100和系统200可以以任何合适的方式配置。
2.1方法-生成分子的第一集合。
生成包括稀释标签的第一集合的分子的第一集合S110可以起到合成一种或更多种分子以用于与一种或更多种生物样品一起处理的作用，其中分子可以通过与浓度分布相关的稀释标签识别。分子的第一集合优选地与一个或更多个靶标志物相关(例如，与其互补或以其他方式对其具有亲和力；靶向；能够被其处理；等等)。靶标志物优选地包括靶序列(例如，指示用户状况的核酸序列；包括突变、多态性等的序列)，但是可以另外地或可选择地包括：蛋白质(例如血清蛋白、抗体，等等)、肽、碳水化合物、脂质、其他核酸(例如，细胞外RNA、微RNA、信使RNA，其中对RNA靶的丰度确定可以包括合适的逆转录酶操作，等等)、全细胞、代谢物、药理剂(pharmacologic agents)、天然产物、遗传倾向生物标志物、诊断生物标志物、预后生物标志物、预测生物标志物、其他分子生物标志物、基因表达标志物、成像生物标志物和/或其他合适的标志物。靶标志物优选地与本文描述的应用相关，并且可以另外地或可选择地与一种或更多种用户状况相关，所述用户状况包括：症状、病因(cause)、疾病、紊乱/障碍和/或与状况相关的任何其他合适的方面。例如，方法100可以包括生成包含正向引物的分子的第一子集和包含反向引物的分子的第二子集，其中引物靶向KRAS癌基因中的突变。
分子优选地包括一种或更多种寡核苷酸。寡核苷酸(和/或其他分子类型)可以包括以下一种或更多种：引物、稀释标签、箱标识物、测序分子(例如，被配置为便于测序系统的运行的测序引物；等等)、探针、用于引入突变和/或限制性位点的组分、RNA的类型(例如反义RNA、小干扰RNA，等等)和/或其他合适的组分。如此，分子的集合中的每个分子可以包括含有不同类型的信息的多于一个标识物(例如，包括稀释标签、箱标识物、充当标识物的引物，等等)。在一个实例中，如图2和图4A中示出的，生成分子的集合可以包括合成：寡核苷酸的第一子集，其中每个寡核苷酸包含正向引物(例如，退火至靶序列)、来自稀释标签的集合的稀释标签，和来自箱标识物的集合的箱标识物；和寡核苷酸的第二子集，其中每个寡核苷酸包含反向引物(例如，与靶序列的互补链退火)、来自稀释标签的集合的稀释标签，和来自箱标识物的集合的箱标识物。在具体的实例中，寡核苷酸的不同子集(例如，寡核苷酸的第一集合的不同子集；等等)包括正向引物子集和反向引物子集，其中正向引物子集中的正向引物子集的寡核苷酸包括：寡核苷酸的不同子集中的第一子集独特的稀释标签；和用于退火至与靶序列相关的链的正向引物区；其中反向引物子集中的反向引物子集的寡核苷酸包括：寡核苷酸的不同子集中的第二子集独特的稀释标签；和退火至与靶序列相关的互补链的反向引物区；并且其中生成寡核苷酸的第一集合包括生成预先确定的相对浓度的寡核苷酸的第一集合，正向引物子集和反向引物子集中的至少一个的预先确定的相对浓度是不同的。在具体的实例中，正向引物子集和反向引物子集处于不同的相对浓度。在具体的实例中，正向引物子集可以包括不同的相对浓度，而反向引物子集则保持在基本上相似的浓度；或反之亦然。在另一个实例中，合成的寡核苷酸的长度各自为15-25个碱基，但是寡核苷酸(和/或本文描述的其他合适的组分，诸如靶序列、加稀释标签的混合物组分，等等)可以具有任何合适的长度(例如，任何合适的碱基数量)。
分子的集合中的每个分子优选地包含一个或更多个稀释标签。稀释标签优选地指示与用稀释标签加标签的分子相关的浓度(例如，相对于其他稀释标签的相对浓度；绝对浓度；等等)。在一个实例中，稀释标签对(例如，包含用于靶序列的正向引物的第一寡核苷酸的第一稀释标签和包含用于靶序列的反向引物的第二寡核苷酸的第二稀释标签，等等)被处理以获得相对于其他稀释标签对(例如稀释标签的集合的其他对排列)的预先确定的浓度(例如，对于加稀释标签的混合物中加稀释标签的遗传靶的子集)，诸如根据相对浓度分布处理，如图2和图4B中示出的。在另一个具体实例中，处理个体稀释标签以获得相对于其他个体稀释标签的相对浓度。然而，浓度信息可以与任何合适数量的稀释标签或稀释标签的组合相关(例如，单个稀释标签、一对、至少三个，等等)。稀释标签优选地是映射到浓度信息(例如，纳入相对浓度分布中的浓度信息)的核苷酸序列，但是可以具有本文描述的任何合适的组分类型。然而，稀释标签可以以任何合适的方式配置。
在一种变化形式中，分子的集合(例如，分子的第一集合、分子的第二集合；等等)中的分子可以包含一个或更多个箱标识物(例如，如图4A、图4C中示出的；等等)。优选地，箱标识物促进(例如，在计算后处理期间)将加稀释标签的遗传靶(和/或其他组分)分组到箱中(例如，其中可以确定每个箱的计数，并且可以通过对与箱相关的个体计数取平均值来确定总计数，等等)，诸如以提高计数准确性(例如，通过利用多于一个个体计数测量来确定具有更高准确性的总计数，等等)，但是可以另外地或可选择地促进任何其他合适的过程和/或目标。箱标识物优选地包括随机化序列。例如，箱标识物可以包括含有一个或更多个“N”核苷酸的N随机化序列，其中“N”可以是处于相等概率(或处于在不同核苷酸之间的任何合适的概率分布)的生物核苷酸(例如，对于基于DNA的分子为A、C、G和T)之一。在具体的实例中，每个分子可以包括“NNNN”随机化序列的箱标识物，用于实现分箱为多达44个箱(例如，对应于“AAAA”、“AAAT”、“AAAC”、“AAAG”，以及以等比例的“NNNN”序列的其他核苷酸排列的箱)。另外地或可选择地，箱标识物可以包括非随机化序列(例如，预先确定的序列)。箱标识物可以促成任何合适数量的箱，以改进计数确定。在一个实例中，确定箱标识物可以包括基于预期计数选择一定数量的箱(例如，选择一定数量的箱以使每个箱能够与足够的测序深度相关；选择一定数量的“N”核苷酸，“N”核苷酸的该数量使得一定数量的箱能够超过预期计数，从而可以通过在计算后处理中将箱组合来优化动态范围和/或准确性)；以及基于所选数量的箱来确定箱标识物(例如，特定序列)。然而，箱标识物可以以任何合适的方式配置。
在另一种变化形式中，分子集合中的分子可以包括被配置为帮助测序系统的运行的一种或更多种测序分子。测序分子优选地包括测序引物(例如，测序引物1和测序引物2，用于促进Illumina测序系统上的成对末端测序)，但是可以另外地或可选择地包括衔接子序列，和/或与任何合适的测序系统(例如，纳米孔测序系统；与任何合适的测序质量分数相关的测序系统；用于本文描述的任何合适应用的测序系统，诸如RNA-seq；等等)相关的其他合适的组分。然而，测序分子可以以任何合适的方式配置。
生成分子可以包括通过进行以下中的任何一种或更多种来合成分子：亚磷酰胺方法、合成后处理、纯化(例如，使用高效液相色谱或其他色谱方法、脱盐、洗涤、离心，等等)、扩增技术(例如聚合酶链式反应)、基于质粒的核酸合成、其他基因合成技术和/或任何合适的样品处理技术。可以生成分子的集合，以用于与多个靶序列相关的多个生物样品一起进行处理(例如，同时合成一批分子以用于多个用户的样品，以提高样品处理系统的效率)。另外地或可选择地，任何合适数量的分子和/或分子类型可以在任何合适的时间和以任何合适的频率生成。
然而，生成包括稀释标签的分子S110可以以任何合适的方式进行。
2.2方法-生成分子的第二集合。
生成包括与稀释标签的第一集合相关的稀释标签的第二集合的分子的第二集合S120可以起到生成分子的第二集合的作用，所述分子的第二集合可以与关于分子的第一集合生成的产物(例如，加稀释标签的遗传靶)一起进行处理(例如，用于PCR中，等等)，和/或可以与任何合适的组分一起进行处理。生成分子的第二集合可以以类似于生成分子的第一集合的任何方式进行(例如，分子的第二集合中的分子可以包括任何类似的组分，等等)。在一个实例中，如图2和图4C中示出的，生成分子的第二集合可以包括合成：寡核苷酸的第一子集，其中每个寡核苷酸包括靶向来自分子的第一集合的分子(例如，包含靶向靶序列的正向引物的寡核苷酸)的稀释标签的正向引物，和测序分子(例如，测序引物1)；和寡核苷酸的第二子集，其中每个寡核苷酸包括靶向来自分子的第一集合的分子(例如，包含靶向靶序列的反向引物的寡核苷酸)的稀释标签的反向引物。在具体的实例中，可以为每种不同类型的稀释标签生成分子的不同子集(例如，寡核苷酸的不同子集，其中每个子集包括靶向不同稀释标签类型的不同引物)。
在实例中，分子(例如，寡核苷酸，等等)的第二集合包括测序引物(例如，本文描述的测序引物和/或测序引物区；等等)来促进加稀释标签的遗传靶的不同子集的高通量测序。
然而，生成分子的第二集合S120可以以任何合适的方式进行(或省略，如同方法100的任何其他合适的部分可以进行的)。
2.3方法-生成加稀释标签的混合物。
基于将分子的第一集合与来自生物样品的靶一起进行处理来生成加稀释标签的混合物S130可以起到用来自分子的第一集合的稀释标签标记(例如，加标签，等等)生物样品(例如，来自生物样品的遗传靶)的作用。生成加稀释标签的混合物可以另外地或可选地起到扩增生物样品的组分、预处理生物样品(例如，样品制备、裂解、基于珠的过程、其他纯化和/或核酸提取技术，等等)和/或以任何合适的方式处理生物样品的作用。方法100可以包括收集一种或更多种生物样品(例如，收集在样品收集试剂盒中提供给用户的样品容器中)，所述生物样品可以包括以下中的任何一种或更多种：血液、血浆、血清、组织、活组织检查、汗液、尿液、粪便、精液、阴道分泌物、泪液、组织间液、其他体液和/或任何其他合适的样品(例如，与人类用户、动物、物体诸如食品、微生物等相关)。生物样品可以包括来自多个用户的组分(例如，包含来自母亲的核酸和来自母亲的未出生婴儿的核酸的血液样品)、跨越多个时间段收集的组分和/或跨越任何合适的状况而不同的组分，使得生成一种或更多种加稀释标签的混合物可以对任何合适数量和类型的实体进行。靶优选地包含一个或更多个靶序列(例如，其中遗传靶是包含靶序列的DNA分子)，但是生成加稀释标签的混合物(和/或方法100的其他部分)可以另外地或可选择地用于任何合适的靶类型(例如，本文描述的靶标志物类型)。
生成加稀释标签的混合物优选地包括用一个或更多个稀释标签对样品组分加标签，其诸如通过引物延伸或连接或其他合适的加标签方法进行。在一个实例中，生成的加稀释标签的混合物可以包括通过不同稀释标签对(Di F,Dj R)识别的加稀释标签的遗传靶的不同子集，其中用分子的第一集合处理生物样品，以获得处于预先确定的相对浓度分布的加稀释标签的遗传靶的不同子集。在具体的实例中，如图2和图4A-4B中示出的，分子的第一集合可以包括与正向引物相关的四种稀释标签类型的第一子集，以及与反向引物相关的四种稀释标签类型的第二子集，其中将分子的第一集合与生物样品一起处理可以产生加稀释标签的混合物，所述加稀释标签的混合物包括针对稀释标签对的每种排列(例如，包括与正向引物相关的四种稀释标签之一并且包括与反向引物相关的四种稀释标签之一的稀释标签对)的加稀释标签的遗传靶的不同子集。可选择地，稀释标签对(和/或其他稀释标签组合)可以不依赖于引物类型(例如，不依赖于引物是正向引物还是反向引物)。然而，加稀释标签的混合物可以包括任何合适浓度的任何合适数量的加稀释标签的遗传靶类型。
在另一个实例中，生成加稀释标签的遗传靶的子集包括进行两轮PCR(或任何合适数量的轮的PCR)，以使分子的第一集合的正向引物和反向引物退火至靶序列。另外地或可选择地，用稀释标签对样品组分加标签可以通过以下的任何一种或更多种进行：连接技术(例如，粘性末端连接；平末端连接；用DNA连接酶诸如Taq连接酶、T4连接酶、T3连接酶、T7连接酶和/或其他合适的连接酶进行连接；用RNA连接酶连接；拓扑异构酶介导的连接；等等)、标签片段化(tagmentation)技术(例如，其中DNA和/或其他合适的核酸分子被裂解和加标签)、加标签技术(例如，加分子标签技术、加荧光标签技术、粒子标记技术，等等)，通过环化方法捕获(例如，分子倒置探针，其中合成的分子可以包括单链探针，该单链探针包括促进丰度确定的稀释标签；基因选择器(gene selector)；通过选择性环化捕获；等等)，其他基因组分区技术(genomic partitioning techniques)，和/或任何其他合适的技术。在一个实例中，生成加稀释标签的混合物包括基于以下中的至少一种用不同的稀释标签对靶分子加标签：基于PCR的技术、连接技术和标签片段化技术。在应用连接技术的实例中，方法100可以包括：合成分子的集合，所述分子的集合包括稀释标签和箱标识物(例如，其中将引物从合成的分子中省略)；使用一种或更多种连接技术将分子的集合连接到来自生物样品的靶(例如，DNA靶)；对经连接处理的靶进行大规模平行定量PCR(qPCR)和/或合适的扩增技术；以及基于经连接处理的靶确定丰度度量。关于在加稀释标签的情况下应用连接技术(和/或其他合适的技术)，应用可以包括：16S宏基因组学、RNA-seq、外排体RNA测序、与适应性免疫相关的测序和/或本文描述的其他合适的应用。
生成加稀释标签的混合物可以包括标记来自生物样品的一个或更多个遗传靶，诸如通过用稀释标签对遗传靶加标签而进行的过程。在实例中，标记可以包括进行以下中的一种或更多种：基于PCR的技术(例如，固相PCR、RT-PCR、qPCR、多重PCR、降落PCR(touchdownPCR)、纳米PCR(nanoPCR)、巢式PCR、热启动PCR，等等)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导等温扩增(LAMP)、自主序列复制(self-sustained sequence replication,3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链式反应(LCR)和/或任何其他合适的扩增技术和/或相关的方案。在具体的实例中，生成加稀释标签的混合物可以包括用分子的第一集合和样品(例如，cfDNA样品)进行第一PCR过程，其中分子的第一集合包括与生物靶相关的靶序列互补的引物区；以及用分子的第二集合进行第二PCR过程(例如，PCR扩增过程，等等)，分子的第二集合包括与不同稀释标签的核苷酸序列互补的稀释标签相关引物区。在变化形式中，进行基于PCR的标记过程可以包括进行PCR扩增过程。
然而，生成加稀释标签的混合物S130可以以任何合适的方式进行。
2.4方法-扩增加稀释标签的混合物。
使用分子的第二集合扩增加稀释标签的靶的子集S140可以起到生成加稀释标签的靶的拷贝的作用。扩增可以通过本文描述的样品处理技术(例如多轮PCR)或任何合适的技术进行。扩增加稀释标签的遗传靶的子集优选地包括分别扩增加稀释标签的靶的不同子集(例如，用不同的PCR操作扩增不同子集，诸如在单独的容器中扩增)。例如，扩增加稀释标签的混合物可以包括将加稀释标签的混合物二次取样成子样品(例如，其中子样品的数量对应于选择用于扩增的加稀释标签的靶的子集的数量，等等)；使每个子样品与加稀释标签的靶的不同子集相关(例如，使第一子样品与第一稀释标签对诸如D0 F,D0 R相关，使第二子样品与第二稀释标签对诸如D0 F,D1 R相关，等等)；并且对于每个子样品，用被配置用于扩增加稀释标签的靶的相应子集的分子(例如，来自分子的第二集合)进行扩增(例如，用包含靶向D0 F,D0 R稀释标签对的序列的引物的分子处理第一子样品，等等)，但是可以以任何合适的方式进行二次取样和相关处理。在具体的实例中，分别扩增加稀释标签的遗传靶的不同子集可以包括将加稀释标签的混合物二次取样成子样品；使每个子样品与不同标签组合中的至少一个稀释标签组合相关；以及对于每个子样品，用寡核苷酸的第二集合的稀释标签组合特异性寡核苷酸进行扩增，其中稀释标签组合特异性寡核苷酸被配置用于扩增加稀释标签的遗传靶，该加稀释标签的遗传靶与以下相关：与该子样品相关的至少一个稀释标签组合。利用靶向来自分子的第一集合的稀释标签序列的引物可以赋予计数准确性和计数比较的改进(例如，其中靶向相同稀释标签序列的相同引物类型可以用于不同生物样品、不同靶序列等的不同扩增操作；其中在方法100的不同实例之间使用相同引物类型可以实现在不同实例之间以相似的速率扩增；等等)。可选择地，扩增加稀释标签的靶的不同子集可以以组合方式(例如，在单个容器中)进行。然而，加稀释标签的混合物的不同组分可以以任何合适的方式以任何合适的组合进行扩增。
扩增加稀释标签的靶的子集可以包括选择子集的子组来扩增(例如，不同于扩增每个子集)。在一个实例中，选择子集的子组可以包括选择代表相对浓度分布中每个可能的相对浓度的稀释标签对类型的子组(例如，选择在图2和图4B中示出的在相对浓度分布中的加粗体的稀释标签对)，诸如不选择将作为子组中已经被代表的相对浓度的重复的任何稀释标签对类型。可选择地，可以扩增加稀释标签的靶的每个子集。然而，扩增加稀释标签的靶的子集S140可以以任何合适的方式进行。
2.5方法-生成经修饰的加稀释标签的混合物。
基于相对浓度分布(例如，描述经扩增的加稀释标签的靶的不同子集的相对浓度)生成经修饰的加稀释标签的混合物S150可以起到生成经修饰的混合物的作用，所述经修饰的混合物包括处于经修改的相对浓度分布的加稀释标签的靶的子集(例如，可通过知晓用于生成经修饰的加稀释标签的混合物的组分的相对浓度；被配置以实现改进的动态范围的经修改的相对浓度分布；等等来实现)。经修改的相对浓度分布优选地是其中加稀释标签的靶的不同子集处于基本上相等的浓度的均衡的浓度分布，但是可以可选择地包括任何合适的浓度分布(例如，相对浓度分布、绝对浓度分布，等等)，其中跨越混合物的组分具有任何合适的浓度分布(concentration distribution)。在一个实例中，生成经修饰的加稀释标签的混合物可以包括：鉴于子样品的已知相对浓度分布(例如，对应于加稀释标签的遗传靶的不同子集的相对浓度，等等)，确定加稀释标签的混合物的每个经扩增的子样品的量，以组合以获得经修饰的加稀释标签的混合物的期望的经修改的相对浓度分布。另外地或可选择地，经修饰的加稀释标签的混合物的成分的已知相对浓度分布可以在生成经修饰的加稀释标签的混合物中以任何合适的方式用于处理成分。在实例中，生成经修饰的加稀释标签的混合物和/或方法100的其他部分可以包括基于对以下进行优化来选择样品处理方案：优化数量、难度、时间要求、误差范围(margin of error)、期望输出和/或任何其他合适的参数。在具体的实例中，生成经修饰的加稀释标签的混合物可以包括：测量加稀释标签的混合物的每个经扩增的子样品中的DNA丰度(例如，DNA质量)(例如，通过Nanodrop UV-vis分光光度法；通过使用Qubit DNA荧光计；等等)；以及基于所测量的DNA丰度，将经扩增的子样品组合成经修饰的加稀释标签的混合物(例如，其中经修饰的加稀释标签的混合物具有均衡的质量分布(mass profile)，其中加稀释标签的靶的不同子集中的每一个子集具有相等或基本上相等的质量，等等)。然而，生成经修饰的加稀释标签的混合物S150可以以任何合适的方式进行。
2.6方法-确定生物靶的丰度。
基于对经修饰的加稀释标签的混合物的分析来确定不同靶(例如，包含靶序列的不同DNA分子)的一个或更多个计数(和/或丰度的其他量度)S160可以起到准确地估计生物样品中的靶计数的作用，其诸如通过鉴定有限稀释(例如，具有最大相对浓度同时在低于阈值检测水平的水平被检测到的稀释标签组合，诸如为以下中的一个或更多个：未检测到的，具有足够低于与不同稀释标签对相关的参考检测水平的检测水平，具有低于预先确定的参考检测水平的检测水平，具有低于阈值数量的读段数量，具有相对于不同稀释标签对的读段为低数量的读段；等等)来进行，其可以对应于估计的靶分子数量(例如，如图3中示出的)。如此，方法的实施方案可以实现基于对数的计数(例如，对数计数、LogLog计数、HyperLogLog，等等)和/或丰度确定中的其他合适的改进。在具体的实例中，基于均衡的加稀释标签的混合物和相对浓度分布确定不同靶分子的计数包括：基于对均衡的加稀释标签的混合物进行测序来鉴定有限稀释；以及基于有限稀释和与不同稀释标签对相关的相对浓度分布来确定不同靶分子的计数。在具体的实例中，鉴定有限稀释包括：确定对应于不同稀释标签对的序列读段，这基于将序列读段的核苷酸序列与不同稀释标签对的核苷酸序列进行比较来进行；以及鉴定具有最大相对浓度同时未在序列读段中检测到的稀释标签对；并且其中确定不同靶分子的计数包括基于由所鉴定的稀释标签对的相对浓度分布指示的相对浓度来确定计数。
对经修饰的加稀释标签的混合物的分析优选地包括对经修饰的加稀释标签的混合物(和/或经修饰的加稀释标签的混合物的经处理的形式)进行测序；计算地处理序列读段结果；和/或任何其他合适的过程。例如，如图3中示出的，确定计数可以包括：对于每个稀释标签对(或其他稀释标签组合)，鉴定对应于稀释标签对的序列读段的数量(例如，基于将序列读段的核苷酸序列与稀释标签对的核苷酸序列进行比较)；鉴定具有最大相对浓度同时不具有序列读段的稀释标签对；以及基于由所鉴定的稀释标签对指示的相对浓度来确定计数。另外地或可选地，确定计数可以包括应用计数确定模型，该计数确定模型包括以下中的任何一种或更多种：概率性属性、启发式属性、确定性属性和/或任何其他合适的属性。
在一种变化形式中，确定靶的丰度可以包括从多于一个个体计数(例如，不同靶分子的不同分组的个体计数，等等)确定总计数，这可以起到提高计数估计的准确性的作用。确定总计数优选地基于分箱方法。例如，如图2中示出的，加稀释标签的靶可以包括来自用于对靶进行处理(例如，引物延伸、扩增，等等)的分子(例如，包含引物的分子)的箱标识物，其中确定总计数可以包括：将加稀释标签的靶分组(例如，将相应的序列读段分组)到通过它们相应的箱标签识别的箱中；对于每个箱，基于与该箱相关的加稀释标签的靶确定个体计数；以及基于个体计数确定总计数(例如，对个体计数取平均值；确定中位数；等等)。在具体的实例中，基于多于一个个体计数确定总计数包括：基于与加稀释标签的遗传靶的不同子集相关的箱标识物确定不同靶分子的不同分组；并且对于不同分组中的每个分组，基于与对应于该分组的不同稀释标签组合相关的相对浓度分布，确定多于一个个体计数中的个体计数。
另外地或可选择地，从个体丰度确定总丰度可以利用任何合适的统计方法，并且可以以任何合适的方式进行。
在另一个变化形式中，确定计数可以包括将不同的计数确定模型(例如，使用不同的相对浓度分布的计数确定；不同的样品处理步骤；不同的稀释标签、箱标识物、引物；等等)应用于不同的应用(例如，对人类核酸靶序列与微生物核酸靶序列应用不同的模型；对NIPT与癌症筛查应用不同的模型；等等)、生物样品(例如，基于生物样品的收集场所应用方法100的一部分的不同参数；基于不同用户人口统计学应用不同参数；对不同时间段收集的生物样品应用不同参数；等等)，和/或状况的任何其他合适的差异。然而，确定靶的丰度S160可以以任何合适的方式进行。
2.7方法-定量地比较丰度
方法100可以另外地或可选择地包括定量地比较不同的计数S170，其可以起到确定通过方法100的一部分(和/或其他合适的方法)估计的计数之间的有意义的比较的作用。比较不同的计数可以针对以下中的一个或更多个进行：针对不同时间段、不同靶(例如，针对不同靶序列)、不同用户(例如，能够针对不同用户人口统计学、针对不同用户行为等等进行比较)、不同的生物样品(例如，不同类型的生物样品)确定的计数，和/或针对状况的任何差异确定的计数。例如，确定和分析靶(例如，循环肿瘤DNA中存在的癌基因靶突变)计数可以在治疗方案的过程中进行，其中随时间推移的靶计数的分析可以用于确定治疗功效(例如，治疗反应，等等)，推荐和/或更新治疗，表征用户状况的状态，和/或进行任何其他合适的治疗相关过程。在一个实例中，生物靶的第一丰度(例如，使用方法100的任何合适部分确定的丰度；等等)与第一时间段相关，其中方法100还可以包括基于随后经修饰的加稀释标签的混合物和相对浓度分布确定生物靶的随后丰度，其中生物靶的随后丰度与第二时间段相关，诸如其中与第一时间段相关的丰度和与第二时间段相关的丰度被配置用于促进状况的表征。在具体的实例中，生物靶与癌症状况相关，并且其中与第一时间段相关的丰度和与第二时间段相关的丰度被配置用于促进对癌症状况的治疗反应的表征。
在另一个实例中，方法100的实施方案可以被频繁地应用(例如，在护理提供者的检查期间)，以确定与不同用户状况相关的靶标志物的随时间推移的计数，其中所述实施方案可以促进常规诊断筛查。然而，定量地比较丰度S170可以以任何合适的方式进行。
2.8方法-提供治疗
方法100可以另外地或可选择地包括基于一个或更多个计数提供治疗S180，其可以起到利用计数数据来确定和/或以其他方式促进个体化治疗提供的作用。治疗可以包括以下中的任何一种或更多种：治疗性组合物(例如，妊娠相关组合物、基于药物的治疗、基于益生菌的治疗、基于局部的治疗，等等)、基于医疗设备的治疗、包括基于丰度数据(例如计数数据)导出的用户状况相关信息和/或治疗相关信息的健康相关通知(例如，传送至受试者、至护理提供者，等等)；饮食相关治疗；认知/行为治疗；物理疗法；临床相关治疗(例如，远程医疗、安排护理提供者预约，等等)；基于替代医疗的治疗；基于环境的治疗；和/或任何其他合适类型的治疗。
在一种变化形式中，提供治疗可以排他地基于丰度数据。例如，可以响应于满足阈值条件的计数(例如，特定靶的超过阈值计数的计数；指示用户状况的风险超过阈值风险的计数；等等)提供治疗。在特定实例中，响应于满足阈值条件的计数，提供治疗可以包括通知护理提供者、安排护理提供者预约、促进数字远程医疗通信和/或进行任何其他合适的行为来促进治疗提供。
在另一变化形式中，提供治疗可以基于丰度数据和补充数据，所述补充数据可以包括以下中的任何一个或更多个：体征数据(biometric data)(例如，在补充医疗设备处采样的体征数据)、病史数据、家族病史、人口统计学数据、遗传史、微生物组数据、和/或与丰度数据的上下文相关的任何其他合适的数据。例如，方法100可以包括随时间推移针对用户状况提供一系列治疗，诸如通过基于与用户状况相关的靶的随时间推移确定的计数而迭代更新治疗方案(例如，调整药物剂量、药物类型，等等)来提供。然而，提供治疗S180可以以任何合适的方式进行。然而，方法100的实施方案的一部分可以以任何合适的方式进行。
3.其他.
方法100和/或系统200的实施方案可以包括各种系统组分和各种方法过程(包括任何变型(例如，实施方案、变化形式、实例、具体实例、附图，等等))的每一个组合和排列，其中方法100和/或本文描述的过程的实施方案的一部分可以通过和/或使用系统200和/或本文描述的其他实体的一个或更多个实例、元件、组件和/或其他方面不同步地(例如，顺序地)、同时地(例如，平行地)或以任何其他合适的顺序进行。
本文描述的任何变型(例如，实施方案、变化形式、实例、具体实例、附图，等等)和/或本文描述的变型的任何部分可以被另外地或可选择地组合、聚集、排除、使用、连续进行、平行进行和/或以其他方式应用。
方法100和/或系统200的实施方案的一部分可以至少部分地被实施和/或实现为被配置为接收存储计算机可读指令的计算机可读介质的机器。指令可以由可与系统200的实施方案整合的计算机可执行组件执行。计算机可读指令可以存储在任何合适的计算机可读介质上，诸如RAM、ROM、闪速存储器、EEPROM、光学设备(CD或DVD)、硬盘驱动器、软盘驱动器或任何合适的设备。计算机可执行组件可以是通用处理器或专用处理器(applicationspecific processor)，但任何合适的专用硬件或硬件/固件组合装置可以可选择地或另外地执行指令。
如本领域技术人员将从先前详细的描述和从附图和权利要求书认识到的，可以对方法100、系统200和/或变型的实施方案进行修改和改变而不脱离权利要求书中定义的范围。

Claims (20)

1.一种用于对来自无细胞DNA(cfDNA)的不同生物靶的相对丰度进行准确、高动态范围的确定的方法，所述方法包括：
·对于与不同遗传基因座相关的不同生物靶中的每个生物靶：
·生成寡核苷酸的第一集合，所述寡核苷酸的第一集合包括基于相对浓度分布处于预先确定的相对浓度的寡核苷酸的不同子集，其中所述寡核苷酸的不同子集中的每个子集包括包含以下的寡核苷酸：
·所述寡核苷酸的不同子集中的该子集独特的稀释标签，其中所述稀释标签与所述相对浓度分布相关，所述相对浓度分布指示不同稀释标签对的不同相对浓度，和
·与所述生物靶相关的靶序列互补的引物区；
·生成寡核苷酸的第二集合，所述寡核苷酸的第二集合包含与所述寡核苷酸的第一集合的所述稀释标签的核苷酸序列互补的稀释标签相关引物区；
·用所述寡核苷酸的第一集合和cfDNA样品进行标记过程，从而生成加稀释标签的混合物，所述加稀释标签的混合物包括加稀释标签的遗传靶的不同子集，所述加稀释标签的遗传靶的不同子集通过由所述相对浓度分布指示的不同相对浓度的所述不同稀释标签对识别；
·用所述寡核苷酸的第二集合和所述加稀释标签的混合物进行扩增过程；
·基于与所述不同稀释标签对相关的相对浓度分布，生成均衡的加稀释标签的混合物，所述均衡的加稀释标签的混合物包括基本上相等浓度的所述加稀释标签的遗传靶的不同子集；以及
·基于所述均衡的加稀释标签的混合物和与所述不同稀释标签对相关的相对浓度分布，确定对应于所述生物靶的不同靶分子的计数；以及
·基于所述不同生物靶的计数确定所述不同生物靶的相对丰度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中对不同生物靶的相对丰度进行准确、高动态范围的确定用于液体活组织检查，其中所述不同生物靶与癌症状况相关，并且其中确定所述不同生物靶的相对丰度包括确定所述不同生物靶的相对丰度以促进所述癌症状况的表征。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述不同生物靶包括ERBB2基因靶，其中确定所述不同生物靶的相对丰度包括确定关于所述ERBB2基因靶的相对丰度，以促进与所述ERBB2基因靶相关的癌症状况的表征。
4.根据权利要求1所述的方法，其中基于所述均衡的加稀释标签的混合物和所述相对浓度分布确定所述不同靶分子的计数包括：
·基于对所述均衡的加稀释标签的混合物进行测序，鉴定有限稀释；和
·基于所述有限稀释和与所述不同稀释标签对相关的相对浓度分布确定所述不同靶分子的计数。
5.根据权利要求4所述的方法，
·其中鉴定所述有限稀释包括：
·确定对应于所述不同稀释标签对的序列读段，这基于将所述序列读段的核苷酸序列与所述不同稀释标签对的核苷酸序列进行比较来进行，以及
·鉴定具有最大相对浓度同时在所述序列读段中未被检测到的稀释标签对；并且
·其中确定所述不同靶分子的计数包括基于由所鉴定的稀释标签对的相对浓度分布指示的相对浓度来确定计数。
6.根据权利要求1所述的方法，
·其中所述寡核苷酸的不同子集包括正向引物子集和反向引物子集，
·其中所述正向引物子集中的正向引物子集的寡核苷酸包含：
·所述寡核苷酸的不同子集中的第一子集独特的稀释标签；和
·用于退火至与所述靶序列相关的链的正向引物区；
·其中所述反向引物子集中的反向引物子集的寡核苷酸包含：
·所述寡核苷酸的不同子集中的第二子集独特的稀释标签；和
·退火至与所述靶序列相关的互补链的反向引物区；并且
·其中生成所述寡核苷酸的第一集合包括生成预先确定的相对浓度的所述寡核苷酸的第一集合，所述正向引物子集和所述反向引物子集中的至少一个的所述预先确定的相对浓度是不同的。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸的第二集合包括测序引物，用于促进所述加稀释标签的遗传靶的不同子集的高通量测序。
8.一种用于确定来自无细胞DNA(cfDNA)的生物靶的丰度的方法，所述方法包括：
·生成寡核苷酸的第一集合，所述寡核苷酸的第一集合包括寡核苷酸的不同子集，其中所述寡核苷酸的不同子集中的每个子集包括包含以下的寡核苷酸：
·与所述寡核苷酸的不同子集中的该子集相关的稀释标签，其中所述稀释标签与指示不同稀释标签组合的不同相对浓度的相对浓度分布相关，和
·与所述生物靶相关的靶序列互补的靶相关区域；
·生成寡核苷酸的第二集合，所述寡核苷酸的第二集合包含与所述寡核苷酸的第一集合的稀释标签的核苷酸序列互补的稀释标签相关区域；
·用所述寡核苷酸的第一集合和所述cfDNA进行标记过程，从而生成加稀释标签的混合物，所述加稀释标签的混合物包括加稀释标签的遗传靶的不同子集，所述加稀释标签的遗传靶的不同子集通过由所述相对浓度分布指示的不同相对浓度的所述不同稀释标签组合识别；
·用所述寡核苷酸的第二集合和所述加稀释标签的混合物进行扩增过程；
·生成经修饰的加稀释标签的混合物，所述经修饰的加稀释标签的混合物包括处于经修改的浓度的所述加稀释标签的遗传靶的不同子集；以及
·基于所述经修饰的加稀释标签的混合物和与所述不同稀释标签组合相关的相对浓度分布确定所述生物靶的丰度。
9.根据权利要求8所述的方法，其中进行所述扩增过程包括分别扩增所述加稀释标签的遗传靶的不同子集。
10.根据权利要求9所述的方法，其中分别扩增所述加稀释标签的遗传靶的不同子集包括：
·将所述加稀释标签的混合物二次取样成子样品；
·使每个子样品与所述不同标签组合中的至少一个稀释标签组合相关；以及
·对于每个子样品，用所述寡核苷酸的第二集合的稀释标签组合特异性寡核苷酸进行扩增，其中所述稀释标签组合特异性寡核苷酸被配置用于扩增加稀释标签的遗传靶，该加稀释标签的遗传靶与所述至少一个稀释标签组合相关，所述至少一个稀释标签组合与该子样品相关。
11.根据权利要求10所述的方法，其中生成所述经修饰的加稀释标签的混合物包括基于与所述不同稀释标签组合相关的相对浓度分布确定所述加稀释标签的混合物的每个经扩增的子样品的量以进行组合。
12.根据权利要求8所述的方法，其中确定所述生物靶的丰度包括基于所述不同靶分子的不同分组的多于一个个体计数来确定不同靶分子的总计数。
13.根据权利要求12所述的方法，其中基于所述多于一个个体计数确定总计数包括：
·基于与所述加稀释标签的遗传靶的不同子集相关的箱标识物，确定所述不同靶分子的不同分组；以及
·对于不同分组中的每个分组，基于与对应于该分组的不同稀释标签组合相关的相对浓度分布，确定所述多于一个个体计数中的个体计数。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述寡核苷酸的不同子集的寡核苷酸包含所述箱标识物，并且其中所述箱标识物中的每个箱标识物包含随机化核苷酸序列，所述随机化核苷酸序列被配置为提高确定所述生物靶的丰度的准确性。
15.一种用于确定来自无细胞DNA(cfDNA)的生物靶的丰度的方法，所述方法包括：
·生成分子的第一集合，所述分子的第一集合包括分子的不同子集，所述分子的不同子集包含与所述分子的不同子集相关的不同稀释标签，其中所述不同稀释标签与相对浓度分布相关，所述相对浓度分布指示与所述不同稀释标签相关的不同相对浓度；
·基于所述分子的第一集合和所述cfDNA生成加稀释标签的混合物，所述加稀释标签的混合物包括加稀释标签的遗传靶的不同子集，所述加稀释标签的遗传靶的不同子集包含与由所述相对浓度分布指示的不同相对浓度相关的不同稀释标签；
·生成经修饰的加稀释标签的混合物，所述经修饰的加稀释标签的混合物包括处于经修改的浓度的所述加稀释标签的遗传靶的不同子集；以及
·基于所述经修饰的加稀释标签的混合物和所述相对浓度分布确定所述生物靶的丰度。
16.根据权利要求15所述的方法，其中生成所述加稀释标签的混合物包括基于以下中的至少一种，用所述不同稀释标签对靶分子加标签：基于PCR的技术、连接技术和标签片段化技术。
17.根据权利要求16所述的方法，其中生成所述加稀释标签的混合物包括：
·用所述分子的第一集合和所述cfDNA进行第一PCR过程，其中所述分子的第一集合包含与所述生物靶相关的靶序列互补的引物区；以及
·用分子的第二集合进行第二PCR过程，所述分子的第二集合包含与所述不同稀释标签的核苷酸序列互补的稀释标签相关引物区。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物靶的丰度与第一时间段相关，其中所述方法还包括基于随后的经修饰的加稀释标签的混合物和所述相对浓度分布确定所述生物靶的随后丰度，其中所述生物靶的随后丰度与第二时间段相关，并且其中与所述第一时间段相关的丰度和与所述第二时间段相关的丰度被配置用于促进状况的表征。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述生物靶与癌症状况相关，并且其中与所述第一时间段相关的丰度和与所述第二时间段相关的丰度被配置用于促进对所述癌症状况的治疗反应的表征。
20.根据权利要求15所述的方法，其中基于所述经修饰的加稀释标签的混合物和所述相对浓度分布确定所述生物靶的丰度包括：
·确定对应于所述不同稀释标签的序列读段，这基于将所述序列读段的核苷酸序列与所述不同稀释标签的核苷酸序列进行比较来进行，以及
·鉴定所述不同稀释标签的具有最大相对浓度同时在所述序列读段中未被检测到的稀释标签组合；并且
·其中确定所述生物靶的丰度包括基于由所鉴定的稀释标签组合的相对浓度分布指示的浓度来确定丰度。
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